一種檢測乙肝肝癌前病變標志物elisa試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測乙肝肝癌前病變標志物ELISA試劑盒，以及該試劑盒在快速檢測肝癌前病變的應用；該試劑盒是采用固相免疫試驗ELISA來檢測肝癌前病變抗體，在X基因陽性與陰性的HepG2細胞系中，通過抑制性cDNA差減雜交，克隆出異常表達的基因片段URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2，并選擇親水端序列，固相合成人工多肽，作為包被抗原，制成檢測乙肝肝癌前病變標志物的ELISA試劑盒；該試劑盒可有效對肝癌前病變進行檢測，方法特異，操作簡便，價格低廉，安全無創，可用簡便的血清學方法檢測。
【專利說明】—種檢測乙肝肝癌前病變標志物ELISA試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種ELISA試劑盒及應用，具體涉及一種檢測乙肝肝癌前病變標志物ELISA試劑盒及應用，屬于醫藥衛生領域。
【背景技術】
[0002]近年統計表明，我國原發性肝癌死亡率為20.40/10萬，占惡性腫瘤死亡率的次位，約占全世界肝癌死亡人數的45%。盡管我國肝癌的一級預防已采取了包括乙肝疫苗在內的多項措施，但其效果尚需等待幾十年。因此，肝癌的早期發現、早期診斷與早期治療的二級預防尤為重要。
[0003]我國從1971年開展甲胎蛋白(AFP)自然人群普查，但效果不理想。八十年代根據流行病學調查結果，對肝癌高危人群進行劃分，使肝癌普查轉為對高危對象普查。我國對肝癌流行因素的研究表明:危險因素為HBV感染與肝癌家族史，國外的流行病學調查也提示HBV是肝細胞癌(HCC)的發生的對立致病危險因素。
[0004]“上海肝癌高危人群監測 方案”對高危對象，每6個月作一次AFP與實時超聲檢查，結果說明可使無癥狀體征的小肝癌檢出率提高34倍，由此湯釗猷在國際上最早系統提出“亞臨床肝癌”的概念和理論，使肝癌的手術患者5年生存率達到61.3%。
[0005]但是“亞臨床肝癌”仍然是小肝癌，只是尚未出現臨床癥狀，而癌前病變是機體在多種致癌因素作用下，開始啟動癌變過程，如何診斷這一階段病變，尚未見報道。因而高危對象，癌前病變，臨床小肝癌，是疾病發展的不同過程。
[0006]AFP是第一個用于隨訪肝癌的腫瘤標志物，1956年首次被發現，1964年發現肝細胞癌患者血中可檢得AFP，直至六、七十年代反復驗證，AFP檢測在全世界普及，成為診斷肝癌的重要標志物，由于AFP檢測對肝癌診斷陽性率只有60%-80%，且AFP是肝腫瘤標志物，一旦AFP持續進行性升高，即為肝癌已形成，所以AFP不能作為肝癌前病變的診斷指標。
[0007]乙肝是肝癌的高危因素，其致癌機制主要定位在X基因上，其具有反式轉錄激活作用，能廣泛激活病毒和細胞啟動子的轉錄，因此可能干擾宿主細胞生化代謝，影響細胞基因的正常表達而誘發HCC。
[0008]早期肝癌病變檢出并不是對高危人群防治的最終目的，肝癌是一種進行性發展的疾病，即使是早期發現，如無有效的治療，患者仍難免因腫瘤的發展而死亡，因而早期防治，提聞生存率才是目的。
[0009]由于AFP檢測對肝癌診斷陽性率只有60-80%，且不能進行癌前病變診斷，使臨床二級預防不能進行癌前阻斷治療研究。采用對肝癌高危對象進行肝癌前相關抗體、AFP同時檢測，進一步分析兩者對早期肝癌診斷，尤其是肝癌前病變的診斷價值，試圖通過分析，使AFP的小肝癌的早期發現，提前到癌前病變階段，這樣為尋求盡早阻斷癌前病變提供時機。
【發明內容】
[0010]本發明的目的是提供一種檢測乙肝肝癌前病變標志物的ELISA試劑盒及應用，對高危病人血清用這種簡單ELISA方法，可以在肝癌發生數年或數月前，可檢測到一種或多種抗體的表達。一旦在慢性乙型肝炎患者中檢測到多個抗體，尤其是URGll和URG19出現，提示患者可能在數月或數年后發生肝癌，因而密切加強隨訪與監測(包括影像與組織學)，為更早期的干預提供了診斷依據；由于這種特異的ELISA方法，將可用于臨床肝癌前抗體診斷，可使血清AFP早期肝癌的診斷提前到癌前病變。
[0011] 為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案是:
一種檢測乙肝肝癌前病變標志物的ELISA試劑盒，該試劑盒是采用固相免疫試驗ELISA來檢測肝癌前病變抗體，在X基因陽性與陰性的HepG2細胞系中，通過抑制性cDNA差減雜交，克隆出異常表達的基因片段URG4、URG7、URGl1、URGl2、URG19和DRG2，并選擇親水端序列，固相合成人工多肽，作為包被抗原，制成檢測乙肝肝癌前病變標志物的ELISA試劑盒，URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2的基因序列見序列表；
一種檢測乙肝肝癌前病變標志物的ELISA試劑盒的建立方法，該建立方法包括下列步
驟:
(一)建立HBX和CAT的H印G2系
將HBX基因轉染到H印G2中，對照組用氯霉素乙酰轉移酶(CAT)轉染到H印G2，建立HepG2-X細胞和H印G2-CAT兩個細胞系，培養，傳代，觀察其表達。首先提取IfepG2-X和H印G2-CAT總RNA及mRNA，RT-PCR反轉錄建立cDAN文庫，用抑制性cDAN差減雜交，cDAN探針的克隆及測序。有8個cDAN探針從HepG2_X細胞中克隆出，有2個基因片段從H印G2-CAT細胞克隆出。H印G2-X細胞克隆出的8個片段，在對照組不表達，反映這些基因高表達(up-regulated)與X基因有關；而對照組克隆出的2個基因片段，在H印G2-X細胞中沒有克隆出，說明這些基因低表達(down-regulated)與X基因也有關。等量H印G2-X細胞和H印G2-CAT細胞于含有10%的胎牛血清中生長無差異；但在無血清培養液中，IfepG2-X生長要明顯快于H印G2-CAT細胞，在無血清培養液中，HBxAg可明顯促進H印G2細胞的生長；
(二)建立ELISAs檢測方法
我們從H印G2-X細胞和H印G2-CAT細胞系克隆出6個基因蛋白(URG4，URG7，URGlI,URGUdRGllDRGZXELISA檢測每一個基因蛋白相對應的抗體，稱之為肝癌前病變抗體。方法是采用固相組合成的人工多肽，序列選擇跨越親水區域。人工多肽由Thomas JeffersonUniversity分子生活實驗室合成，其序列如表1。多肽分別用載體蛋白鑰孔戚血蘭素(KLH，Sigma Chemical C0., St, Louis, MO)偶聯,配成一定濃度的人工多肽。
[0012]建立一定方法的ELISA。分實驗組與對照組，實驗組包被用人工多肽，對照組用PBS (Phosphate Buffered Saline)。檢測中還設立陽性對照與陰性對照，陽性對照是用專門的兔抗人工合成多肽血清，陰性血清是從公司購買。具體方法:首先將每個人工多月太(如表 I) IMg 加入 50KlPBS,包被在 96 孔平皿板(Immunolon 4, Thermo Lab Systems,Franklin, MA)孔中，放在4 °C冰箱孵化過夜,用PBS洗7次(用Nunc Immuno Wash 120),然后用含10%小牛血清(FSC)PBS封閉，再用PBS洗3次。加入待檢的血清50μ1 (用含小牛血清的PBS 1:10稀釋)后放入4°C冰箱過夜。再用PBS洗7次。辣根過氧化酶(5(^l/well，用1:100PBS/FCS稀釋,Cooper Biomedical, Malvern, PA)結合的羊抗人免疫球蛋白加入培養板中，在37°C C02培養箱中孵化lh，再用PBS洗7次，加入苯丙氨酸脫氨酶(0PD，AbbottLabs, North Chicago, IL)檢測，在酶標儀上,450nm光波自動讀數。[0013](三)特異性及放射免疫沉淀檢測
為檢測建立的ELISA方法的特異性，我們在ELISA實驗前將抗體陽性的血清與相關、或不相關的人工多肽混合在一起，然后加入預先包被的同樣人工多肽的培養液中，即在實驗前預先分別加入0、0.5、5、10、25Pg作為對照，以觀察混合不同濃度人工多肽的陽性血清標本與包被同樣人工多肽的結合情況，來分析其特異性。特異性抗體檢測結果顯示(圖1):預前抗體陽性的血清可與不同量的同源人工多肽結合，但不與不相關的人工多肽結合。雖然數據表示的是抗URG4(圖1A)和URGll (圖1B)，但是相同的數據在ELISA的URG7和URG12，以及URG19、DRG2中均可得到。由此證明我們建立的ELISA方法具有特異性(圖1C)。
