專利名稱：葉片中葉綠素無損測定方法
技術領域：
本發明涉及葉綠素的檢測分析方法，具體涉及一種葉片中葉綠素無損測定方法。
背景技術：
葉綠素含量是衡量植物光合作用與生長狀況的一項重要指標，葉綠素含量檢測技術的研究在農業生產、林業研究等方面有著至關重要的意義。傳統的葉綠素含量檢測方法都是先提取葉綠素，再用分光光度法測定其含量。這種方法具有耗時長、對葉片有破壞性、不便于野外測量、不便于連續測量等諸多缺點。而現在使用比較多的是葉綠素測定儀來進行測量，使用這種方法雖然彌補了傳統測量方法的缺點，能夠快速無損傷估測準確的測量葉綠素含量，但也存在許多不足之處。迄今為止國內外葉片葉綠素無損測定普遍采用透射式比色方法，例如日本柯尼卡美能達公司的SPAD 502plus葉綠素儀、美國國OPTI電器公司CCM—200型手持葉綠素計、英國Hansatech公司CL-Ol葉綠素儀、美國FT綠色有限公司產品atLEAF葉綠素儀等，以及我國一些廠家所生產的SPAD的葉綠素儀，均采用透射比色方法，其測值是一個與葉綠素含量相關的相對指標。這些現有方法的優點是無損測定、方便、快捷、效率高，其不足之處主要是:①測定的葉片厚度受限，含量濃度受限:這是由于葉片是一個透明度很低的檢測對象；據SPAD說明書稱其最大可測定厚度為1.2mm,實際上當葉綠素濃度較大時其分辨率就已經很低了；②測試得到的相對指標與葉片葉綠素含量之間的關系，需要按照作物品種、生長期、取樣部位建立不同的相關曲線才能取得；③不能反映葉綠素a、葉綠素b，組成成分的數量和比例；④不能定量，只是半定量性的估測。目前反射式檢測技術已有廣泛性應用，如德國默克爾公司的RQ-reflex反射式植株營養診斷儀，通過試紙條的反射光比色，測定葉片硝酸鹽含量。但它屬于有損檢測，需要采下葉片，處理成顯色溶液才能比色測試。尚未見有關反射式比色無損測定植株葉片成分的報道。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種快速簡便的葉片中葉綠素無損測定方法，該測定方法不受葉片厚度限制、適用于任何作物、任何品種、任何生長期、任何采樣部位，且檢測成本低廉。為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案:設計一種葉片中葉綠素無損測定方法(2個波長法)，包括以下步驟:①選定檢測光波長:以葉綠素a吸收光譜曲線和葉綠素b吸收光譜曲線相交匯區的波長為工作波長，以葉綠素a和葉綠素b都沒有吸收的近紅外光譜區為參照波長；
②求葉綠素反射率:分別以工作波長、參照波長的單色光依次照射在待測葉片和參照反射板(照射在參照反射板上，目的在于調校檢測儀器)上，使其產生漫反射，以光電反射儀檢測記錄兩種波長下的漫反射率R工、R# P以下式求得葉綠素反射率:R = R1-1T1XI^1,上式中R為待測葉片中葉綠素反射率；R#1為參照波長照射下的待測葉片基質的漫反射率；R工為工作波長照射下的葉片的漫反射率為系數，取值0.9 1.8 ;以參照波長測定待測葉片的基質反射率(在參照波長下，葉片基質對光有吸收而葉綠素對光無吸收，因而葉片的反射率就是葉片基質的反射率)，乘以一定系數A，在計算葉綠素反射率時予·以扣減(消除葉片基質本身的干擾)，A的取值范圍0.9 1.8，可進一步通過實驗室驗證進行優化選擇。③計算葉綠素反射函數:將上步所得葉綠素反射率R代入下述庫比爾卡-芒克公式計算出待測葉片中所含葉綠素的反射函數Fkm:Fkm = ( 1- R)2/2R；④計算葉綠素總含量:由下式將所述反射函數換算為待測葉片中的葉綠素總含量:C = BXFkm,上式中C為待測葉片中葉綠素總含量；B為標定的換算系數，其標定方法為測定任一個已知葉綠素含量的葉片的反射函數，求得葉綠素含量與反射函數的比值。也可以下述步驟取代上述步驟④:先以所述步驟① ③得到一定數量的同類植物葉片中所含葉綠素的反射函數Fkm，并按常規方法測定其葉綠素含量，然后將按常規方法測定的葉綠素含量與對應的葉片反射函數Fkm進行回歸:C = aXF^b,所得到的回歸方程如相關性顯著，即作為換算方程，根據步驟① ③所得待測葉片的反射函數，由所得換算方程換算出待測葉片中的葉綠素總含量。