專利名稱：一種檢測禽呼腸孤病毒的電化學免疫傳感器及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測禽呼腸孤病毒的電化學免疫傳感器及其制備方法。
背景技術：
禽呼腸孤病毒(Avian reovirus, ARV)是呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬的成員，可感染雞、火雞、鴨、鵝及其它野鳥，引起病毒性關節炎、呼吸道疾病、腸道疾病、中樞神經癥狀和免疫抑制等多種疾病。目前檢測ARV的主要方法有ELISA、RT-PCR、半套式RT-PCR、核酸探針技術。電化學免疫傳感器是將免疫測定法與高靈敏的電化學傳感技術相結合而構建的一類新型生物傳感器，可用于痕量免疫原性物質的分析檢測，具有很強的專一性。其工作原理和傳統的免疫測試法相似，都屬于固相免疫測試法，即把抗原或抗體固定在傳感器表面，通過傳感技術將抗原抗體發生的免疫反應轉變成可檢測的電化學信號來測定樣品中的目標物質。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種用于制備電化學免疫傳感器的復合物A (G-Ch1-Ag納米粒子復合物)的制備方法。本發明提供的方法，包括如下步驟:I)制備石墨烯-甲殼胺懸濁液；2)將AgNO3水溶液與所述石墨烯-甲殼胺懸濁液混合，依次經加熱反應和超聲，得到復合物A ;所述制備石墨烯-甲殼胺懸濁液的方法包括如下步驟:A)將甲殼胺(Chi，甲殼胺分子式為:(C6HnN04)n,MV: 1.5X105, Viscosity: IOOMpa.S)溶于醋酸溶液中，混合，得到甲殼胺溶液；所述醋酸溶液為冰醋酸和水混合得到的溶液；B)將石墨烯與甲殼胺溶液混勻，超聲，得到石墨烯-甲殼胺懸濁液。上述方法中的各原料投料配比如下:所述甲殼胺:所述冰醋酸:所述石墨烯:所述AgNO3 為 5g:28ml: Ig:0.34g。上述方法中，步驟I)的A中，所述混合為25°C混勻(具體為磁力攪拌)0.5_2h，所述混合具體為25°C 混勻 Ih ；步驟I)的B中，所述超聲的條件為功率250W連續超聲，所述超聲的時間為l_3h，所述超聲時間具體為2h ；步驟2)中，所述混合為25-28°C混勻(磁力攪拌)30_120min ;所述混合具體為25°C混勻30min ；
所述加熱反應為所述混合得到的產物在80°C反應0.5-lh，得到加熱反應產物，所述加熱反應具體為所述混合得到的產物在80°C反應lh，得到加熱反應產物；
所述超聲為所述加熱反應產物在超聲功率250W下連續超聲2min得到石墨烯-甲殼胺懸濁液。由上述的方法制備的復合物A也是本發明保護的范圍。
本發明的另一個目的是提供用于制備電化學免疫傳感器的復合物B (抗體-石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物，G-Ch1-Ag-ARV/MAb)的制備方法。
本發明提供的方法，包括如下步驟:將權利要求4所述的復合物A和抗體在BSA水溶液中反應，得到復合物B。
上述方法中的各原料的投料質量比如下:制備所述復合物A所需的石墨烯:所述抗體為50:1 ；
所述BSA水溶液的質量百分含量具體為1%_5%，所述BSA水溶液的質量百分含量進一步具體為1% ;
所述抗體具體為單克隆抗體或多克隆抗體(即為待測樣品的單克隆抗體或多克隆抗體)，所述單克隆抗體進一步具體為禽呼腸孤病毒單克隆抗體；
所述反應條件為2-8V、反應8_24h,所述反應條件具體為4°C、反應12h。
由上述方法制備的復合物B也是本發明保護的范圍。
本發明第三個目的是提供一種用于制備電化學免疫傳感器工作電極的試劑盒。
本發明提供的試劑盒，包括獨立包裝的上述的復合物B和復合物C (G-Ch1-Au納米粒子復合物);
所述復合物C按照如下方法制備:將HAuCl4水溶液與權利要求1-3中任一所述方法中的所述含有石墨烯和甲殼胺的懸濁液混合，反應，得到復合物C ；
所述復合物C制備方法中的原料的投料配比具體如下:所述甲殼胺:所述冰醋酸:所述石墨烯:所述HAuCl4為5g:28ml:lg:0.2g ；
所述混合為25-28V混勻30-120min ;所述混勻具體為25°C混勻30min ；
