專利名稱：一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種致病菌的快速檢測方，尤其涉及一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法。
背景技術：
基本原理:單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過共價鍵結合，這種結合不會改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結合。Fe-Ni合金材料具有鐵磁性，當粒子直徑小到一定程度會出現順磁特性。即沒有外加磁場時沒有磁性，而在有外加磁場時表現出一定的磁性，可以用于磁分離。同時，順磁性物質對核磁共振信號的影響十分顯著，微量的順磁性物質就會使核磁共振信號表現出變化。因此可以構建順磁性的特異性Fe-Ni合金納米探針生物傳感器，從磁共振的角度來做檢測。其主要的原理步驟:1.在樣品中加入檢測目標菌的第I抗體，若樣品中存在目標菌，則通過抗體抗原的結合形成I抗復合物，此時I抗起信號放大作用。2.從市場上購買順磁納米Fe-Ni合金材料,也可以通過其他方法制備納米級的Fe-Ni合金。使用娃燒偶聯齊U，其通式為:Y(CH2)nSiX3。此處，η為0-3 ;X為可水解的基團；￥為有機官能團。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，這些基團水解時即生成硅醇(Si (OH) 3)，而與無機物質結合，形成娃氧燒。Y是乙稀基、氣基、環氧基、甲基丙稀酸氧基、疏基。這些反應基團可與有機物質反應而結合。因此，通過使用硅烷偶聯劑，可在無機物質和有機物質的界面之間架起“分子橋”，把兩種性質懸殊的材料連接在一起提高復合材料的性能和增加粘接強度的作用。通過修飾抗體可實現表面功能化，形成特異性免疫探針，再封閉多余的活性位點。由于納米Fe-Ni合金探針具有順磁特性，因此，可以通過外加磁場分離沒有聯上的抗體。納米Fe-Ni合金材料修飾的 是第I抗體的抗體，即2抗。3.將目標菌特異性第I抗體采用一定的方法固定在固相載體表面，并將多余活性位點封閉備用。4.在第I步處理過的樣品，力口入第2步制得的順磁納米Fe-Ni合金探針，充分混合震蕩反應一段時間，抓取目標菌后施加外加磁場，由于納米Fe-Ni合金具有順磁特性，Fe-Ni合金探針會聚集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出探針。若待檢樣本中有目標菌，則首先會在第I步時與I抗形成I抗復合物，I抗復合物會再與探針表面的2抗復合，通過外加磁場而被富集、分離。洗滌、磁分離后加少量無菌的去離子水則形成目標菌的順磁納米Fe-Ni合金探針懸濁液。此時，抓到目標菌和未抓到目標菌的過量探針還是混在一起。5.將上述混在一起的探針,加到第3步的固相載體表面，則抓取了目標菌的探針將與固相載體表面單克隆抗體發生特異性結合，形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗可以將未發生結合的探針洗脫。6.再采用洗脫劑將固定載體上的結合的特異性納米免疫探針洗下來，用磁分離的方法清洗掉離子、溶劑。此部分探針如果存在，就是抓取了目標菌的探針。由于Fe-Ni合金具有順磁特性，對于共振儀器非常敏感，相對于其他分子而言，微量的Fe-Ni合金能夠大幅降低無菌的去離子水的自旋-晶格馳豫參數Tl和自旋-自旋弛豫時間T2，而無菌的去離子水在一定的均勻場強下，T1/T2是固定的。將洗脫液置于核磁共振儀中，與無菌的去離子水對照組進行對照。顯著發生Tl/T2值降低的說明有探針存在，從而間接說明食品樣品中有致病菌檢出。探針含量與T1/T2值降低呈正比。通過加標，可以定量檢測目標菌。該方法中Fe-Ni合金探針既是分離富集的手段，同時Fe-Ni合金具有的順磁特性，又可作為定量檢測的探針。該方法的主要優點就是快速、靈敏度高。相對于致病菌的微生物培養2-3天甚至幾天的時間。此方法主要取決于樣品的預處理時間，核磁共振檢測只需幾分鐘。所有的食品標準，致病菌都不得檢出。因此，用該方法可做大規模待檢樣本的陽性篩選，一定程度上可以定量檢測。目前，國內外還沒有文獻報道這種方法。
發明內容
