專利名稱：煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法
技術領域：
本發明屬于煙草中農藥殘留的檢測領域，具體涉及為煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法。
背景技術：
天然化合物蛇床子素(osthol)，是從蛇床、歐前胡等傳統中草藥中提取的香豆素類化合物，化學名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是由江蘇省農業科學院聯合蘇科農化有限責任公司在21世紀初研發的殺菌、殺蟲劑。主要用于防治蔬菜中各種白粉病、霜霉病、小菜蛾、菜青蟲、蚜蟲等常年危害嚴重的病蟲害，具有高活性、微毒性、低殘留等特點。隨著這一產品在煙草上的大好使用前景，建立快速、準確的測定煙草中蛇床子素的分析方法十分必要。目前關于蛇床子素化合物的分析方法報道較多，但主要為中藥的常規質量控制及生物試樣的檢測，對其在農產品上的殘留分析方法研究較少，只有陳浩等采用高效液相色譜-紫外檢測器法對土壤和黃瓜中蛇床子素的殘留進行了研究。有關蛇床子素的主要檢測方法有液相色譜-紫外檢測器法、氣相色譜-火焰離子化檢測器法、氣相色譜-質譜聯用法。由于蛇床子素結構的共軛雙鍵較多，最大吸收波長達到322 nm，在該波長下分析檢測，干擾成分相對較少，靈敏度較高，使得高效液相色譜-紫外檢測器法是檢測蛇床子素的主流方法。本發明提供了一種用甲醇水溶液提取，通過液液萃取和固相萃取凈化后，高效液相色譜-紫外檢測器法檢測煙葉中的生物源新農藥-蛇床子素的測定方法，具有良好的檢測效果。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種用甲醇水溶液提取，通過液液萃取和固相萃取凈化后，高效液相色譜-紫外檢測器法檢測煙葉中的生物源新農藥-蛇床子素的測定方法，首次建立了生物源新農藥-蛇床子素在煙葉中的殘留檢測方法，本方法具有操作簡便，提取效率高；所建立的色譜檢測方法線性范圍寬，重復性好，檢測限低等優點。本發明采用的技術方案:
本發明煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，包括以下步驟:
(1)稱取研磨的鮮煙葉，用甲醇水溶液超聲提取后抽濾，用二氯甲烷萃取，合并濃縮；
(2)濃縮液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟羅里硅土固相萃取柱凈化；
(3)用高效液相色譜儀測定煙葉中的蛇床子素殘留量。所述的甲醇水溶液為甲醇與水的體積比為1:1。所述的濃縮液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟羅里硅土固相萃取柱凈化具體步驟為:將N-丙基乙二胺固相萃取柱用二氯甲烷預處理活化后，將濃縮液轉移至柱中，用二氯甲烷洗脫分析物，將洗脫液在40 °C下濃縮至近干，氮氣吹干，再將殘留物用正己烷溶解后轉移至用正己烷活化的氟羅里硅土固相萃取柱中，加入正己烷淋洗萃取柱，棄去淋洗液后用正己烷與丙酮的混合溶液對分析物進行洗脫，收集洗脫液后氮氣吹干，用體積比為1:1的甲醇水溶液溶解，過0.45 um微孔有機濾膜。正己烷與丙酮的混合溶液為丙酮與正己烷體積比為6:4。高效液相色譜儀的檢測器為紫外二極管陣列檢測器。高效液相色譜儀的色譜條件為:Zorbax SB-C18色譜柱；柱溫25°C ;流速I mL/min;進樣量:20 u L ;檢測波長:322 nm，參比波長為400 nm ;流動相為A=甲醇，B=水；時間程序:開始50%B到10 min時減少至20% B，并保持到15 min,到17 min時又升至50%B，并保持到18 min結束。本發明達到的有益效果:
(I)首次建立蛇床子素在煙葉中的殘留檢測方法
相對于現有的檢測方法，該方法更合適分析復雜基質中蛇床子素中的含量，本發明用甲醇水溶液提取，通過液液萃取和固相萃取凈化后獲得雜質含量較少的提取成分，用高效液相色譜-紫外檢測器檢測具有較簡單的色譜圖。(2)檢測靈敏度高，線性范圍寬
