專利名稱：磁性固相萃取-毛細管區帶電泳測定生物樣本中吡咯并喹呤醌含量的方法
技術領域：
磁性固相萃取-毛細管區帶電泳測定生物樣本中吡咯并喹呤醌含量的方法，屬于生物分析技術領域。
背景技術：
卩比咯并喹呤醌(pyrroloquinolinequinine PQQ)是一種新的氧化還原酶輔基,主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳動物之中，在牛奶尤其母乳中含量較高，被認為是體內必需的維生素之一。生物樣本中PQQ的分析方法有氣相色譜-質譜法、高效液相色譜、毛細管電泳法等[文獻方法 I:Zdene " k Glatz*, Martina Moravcova 1 , Oldr " ich Janiczek,Determination of pyrroloquinoline quinone by capillary zone Electrophoresis,Journal of Chromatography B, 739 (2000) 101 - 107.] 毛細管電泳是二十世紀 80 年代發展起來的一種快速分析方法，具有分析速度快、分離效率高、樣品和試劑消耗量少的優點。與高效液相色譜法相比，毛細管柱容易清洗、使用壽命長。文獻報道的PQQ毛細管電泳檢測法是在緩沖體系加入β -丙氨酸，采用反相C18小柱固相萃取分離富集細胞培養基中的PQQ,檢出限為0.1 0.2 μ M，PQQ峰型存在拖尾現象，固相萃取所用的C18小柱價格昂貴，而且步驟繁瑣，工作量大。近年來，磁納米固相萃取技術在生物樣品制備領域受到廣泛關注。由于磁性萃取介質直接分散于樣品溶液中，接觸面大，對生物樣品和液體中含固體懸浮物的樣品尤其適合，樣品處理簡單。本發明采用SiO2與不同極性的吸附劑混合組成，這些吸附劑對疏水性能不同的化合物具有不同的選擇性，從而能夠有效的進行分離。本方法快速、簡便，首次應用磁固相萃取技術結合毛細管電泳測定牛奶中PQQ的含量。本方法采用的毛細管電泳法加入了修飾劑環糊精，首次在毛細管電泳緩沖體系中加入三氟乙酸，解決了毛細管電泳圖中峰的拖尾問題。峰的對稱性明顯好于文獻報道。與文獻方法對比，分離效率提高了 6倍。
發明內容
本發明的目的在于提供一種磁性固相萃取-毛細管區帶電泳測定生物樣本中吡咯并喹呤醌含量的方法，使PQQ與其他較難分離的電中性雜質達到高效快速的分離。本發明的技術方案:一種磁性固相萃取-毛細管區帶電泳測定生物樣本中吡咯并喹呤醌含量的方法:( I)毛細管選擇及預處理:選用未涂層的41.5cmX50ym石英毛細管柱； 新毛細管柱先依次用甲醇沖洗IOmin,蒸懼水沖洗5min, lmol/L NaOH溶液沖洗30min,蒸懼水沖洗5min,最后再用運行緩沖液沖洗10-15min ;每次進樣前，用蒸餾水及運行緩沖液沖洗2min ；
運行緩沖液及樣品溶液均用0.22 μ m微孔針頭過濾器過濾；(2)毛細管電泳分析條件:檢測波長為249nm，進樣方式為0.5psi壓力進樣，進樣時間10.0秒，分離電壓為25kv，毛細管柱溫25°C ；運打緩沖液為:pH=8.8、10mmol/L砸砂_10mmol/L β _環糊精_質量濃度0.1% 二
氟乙酸的混合液。(3)生物樣本中吡咯并喹呤醌PQQ的檢測選用牛奶作為生物樣本的典型，①Fe3O4磁性納米粒子的制備:IOOmLl.25mM FeSO4.7Η2060 下攪拌，用 6Μ NaOH 調 pH 至 10，Ih 后磁性沉淀物分離，用去離子水沖洗，60°C真空干燥6h，得Fe3O4磁性納米粒子；②改性的混合磁性功能納米粒子Fe304-Si02-Phenyl_C8的制備:將制備得到的Fe3O4磁性納米粒子加入到含ImM四甲氧基硅烷、ImM苯基三甲氧基硅烷和ImM辛基三甲氧基硅烷混合液中，四甲氧基硅烷:苯基三甲氧基硅烷:辛基三甲氧基硅烷體積比1:1:1，加50mL含w/v0.01%吐溫-100、w/v0.02%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的v/vl2.5%甲醇和0.3mL w/v25%NH3作催化劑，120°C攪拌回流12 16h，用水、丙酮、正己烷依次清洗多次，60°C真空干燥6h，得磁性功能納米粒子Fe304-Si02-Phenyl-C8 ；