所述加熱反應為將所述混合得到的產物在80°C反應0.5_2h，得到復合物C，所述加熱反應具體為將所述混合得到的產物在80°C反應lh，得到復合物C。
本發明第四個目的是提供一種用于檢測呼腸孤病毒電化學免疫傳感器的工作電極的制備方法。
本發明提供的方法，包括如下步驟:
I)將上述試劑盒中的復合物C涂到金電極表面，干燥(室溫25°C下自然晾干)，得到復合物C修飾金電極；
2)將待測樣品涂到所述復合物C修飾金電極上，反應，得到固定待測樣品金電極；
3)將BSA水溶液涂到所述固定待測樣品金電極上，反應，得到BSA封閉金電極；
4)將上述的復合物B涂到所述BSA封閉金電極上，反應，得到工作電極；
上述金電極為將金電極(0 = 3 mm)以0.05 μ m的Al2O3拋光粉拋光打磨至鏡面后用蒸餾水洗干凈，再分別在二次去離子水、無水乙醇、二次去離子水中超聲清洗5min，用N2吹干；然后在0.5mol.T1H2SO4溶液(掃描前通入N2除氧15min)中用循環伏安進行掃描，掃描速度為50mV/s，電壓范圍為-0.3至+1.5V，持續掃描直到循環伏安圖穩定之后，取出用蒸餾水洗凈，N2吹干待用，得到待修飾金電極；
步驟I)中，所述干燥為室溫25°C下自然晾干；步驟2)中，所述反應具體為2_8°C下反應8_24h,所述反應進一步具體為4°C下反應8小時；步驟3 )中，所述BSA水溶液的質量百分含量具體為1%_5%，所述BSA水溶液的質量百分含量進一步具體為1% ;所述反應具體為2_8°C下反應8_24h,所述反應進一步具體為4°C下反應12小時；步驟4)中，所述反應具體為37°C下反應30-60min,所述反應進一步具體為37°C下反應40min。本發明的第五個目的是提供一種利用電化學免疫傳感器檢測待測樣品的套裝產
品O本發明提供的套裝產品，為包括上述的復合物B和免疫傳感器，所述免疫傳感器的金電極為由上述試劑盒中的復合物C修飾的金電極；上述由上述試劑盒中的復合物C修飾的金電極按照上述檢測呼腸孤病毒電化學免疫傳感器的工作電極的制備方法中的步驟I)制備。包括上述方法制備的工作電極的電化學免疫傳感器也是本發明保護的范圍；或上述的復合物A、上 述的復合物B、上述的試劑盒、上述方法制備的工作電極在制備用于檢測呼腸孤病毒中的產品中的應用也是本發明保護的范圍。本發明的實驗證明，本發明具有如下優點:I)本發明制備了一種新的石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物，且將其與禽呼腸孤病毒抗體復合，得到抗體-石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物(探針)，將其作為電化學免疫傳感器分析檢測的示蹤標記物可實現信號放大，大大的提高檢測的靈敏度，并且該傳感器不需要在測試底液中加入電化學活性物質，只需要簡單的KCl溶液作為測試底液即可完成電化學檢測；2)利用石墨烯-甲殼胺-金納米粒子復合物對金電極進行修飾，其大的比表面積和好的生物相容性為下一步的樣品固定奠定良好的界面，并且其好的導電性為最后的電化學檢測呼腸孤病毒提供充足的電子傳遞通道；3)相對現有的電化學免疫傳感器，本發明的免疫傳感器還有一大突破:一般的傳感器固定敏感界面之后會固定探針，用于捕獲待測樣品中的目標物質，通常固定在電極表面的探針在4°C下只能保存一個月，有效時間較短，很大程度上限制了免疫傳感器在實際中的應用。而本發明突破了常規的思路，在固定石墨烯-甲殼胺-金納米粒子復合物作為傳感器的敏感界面后，直接滴涂待測樣品，然后再與抗體-石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物探針反應，這樣既可以保證了傳感器特異性的前提下，提高了傳感器的有效保存時間。
圖1為不同電極修飾材料的循環伏安曲線圖2為免疫電極作為工作電極在IM KCl溶液中的線性掃描伏安(LSV)3為檢測禽呼腸孤病毒靈敏度檢測
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