紫外檢測器采用波長較長的參比波長(400 nm)進行比對，提高了蛇床子素在紫外檢測器上的靈敏度，降低了檢測限。將一定濃度的標準品添加(0.05 mg/kg)到樣品中，經過前處理和上機檢測分析，以S/N=3.14計算檢測限(L0D)，檢測限為0.016 mg/kg ；
將濃度梯度為 0.25 ug/mL, 0.5 ug/mL, 1.0 ug/mL, 5.0 ug/mL 和 10.0 ug/mL 用高效液相色譜-紫外檢測器分析，以濃度為橫坐標，峰面積響應值為縱坐標，進行線性回歸，蛇床子素的回歸方程為 Y=40.4827X-0.8418，R2=0.9998，表明線性關系較好，說明該方法具有檢測靈敏度高，線性范圍寬的優點。(3)回收率高，精密度好
蛇床子素在鮮煙葉中的回收率在92.7%-96.7%之間，日內變異系數為3.4%_5.1%，日間變異系數3.2%-6.4%，說明該方法回收率高，精密度好。
:附圖1為0.5 U g/mL蛇床子素標準溶液和煙草空白樣品添加0.1 mg/kg蛇床子素的色譜圖。
具體實施例方式實施例1
稱取研磨的鮮煙葉10 g于250 mL錐形瓶中，加入體積比為1:1 (V/V)的甲醇水溶液60 mL，混勻后，室溫超聲提取15 min，經鋪有Celite 545的砂芯漏斗快速抽濾，殘渣再用20 mL提取液洗滌，將濾液轉移至250 mL的分液濾斗中，加入10 mL飽和食鹽水后，依次用50 mL、30 mL、20 mL 二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷過裝有無水硫酸鈉和脫脂棉的三角漏斗，于40 1:下濃縮至2 mL。將N-丙基乙二胺萃取柱(型號:Cleanert PSA 500MG，3ML)用5mL 二氯甲烷預處理活化后，將2 mL殘留物轉移至柱中，再用4 mL 二氯甲烷洗脫分析物，將6 mL洗脫液在40 °C下濃縮近干，氮氣吹干。將殘留物用2 mL正己烷溶解，將溶解物轉移至用5 mL正己烷活化的氟羅里硅土固相萃取柱中(型號:B0ND ELUT-FL 500MG，3ML)，再加A 6 mL正己燒淋洗雜質,最后用體積比為4:6 (V/V)的正己燒:丙酮10 mL對分析物進行洗脫，收集洗脫液后氮氣吹干，用I mL 1:1 (V/V)的甲醇水溶液溶解，過0.45 Pm微孔有機濾膜，將其轉移至2 mL色譜瓶中，待高效液相色譜儀檢測。高效液相色譜儀的檢測器為紫外二極管陣列檢測器。高效液相色譜儀的色譜條件:Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mmX 150 mm, 5 u m )；柱溫25°C ;流速I mL /min;進樣量20 U L ;檢測波長:322 nm，參比波長為400 nm ;流動相為A=甲醇，B=水；時間程序:開始時50%B到10 min時減少至20% B，并保持到15 min,到17 min時又升至50% B，并保持到18 min結束。在該色譜條件下，蛇床子素的保留時間為 12.05 min。實施例2
蛇床子素標準品用甲醇配制，濃度為200 U g/mL的儲存標準溶液。工作標準溶液用甲醇把儲存標準溶液稀釋為相應的濃度。即配制成不同濃度的蛇床子素標準溶液，標準溶液的濃度梯度為:0.25 ug/mL, 0.5 ug/mL, 1.0 ug/mL, 5.0 ug/mL 和 10.0 ug/mL。將蛇床子素標準品以0.05 mg/kg的濃度添加到樣品中，經過前處理和上機檢測分析，以S/N=3.14計算檢測限(LOD)，檢測限為0.016 mg/kg ；
將濃度梯度為 0.25 ug/mL, 0.5 ug/mL, 1.0 ug/mL, 5.0 ug/mL 和 10.0 ug/mL 用高效液相色譜-紫外檢測器分析，以濃度為橫坐標，峰面積響應值為縱坐標，進行線性回歸，蛇床子素的回歸方程為Y=40.4827X-0.8418，R2=0.9998，表明線性關系較好，說明該方法具有檢測靈敏度高，線性范圍寬的優點。實施例3