一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，用于對各種不同的食品樣品進行評價。該方法是一種客觀有效的檢出食品中有害致病菌的方法，從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的篩選時間。一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，利用核磁共振儀對順磁物質的響應敏感性，提出核磁共振弛豫參數變化與Fe-Ni合金納米粒子順磁免疫探針含量的相關性指標。不同的致病菌檢出下限不同。該方法依賴于建立的可用于食品樣品中有害致病菌特異性順磁納米Fe-Ni合金探針富集、分離，從核磁共振弛豫信號參數變化的角度，檢測出樣品中的有害致病菌。采用偶聯了特異性單克隆抗體的順磁納米Fe-Ni合金探針，可以將樣品中的特異性致病菌進行富集。由于核磁共振儀自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率對Fe-Ni合金納米粒子非常敏感，即在去離子水中，存在微量的順磁Fe-Ni合金納米粒子，則水的自旋-晶格弛豫時間(Tl)和/自旋-自旋弛豫(T2)就會顯著下降。在一定條件下，順磁免疫探針的順磁特性使核磁共振的弛豫衰減信號T2/T1產生線性減小。通過定量檢測出樣品中的免疫探針含量，從而可以間接定量出食品樣品中的有害致病菌含量。檢測出的致病菌含量與探針含量線性相關，擬合度較好。最終以順磁免疫探針與致病菌間的對應關系為紐帶，確定食品樣本中的致病菌菌落數。而所有的食品標準，致病菌均不得檢出。因此，該方法可做大規模待檢樣本的陽性篩選，一定程度上可以定量檢測。本發明是這樣實現的，步驟如下:
I)在樣品中加入檢測目標菌的第I抗體，若樣品中存在目標菌，則通過抗體抗原的結合形成I抗復合物。2)檢測目標菌的第I抗體的抗體，即2抗包被順磁納米Fe-Ni合金探針的制備；。3)將目標菌特異性第I抗體在固相載體上的固定備用。4)富集目標菌株，并分離:在第I步處理過的樣品，加入第2步制得的順磁納米Fe-Ni合金探針，充分混合震蕩反應一段時間，抓取目標菌后施加外加磁場，由于納米Fe-Ni合金的順磁特性，則Fe-Ni合金探針就匯集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出探針。若待檢樣本中有目標菌，則首先會在第I步時與I抗形成I抗復合物，I抗復合物會再與探針表面的2抗復合，通過外加磁場而被富集、分離。洗滌、磁分離后加少量無菌的去離子水則形成目標菌的順磁納米Fe-Ni合金探針懸濁液。此時，抓到目標菌和未抓到目標菌的過量探針還是混在一起。5)將富集的探針懸濁液加到第3步制作的固定了單克隆抗體的固相載體上，若存在目標菌則形成雙抗夾心；用無菌的去離子水清洗，則沒有抓取到目標菌的探針就被洗掉，若不存在目標菌，則所有探針都被洗掉。6)之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的探針洗下來，用外加磁場分離探針的方法用無菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在探針就是抓到目標菌的探針。這部分探針，加入無菌的去離子水形成探針的懸濁液，進行核磁共振的弛豫時間測定，以無菌的去離子水為空白，測得的懸濁液的弛豫時間T1/T2相比無菌的去離子水有顯著降低，則說明含有探針，從而間接證明樣本中有目標致病菌，探針的量與T1/T2的下降呈正比，可以通過定量探針在一定程度上間接定量出目標菌的量。所述NMR探針為具有順磁特性的納米級Fe-Ni合金材料，納米粒徑小于1000納米。所述的目標菌的最終檢出評價方法基于核磁共振技術的弛豫時間特性參數的變化。所述弛豫時間特性，是指自旋-晶格弛豫時間(Tl)和自旋-自旋弛豫時間(T2)。所述弛豫時間特性，Tl采用180° -τ-90°脈沖方法測定，Τ2采用CPMG序列方法測定。所述的I抗為檢測目標菌的特異性抗體，最好是單抗。2抗為第I抗體的抗體。本發明的有益效果:本發明提供一種客觀的快速檢測出食品中的有害致病菌的方法，其特征是依賴于建立的可用于檢測順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的核磁共振檢測方法。該方法可以客觀有效地對食品中有害致病菌進行檢測，相比于致病菌的生物培養確認，該方法具有快速檢測的優勢，可以用于大規模樣本的快速篩選。
具體實施例方式實例I
