專利名稱：乙肝5項化學發光檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種用于乙肝檢測的試劑盒，尤其是涉及一種采用酶標記生物素-鏈霉親和素技術的乙肝5項化學發光檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染引起的一種嚴重危害人們身體健康的傳染病，據WHO報告，全世界HBV攜帶者約3.5億人。我國是乙肝高發區，據統計，我國人群乙肝表面抗原(HBsAg)的檢出率達10.09%，HBsAg攜帶者達1.2億，男性高于女性(10.3%對7.29%)，農村高于城市(10.2%對7.9%)，總感染率高達35.5% 61.1%，其中慢性肝炎占56%。全球每年有一百萬人死于肝衰或肝癌，乙肝已經成為全球第9位死亡原因。對于乙肝病毒的檢測與預防是我國目前首要任務之一。乙肝5項，包括乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg)、乙肝病毒表面抗體(Hepatitis B surface antibody,抗 HBs)、乙肝病毒 e 抗原(Hepatitis BeAntigen, HBeAg)、乙肝病毒e抗體(Hepatitis B e Antibody,抗HBe)以及乙肝病毒核心抗體(HepatitisB core antibody,抗HBc)是目前最常用的乙肝檢測手段。常用的方法檢測出HBsAg陰性的人群中，有11.0%HBV-DNA呈陽性反應，也就是說，常規的檢測方法可能有
11.0%的漏檢率，究其原因主要是由于抗原含量低于現行方法的可檢出水平。另外，傳統的檢測方法只能提供定性結果，最高也只能進行滴度的分析，在臨床使用上有一定的局限性，特別是在療效觀察和疫苗注射后抗體產生情況的觀察上存在著明顯的不足，故需要一種新的既靈敏快捷準確又不太昂貴的方法來填補這一缺陷。因此對于乙肝5項的定量研究變得尤為重要。目前，國內針對乙肝5項的定量檢測大多采用國外進口試劑盒，價格昂貴，成本花費巨大，而我國人口眾多，對于乙肝5項檢測的需求量很多，長期使用進口試劑盒不僅在經濟上是高額的負擔，也不利于大量的使用。
發明內容
本發明的目的是提供一種采用酶標記生物素-鏈霉親和素技術的乙肝5項化學發光檢測試劑盒及其制備方法。本發明所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒，包括包被的微孔反應板、生物素標記物、堿性磷酸酶標記物、中和試劑、校準品、發光底物液和濃縮清洗液。所述微孔反應板為包被有鏈霉親和素的微孔板，所述微孔反應板的材料為聚苯乙烯；所述生物素標記物共有5種生物素標記物，分別為生物素標記的乙肝表面抗體、生物素標記的乙肝表面體原、生物素標記的乙肝e抗體1、生物素標記的乙肝e抗體2和生物素標記的乙肝核心抗原，所述生物素標記的乙肝e抗體I和生物素標記的乙肝e抗體2的分子成份相同，工作濃度不同，所述生物素標記的乙肝e抗體I用于乙肝e抗原檢測，生物素標記的乙肝e抗體2用于乙肝e抗體檢測；所述堿性磷酸酶標記物共有5種堿性磷酸酶標記物，分別為乙肝表面抗體堿性磷酸酶標記物、乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物，乙肝e抗體堿性磷酸酶標記物I，乙肝e抗體堿性磷酸酶標記物2和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標記物，所述堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體I和堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體2的分子成份相同，工作濃度不同，所述堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體I用乙肝e抗原檢測，堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體2用于乙肝e抗體檢測；所述堿性磷酸酶標記物共有5種堿性磷酸酶標記物，分別為乙肝表面抗體堿性磷酸酶標記物、乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物、乙肝e抗體堿性磷酸酶標記物1、乙肝e抗體堿性磷酸酶標記物2和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標記物，所述堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體I和堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體2的分子成份相同，工作濃度不同，所述堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體I用于乙肝e抗原檢測，堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體2用于乙肝e抗體檢測；所述中和試劑為中和試劑乙肝e抗原；所述校準品包括乙肝病毒表面抗原校準品、乙肝病毒表面抗體校準品、乙肝病毒e抗原校準品、乙肝病毒e抗體校準品和乙肝病毒核心抗體校準品共5種校準品，其中乙肝病毒表面抗原校準品的濃度包括 200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.lng/mL、0ng/mL共6個濃度，乙肝病毒表面抗體校準品的濃度包括1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL共6個濃度，乙肝病毒e抗原校準品的濃度包括40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、ONCU/mL 共 6 個濃度，乙肝病毒 e 抗體校準品的濃度包括 0.4NCU/mL、INCU/mL,2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、ONCU/mL 共 6 個濃度，乙肝病毒 c 抗體校準品的濃度包括 4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、ONCU/mL共6個濃度；所述發光底物液為金剛烷胺衍生物csro。