下述實施例中所用的儀器有:CHI660D電化學工作站(北京華科普天科技責任有限公司)，使用常規的三電極電化學池進行電化學測量，修飾的金電極作為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，鉬電極作為輔助電極。免疫傳感器包括工作電極、參比電極和輔助電極構成的電極系統，免疫傳感器通過導線與電化學工作站相連。
實施例1、石墨烯-甲殼胺-金納米粒子復合物、石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物和抗體-石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物的制備
1、石墨烯-甲殼胺-金納米粒子復合物(G-Ch1-Au)和石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物(G-Ch1-Ag)的制備
I)石墨烯(G)的制備
根據Hummer方法改進后制備氧化石墨烯，具體步驟如下:冰水浴條件下，在200mL的燒杯中加入Ig石墨粉、2.5g硝酸鉀、IOOmL H2SO4，攪拌均勻后緩慢加入5g KMnO4，隨后將燒杯置于35°C水浴反應2h，逐步加入IOOmL去離子水，溫度升至95°C繼續反應lh，混合物由棕褐色變成亮黃色，冷卻至室溫(25°C)后加入300mL水稀釋，并加入質量分數為30%的H2O2中和未反應的高錳酸鉀，先用0.5mol/L的鹽酸水溶液洗滌，再用水反復離心洗滌，真空干燥，得到氧化石墨。
稱取IOmg上述制備的氧化石墨置于燒杯中，加入IOOmL去離子水，超聲(250W持續超聲)Ih,得到氧化石墨烯(GO)。
再以硼氫化鈉(NaBH4)作還原劑，95°C的條件下進行還原得到石墨烯(G)，具體如下:磁力攪拌條件下在IOmL0.lmg/mL的氧化石墨烯中逐滴加入lmLlmg/mL硼氫化鈉(NaBH4)水溶液，然后升溫至95°C反應30min時間，置于室溫(25°C )下自然冷卻后，用二次去離子水離心洗滌3次，85°C真空干燥24小時得到石墨烯。
將上述制備的石墨烯用于后期實驗，也可以用商業購買的石墨烯直接制備后面的復合物。
2) G-Ch1-Au納米粒子復合物和G-Ch1-Ag納米粒子復合物的制備
A、G-Chi懸濁液的制備
將0.5g的甲殼胺(Chi，甲殼胺分子式為:(C6H11NO4)n, MV: L 5X 105，Viscosity: IOOMpa.S)加入到IO`OmL濃度為1.0%(體積百分含量)醋酸溶液(冰醋酸溶于水中)中，室溫(25°0條件下磁力攪拌111，得到0.5% (質量百分含量)甲殼胺溶液。其中，甲殼胺與冰醋酸的投料配比為0.5g:2.8ml。
將IOmg的上述I)得到的石墨烯(G)加入到IOmL0.5% (質量百分含量)甲殼胺溶液中連續超聲(超聲功率250W)2h，其中G =Chi的投料質量比=1:5，得到石墨烯-甲殼胺懸濁液(G-Chi懸濁液)。
B、G-Ch1-Au納米粒子復合物的制備
取0.2mLl.0% (質量百分含量)HAuCl4水溶液加入到IOml上述A制備好的G-Chi懸濁液中室溫(25°C)下混勻30min，然后水浴加熱至80°C繼續反應lh，其中甲殼胺:冰醋酸:石墨烯=HAuCl4的投料配比為5g:28ml:lg:0.2g,得到石墨烯-甲殼胺-金納米粒子復合物(G-Ch1-Au納米粒子復合物)。
C、G-Ch1-Ag納米粒子復合物的制備取2mLlmM AgNO3水溶液加入到Iml上述A制備好的G-Chi懸濁液中室溫(25°C )下磁力攪拌30min，然后水浴加熱至80°C繼續反應lh，待其冷卻至室溫后用二次去離子水反復離心洗滌5次，最后加入Iml 二次去離子水，超聲(連續超聲，超聲功率250W) 2min，其中，甲殼胺、冰醋酸、石墨烯和AgNO3的投料配比為5g:28ml:lg:0.34g,得到石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物(G-Ch1-Ag納米粒子復合物)。