③牛奶樣品去除蛋白ImL牛奶加5mL甲醇，潤旋振蕩2min,4000rpm離心IOmin,上清液用50mLMcIlvaine buffer緩沖液稀釋，以備磁性固相萃取；McIlvaine buffer緩沖液為:ρΗ7.0,0.1M檸檬酸調0.2Μ磷酸氫二鈉溶液；④磁性固相萃取稱取上述制備好的50mg磁性功能納米粒子Fe304-Si02-Phenyl_C8于安普瓶中，分別用ImL的甲醇和水活化；加入步驟③處理后的牛奶樣品溶液10mL，渦旋萃取lmin，甲醇解吸3min，解吸液經氮氣吹干，用pH7.0、100 μ L磷酸緩沖液稀釋，進行毛細管電泳分析。本發明的有益效果:本發明采用SiO2與不同極性的吸附劑混合組成，這些吸附劑對疏水性能不同的化合物具有不同的選擇性，從而能夠有效的進行分離。本方法快速、簡便，首次應用磁固相萃取技術結合毛細管電泳測定牛奶中PQQ的含量。本方法采用的毛細管電泳法加入了修飾劑環糊精，首次在毛細管電泳緩沖體系中加入三氟乙酸，解決了毛細管電泳圖中峰的拖尾問題。峰的對稱性明顯好于文獻報道。與文獻方法對比，分離效率提高了 6倍。
圖1pH對PQQ保留時間的影響。圖2PQQ毛細管電泳圖，運行緩沖液10mmol/L硼砂-10mmol/LP -環糊精，pH=8.8,分尚電壓25kV。圖3PQQ毛細管電泳圖，運行緩沖液10mmol/L硼砂-10mmol/LP -環糊精，pH=8.8,
0.1 % 二氣乙酸,分尚電壓25kV。圖4PQQ標準曲線。
圖5a:牛奶磁固相萃取后的毛細管電泳圖，b:含20μ g/mL PQQ標準品的牛奶溶液經磁固相萃取后的毛細管電泳圖。
具體實施例方式實施例1( I)毛細管電泳分析條件:未涂層石英毛細管柱(41.5cmX50 μ m，河北永年縣銳灃色譜器件有限公司)，新毛細管先用甲醇沖洗lOmin，蒸餾水沖洗5min，lmol/L NaOH溶液沖洗30min，蒸餾水沖洗5min,最后再用運行緩沖液沖洗10_15min。運行緩沖液及樣品溶液均用0.22 μ m微孔針頭過濾器過濾。每次進樣前，用蒸餾水和運行緩沖液沖洗2min。檢測波長是249nm，進樣方式為壓力進樣(0.5 ^，10.0秒)，分離電壓為251^，毛細管柱溫25°C。運行緩沖液為:10mmol/L硼砂-lOmmol/L β -環糊精混合液，ρΗ=8.8，含有質量濃度0.1%的三氟乙酸。( 2)緩沖體系的選擇緩沖體系及濃度直接影響離子的遷移和分離。實驗考察了 PQQ在甘氨酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼砂緩沖體系中的分離情況。結果峰型很差，都達不到理想的分離狀況。可能PQQ分子中具有多羧基的緣故，具有較低的淌度，其淌度方向和電滲流方向相反，影響它的流出，不能得到較好的峰型。因此，本實驗考慮在背景電解液中加入環糊精，β-環糊精上的14個仲羥基位于空腔的寬口，其疏水性空腔可以選擇性地和分析物形成包合物。PQQ上的羧基與β_環糊精上的羥基能夠形成穩定的包合物，從而影響樣品的權均淌度，因此改善了分離。我們在不同緩沖體系(甘氨酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼砂緩沖液)中加入β環糊精，結果顯示，硼砂環糊精緩沖體系較好，與單純的硼砂相比，峰型有了很大的改善，能得到較尖銳的峰。( 3 )硼砂濃度的選擇緩沖液濃度是一個重要的指標，對選擇性的影響非常突出。我們分別用硼砂濃度5,10,15, 20mmol/L實驗，當濃度大于10mmol/L時,峰形嚴重不對稱,分離效果不佳。可能隨著濃度的增加，導電的離子數增加，毛細管的電流值增大，焦耳熱增加；而且隨著緩沖液濃度的增加，離子強度增加，電滲流速降低，溶質在毛細管內的遷移速度下降，遷移時間會延長。當濃度小于10mmol/L時,前沿拖尾較為嚴重。因此,我們選擇硼砂濃度為10mmol/L時最為合適。(4) pH值對遷移時間的影響緩沖液的pH值影響可解離分析物的有效電荷，決定其在電場中的遷移速度。同時它還影響Zeta電勢，通過pH值的選擇可有利調整電遷移和電滲的平衡，增加分離度。分別調pH3.0、5.0、7.0、8.0、9.0實驗，發現pH7.0以下，峰很寬，pH大于8.0峰較好。