所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟:I)制備鏈霉親和素預包被反應板鏈霉親和素用包被緩沖液稀釋,取反應板,將稀釋的鏈霉親和素加入反應板中，預包被后，甩去包被緩沖液，再加入封板緩沖液，置37°C恒溫放置2h，去掉封板緩沖液，烘干后，加干燥劑密封，得鏈霉親和素預包被反應板；2)制備校準品系列(I)配制乙肝表面抗原校準品將高值乙肝表面抗原用校準品稀釋液稀釋，用國家標準品(購自中國生物制品檢定所)重復標定3次，3次標定值，取均值作為標定的表面抗原乙肝表面抗原濃度，所述校準品稀釋液由0.05mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、0.0lmmol/L的氯化鈉的1%的牛血清白蛋白及10%新生牛血清組成，pH值7.4，乙肝表面抗原作標準品濃度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.lng/mL、0ng/mL,分裝成 0.5mL/ 瓶，2 8°C或一20°C存放備用；(2)配制乙肝表面抗體校準品同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL ；(3)配制乙肝e抗原校準品同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為40NCU/mL、I ONCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、ONCU/mL ；(4)配制乙肝e抗體校準品同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為0.4NCU/mL、INCU/mL、
2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、ONCU/mL ；( 5 )配制乙肝c抗體校準品同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、ONCU/mL ；3)制備生物素標記物( I)制備乙肝表面抗體生物素標記物將Img乙肝表面抗體溶于0.lmol/L, pH8.8的硼酸鹽緩沖液0.5ml配成濃度為2mg/ml乙肝表面抗體溶液中，將生物素用二甲亞砜配制成濃度為lmg/ml生物素溶液，按照30 80 μ g/mg的比率，將生物素加入到乙肝表面抗體溶液中，避光振蕩反應4h，10°C，按照每250 μ g生物素加20 μ L的量，加入新鮮配制lmol/L的NH4C1溶液，避光震蕩反應IOmin后，用PBS避光透析過夜，根據終體積計算抗體的濃度，加入甘油制備乙肝表面抗體生物素標記物；(2)制備乙肝表面抗原生物素標記物、乙肝e抗體生物素標記物和乙肝核心抗原生物素標記物方法同步驟(I)乙肝表面抗體生物素標記物的制備，所不同的是乙肝表面抗原的濃度為4mg/ml,乙肝e抗體的濃度為lmg/ml,乙肝核心抗原的濃度為0.5mg/ml ；4)制備堿性磷酸酶標記物( I)制備乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物采用改良過碘酸鈉-乙二醇法進行乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記，將獲得的乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L(pH7.5)TBS緩沖液按I: 1000稀釋成工作液，保存于一 20°C ;(2)制備乙肝表面抗體堿性磷酸酶標記物、乙肝e抗體I堿性磷酸酶標記物、乙肝e抗體2堿性磷酸酶標記物和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標記物方法同步驟(I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物的制備；5)制備中和試劑將乙肝e抗原配制成lmg/ml濃度作為中和試劑乙肝e抗原；6)制備發光底物液取底物稀釋緩沖液450mL，增強劑(10 X) 50mL，lmol/L MgCl2500 μ L，加發光底物金剛烷胺衍生物csro8000 μ L于滅活容器中，振蕩混勻，避光，密封2 8°C保存，得發光底物液 508.5mL ；7)制備濃縮清洗液配制0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4) lOOOmL，加20mL的吐溫-20作為濃縮清洗液；