2、抗體-石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物(G-Ch1-Ag-ARV/MAb)的制備移取ImL上述I得到的G-Ch1-Ag納米粒子復合物，加入50 μ L濃度為0.043mg/mlARV/MAb (由雜交瘤細胞株SF6-3K3制備得到單抗；該雜交瘤細胞株記載在禽呼腸孤病毒S1733株單克隆抗體的制備及特性鑒定，中國畜牧獸醫，謝志勤；謝芝勛；劉加波；龐耀珊；鄧顯文；謝麗基；彭宜；范晴，2012年11期，47-51頁，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。),200 μ Ll% (質量百分含量)BSA水溶液,4°C下反應過夜(12h)，用二次去離子水反復離心洗滌3次，最后加入lmLl%(質量百分含量)BSA水溶液于4°C保存得到的G-Ch1-Ag-ARV/MAb納米粒子復合物 。其中，制備G-Ch1-Ag中的G和ARV/MAb的投料質量比為50:1。實施例2、禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器及試劑盒—、禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器1、工作電極的制備將金電極(0 = 3 mm)以0.05μπι的Al2O3拋光粉拋光打磨至鏡面后用蒸餾水洗
干凈，再分別在二次去離子水、無水乙醇、二次去離子水中超聲清洗5min，用N2吹干。然后在0.5mol.T1H2SO4溶液(掃描前通入N2除氧15min)中用循環伏安進行掃描，掃描速度為50mV/s，電壓范圍為-0.3至+1.5V，持續掃描直到循環伏安圖穩定之后，取出用蒸餾水洗凈，N2吹干待用，得到待修飾金電極；用移液槍移取8 μ L由實施例1的I的2)制備的G-Ch1-Au納米粒子復合物涂到待修飾金電極表面(涂滿即可)，室溫(25°C)下自然晾干，得到G-Ch1-Au修飾金電極；再將G-Ch1-Au修飾金電極上滴涂(涂滿即可)8 μ L待測樣品置于4°C下反應8小時，得到固定待測樣品金電極；再將固定待測樣品金電極上滴涂(涂滿即可)15 μ Ll% (質量百分含量)BSA水溶液4°C下封閉過夜(12小時)，取出用二次去離子水洗凈，得到BSA封閉金電極；最后在BSA封閉金電極上滴涂(涂滿即可)15 μ L G_Chi_Ag-ARV/MAb納米粒子復合物37 °C下反應40min，用二次去離子水反復離心洗滌3次，得到免疫電極，即為工作電極。2、禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器包括上述I制備的工作電極、參比電極和輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，鉬電極作為對輔助電極。3、禽呼腸孤病毒試劑盒禽呼腸孤病毒試劑盒可以包括G-Ch1-Au納米粒子復合物和G_Chi_Ag-ARV/MAb納米粒子復合物；也可以包括本實施例制備的工作電極，還可以包括本實施例的禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器。實施例3、禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器或試劑盒的應用
一、禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器的應用
1、禽呼腸孤病毒待測液的制備
禽呼腸孤病毒待測液的制備:將禽呼腸孤病毒S1133 (購于中國獸藥監察所，產品目錄號:AV2311.)用濃度為0.lmol/L PBS (pH=7.4)緩沖溶液稀釋至106 5EID5(l/mL，得至Ij106_5EID5tlAiL的禽呼腸孤病毒待測液。
2、禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器檢測待測樣品
電極表面修飾過程采用循環伏安法(CV)進行表征，同時采用線性掃描伏安法(LSV)法實現了對禽呼腸孤病毒的檢測。
I)禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器中不同修飾的電極進行表征
采用工作電極制備過程中不同修飾的電極進行表征，不同修飾的電極具體分別為實施例2的一的I制備的待修飾金電極、G-Ch1-Au修飾金電極、固定待測樣品金電極(制備方法同實施例2的一的I中所示，其中待測樣品為106_%ID5(l/mL的禽呼腸孤病毒待測液)和BSA封閉金電極，鉬電極作為對輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極。