分別測定樣品在pH值為8.5,8.8,9.0,9.5、10.0的硼砂-β環糊精緩沖溶液中遷移時間，發現pH值對保留時間有明顯的變化，以PH值為橫坐標，保留時間為縱坐標，作圖1。如圖1看出，pH值對其保留時間有一定的影響，當pH大于9.0時，遷移時間增加，且峰形嚴重不對稱，故選擇pH小于9.0較為合適，綜合考慮，最終選擇pH為8.8。(5) β-環糊精濃度的影響環糊精的濃度直接影響它對分析物的包合， 因此，其濃度的選擇非常重要。我們改變β-環糊精的濃度，分別取5，10，12，15，20mmol/L實驗。當β-環糊精濃度高于20mmol/L時，分離效果欠佳，峰型不理想；當β -環糊精濃度為lOmmol/L時，峰形對稱性有很大的改善，但峰的前沿和拖尾現象始終存在，有待繼續優化，如圖2。(6)有機溶劑的影響為了進一步優化分離，我們考慮添加有機溶劑來改善分離。加入有機溶劑往往可以使包合常數K增大，在低濃度的β_環糊精下達到分離。我們分別采用乙腈、乙醇等多種有機溶劑實驗，考察其對樣品PQQ分離效果的影響。結果表明，各種有機溶劑的加入，對峰的拖尾并無多大的改善。(7)三氟乙酸的影響PQQ的結構式為弱酸 性，我們考慮是否可以添加三氟乙酸來改善峰的拖尾現象。我們在硼砂-β環糊精體系中，加入少量的三氟乙酸，并考察三氟乙酸濃度的影響，在緩沖體系中分別加入0.01%, 0.05%, 0.1%的三氟乙酸實驗。實驗結果證明，加入少量的三氟乙酸可以很好的改善峰形的拖尾現象，按濃度來看，選擇0.1%最為合適,能最有效的使峰形變得對稱，如圖3。(8)電壓的選擇溶質的出峰時間對電場強度非常敏感，電場強度會影響溶質在毛細管中的停留時間。被分析物與環糊精形成包合物后，若各組分平均遷移率相差較大，增加電場強度能提高分離度；反之，若平均遷移率相差較小，增加電場強度并不能有效改善分離。包合是一個快速可逆平衡過程，從動力學角度講，高溫不利于包合，在高電場強度下，由于焦耳熱的產生，徑向溫度梯度增加，使包合常數K減小，分離度降低，因此，一味增加電場強度并不是一個良策，通常需要有一個平衡。在緩沖液為lOmmol/L硼砂-10mmol/Li3-環糊精混合液，pH=8.8，含有0.1%的三氟乙酸時，考查樣品PQQ在10、15、20、22、25、27kV電壓下的分離情況，當電壓大于25kV時，分離時間縮短，分離度降低，且基線不穩定。電壓低于20kv時，分離時間較長，實驗中選擇25kV最為理想。(9)線性關系與檢測限測定精密稱取PQQl.0mg，加ImL磷酸緩沖液(pH7.0)，用運行緩沖液稀釋成濃度為
0.025,0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、1.0μ g/mL的標準溶液，每個樣品分別重復進樣3次，
得峰面積取平均值，以平均峰面積為縱坐標，PQQ濃度C為橫坐標作圖。得標準曲線(圖4)。所得回歸方程為:y=553571x+5686.8(R2=0.9996)。在 0.025 1.0 μ g/mL 濃度范圍內呈良好的線性關系。最低檢出濃度為0.05 0.1 μ M (S/N彡3)。(10)生物樣本中PQQ的檢測I) Fe3O4磁性納米粒子的制備:IOOmLl.25mM FeSO4.7Η2060Γ下攪拌，用 6Μ NaOH 調 pH 至 10，Ih 后磁性沉淀物分離，用去離子水沖洗。60°C真空干燥6h。2)改性的混合極性功能納米粒子Fe3O4-SiO2-Pheny1-C8的制備:將制備得到的Fe3O4磁性納米粒子加入到含ImM四甲氧基硅燒(98%, tetramethy1rthosi Iicate TM0S),ImM 苯基三甲氧基娃燒(97%, pheny ltrimethoxy si lane, PTMS)和 ImM 辛基三甲氧基娃燒(98%，octy ltrimethoxy si lane, C8)混合物中(1:1:1, v/v/v)，力口 5 OmL 含 0.01% 吐溫-100 (w/v)，