8)組裝乙肝5項化學發光定量檢測試劑盒將包被微孔反應板、生物素標記物、堿性磷酸酶標記物、中和試劑、校準品、發光底物液、濃縮清洗液組裝成乙肝5項化學發光定量檢測試劑盒。在步驟I)中，所述包被緩沖液為pH9.6、50mmol/L的Na2CO3-NaHCO3沖溶液，所述鏈霉親和素稀釋濃度為8 μ g/mL ;所述稀釋的鏈霉親和素的加入量可為每反應板150μ L ;所述預包被的條件可置37°C恒溫放置2h進行預包被；所述封板緩沖液的加入量可為每反應板加入150 μ L封板緩沖液；所述烘干的條件可于37°C干燥室烘干2h ;所述封板緩沖液為0.01mol/LTBS-T再加上1%BSA、0.2%明膠；所述干燥室的相對濕度度小于30%。在步驟6)中，所述底物稀釋緩沖液為0.05mol/L Tris-HCl, pH9.5。本發明應用生物素-鏈霉親和素檢測系統，實現乙肝5項不同項目使用同樣的包被反應板，根據待測樣品選擇相應的抗原或抗體，抗原或抗體用生物素標記，在檢測的過程中，只要將生物素標記的抗原或抗體加入含有鏈霉親和素的微孔板中，就將相應的抗原或抗體固相到了微孔板上，之后再加入待測樣品，就可以實現檢測過程。通過生物素標記抗原或抗體的方法，使得針對不同樣品的檢測過程都可以使用同樣的含有鏈霉親和素的微孔板，而不需要分別制備含有不同抗原或抗體的預包被板。這樣不僅使得后期檢測過程變得簡便易行，更加節省了預包被板過程中人力的花費，更加經濟，大大降低了成本，也縮短了檢測的時間。本發明特有的堿性磷酸酶-金剛烷胺發光系統，具有靈敏度高，線性范圍寬，檢測平臺期長等優點，無需進行繁瑣的底物使用前的混合操作。且項目利用的手段比其它自動化微孔檢測方式操作簡單、檢測速度快，檢測周期短、全自動程度更高，降低了檢測成本與人力花費，提高了檢測靈敏度，使得檢測過程更加人性化。項目開發的產品市場前景廣闊，經濟和社會與傳統方法比較，本發明所提供的乙肝5項化學發光檢測試劑盒簡化了操作步驟,大大縮短了檢測時間；效益顯著,意義重大。通過本發明的應用，得到的鏈霉親和素包被板不僅可以用于多種樣品的檢測，一定程度上減少了預包被板制備過程中抗原或抗體的使用量，而且得到的乙肝5項化學發光檢測試劑盒可以取代國外試劑盒來進行乙肝5項的檢測。與國外試劑盒相比，本發明制備的乙肝5項化學發光檢測試劑盒不僅價格低廉，而且操作簡便，靈敏度高，可以長期大量的使用，在經濟上減少開支。且本發明制備的乙肝5項化學發光檢測試劑盒不僅可以靈敏檢測出乙肝5項，并且可以對其進行精確的定量鑒定，價格便宜，操作簡單，結果準確，環保無污染，具有長遠的好處。
圖1為本發明試劑盒實施例組裝示意圖。I為鏈霉親和素預包被反應板；2 6為生物素標記物，其中2為乙肝表面抗體生物素標記物、3為乙肝表面抗原生物素標記物、4為乙肝e抗體I生物素標記物、5為乙肝e抗體2生物素標記物、6為乙肝核心抗原生物素標記物；7 11為堿性磷酸酶標記物，其中7為乙肝表面抗體堿性磷酸酶標記物、8為乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物、9為乙肝e抗體I堿性磷酸酶標記物、10為乙肝e抗體2堿性磷酸酶標記物、11為乙肝核心抗體堿性磷酸酶標記物；12為中和試劑乙肝e抗原、13為試劑外包裝盒；14 19 為乙肝表面抗原 200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL和0ng/mL6個濃度的校準品，20 25為乙肝表面抗體1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL 和 0mIU/mL6 個濃度的校準品，26 31 為乙肝 e 抗原 40NCU/mL、IONCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL 和 0NCU/mL6 個濃度的校準品；32 37 為乙肝 e 抗體0.4NCU/mL、INCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL 和 0NCU/mL6 個濃度的校準品；38 43為乙肝 c 抗體 4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL 和 0NCU/mL6 個濃度的校準品；44為濃縮清洗液；45為發光底物液。
具體實施例方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。參見圖1，本發明所述乙肝5項化學發光定量檢測試劑盒實施例由鏈霉親和素預包被反應板I ;乙肝表面抗體生物素標記物2、乙肝表面抗原生物素標記物3、乙肝e抗體I生物素標記物4、乙肝e抗體2生物素標記物5、乙肝核心抗原生物素標記物6 ；乙肝表面抗體堿性磷酸酶標記物7、乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物8、乙肝e抗體I堿性磷酸酶標記物9、乙肝e抗體2堿性磷酸酶標記物10、乙肝核心抗體堿性磷酸酶標記物11 ;中和試劑乙肝e抗原12、試劑外包裝盒13 ;乙肝表面抗原200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL和0ng/mL6個濃度的校準品14 19,乙肝表面抗體1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL 和 0mIU/mL6 個濃度的校準品 20 25，乙肝 e 抗原 40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL 和 0NCU/mL6 個濃度的校準品 26 31 ;乙肝e 抗體 0.4NCU/mL、INCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL 和 0NCU/mL6 個濃度的校準品32 37 ;乙肝 c 抗體 4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL 和 0NCU/mL6 個濃度的校準品38 43 ;濃縮清洗液44 ;發光底物液45共同組成。其中所述發光底物液為金剛烷胺衍生物csro。所述乙肝5項化學發光定量檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟:1.鏈霉親和素預包被反應板制備鏈霉親和素預包被反應板制備鏈霉親和素用包被緩沖液稀釋。