在新鮮煙葉中加入三個濃度梯度的蛇床子素標準溶液，放入4 C左右冰箱中靜置過夜，然后進行前處理，再用高效液相色譜檢測分析。并按照添加量和測定值計算其添加回收率。結果見表I，從表I可以看出，按照0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg進行添加時,蛇床子素的平均添加回收率在92.7%-96.7%范圍內，日內相對標準偏差為3.4%_5.1%，日間相對標準偏差為3.2%-6.4%，說明本方法回收率高，精密度較好。0.5 y g/mL蛇床子素標準溶液和煙草空白樣品添加0.1 mg/kg蛇床子素的色譜圖見附圖1所示。
權利要求
1.煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)稱取研磨的鮮煙葉，用甲醇水溶液超聲提取后抽濾，用二氯甲烷萃取，合并濃縮； (2)濃縮液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟羅里硅土固相萃取柱凈化； (3)用高效液相色譜儀測定煙葉中的蛇床子素殘留量。
2.根據權利要求1所述的煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，其特征在于:所述的甲醇水溶液為甲醇與水的體積比為1:1。
3.根據權利要求1所述的煙葉中蛇床子素農藥殘留量的測定方法，其特征在于:所述的濃縮液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟羅里硅土固相萃取柱凈化具體步驟為:將N-丙基乙二胺固相萃取柱用二氯甲烷預處理活化后，將濃縮液轉移至柱中，用二氯甲烷洗脫分析物，將洗脫液在40 °C下濃縮至近干，氮氣吹干，再將殘留物用正己烷溶解后轉移至用正己烷活化的氟羅里硅土固相萃取柱中，加入正己烷淋洗萃取柱，棄去淋洗液后用正己烷與丙酮的混合溶液對分析物進行洗脫，收集洗脫液后氮氣吹干，用體積比為1:1的甲醇水溶液溶解，過0.45 um微孔有機濾膜。
4.根據權利要求3所述的煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，其特征在于:所述的正己烷與丙酮的混合溶液為丙酮與正己烷體積比為6:4。
5.根據權利要求1所述的煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，其特征在于:所述高效液相色譜儀的檢測器為紫外二極管陣列檢測器。
6.根據權利要求5所述的煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，其特征在于:所述高效液相色譜儀的色譜條件為:Zorbax SB-C18色譜柱；柱溫25°C ;流速I mL /min;進樣量:20 V- L ;檢測波長:322 nm,參比波長為400 nm ;流動相為A=甲醇,B=水；時間程序:開始50%B到10 min時減少至20% B，并保持到15 min,到17 min時又升至50% B，并保持到.18 min結束。
全文摘要
本發明公開了一種煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，包括以下步驟稱取研磨的煙葉用甲醇水溶液超聲提取，液液萃取后得到濾液，用N-丙基乙二胺和氟羅里硅土固相萃取柱凈化，再用高效液相色譜儀-紫外檢測器測定鮮煙葉中蛇床子素殘留量的方法，本發明首次建立蛇床子素在鮮煙葉的殘留檢測方法，具有前處理簡單和干擾較少的優點，還具有線性范圍寬、重復性好和檢測限低等優點。
文檔編號G01N30/88GK103163271SQ201310106689
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月29日 優先權日2013年3月29日
發明者蔡凱, 陳興江, 雷波, 向章敏, 潘文杰, 耿召良, 趙會納, 任竹 申請人:貴州省煙草科學研究院