上述工作波長為620 670nm ;參照波長為800 1500nm。另一種葉片中葉綠素無損測定方法(3-4個波長法)，其與第一種方法(雙波長法)相同處是都采用了反射法，其不同處則是增加了一個光源，由半定量提升為定量，具體包括以下步驟:①選定檢測光波長:以630 ±30nm為第一工作波長，以620 680nm為第二工作波長，以780 1200nm為參照波長；②求葉綠素反射率:分別以第一工作波長、第二工作波長及參照波長的單色光依次照射在待測葉片和參照反射板上，使其產生漫反射，檢測記錄三種波長下的漫反射率I!>Ra2> R#2 分別以下式求得葉綠素a的反射率Ra和葉綠素b的反射率Rb:Ra = Rx2-T2XR02,Rb = RA1-r3XR 參 2，式中r2、r3為系數，r2> r3取值范圍均為0.9 1.8 ;③計算葉綠素反射函數:分別將上步所得葉綠素a、葉綠素b的反射率Ra、Rb代入庫比爾卡-芒克公式計算出待測葉片中所含葉綠素a、葉綠素b的反射函數FKMA2、FKMA1:
Fkmm = (1-Rb) 2/2Rb Fkma2 = (1-Ra) 2/2Ra,④按常規建立反射函數相對于葉綠素a、葉綠素b含量的雙波長方程，求解可得待測葉片中的葉綠素含量C。:Ca — M1Fkmx2-N1FkmxCb — M1Fkmx 1-N2Fkmx2,Cc = Ca+Cb ；式中，Fkw PFkma2分別為待測葉片在第一波長、第二波長的庫比爾卡一芒克反射函數，MpNpM2'N2為雙波長方程系數，其通過常規方法建立Fkmai與第一波長的相關工作曲線、& 2與第二波長的相關曲線，后可得到(可參照分光光度學有關雙波長法(或三波長法)論述，是公知的常規方法，其曲線的縱坐標取為Fkm，橫坐標取為波長)。也可以下步驟替代所述步驟④:先用常規方法測定待測植株葉片中所含葉綠素a、葉綠素b的吸光度Αλ 2、Αλ1，將Αλ2> Αλ1與上步所得FkiuPFkiu2進行線性回歸,得如下關系式:Axi = a+bFKMXi,根據上述對應的關系式求得待測葉片在第一波長、第二波長下的葉片吸光度Αλ!>Αλ 2 ;再建立吸光度Αλ相對于葉綠素含量的雙波長方程(或三波長方程)，求解可得待測葉片中的葉綠素含量 C。:C3 = M1Aa2-N1Aai,Cb = Μ2Αλ J-N2Ax2,Cc = Ca+Cb,Αλ ρΑλ 2分別為待測葉片在第一波長、第二波長下的葉片吸光度為雙波長方程系數，其通過常規方法建立Αλ i與第一波長的相關曲線、Αλ2與第二波長的相關曲線后取得；Ca、Cb、C。分別為葉綠素a和葉綠素b的含量及葉綠素總含量。還可以下步驟替代上述步驟④:分別采用線性回歸方法的建立FKMA1、Fkma2相對于常規測定方法所得葉綠素b濃度、葉綠素a濃度的換算關系，再用把二者相加求出葉綠素總含量:Ca = A^B2XFkm2,Cb = A^B1XFkmi,Cc = Ca+Cb式中A1J2為常數！BpB2為換算系數。本發明具有積極有益的技術效果:1.本發明方法不受葉片厚度的限制，而現有的透射式比色測定法在葉片厚度大時，吸光度A > 1.0時，誤差急速擴大；本發明所采用的漫反射式測定方法則因漫反射發生在葉片內部的任一層面，受葉片厚度的影響輕微，能成功地測定玻璃翠葉片(厚3.7mm)。2.本發明2波長法(光源為2個波長)是采用一個對葉綠素不吸收，對葉片基質吸收的波長作為參照，因而基本消除了葉片葉脈對檢測結果的影響，大大減少了誤差，應用該方法可以將相關性的置信水平由0.05提升至0.01 ;在第二種方法(光源為3-4個波長)運用中，可以結合雙波長法(或三波長法)使葉片無損檢測由半定量提升到定量。