取反應板,將稀釋的鏈霉親和素加入相應反應板中，每反應板150 μ L。置37°C恒溫放置2h進行預包被。甩去包被液，在干凈的吸水紙上拍干，每反應板再加入150 μ L封板緩沖液，置37°C恒溫放置2h。去掉封板液，于37°C干燥室烘干2h，加干燥劑密封。所述包被緩沖液為pH9.6、50mmol/L的Na2C03_NaHC03緩沖溶液，所述鏈霉親和素稀釋濃度為8 μ g/mL。所述封板緩沖液為0.0lmol/L TBS-T+(1%BSA、0.2%明膠)。所述干燥室的相對濕度度小于30%。2.校準品系列的制備(I)乙肝表面抗原校準品的配制將高值乙肝表面抗原用校準品稀釋液稀釋，用國家標準品(購自中國生物制品檢定所)重復標定3次。3次標定值，取均值作為標定的表面抗原乙肝表面抗原濃度。所述校準品稀釋液由0.05mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、0.0lmmol/L的氯化鈉的1%牛血清白蛋白與10%的新生牛血清組成，pH值7.4。乙肝表面抗原作標準品濃度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL，分裝成0.5mL/瓶，2 8°C (12個月)或一20°C (4年)存放備用。(2)乙肝表面抗體校準品的配制
同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL。(3)乙肝e抗原校準品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為40NCU/mL、I ONCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、ONCU/mL。(4)乙肝e抗體校準品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為0.4NCU/mL、INCU/mL、
2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、ONCU/mL。(5)乙肝核心抗體校準品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、ONCU/mL。3.生物素標記物的制備(I)乙肝表面抗原生物素標記物的制備將Img乙肝表面抗原溶于0.lmol/L, pH8.8的硼酸鹽緩沖液0.5ml配成濃度為2mg/ml乙肝表面抗原溶液中，將生物素用二甲亞砜配制成濃度為lmg/ml生物素溶液，按照30 80 μ g/mg的比率，將生物素加入到乙肝表面抗原溶液中，避光振蕩反應4h，10°C，按照每250 μ g生物素加20 μ L的量，加入新鮮配制lmol/L的NH4Cl溶液，常溫避光震蕩反應IOmin0 IOmin后，用PBS避光透析過夜。根據終體積計算抗體的濃度,加入甘油制備乙肝表面抗原生物素標記物。(2)乙肝表面抗原生物素標記物、乙肝e抗體生物素標記物、乙肝核心抗原生物素標記物的制備方法同步驟(I)乙肝表面抗體生物素標記物的制備。所不同的是乙肝表面抗原的濃度為4mg/ml,乙肝e抗體的濃度為lmg/ml,,乙肝核心抗原的濃度為0.5mg/ml。4.堿性磷酸酶標記物的制備( I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物的制備采用改良過碘酸鈉-乙二醇法進行乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記，將獲得的乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L(pH7.5)TBS緩沖液按I: 1000稀釋成工作液，保存于一 20°C。(2)乙肝表面抗體堿性磷酸酶標記物、乙肝e抗體I堿性磷酸酶標記物、乙肝e抗體2堿性磷酸酶標記物、乙肝核心抗體堿性磷酸酶標記物的制備方法同步驟(I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物的制備。5.制備中和試劑將乙肝e抗原配制成lmg/ml濃度作為中和試劑乙肝e抗原。6.制備發光底物液取底物稀釋緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl (ρΗ9.5) ) 450mL，增強劑(10X)50mL,lmol/L MgCl2500 μ L,加發光底物金剛烷胺衍生物CSro8000 μ L于滅活容器中，振蕩混勻，避光，密封2 8°C保存。得底物工作液508.5mL。7.制備濃縮清洗液配制0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4) lOOOmL，加吐溫20mL作為濃縮清洗液。8.制備乙肝5項(或乙肝兩對半)化學發光定量檢測試劑盒
包被微孔反應板、生物素標記物、堿性磷酸酶標記物、中和試劑、校準品、發光底物液、濃縮清洗液共同組成乙肝5項(或乙肝兩對半)化學發光定量檢測試劑盒。以下給出采用乙肝5項(或乙肝兩對半)化學發光定量檢測試劑盒檢測患者的臨床標本中的乙肝表面抗原:1.標本處理:血清:靜脈血5mL，置37°C水浴30min，3000g離心lOmin，上清為檢測
樣品備用。2.標本檢測:將樣品、生物素標記的乙肝表面抗體和堿性磷酸酶標記的乙肝表面抗體加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應60min后，乙肝表面抗原分子與生物素標記的乙肝表面抗體和堿性磷酸酶標記分別特異性結合，洗掉游離成分。加入發光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發出463nm的可見光。于第15min測定各樣品孔的發光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝表面抗原濃度呈正相相關。樣品結果根據其RLU值可進行定量計笪以下給出乙肝5項化學發光定量檢測試劑盒的性能檢定:
1、精密度試驗:對同一樣本每天進行I批次檢測，每批重復檢測2次，共進行20天。收集20天的有效數據，進行重復性評價。2、分析靈敏度:以乙肝表面抗原100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.lng/mL4個濃度樣品每天重復8次檢測，連續做3次，95%檢出陽性的最低濃度值為乙肝表面抗原分析靈敏度；乙肝表面抗體的分析靈敏度同乙肝表面抗原，所不同的其檢測的樣品濃度為500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL ;乙肝e抗原的分析靈敏度同乙肝表面抗原,所不同的其檢測的樣品濃度為10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL ;乙肝e抗體的分析靈敏度同乙肝表面抗原，所不同的其檢測的樣品濃度為0.4NCU/mL、INCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL ；乙肝c抗體的分析靈敏度同乙肝表面抗原，所不同的其檢測的樣品濃度為4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL ；3、特異性:臨床常見肝炎患者標本150例，其中丙肝患者標本50例、戊肝患者標本50例、甲肝患者標本50例，評價方法的特異性。4、線性范圍:根據較準曲線的線性，維持相關系數在0.97以上，判斷方法的線性范圍。5、試劑穩定性:用兩個濃度水平臨床樣本,每個濃度水平樣本重復測定至少6次，計算平均值。新配制及穩定期末工作液應在同次運行中測定，將儀器帶來的不精密度減到最小。測定新配制的試劑工作液和穩定期末試劑工作液兩組平均值之間的一致性。以下給出具體實施例。實施例11.鏈霉親和素預包被反應板制備鏈霉親和素用包被緩沖液稀釋。取反應板,將稀釋的鏈霉親和素加入相應反應板中，每反應板150 μ L。置37°C恒溫放置2h進行預包被。甩去包被液，在干凈的吸水紙上拍干，每反應板再加入150 μ L封板緩沖液，置37°C恒溫放置2h。去掉封板液，于37°C干燥室烘干2h，加干燥劑密封。所述包被緩沖液為pH9.6、50mmol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液，所述鏈霉親和素稀釋濃度為8 μ g/mL。所述封板緩沖液為0.0lmol/L TBS-T+(1%BSA、0.2%明膠)。所述干燥室的相對濕度度小于30%。
2.校準品系列的制備(I)乙肝表面抗原校準品的配制將高值乙肝表面抗原用校準品稀釋液稀釋，用國家標準品(購自中國生物制品檢定所)重復標定3次。3次標定值，取均值作為標定的表面抗原乙肝表面抗原濃度。所述校準品稀釋液由0.05mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、0.0lmmol/L的氯化鈉的1%牛血清白蛋白和10%牛血清組成，pH值7.4。乙肝表面抗原作標準品濃度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL，分裝成0.5mL/瓶，2 8°C (12個月)或一20°C (4年)存放備用。(2)乙肝表面抗體校準品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL。(3)乙肝e抗原校準品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為40NCU/mL、I ONCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、ONCU/mL。(4)乙肝e抗體校準品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為0.4NCU/mL、INCU/mL、
2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、ONCU/mL。(5)乙肝核心抗體校準品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、ONCU/mL。3.生物素標記物的制備(I)乙肝表面抗原生物素標記物的制備將Img乙肝表面抗原溶于0.lmol/L, pH8.8的硼酸鹽緩沖液0.5ml配成濃度為2mg/ml乙肝表面抗原溶液中，將生物素用二甲亞砜配制成濃度為lmg/ml生物素溶液，按照30 80 μ g/mg的比率，將生物素加入到乙肝表面抗原溶液中，避光振蕩反應4h，10°C，按照每250 μ g生物素加20 μ L的量，加入新鮮配制lmol/L的NH4Cl溶液，常溫避光震蕩反應IOmin0 IOmin后，用PBS避光透析過夜。根據終體積計算抗體的濃度,加入甘油制備乙肝表面抗原生物素標記物。(2)乙肝表面抗原生物素標記物、乙肝e抗體生物素標記物、乙肝核心抗原生物素標記物的制備方法同步驟(I)乙肝表面抗體生物素標記物的制備。所不同的是乙肝表面抗原的濃度為4mg/ml,乙肝e抗體的濃度為lmg/ml,,乙肝核心抗原的濃度為0.5mg/ml。4.堿性磷酸酶標記物的制備(I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物的制備采用改良過碘酸鈉-乙二醇法進行乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記，將獲得的乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L(pH7.5)TBS緩沖液按I: 1000稀釋成工作液，保存于一 20°C。(2)乙肝表面抗體堿性磷酸酶標記物、乙肝e抗體I堿性磷酸酶標記物、乙肝e抗體2堿性磷酸酶標記物、乙肝核心抗體堿性磷酸酶標記物的制備方法同步驟(I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物的制備。