將上述不同的修飾電極、輔助電極和參比電極均置于含有5mMFe (CN)63^0.1MKCl的0.01mol/L PBS (pH7.0)緩沖溶液中進行循環伏安(CV)掃描，電化學工作站的測定參數:電位掃描范圍-0.2-0.6V，掃描速率為0.05V/s。
結果如圖1所示，為免疫傳感器制備過程的循環伏安圖，其中a為待修飾金電極的循環伏安曲線，出現氧化還原特征峰；當金電極上覆蓋了一層Au-Ch1-G之后的G-Ch1-Au修飾金電極，其氧化還原峰電流值增加(圖1b)，這是因為金納米粒子和石墨烯的修飾有效的提高了電極表面的電子傳導能力；隨后，修飾電極滴涂了呼腸孤病毒液后得到的固定待測樣品金電極，其循環伏安掃描的響應電流值明顯下降(圖1c)，這是因為呼腸孤病毒是蛋白分子物質，阻礙了電極表面的電子轉移通道；BSA封閉電極表面的活性位點得到的BSA封閉金電極其電流值下降(圖1d)。
2)禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器檢測待測樣品
按照實施例2的一的方法制備的免疫電極作為工作電極，其中，待測樣品分別為禽呼腸孤病毒陽性待測樣品和禽呼腸孤病毒陰性待測樣品，得到陽性待測樣品工作電極和陰性待測樣品工作電極；其中禽呼腸孤病毒陽性待測樣品為上述I制備的106_%ID5(l/mL的禽呼腸孤病毒待測液，禽呼腸孤病毒陰性待測樣品為將SPF雞的咽候棉拭子溶解在濃度為0.lmol/L PBS (pH=7.4)緩沖溶液中得到的樣品(SPF雞不存在禽呼腸孤病毒)。
將陽性待測樣品工作電極和陰性待測樣品工作電極分別與對電極和參比電極置于IM KCl水溶液中進行線性掃描伏安法(LSV)，電化學工作站的LSV測定參數:電位掃描范圍-0.15-0.25V，掃描速率為0.05V/s。
結果如圖2所示，其中a為禽呼腸孤病毒陰性樣品檢測曲線，b為禽呼腸孤病毒陽性樣品檢測曲線，可以看出，b線陽性樣品在0.07V處出現明顯的吸收峰，而陰性樣品沒有出現吸收峰，根據此 原理本發明的禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器的工作電極可以用來特異檢測出禽呼腸孤病毒，且只需要簡單的KCl溶液作為測試底液即可完成電化學檢測。
三、檢測禽呼腸孤病毒靈敏度
1、禽呼腸孤病毒待測液的制備
對病毒含量為106_ 5EID5tlAiL的禽呼腸孤病毒液SI 133用ρΗ=7.4、濃度為0.1mol/LPBS溶液進行10倍倍比稀釋到106 5EID5(l/mL-10°_5EID5ciAiL，各取15 μ L作為待測樣品，然后按照實施例2的一的I制備免疫電極作為禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器工作電極。再將禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器工作電極、飽和甘汞電極(SCE)、鉬電極均放入IM KCl水溶液中用線性掃描伏安法進行電化學檢測。掃描電位-0.15-0.25V，掃速:
0.05V/S。結果如圖3所示(圖中在出峰的位置從下到上的曲線對應的禽呼腸孤病毒液S1133 濃度分別依次為 106 5EID5(l/mL-10°_5EID5Q/mL)，在 10_5 倍稀釋(1015EID5Q/mL)時仍然可以出現明顯的吸收峰，因此該免疫傳感器的最低檢出量為1015EID5(l/mL。四、特異性檢測1、待測液的制備試驗中選取禽呼腸孤病毒S1133、H3N6亞型禽流感病毒(Duck/HK/526/79/2BH3N6)、H9N2 亞型禽流感病毒(Duck/Guangxi/1/00H9N2)、NDV 毒株 GX1/00、雞白痢沙門氏菌SE、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性支氣管炎IBV毒株MassachussettMl和傳染性法氏囊病毒A80株進行特異性試驗: H3N6 亞型禽流感病毒(Duck/HK/526/79/2B H3N6)、H9N2 亞型禽流感病毒(Duck/Guangxi/1/00H9N2)均記載在:A multiplex RT-PCR for detection of type A influenzavirus and differentiation of avian H5, H7, and H9hemagglutinin subtypes ；ZhixunXiea'*, Yao-shan Panga, Jiabo Liua, Xianwen Denga, Xiaofei Tanga, Jianhua Suna, Mazhar