[0014] 另外，將URG4，URG7，URG11，URG12，URG19，DRG2 全長 cDNA 分別被亞克隆到 pcDNA3。每個重組體在體外成線性轉錄，然后在兔網織紅細胞裂解物中翻譯(Promega, Madison,WI)，用35S蛋氨酸標記和35S半胱氨酸(Amersham, Piscataway, NJ)標記結合用放射自顯影SDS/PAGE檢測。在放射免疫沉淀反應時，將先前用ELISA方法檢測到陽性與陰性血清5μ1與放射標記(5Χ IO4計數/分鐘)體外翻譯蛋白一起放在37°C孵化Ih,然后與2μ1 Sepharose4B-Protien G beads(P HARMACIA, Piscataway, NJ)之余冰上 15min,在網織紅細胞裂解物抗體緩沖液(100mmol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris-HCl (ΡΗ8.0)，1%NP40)洗 3 次，然后用 SDS/PAGE(12%膠)電泳，進行放射自顯影。放射免疫沉淀反應結果顯示在ELISAs中是陽性的標本，在免疫沉淀中也顯示為陽性，反之，則為陰性。另外在沒有人血清的情況下，Sepharose4B-Protien G beads不結合任何體外放射蛋白，提示沒有非特異性結合。
[0015](四)慢性HBV感染患者乙肝相關的肝癌前抗體檢測的應用
患者與分組:所有檢測的血清標本皆來自于中國深圳的居民與美國東岸的韓國移民，共730人。其中深圳居民305人，韓國移民425人；男性496人，女性234人，年齡20~65歲。
[0016]分為6組(表2)。組1，HBsAg陰性(或ant1-HBs陽性)、丙氨酸轉氨酶(ALT)正常者，共416例(韓國316例，深圳100例);組2，HBsAg陽性、ALT正常者(即乙肝病毒攜帶者)，共52例(韓國21例，深圳31例);組3，HBsAg陽性、ALTM0U/L者(即慢性乙型肝炎)，共139例(韓國40例，深圳99例)-M 4，乙肝肝硬化者71例(韓國28例，深圳43例);組5，藥物肝炎或其它肝炎(排出HCV)，共16例，皆是深圳居民；組6，為HCC患者(不包括HCV陽性)，共36例(韓國20例，深圳16例)。還設有HCV所致HCC、其他腫瘤(胸部腫瘤、結腸腫瘤、頭頸部腫瘤、前列腺腫瘤--)、希臘、冰島血清(--)作為對照組。所有的診斷有血生化和CT、核共振(MRI)依據，這些病人在年齡、種族、性別方面分布是一致(P>0.05)。
[0017]在檢測前所有的標本儲存在_80°C，所有的標本按編號排列，按盲法，檢測者不知道標本的有關信息。
[0018]統計學處理:采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析。對不同組6個肝癌前抗體檢測，不同組肝癌前抗體數目的陽性率用X2檢驗，對不同數目抗體患者的存活時間均差，以及對肝癌組與肝硬化再生或不良結節組患者抗體數的均差進行方差檢驗，而對所檢測到的6種不同的肝癌前抗體數目陽性率用X2檢驗。
[0019]應有結果=ELISA檢測不同患者血清肝癌病變前標志物抗體情況。6組患者及對照組血清肝癌前6個抗體檢測結果:在36例肝癌患者有29例(80%)，71例肝硬化患者有46例(65%)，139例慢性肝炎患者有62例(45%)，檢測到血清肝癌病變前標志物抗體陽性，而在416例正常人群與52例乙肝病毒攜帶者分別是62例、12例(15%，35%)。用卡方檢驗各組抗體陽性發生率，與HBsAg (_)組相比，乙肝病毒攜帶者組、其他肝炎、其他腫瘤對照皆無統計學意義，而乙型肝炎、肝硬化、肝癌組皆在統計學意義，且顯著性也隨肝炎-肝硬化-肝癌變化而升高。冰島是全球HBV感染率最低的國家，檢測結果也說明這點。HBsAg (_)組中，有20例(15+5)出現2個以上抗體陽性，此可能存在交叉反應。
[0020]比較冰島與中國、韓國的正常人群，冰島正常人能檢測到HCC相關抗體為0.64%(1/156)，而中國與韓國分別是 12% (12/100，P=0.001)與 16% (50/316，P=0.0000)。比較歐洲與亞洲，HBV攜帶者、乙肝肝炎患者、希臘人檢測到抗體的有7% (4/56)，而在中國和韓國為40% (74/191，P=0.000);但是，乙肝肝硬化與HCC患者檢測出抗體陽性率韓國是79%(38/48)，中國是63% (37/59)，希臘是57% (13/23)，沒有統計學意義。由此可見，抗體陽性率，在低危人群中，差異可能與HBV感染率以及垂直感染有關，但在高危患者中，與不同的國家，地區，人種無差異。
[0021]所述的試劑盒在檢測乙肝肝癌前病變標志物的應用。
[0022]本發明相對于現有技術的有益效果是:在慢性乙型肝炎自然史，雖然多出現于肝硬化后期，但肝癌可發生慢性乙型肝炎自然史的任何階段，而AFP的持續升高，即為肝癌已形成，所以AFP不能作為肝癌前病變的診斷指標。對高危病人血清用這種簡單ELISA方法，可以在肝癌發生數年或數月前，可檢測到一種或多種抗體的表達。一旦在慢性乙型肝炎患者中檢測到多個抗體，尤其是URGll和URG19出現，提示患者可能在數月或數年后發生肝癌，因而密切加強隨訪與監測(包括影像與組織學)，為更早期的干預提供了診斷依據。