5.中和試劑制備將乙肝e抗原配制成lmg/ml濃度作為中和試劑乙肝e抗。6.發光底物液制備取底物稀釋緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl (ρΗ9.5) ) 450mL，增強劑(10X)50mL,lmol/L MgCl2500 μ L,加發光底物金剛烷胺衍生物CSro8000 μ L于滅活容器中。振蕩混勻，避光，密封2 8°C保存。得底物工作液508.5mL。7.濃縮清洗液制備配制0.01mol/L磷 酸鹽緩沖液(pH7.4)1000mL，加20mL吐溫-20作為濃縮清洗液。8.制備乙肝5項(或乙肝兩對半)化學發光定量檢測試劑盒包被微孔反應板、生物素標記物、堿性磷酸酶標記物、中和試劑、校準品、發光底物液、濃縮清洗液共同組成乙肝5項(或乙肝兩對半)化學發光定量檢測試劑盒。9.標本處理:血清:靜脈血5mL，置37°C水浴30min，3000g離心lOmin，上清為檢測樣品備用。10.標本檢測:將樣品、生物素標記的乙肝表面抗體和堿性磷酸酶標記的乙肝表面抗體加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應60min后，乙肝表面抗原分子與生物素標記的乙肝表面抗體和堿性磷酸酶標記乙肝表面抗體分別特異性結合，洗掉游離成分。加入發光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發出463nm的可見光。于第15min測定各樣品孔的發光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝表面抗原濃度呈正相相關。樣品結果根據其RLU值可進行定量計笪
ο實施例2與實施例1相似，其區別在于待檢標本中的乙肝表面抗體，將樣品、生物素標記的乙肝表面抗原和堿性磷酸酶標記的乙肝表面抗原加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應60min后，乙肝表面抗體分子與生物素標記的乙肝表面抗原和堿性磷酸酶標記的乙肝表面抗原分別特異性結合，洗掉游離成分。加入發光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發出463nm的可見光。于第15min測定各樣品孔的發光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝表面抗體濃度呈正相相關。樣品結果根據其RLU值可進行定量計算。實施例3與實施例1相似，其區別在于待檢標本中的乙肝e抗原，將樣品、生物素標記的乙肝e抗體I和堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體I加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應60min后，乙肝e抗原分子與生物素標記的乙肝e抗體I和堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體I分別特異性結合，洗掉游離成分。加入發光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發出463nm的可見光。于第15min測定各樣品孔的發光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝e抗原濃度呈正相相關。樣品結果根據其RLU值可進行定量計算。實施例4與實施例1相似，其區別在于待檢標本中的乙肝e抗體，將樣品、生物素標記的乙肝e抗體2、堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體2和中和抗原乙肝e抗原加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應60min后，生物素標記的乙肝e抗體2與固相的親和素結合后與中和抗原乙肝e抗原結合，標本中的乙肝e抗體分子與堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體2競爭與結合了生物素標記的乙肝e抗體2的中和抗原乙肝e抗原結合，洗掉游離成分。加入發光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發出463nm的可見光。于第15min測定各樣品孔的發光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝e抗體的濃度呈負相相關。樣品結果根據其RLU值可進行定量計算。實施例5與實施例1相似，其區別在于待檢標本中的乙肝核心抗體，將樣品、生物素標記的乙肝核心抗體、堿性磷酸酶標記的乙肝核心抗體和中和抗原乙肝核心抗原加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應60min后，生物素標記的乙肝核心抗原與固相的親和素結合的乙肝核心抗原結合，標本中的乙肝核心抗體分子與堿性磷酸酶標記的乙肝核心抗體競爭與結合了生物素標記的乙肝核心抗體的中和抗原乙肝核心抗原結合，洗掉游離成分。加入發光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發出463nm的可見光。于第15min測定各樣品孔的發光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝核心抗體的濃度呈負相相關。樣品結果根據其RLU值可進行定量計算。