檢驗食品樣本中測定其是否含有有害致病菌——單增李斯特菌。1.納米Fe-Ni合金免疫探針制備:第I抗體采用單增李斯特菌的兔抗IgG單克隆抗體，2抗為單增李斯特菌的羊抗兔IgG。Fe-Ni合金納米粒子可以從市場上購買。比如北京德科島金科技股份有限公司或上海超威納米材料公司，20nm,比例1:1，各自純度99.5%。二氧化硅包被納米Fe-Ni合金:取47.5g硅酸鈉，用去離子水溶解于燒杯中，用鹽酸調節pH值為12-13。取5.0g納米Fe-Ni合金加入到此燒杯中，機械攪拌(用玻璃棒)5min。將混合液超聲30min，適時攪拌。升溫到85°C，逐滴加入鹽酸調節pH值6_7，生成沉淀。邊磁分離邊用去離子水洗滌沉淀，洗滌3-4次。然后，將沉淀分散于250mL甲醇中。以上過程重復三次，保證硅依附在Fe-Ni合金上。胺基硅烷化Fe-Ni合金納米材料:將制得的二氧化硅包被的納米Fe-Ni合金加入到25mL甲醇中，用ImLH2O和甲醇稀釋到150mL。然后加入150mL甘油混合。超聲30min，轉移到有攪拌裝置的500mL三口燒瓶中。加入IOmL氨基硅烷偶聯劑(AEAPS)，在80-90 V下快速攪拌3h后，轉移出產物。產物用去離子水洗滌3次，甲醇洗滌2次(用布氏漏斗抽濾)。真空干燥。需要注意的是，抽濾由于有甘油，所以比較慢，抽一段時間后可適時用吸管吸去上層液體，抽濾過程約需6-8h。最后將得到的胺基硅烷化Fe-Ni合金納米材料真空干燥 12h。抗體修飾:取一定量氨基化Fe-Ni合金納米粒子,加入過量的單增李斯特菌的羊抗兔IgG抗體，26 °C孵育、洗滌后，加過量1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，封閉表面活性空位，洗漆、重懸浮。因納米Fe-Ni合金具有順磁特性,外加磁場分離,納米Fe-Ni合金就會匯集到磁場一邊，吸走上清液，洗滌，則將多余的抗體、BSA洗去。制備的順磁納米免疫探針保存在4 C待用。2.單克隆抗體固定:可以采用常規的酶標板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5X5mm2正方形,鍍膜機先噴一層Cr (2 - 4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亞胺-丙酸酯(DSP)對納米金進行修飾(DMS0, 二甲基亞砜稀釋DSP)。加入單增李斯特菌第一抗體，兔抗IgG單克隆抗體，即將100μ L100 μ g/mL單克隆抗體通過共價偶聯法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，I小時，將板上剩余的活性位點進行封閉并干燥。3.將食品樣本進行預處理，必要時采用FDA增菌法，對樣品進行過濾、增菌活化等預處理，得到待檢樣本。將待檢樣本中加入第I抗體，單增李斯特菌的兔抗IgG。若待檢樣本中存在單增李斯特菌，將與I抗形成I抗復合物。將第I步制得的第2抗體單增李斯特菌的羊抗兔IgG探針加入后進行充分震蕩。上磁力架分離探針，加少量無菌的去離子水得到探針的懸濁液。此時，如果待檢樣本中有目標單增李斯特菌，則通過第2抗體與第I抗體的相互作用，從而捕獲該 復合物，達到了目標菌富集的目的。此時，結合了目標菌的I抗復合物和沒有結合目標菌的過量I抗都會與探針表面的2抗結合，還是混在一起。將此富集的探針懸濁液加到第2步所制備的I抗固定板上，則探針懸濁液中結合了單增李斯特菌的探針會進一步與固定板上的單克隆抗體發生特異性結合，形成雙抗夾心結構。此時用無菌的去離子水清洗，就可以將沒有結合單增李斯特菌的探針洗去。在固定板上剩下的就只有結合了單增李斯特菌的探針。
4.用洗脫液(甲醇等)將固定板上的結合了單增李斯特菌的探針洗脫下來。上磁力架，分離探針并清洗1-2次，將離子洗去。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司)測定溶液的Tl和T2。以無菌的去離子水為空白，溶液測得的T1/T2與空白相比較，有顯著差異，說明溶液中有探針存在，從而說明樣本中有單增李斯特菌。探針的量與T1/T2的下降值呈正比。下降的越多說明探針越多，從而間接說明單增李斯特菌越多，通過加標驗證可以定量檢測樣本中目標菌的數目。所有食品標準均不得檢出單增李斯特菌，此方法可以快速檢測出樣品中是否含有單增李斯特菌。