0.02%CTAB (w/v)，12.5% 甲醇(v/v)和 0.3mL25%(w/v)NH3 作催化劑，120°C攪拌回流 16h。用水、丙酮和正己烷依次清洗多次，60°C真空干燥6h。3)牛奶樣品去除蛋白1mL牛奶加5mL甲醇，潤旋振蕩2min,離心4000rpml0min,上清液用50mLMcIlvaine buffer緩沖液(0.1M檸檬酸調0.2M磷酸氫二鈉pH7.0)稀釋，以備磁性固相萃取。4)磁性固相萃取稱取上述制備好的50mg磁性功能納米材料于安普瓶中，分別用ImL的甲醇和水活化；加入上述牛奶處理后的溶液IOmL,渦旋萃取lmin,甲醇解吸3min。解吸液經氮氣吹干，用100 μ L磷酸緩沖液(ρΗ7.0)稀釋，進行毛細管電泳分析。如圖5。5)提取回收率與精密度測定稱取一定量的PQQ標準品適量，使其在牛奶中的濃度為20、60、100μ g/L，按上述方法進行處理、萃取，經毛細管電泳分析測定PQQ的濃度，測定值除以理論值得PQQ提取回收率。結果見表I。表I提取回收率測定
權利要求
1.一種磁性固相萃取-毛細管區帶電泳測定生物樣本中吡咯并喹呤醌含量的方法，其特征在于: (1)毛細管選擇及預處理: 選用未涂層的41.5cmX 50 μ m石英毛細管柱；新毛細管柱先依次用甲醇沖洗lOmin，蒸餾水沖洗5min，lmol/L NaOH溶液沖洗30min，蒸餾水沖洗5min，最后再用運行緩沖液沖洗10-15min ;每次進樣前,用蒸懼水及運行緩沖液沖洗2min ； 運行緩沖液及樣品溶液均用0.22 μ m微孔針頭過濾器過濾； (2)毛細管電泳分析條件: 檢測波長為249nm,進樣方式為0.5psi壓力進樣,進樣時間10.0秒,分離電壓為25kV,毛細管柱溫25 °C ； 運行緩沖液為:pH=8.8、10mmol/L硼砂-10mmol/L@ -環糊精-質量濃度0.1%三氟乙酸的混合液； (3)生物樣本中吡咯并喹呤醌PQQ的檢測 選用牛奶作為生物樣本的典型 ①Fe3O4磁性納米粒子的制備 IOOmLl.25mM FeSO4.7H2060°C下攪拌，用6M NaOH調pH至10，Ih后磁性沉淀物分離，用去離子水沖洗，60°C真空干燥6h，得Fe3O4磁性納米粒子； ②改性的混合磁性功能納米粒子Fe3O4-SiO2-Pheny1-C8的制備 將制備得到的Fe3O4磁性納米粒子加入到含ImM四甲氧基硅烷、ImM苯基三甲氧基硅烷和ImM辛基三甲氧基硅烷混合液中，四甲氧基硅烷:苯基三甲氧基硅烷:辛基三甲氧基硅烷體積比1: 1: 1，加50mL含w/v0.01%吐溫-100、w/v0.02%十六烷基三甲基溴化銨的v/vl2.5%甲醇和0.3mL w/v25%NH3作催化劑，120°C攪拌回流12 16h，用水、丙酮、正己烷依次清洗多次，60°C真空干燥6h，得磁性功能納米粒子Fe304-Si02-Phenyl-C8 ； ③牛奶樣品去除蛋白 1mT,牛奶加5mL甲醇，潤旋振蕩2min,4000rpm離心IOmin,上清液用50mL McIlvainebuffer緩沖液稀釋，以備磁性固相萃取； McIlvaine buffer緩沖液為:pH7.0,0.1M檸檬酸調0.2M磷酸氫二鈉溶液； ④磁性固相萃取 稱取上述制備好的50mg磁性功能納米粒子Fe3O4-SiO2-Pheny1-C8于安普瓶中，分別用ImL的甲醇及水活化；加入步驟③處理后的牛奶樣品溶液10mL，渦旋萃取lmin，甲醇解吸3min，解吸液經氮氣吹干，用pH7.0、100 μ L磷酸緩沖液稀釋，進行毛細管電泳分析。
全文摘要
磁性固相萃取-毛細管區帶電泳測定生物樣本中吡咯并喹呤醌含量的方法，屬于生命分析技術領域。本發明采用SiO2與不同極性的吸附劑混合組成，這些吸附劑對疏水性能不同的化合物具有不同的選擇性，從而能夠有效的進行分離。本方法采用的毛細管電泳法加入了修飾劑β-環糊精，首次在毛細管電泳緩沖體系中加入三氟乙酸，解決了毛細管電泳圖中峰的拖尾問題，峰的對稱性明顯好于文獻報道。本方法快速、簡便，首次應用磁固相萃取技術結合毛細管電泳測定牛奶中PQQ的含量。與文獻方法對比，分離效率提高了6倍。
文檔編號G01N27/447GK103196982SQ20131012113
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月9日 優先權日2013年4月9日
發明者周杏琴, 毛師師, 張建康, 曹國憲, 欽曉峰 申請人:江蘇省原子醫學研究所