權利要求
1.乙肝5項化學發光檢測試劑盒，其特征在于包括包被的微孔反應板、生物素標記物、堿性磷酸酶標記物、中和試劑、校準品、發光底物液和濃縮清洗液。
2.如權利要求1所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒，其特征在于所述微孔反應板為包被有鏈霉親和素的微孔板，所述微孔反應板的材料可為聚苯乙烯。
3.如權利要求1所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒，其特征在于所述生物素標記物共有5種生物素標記物，分別為生物素標記的乙肝表面抗體、生物素標記的乙肝表面體原、生物素標記的乙肝e抗體1、生物素標記的乙肝e抗體2和生物素標記的乙肝核心抗原，所述生物素標記的乙肝e抗體I和生物素標記的乙肝e抗體2的分子成份相同，工作濃度不同，所述生物素標記的乙肝e抗體I用于乙肝e抗原檢測，生物素標記的乙肝e抗體2用于乙肝e抗體檢測。
4.如權利要求1所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒，其特征在于所述堿性磷酸酶標記物共有5種堿性磷酸酶標記物，分別為乙肝表面抗體堿性磷酸酶標記物、乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物，乙肝e抗體堿性磷酸酶標記物1，乙肝e抗體堿性磷酸酶標記物2和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標記物，所述堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體I和堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體2的分子成份相同，工作濃度不同，所述堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體I用乙肝e抗原檢測，堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體2用于乙肝e抗體檢測。
5.如權利要求1所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒，其特征在于所述堿性磷酸酶標記物共有5種堿性磷酸酶標記物，分別為乙肝表面抗體堿性磷酸酶標記物、乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物、乙肝e抗體堿性磷酸酶標記物1、乙肝e抗體堿性磷酸酶標記物2和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標記物，所述堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體I和堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體2的分子成份相同，工作濃度不同，所述堿性磷酸酶標記的乙肝e抗體I用于乙肝e抗原檢測，堿性磷酸酶標記的乙 肝e抗體2用于乙肝e抗體檢測。
6.如權利要求1所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒，其特征在于所述中和試劑為中和試劑乙肝e抗原。
7.如權利要求1所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒，其特征在于所述校準品包括乙肝病毒表面抗原校準品、乙肝病毒表面抗體校準品、乙肝病毒e抗原校準品、乙肝病毒e抗體校準品和乙肝病毒核心抗體校準品共5種校準品，其中乙肝病毒表面抗原校準品的濃度包括 200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.lng/mL、Ong/mL 共 6 個濃度，乙肝病毒表面抗體校準品的濃度包括 1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL共6個濃度，乙肝病毒e抗原校準品的濃度包括40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.lNCU/mL、ONCU/mL共6個濃度，乙肝病毒e抗體校準品的濃度包括0.4NCU/mL、INCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、0NCU/mL共6個濃度，乙肝病毒c抗體校準品的濃度包括4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、0NCU/mL 共 6 個濃度。
8.如權利要求1所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒，其特征在于所述發光底物液為金剛烷胺衍生物csro。