1.Khanb'1,# ；Molecular and Cellular Probes20 (2006) 245 - 249 中；公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；NDV毒株GX1/00記載在文獻:陳安莉，謝芝勵，周辰瑜，等.新城疫病毒強弱毒株LAMP鑒別檢測方法的建立[J].中國獸醫科學，2011，41 (09):917-922 ;公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；雞白痢沙門氏菌SE購自國家獸醫生物菌種管理中心，目錄號:cvcc534，全稱:雞白痢沙門氏菌。傳染性喉氣管炎病毒購自國家獸醫生物菌種管理中心，目錄號:AV22傳染性支氣管炎IBV毒株MassachussettMl記載在文獻:謝志勤，謝芝勛，呂華剛.等.30株雞傳染性支氣管炎病毒標準株與分離株SI基因的克隆及序列分析[J].西南農業學報，2008，21 (6):1733-1736 ;公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；傳染性法氏囊病毒A80株購自中國獸藥監察所，產品目錄號:AV2321將上述各個病毒用濃度為0.lmol/L pH值7.4PBS緩沖溶液進行稀釋至病毒的含量均為lmg/ml作為待測樣品。各取15 μ L作為待測樣品按照實施例2的一的I制備免疫電極作為禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器工作電極。再將禽呼腸孤病毒電化學免疫傳感器工作電極、飽和甘汞電極(SCE)、鉬電極均放入IM KCl水溶液中用線性掃描伏安法進行電化學檢測。掃描電位-0.15-0.25V，掃速:0.05V/S。結果為該傳感器只對呼腸孤病毒出現預期的電位的吸收峰，其他病毒均沒有出現該吸收峰，表明該傳感器特異性好。
權利要求
1.一種用于制備電化學免疫傳感器的復合物A的制備方法，包括如下步驟: O制備石墨烯-甲殼胺懸濁液； 2)將AgNO3水溶液與所述石墨烯-甲殼胺懸濁液混合，依次經加熱反應和超聲，得到復合物A ; 所述制備石墨烯-甲殼胺懸濁液的方法包括如下步驟: A)將甲殼胺溶于醋酸溶液中，混合，得到甲殼胺溶液； 所述醋酸溶液為冰醋酸和水混合得到的溶液； B)將石墨烯與甲殼胺溶液混勻，超聲，得到石墨烯-甲殼胺懸濁液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于: 所述方法中的各原料投料配比如下:所述甲殼胺:所述冰醋酸:所述石墨烯:所述AgNO3 為 5g:28ml: Ig:0.34g。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于: 步驟I)的A中，所述混合為25°C混勻0.5-2h，所述混合具體為25°C混勻Ih ； 步驟I)的B中，所述超聲的條件為功率250W連續超聲，所述超聲的時間為l_3h，所述超聲時間具體為2h ； 步驟2)中，所述混合為25-28°C混勻30-120min ;所述混合具體為25°C混勻30min ；所述加熱反應為所述混合得到的產物在80°C反應0.5-lh，得到加熱反應產物，所述加熱反應具體為所述混合得到的產物在80°C反應lh，得到加熱反應產物； 所述超聲為所述加熱反應產物在超聲功率250W下連續超聲2min得到石墨烯-甲殼胺懸濁液。
4.由權利要求1-3中任一所述的方法制備的復合物A。
