專利名稱：依諾肝素鈉生產過程中肝素芐基酯的酯化率的檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體地說是一種依諾肝素鈉生產過程中肝素芐基酯的酯化率的檢測方法。
背景技術：
肝素類藥物是抗凝血藥的首選藥物，使用歷史已有70多年，除具有抗凝血、抗血栓作用外，還有降血脂等作用，但具有生物利用度低、副作用大等缺陷，限制了肝素在臨床上的應用。近年來具有高抗栓活性和低出血副作用的新一代抗凝藥物——低分子量肝素(LMWH)被開發上市。新一代抗凝藥的抗血栓作用優于肝素，而抗凝血作用卻低于肝素，并具有生物利用度高、體內半衰期長、出血傾向小、口服易吸收等特點。除用于治療血栓病外，還可抑制動脈粥樣硬化，抗腫瘤、抗炎等，且臨床應用無需監護，用藥便捷。
低分子量肝素(LMWH)(Robert J.Linhardt, PH.D.And Nur Sibel Guany, M.S,Seminar in Thrombosis and Hemostasis，1999，25 (3):5-16)是在分離普通肝素時得到的一些低分子量組分，或肝素裂解后產生的小分子片段，長度約普通肝素的1/3。LMWH分子量在3000-8000Da之間，平均分子量為5000Da左右。與普通肝素相比，通過體內、外實驗發現，在同等劑量下，LMWH的抗凝作用小于肝素，但其體內和體外抗血栓作用明顯強于普通肝素。
依諾肝素鈉(Enoxaparin Sodium)作為其中的一種低分子肝素，占有低分子肝素60%以上的市場份額，是最為主要的低分子肝素。它通過對豬腸粘膜肝素的芐基酯衍生物進行堿解聚而獲得。其中肝素芐基酯的制備中酯化程度的控制是生產工藝的關鍵。
肝素芐基酯的酯化程度直接影響依諾肝素成品中1，6_脫水結構、分子量及其分布、活性等關鍵指標的情況，其酯化率決定了后期降解的工藝參數，從而影響和制約依諾肝素鈉的生產收率和產品成本，但目前還沒有任何一種對肝素芐基酯的酯化率進行檢測的方法面世，造成了酯化率控制的實施困難。發明內容
本發明的技術任務是針對上述現有技術的不足，提供一種依諾肝素鈉生產過程中肝素芐基酯的酯化率的檢測方法。利用該方法可以簡單、快速、準確地監測肝素芐基酯的酯化率，對下一步的降工藝解提供數據支持，從而實現控制依諾肝素鈉成品的1，6脫水結構、分子量及其分布、活性等關鍵指標的目的。
本發明的技術任務是按以下方式實現的:依諾肝素鈉生產過程中肝素芐基酯的酯化率的檢測方法，其特征在于包括以下步驟:
(I)測試液配制
檢測液:稱取一定量的肝素芐基酯樣品，將樣品置于堿性環境下使其發生beta-消除反應以生成苯甲醇，反應一定時間后加入冰乙酸終止反應，并用超純水稀釋定各，備用;
對照液:稱取一定量的苯甲醇標準品，加入超純水溶解，備用；
(2)樣品檢測利用辛基硅膠柱，采用帶紫外檢測器的高效液相色譜儀對步驟(I)所述檢測液和對照液做進樣檢測，并通過如下公式計算得到酯化率X:
權利要求
1.依諾肝素鈉生產過程中肝素芐基酯的酯化率的檢測方法，其特征在于包括以下步驟: (1)測試液配制 檢測液:稱取一定量的肝素芐基酯樣品，將樣品置于堿性環境下使其發生beta-消除反應以生成苯甲醇，反應一定時間后加入冰乙酸終止反應，并用超純水稀釋定容，備用；對照液:稱取一定量的苯甲醇標準品，加入超純水溶解，定容，備用； (2)樣品檢測 利用辛基硅膠柱，采用帶紫外檢測器的高效液相色譜儀對步驟(I)所述檢測液和對照液做進樣檢測，并通過如下公式計算得到酯化率X:
2.根據權利要求1所述的依諾肝素鈉生產過程中肝素芐基酯的酯化率的檢測方法，其特征在于，步驟(I)中檢測液的配制過程為:稱取0.5 1.0g肝素芐基酯樣品于反應容器中，加入IOml的5mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，水浴控溫60 70°C，反應120分鐘，加入IOml冰乙酸終止反應，用超純化水稀釋定容至100ml，搖勻，備用。
3.根據權利要求1所述的依諾肝素鈉生產過程中肝素芐基酯的酯化率的檢測方法，其特征在于，步驟⑵中高效液相色譜儀所用流動相為甲醇、乙腈的混合水溶液，甲醇、乙腈、超純水的體積比為10: 20: 70。
4.根據權利要求1所述的依諾肝素鈉生產過程中肝素芐基酯的酯化率的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中高效液相色譜儀的紫外檢測波長為256nm，流速為1.0±0.lml/min。
5.根據權利要求1所述的依諾肝素鈉生產過程中肝素芐基酯的酯化率的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中辛基硅膠柱的內徑為4.6_，長為150_，每米檢測柱的理論塔板數不低于20000。
全文摘要
本發明公開了一種依諾肝素鈉生產過程中肝素芐基酯的酯化率的檢測方法，屬于生物醫藥領域。該方法采用反相液相色譜法，利用帶紫外檢測器的高效液相色譜儀對肝素芐基酯在堿性環境下脫落生成的苯甲醇進行定量檢測，并以此反映肝素芐基酯的酯化率，從而達到控制依諾肝素鈉成品質量的目的。與現有技術相比，本發明的檢測方法可以簡單、快速、準確地監測肝素芐基酯的酯化率，從而降低依諾肝素鈉成品的不合格風險和企業生產成本，具有很好的推廣應用價值。
文檔編號G01N30/02GK103175925SQ20131008828
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月20日 優先權日2013年3月20日
發明者周霞, 林勇 申請人:山東辰中生物制藥有限公司