3.本發明的第二方法(光源為3個以上波長法)，設計有3-4個檢測波長，可以運用雙波長法(或三波長法)，排除相互干擾；可以分別得到葉綠素a、葉綠素b含量，比實驗室有損檢測效率提高近百倍。4.本發明的第二種方法得到的葉綠素含量，適用于任何作物、任何品種、任何生長期、任何采樣部位；檢測效率高，結合相關的反射式光電檢測儀可直觀的讀取葉綠素值；能使檢測工作完全從繁復的建模實驗中解脫出來，降低勞動強度。5.本發明方法對葉綠素的檢測成本極低，幾乎沒有耗材，也無需換算模型的技術準備過程，有利于在農村大面積使用葉綠素測定值指導農業生產。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步闡述本發明。以下實施例所涉及反射式光電檢測儀器為河南農大迅捷測試技術有限公司生產的多波長多光源漫反射式比色裝置(發明專利申請號:201110027702.5)，只是更換不同波長的光源完成的；用以對比的葉綠素測定方法是實驗室測定葉綠素常規方法(參照國家標準GB/T22182-2008)，用以校對的儀器為721型分光光度計。實施例1:本發明的第一種方法(2個波長法)測定桐樹葉中的葉綠素含量
(I)選定工作波長62Onm,參照波長96Onm ；(2)分別以工作波長、參照波長的單色光依次照射在待測葉片和參照反射板(以白板為參照反射板，反射率為100% ))上，使其產生漫反射，以光電反射儀檢測記錄兩種波長下的漫反射率R工、R# i (結果見表I)，以下式求得葉綠素反射率:R = R 工-111XRs1(3)將上步所得葉綠素反射率R代入下述庫比爾卡-芒克公式計算出待測葉片中所含葉綠素的反射函數fkm(結果見表I):Fkm = (1-R) 2/2R ；(4)將葉綠素實測值與對應的葉片中所含葉綠素的反射函數Fkm進行回歸，建立如下回歸方程:C = 0.403261 XFkm+0.142268，r = 0.8163，相關性顯著，可作為換算方程。(5)根據步驟(3)所得到的待測葉片的反射函數，由步驟(4)所得換算方程換算出待測葉片中的葉綠素總含量。表I桐樹葉中葉綠素檢測過程中的相關測定參數和計算參數
權利要求
1.一種葉片中葉綠素無損測定方法，包括以下步驟: ①選定檢測光波長:以葉綠素a吸收光譜曲線和葉綠素b吸收光譜曲線相交匯區域的波長為工作波長，以葉綠素a和葉綠素b都沒有吸收的近紅外光譜區為參照波長； ②求葉綠素反射率:分別以工作波長、參照波長的單色光依次照射在待測葉片和參照反射板上，使其產生漫反射，以光電反射儀檢測記錄兩種波長下的漫反射率R工、R01,以下式求得葉綠素反射率:R = R 工 上式中R為待測葉片中葉綠素反射率；R#1為參照波長照射下的待測葉片基質的漫反射率；R工為工作波長照射下的葉片的漫反射率而為系數，取值0.9 1.8 ; ③計算葉綠素反射函數:將上步所得葉綠素反射率R代入下述庫比爾卡-芒克公式計算出待測葉片中所含葉綠素的反射函數Fkm:Fkm= (1-R) 2/2R； ④計算葉綠素總含量:由下式將所述反射函數換算為待測葉片中的葉綠素總含量: C — B X Fkm, 上式中C為葉綠素總含量；B為標定的換算系數,其標定方法為測定任一個已知葉綠素含量的葉片的反射函數，求得葉綠素含量與反射函數的比值。
2.根據權利要求1所述的葉片中葉綠素無損測定方法，其特征在于，所述工作波長為620 670nm ;參照波長為800 1500nm。
3.根據權利要求1所述的葉片中葉綠素無損測定方法，其特征在于，以下述步驟取代所述步驟④: 先以所述步驟① ③得到一定數量的同類植物葉片中所含葉綠素的反射函數Fkm，并按常規方法測定其葉綠素含量，然后將按常規方法測定的葉綠素含量與對應的葉片反射函數Fkm進行回歸:C = aXFKM+b, 所得到的回歸方程如相關性顯著，即作為換算方程，根據步驟① ③所得待測葉片的反射函數，由所得換算方程換算出待測葉片中的葉綠素總含量。