5.用于制備電化學免疫傳感器的復合物B的制備方法，包括如下步驟:將權利要求4所述的復合物A和抗體在BSA水溶液中反應，得到復合物B。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:所述方法中的各原料的投料質量比如下:制備所述復合物A所需的石墨烯:所述抗體為50:1 ; 所述BSA水溶液的質量百分含量具體為1%_5%，所述BSA水溶液的質量百分含量進一步具體為1% ; 所述抗體具體為單克隆抗體或多克隆抗體，所述單克隆抗體進一步具體為禽呼腸孤病毒單克隆抗體； 所述反應條件為2-8V、反應8-24h,所述反應條件具體為4°C、反應12h。
7.由權利要求5或6的方法制備的復合物B。
8.一種用于制備電化學免疫傳感器工作電極的試劑盒，包括獨立包裝的權利要求7所述的復合物B和復合物C ； 所述復合物C按照如下方法制備:將HAuCl4水溶液與權利要求1-3中任一所述方法中的所述含有石墨烯和甲殼胺的懸濁液混合，加熱反應，得到復合物C ； 所述復合物C制備方法中的原料的投料配比具體如下:所述甲殼胺:所述冰醋酸:所述石墨烯:所述 HAuCl4 為 5g:28ml:lg:0.2g ； 所述混合為25-28V混勻30-120min ;所述混勻具體為25°C混勻30min ； 所述加熱反應為將所述混合得到的產物在80°C反應0.5-2h，得到復合物C，所述加熱反應具體為將所述混合得到的產物在80°C反應lh，得到復合物C。
9.一種用于檢測呼腸孤病毒電化學免疫傳感器的工作電極的制備方法，包括如下步驟: 1)將權利要求8所述試劑盒中的復合物C涂到金電極表面，干燥，得到復合物C修飾金電極； 2)將待測樣品涂到所述復合物C修飾金電極上，反應，得到固定待測樣品金電極； 3)將BSA水溶液涂到所述固定待測樣品金電極上，反應，得到BSA封閉金電極； 4 )將權利要求7所述的復合物B涂到所述BSA封閉金電極上，反應，得到工作電極； 步驟2)中，所述反應具體為2-8°C下反應8-24h,所述反應進一步具體為4°C下反應8小時； 步驟3 )中，所述BSA水溶液的質量百分含量具體為1%_5%，所述BSA水溶液的質量百分含量進一步具體為1% ; 所述反應具體為2-8°C下反應8-24h,所述反應進一步具體為4°C下反應12小時； 步驟4)中，所述反應具體為37°C下反應30-60min，所述反應進一步具體為37°C下反應40mino
10.一種利用電化學免疫傳感器檢測待測樣品的套裝產品，包括權利要求7所述的復合物B和免疫傳感器，所述免疫傳感器的金電極為由權利要求8所述試劑盒中的復合物C修飾的金電極； 或包括權利要求9制備的工作電極的電化學免疫傳感器； 或權利要求4所述的復合物A、權利要求7所述的復合物B、權利要求8所述的試劑盒、權利要求9的方法制備的工作電極在制備用于檢測呼腸孤病毒中的產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測禽呼腸孤病毒的電化學免疫傳感器及其制備方法。本發明提供了用于制備電化學免疫傳感器的復合物A的制備方法，包括如下步驟1)制備含有石墨烯和甲殼胺的懸濁液；2)將AgNO3水溶液與所述含有石墨烯和甲殼胺的懸濁液混勻，反應，得到復合物A。本發明的實驗證明，本發明制備了一種新的石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物，且將其與呼腸孤病毒抗體復合，得到抗體-石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物，通過抗體-石墨烯-甲殼胺-銀納米粒子復合物和石墨烯-甲殼胺-金納米粒子復合物對金電極進行修飾，得到的免疫電極作為工作電極，可以不需要在測試底液中加入電化學活性物質作為電化學指示劑。
文檔編號G01N33/569GK103235123SQ201310137080
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月19日 優先權日2013年4月19日
發明者謝芝勛, 黃嬌玲, 滕麗瓊, 黃莉, 謝麗基, 劉加波, 龐耀珊, 鄧顯文, 謝志勤, 范晴, 羅思思 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所