9.如權利要求1所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟: I)制備鏈霉親和素預包被反應板 鏈霉親和素用包被緩沖液稀釋，取反應板，將稀釋的鏈霉親和素加入反應板中，預包被后，甩去包被緩沖液，再加入封板緩沖液，置37°C恒溫放置2h，去掉封板緩沖液，烘干后，力口干燥劑密封，得鏈霉親和素預包被反應板； 2)制備校準品系列 (1)配制乙肝表面抗原校準品 將高值乙肝表面抗原用校準品稀釋液稀釋，用國家標準品(購自中國生物制品檢定所)重復標定3次，3次標定值，取均值作為標定的表面抗原乙肝表面抗原濃度，所述校準品稀釋液由0.05mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、0.0lmmol/L的氯化鈉的1%的牛血清白蛋白及10%新生牛血清組成,pH值7.4,乙肝表面抗原作標準品濃度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.lng/mL、0ng/mL,分裝成 0.5mL/ 瓶，2 8°C或一20°C存放備用； (2)配制乙肝表面抗體校準品 同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL ； (3)配制乙肝e抗原校準品 同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、ONCU/mL ； (4)配制乙肝e抗體校準品 同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為0.4NCU/mL、INCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、ONCU/mL ； (5)配制乙肝c抗體 校準品 同乙肝表面抗原的配制，其中校準品系列工作濃度為4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、ONCU/mL ； 3)制備生物素標記物 (1)制備乙肝表面抗體生物素標記物 將Img乙肝表面抗體溶于0.lmol/L,pH8.8的硼酸鹽緩沖液0.5ml配成濃度為2mg/ml乙肝表面抗體溶液中，將生物素用二甲亞砜配制成濃度為lmg/ml生物素溶液，按照30 80 μ g/mg的比率，將生物素加入到乙肝表面抗體溶液中，避光振蕩反應4h，10°C，按照每250 μ g生物素加20 μ L的量，加入新鮮配制lmol/L的NH4Cl溶液，避光震蕩反應IOmin后，用PBS避光透析過夜，根據終體積計算抗體的濃度，加入甘油制備乙肝表面抗體生物素標記物； (2)制備乙肝表面抗原生物素標記物、乙肝e抗體生物素標記物和乙肝核心抗原生物素標記物 方法同步驟(I)乙肝表面抗體生物素標記物的制備，所不同的是乙肝表面抗原的濃度為4mg/ml,乙肝e抗體的濃度為lmg/ml,乙肝核心抗原的濃度為0.5mg/ml ； 4)制備堿性磷酸酶標記物 (1)制備乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物 采用改良過碘酸鈉-乙二醇法進行乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記，將獲得的乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L(pH7.5) TBS緩沖液按1: 1000稀釋成工作液，保存于一 20°C ； (2)制備乙肝表面抗體堿性磷酸酶標記物、乙肝e抗體I堿性磷酸酶標記物、乙肝e抗體2堿性磷酸酶標記物和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標記物 方法同步驟(I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標記物的制備； 5)制備中和試劑 將乙肝e抗原配制成lmg/ml濃度作為中和試劑乙肝e抗原； 6)制備發光底物液 取底物稀釋緩沖液450mL，增強劑(10 X) 50mL, lmol/L MgCl2500 μ L，加發光底物金剛烷胺衍生物CSro8000 μ L于滅活容器中，振蕩混勻，避光，密封2 8°C保存，得發光底物液508.5mL ； 7)制備濃縮清洗液 配制0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4) lOOOmL，加20mL的吐溫-20作為濃縮清洗液； 8)組裝乙肝5項化學發光定量檢測試劑盒 將包被微孔反應板、生物素標記物、堿性磷酸酶標記物、中和試劑、校準品、發光底物液、濃縮清洗液組裝成乙肝5項化學發光定量檢測試劑盒。
10.如權利要求9所述乙肝5項化學發光檢測試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述包被緩沖液為pH9.6、50mmol/L的Na2CO3-NaHCO3沖溶液，所述鏈霉親和素稀釋濃度為8 μ g/mL ;所述稀釋的鏈霉親和素的加入量可為每反應板150 μ L ;所述預包被的條件可置37°C恒溫放置2h進行預包被；所述封板緩沖液的加入量可為每反應板加入150 μ L封板緩沖液；所述烘 干的條件可于37°C干燥室烘干2h ;所述封板緩沖液為0.01mol/L TBS-T再加上1%BSA、0.2%明膠；所述干燥室的相對濕度度小于30% ； 在步驟6)中，所述底物稀釋緩沖液為0.05mol/L Tris-HCl, pH9.5。
全文摘要
乙肝5項化學發光檢測試劑盒及其制備方法，涉及一種用于乙肝檢測的試劑盒。試劑盒，包括包被的微孔反應板、生物素標記物、堿性磷酸酶標記物、中和試劑、校準品、發光底物液和濃縮清洗液。分別制備鏈霉親和素預包被反應板、校準品系列、生物素標記物、堿性磷酸酶標記物、中和試劑、發光底物液、濃縮清洗液，組裝乙肝5項化學發光定量檢測試劑盒。制備的乙肝5項化學發光檢測試劑盒不僅可以靈敏檢測出乙肝5項，并且可以對其進行精確的定量鑒定，價格便宜，操作簡單，結果準確，環保無污染，具有長遠的好處。
文檔編號G01N33/535GK103163294SQ201310091509
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月21日 優先權日2013年3月21日
發明者陳巧欽, 嚴小莉, 蔡雅銓, 徐鏡波, 楊家麗, 張長弓 申請人:廈門市波生生物技術有限公司