4.一種葉片中葉綠素無損測定方法，包括以下步驟: ①選定檢測光波長:以600 660nm為第一工作波長，以620 680nm為第二工作波長，以780 1200nm為參照波長； ②求葉綠素反射率:分別以第一工作波長、第二工作波長及參照波長的單色光依次照射在待測葉片和參照反射板上，使其產生漫反射，檢測記錄三種波長下的漫反射率R；u、Ru、R#2，分別以下式求得葉綠素a的反射率Ra和葉綠素b的反射率Rb: Ra = R 入 2-r2XR參 2，Rb = Irr3XR參 2， 式中r2、r3為系數，r2、r3取值范圍均為0.9 1.8 ; ③計算葉綠素反射函數:分別將上步所得葉綠素a、葉綠素b的反射率Ra、Rb代入庫比爾卡-芒克公式計算出待測葉片中所含葉綠素a、葉綠素b的反射函數FKMA2、FKMA1:Fkmai — (Ub) /2 Fkma2 = (Ua) /2Ra，④按雙波長分光光度法的檢測原理建立起反射函數相對于葉綠素a、葉綠素b含量的雙波長方程，求解可得待測葉片中的葉綠素含量C。: Ca — M1Fkmx2-N1Fkmxi, Cb — M2Fkma 1-N2Fkmx2, Cc = Ca+Cb ； 式中，Fkmai^kma2分別為待測葉片在第一波長、第二波長的庫比爾卡-芒克反射函數，MpRnMyN2為雙波長方程系數,是在分別建SFkmai與第一波長、Fkma2與第二波長的工作曲線基礎上，按照分光光度學雙波長分析經典方法得到的相關曲線、Fkma2與第二波長的相關曲線后得到。
5.根據權利要求4所述的葉片中葉綠素無損測定方法，其特征在于，以下步驟替代所述步驟④: 先用常規方法測定待測植株葉片中所含葉綠素a、葉綠素b的吸光度Αλ2、Αλ1，將Αλ2、Αλ1與上步所得F kiu1、Fkm a2進行線性回歸,得如下關系式: Αλ — ci~*~bFKMx j, 根據上述對應的關系式求得待測葉片在第一波長、第二波長下的葉片吸光度Αλ1、Αλ2 ；再建立吸光度Αλ相對于葉綠素含量的雙波長方程，求解可得待測葉片中的葉綠素含量C。:Ca = M1Aa2-N1Aai, Cb — M2A λ J-N2Ax 2 Cc = Ca+Cb， Αλ1>Αλ2分別為待測葉片在第一波長、第二波長下的葉片吸光度WpNpMyN2為雙波長方程系數，其通過常規方法建立Αλ1與第一波長的吸收曲線、Αλ2與第二波長的吸收曲線后，按照雙波長分光光度法得到的；Ca、Cb、C。分別為葉綠素a和葉綠素b的含量及葉綠素總含量。
6.根據權利要求4所述的葉片中葉綠素無損測定方法，其特征在于，以下步驟替代所述步驟④: 分別采用線性回歸方法的建立FKMA1、Fkma2相對于常規測定方法所得葉綠素b濃度、葉綠素a濃度的換算關系，再用把二者相加求出葉綠素總含量: Ca — A2+B2 X Fkm2， Cb — Aj+Bj X Fkmi ,Cc = Ca+Cb 式中ApA2為常數；B1、B2為換算系數。
全文摘要
本發明涉及一種葉片中葉綠素無損測定方法。其方法是用兩種(或三種)特定波長的光線照射在葉片和反射板上按照它們反射率計算出葉綠素含量的一種相對指數(或實際含量)，該指數(或實際含量)與葉綠素總含量(或葉綠素a、葉綠素b含量及總量)存在顯著的相關關系(或定量函數關系)，進而根據這種相關性估測計算或還原出片中葉綠素的含量(或計算出葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素量)。本發明方法不受葉片厚度的限制，而現有的透射式比色測定法在葉片厚度大時，吸光度A＞1.0時，誤差急速擴大；本發明所采用的漫反射式測定方法則因漫反射發生在葉片內部的任一層面，受葉片厚度的影響輕微；本發明方法對葉綠素的檢測成本極低，幾乎沒有耗材，也無需換算模型的技術準備過程。
文檔編號G01N21/31GK103163094SQ20131009159
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月21日 優先權日2013年3月21日
發明者段鐵城, 胡建東, 胡小寧, 楊張青, 蘇偉波, 葉優良, 王萬章, 朱秀紅, 劉存祥, 管澤民 申請人:河南農大迅捷測試技術有限公司