具體實施例方式實例2測定食品樣品是否含有有害致病菌——大腸桿菌0157:H7。1.納米Fe-Ni合金免疫探針制備:I抗采用0157:H7的兔抗IgG單克隆抗體，2抗為0157:H7的羊抗兔IgG，可以是單抗也可以是多抗。Fe-Ni合金納米粒子可以從市場上購買。比如北京德科島金科技股份有限公司或上海超威納米材料公司，20nm，比例1: 1，各自純度 99.5%。二氧化硅包被納米Fe-Ni合金:取47.5g硅酸鈉，用去離子水溶解于燒杯中，用鹽酸調節pH值為12-13。取5.0g納米Fe-Ni合金加入到此燒杯中，機械攪拌(用玻璃棒)5min。將混合液超聲30min，適時攪拌。升溫到85°C，逐滴加入鹽酸調節pH值6_7，生成沉淀。邊磁分離邊用去離子水洗滌沉淀，洗滌3-4次。然后，將沉淀分散于250mL甲醇中。以上過程重復三次，保證硅依附在Fe-Ni合金上。胺基硅烷化Fe-Ni合金納米材料:將制得的二氧化硅包被的納米Fe-Ni合金加入到25mL甲醇中，用ImLH2O和甲醇稀釋至IJ 150mL。然后加入150mL甘油混合。超聲30min,轉移到有攪拌裝置的500mL三口燒瓶中。加入IOmL氨基硅烷偶聯劑(AEAPS)，在80-90 V下快速攪拌3h后，轉移出產物。產物用去離子水洗滌3次，甲醇洗滌2次(用布氏漏斗抽濾)。真空干燥。需要注意的是，抽濾由于有甘油，所以比較慢，抽一段時間后可適時用吸管吸去上層液體，抽濾過程約需6-8h。最后將得到的胺基硅烷化Fe-Ni合金納米材料真空干燥 12h。抗體修飾:取一定量氨基化Fe-Ni合金納米粒子，加入過量的2抗，即大腸桿菌0157:H7的羊抗兔IgG抗體，26 °C孵育、洗滌后，加過量1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，封閉表面活性空位，洗滌、重懸浮。因納米Fe-Ni合金具有順磁特性，外加磁場分離，納米Fe-Ni合金就會匯集到磁場一邊，吸走上清液，洗滌，則將多余的抗體、BSA洗去。制備的順磁納米免疫探針保存在4 C待用。
2.單克隆抗體固定:可以采用常規的酶標板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5X5mm2正方形,鍍膜機先噴一層Cr (2 - 4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亞胺-丙酸酯(DSP)對納米金進行修飾(DMS0，二甲基亞砜稀釋DSP)。加入第I抗體，即兔抗IgG單克隆抗體，即將100 μ LlOO μ g/mL單克隆抗體通過共價偶聯法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入牛血清蛋白將板上剩余的活性位點進行封閉并干燥。3.將食品樣本進行預處理，必要時采用FDA增菌法，對樣品進行過濾、增菌活化等預處理,得到待檢樣本。將待檢樣本中加入第I抗體，0157:H7的兔抗IgG。若待檢樣本中存在0157:H7，將與I抗形成I抗復合物。將第I步制得的第2抗體，0157:H7的羊抗兔IgG探針加入后進行充分震蕩。上磁力架分離探針，加少量無菌的去離子水得到探針的懸濁液。此時，如果待檢樣本中有目標單增李斯特菌，則通過第2抗體與第I抗體的相互作用，從而捕獲該復合物，達到了目標菌富集的目的。此時，結合了目標菌的I抗復合物和沒有結合目標菌的過量I抗都會與探針表面的2抗結合,還是混在一起。將此富集的探針懸池液加到第2步所制備的I抗固定板上，則探針懸濁液中結合了 0157:H7的探針會進一步與固定板上的單克隆抗體發生特異性結合，形成雙抗夾心結構。此時用無菌的去離子水清洗，就可以將沒有結合0157:H7的探針洗去。在固定板上剩下的就只有結合了 0157:H7的探針。用洗脫液(甲醇等)將固定板上的結合了大腸桿菌0157:H7的探針洗脫下來。上磁力架，分離探針并用無菌的去離子水清洗1-2次，將離子、溶劑洗去。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司或miFe-Ni合金NMR華東師范大學)測定溶液的Tl和T2，以去離子水為空白，溶液測得的T1/T2與空白比較，有顯著差異，說明溶液中有探針存在，從而說明樣本中有大腸桿菌0157:H7，探針的量與T1/T2的下降值呈正比。下降的越多說明探針越多，從而間接說明大腸桿菌0157:H7越多，通過加標驗證可以定量檢測樣本中目標菌的數目。
權利要求