[0023]由于這種特異的ELISA方法，將可用于臨床肝癌前抗體診斷，可使血清AFP早期肝癌的診斷提前到癌前病變。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為ELISAs的特異性與免疫沉淀反應圖，圖中，橫坐標是指4個不同的病人，1A，是抗URG4檢測;1B，是抗URGll的檢測；每例加入0、0.5、5、10、25ug，以及對照25ug人工多肽，縱坐標是所見酶標儀上450nm光波的讀數。1C，是35S標記在體外翻譯URG7 (Mr:10，700 ;泳道 I 和 2),URG (Mr:10，400 ;泳道 3 和 4)、URG12(Mr:14, 300 ;泳道 5 和 6)、DRG2(Mr:13, 300 ;泳道 7 和 8),URGll (Mr:68，000 ;泳道 9 和 10)、URG19 (Mr:170,000 ;泳道 11和12)。放射免疫沉淀法與ELISAs檢測的結果是一致，即人血清陽性標本(泳道1、3、5、7、9、11)，和人血清陰性標本(泳道2、4、6、8、10、12)。A，吸光度。
【具體實施方式】
[0025]下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，并不限制本發明的范圍。
[0026]實施例1
A patient #10
MonthsO257162350 expired
HCC Dx* m0.56
TxTACE
【權利要求】
1.一種檢測乙肝肝癌前病變標志物的ELISA試劑盒，其特征在于:該試劑盒是采用固相免疫試驗ELISA來檢測肝癌前病變抗體，在X基因陽性與陰性的H印G2細胞系中，通過抑制性cDNA差減雜交，克隆出異常表達的基因片段^64川1^7川1?11川1?12川1?19和DRG2，并選擇親水端序列，固相合成人工多肽，作為包被抗原，制成檢測乙肝肝癌前病變標志物的ELISA試劑盒，URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2的基因序列見序列表。
2.一種檢測乙肝肝癌前病變標志物的ELISA試劑盒的建立方法，其特征在于:該試劑盒的建立方法包括下列步驟: (一)建立HBX和CAT的H印G2系 將HBX基因轉染到HepG2中，對照組用氯霉素乙酰轉移酶CAT轉染到H印G2，建立HepG2-X細胞和H印G2-CAT兩個細胞系，培養，傳代，觀察其表達；首先提取H印G 2-X和HepG 2-CAT總RNA及mRN A，RT-P C R反轉錄建立c DNA文庫，用抑制性c DNA差減雜交，c D N A探針的克隆及測序； (二)建立ELISAs檢測方法 從H印G2-X細胞和H印G2-CAT細胞系克隆出6個基因蛋白:URG4、URG7、URGl 1、URG12、URG19和DRG2，ELISA檢測每一個基因蛋白相對應的抗體，稱之為肝癌前病變抗體；方法是采用固相合成的人工多肽，序列選擇跨越親水區域，人工多肽由分子生物實驗室合成，多肽分別用載體蛋白鑰孔戚血蘭素偶連，配成一定濃度的人工多肽； 建立一定方法的ELISA:分實驗組與對照組，實驗組包被用人工多肽，對照組用PBS:Phosphate Buffered Saline,檢測中設立陽性對照與陰性對照，陽性對照是用專門的兔抗人工合成多肽血清，陰性血清是從公司購買； (三)特異性及放射免疫沉淀檢測 為檢測建立的ELISA方法的特異性，在ELISA實驗前將抗體陽性的血清與相關、或不相關的人工多肽混合在一起，然后加入預先包被的同樣人工多肽的培養液中，以觀察混合不同濃度人工多肽的陽性血清標本與包被同樣人工多肽的結合情況，來分析其特異性； 將 URG4、URG7、URGl1、URG12、URG19 和 DRG2 全長 cDNA 分別被亞克隆到 pcDNA3 ;每個重組體在體外成線性轉錄，然后在兔網織紅細胞裂解物中翻譯，用35S蛋氨酸標記和35S半胱氨酸標記結合用放射自顯影SDS/PAGE檢測。
3.—種檢測乙肝肝癌前病變標志物ELISA試劑盒的應用，其特征在于:所述的試劑盒在檢測乙肝肝癌前病變標志物的應用。
【文檔編號】G01N33/574GK103543265SQ201310111583
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年4月2日 優先權日:2013年4月2日
【發明者】童光東, 周大喬 申請人:深圳市中醫院