1.一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征步驟如下: 1)在樣品中加入檢測目標菌的特異性第I抗體，若樣品中存在目標菌，則通過抗體抗原的結合形成I抗復合物； 2)檢測目標菌的第I抗體的抗體，即2抗包被順磁納米Fe-Ni合金探針的制備； 3)將目標菌特異性第I抗體在固相載體上的固定備用； 4)富集目標菌株，并分離:在第I步處理過的樣品，加入第2步制得的順磁納米Fe-Ni合金探針，充分混合震蕩反應一段時間，抓取目標菌后施加外加磁場，由于納米Fe-Ni合金具有順磁特性，Fe-Ni合金探針會聚集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出探針，若待檢樣本中有目標菌，則首先會在第I步時與I抗形成I抗復合物，I抗復合物會再與探針表面的2抗復合，通過外加磁場而被富集、分離、洗滌、磁分離后加少量無菌的去離子水則形成目標菌的順磁納米Fe-Ni合金探針懸池液,此時,捕到和未捕到I抗復合物的Fe-Ni合金探針還是混在一起； 5)將富集的Fe-Ni合金探針懸濁液加到第2步固定了單克隆抗體的固相載體上，若存在目標菌則形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗，則沒有抓取到目標菌的探針就被洗掉，若不存在目標菌，則所有探針都被洗掉； 6)之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的探針洗下來，用外加磁場分離探針的方法用無菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在探針就是抓到目標菌的探針； 7)這部分探針，加入無菌的去離子水形成探針的懸濁液，進行核磁共振的弛豫時間測定，在固定場強下，無菌的去離子水的T1/T2是一個恒定值，以無菌的去離子水為空白，測得的懸濁液的弛豫時間T1/T 2相比無菌的去離子水有顯著降低，則說明含有探針，從而間接證明樣本中有目標致病菌，探針的量與T1/T2的下降呈正比，可以通過加標定量探針而間接定量出目標菌的量。
2.根據權利要求1所述的基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是所述NMR納米探針為具有順磁特性的納米Fe-Ni合金材料。
3.根據權利要求1所述的基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是所述的目標菌的最終檢出評價方法基于核磁共振技術的弛豫時間特性參數的變化。
4.根據權利要求1所述的基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是所述NMR弛豫時間特性，是指自旋-晶格弛豫時間(Tl)和自旋-自旋弛豫時間(T2)。
5.根據權利要求1所述的基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是所述弛豫時間特性，Tl采用180° - τ -90°脈沖方法測定，Τ2采用CPMG序列方法測定。
6.根據權利要求1所述的基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是所述的I抗為檢測目標菌的特異性抗體，最好是單抗，2抗為第I抗體的抗體。
全文摘要
一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，屬于食品安全致病菌快速檢測技術領域。本發明依賴于建立的可以用于食品液體樣本中致病菌的核磁共振檢測方法，利用第1抗體捕獲目標菌，利用第1抗體的抗體即2抗包被制備的順磁納米Fe-Ni合金探針對目標菌進行富集、分離，利用納米Fe-Ni合金的順磁特性對核磁共振衰減信號的弛豫時間的影響，檢測出樣本中是否含有目標致病菌。不同的具體的對應關系為順磁納米Fe-Ni合金探針，在一定條件下顯示出線性關系，即納米Fe-Ni合金含量大，樣品的T2/T1值越小，在一定范圍能夠定量檢測目標菌。該方法可以用于食品樣本中有害致病菌的快速檢測，從而可以作為大批待檢樣品的快速篩選。
文檔編號G01N24/08GK103217449SQ20131009763
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月26日 優先權日2013年3月26日
發明者張錦勝, 唐群, 賴衛華 申請人:南昌大學