專利名稱：一種蛋白質定量分析方法
技術領域：
本發明屬于化學分析領域，尤其涉及一種蛋白質材料定量分析的方法，特別用于指導真絲、合成蛋白質纖維、羽絨等材料的低損傷加工工藝的優化與表征。
背景技術：
目前的蛋白質成分的標準定量分析方法是基于N元素含量測試的凱氏定氮法，這種方法的最大問題是只認N元素，而不考慮其來源，這就給食品、材料等領域中的蛋白質分析帶來很多的麻煩，乃至給不法分子提供了可乘之機，如在奶粉中添加含N量極高的三聚氰胺，造成了及其惡劣的社會問題。同時，絲綢、羊毛、羽絨等蛋白質纖維在染整加工、服用過程中，當經受不合適的酸堿、氧化劑等化學藥劑，或使用中的紫外光照、熱量等外在因素的影響，會造成蛋白質成分損失。中國專利號為CN200910172516.3公開了一種食品中蛋白質含量快速檢測方法，根據樣品中蛋白質與檢測試劑起顯色反應，反應產物在610nm處有最大吸收峰，通過比較不同濃度蛋白質標準樣品的Abs61tl(吸光度)值，制定標準曲線，進而計算待測物中蛋白質的含量，該檢測方法具有檢測方便、測量速度快且檢測成本較低等優點，可以滿足快速檢測蛋白質的需要。但這種檢測方法且需要配制較為復雜的溶液，十二烷基鹽組合等多種助劑的加入將使溶液渾濁，直接影響測量吸光度值的準確性，且蛋白質材料中多糖類等其他非蛋白質成分可與染料形成基色，測量不能真實反映蛋白質吸光值，并且本方法測量對象較為局限。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種準確度高、實驗簡便易行的蛋白質材料中蛋白質定量分析的方法。為了實現上述目的，本發明采取的技術方案為提供一種蛋白質定量分析方法，包括如下步驟:(I)制備芳香胺類重氮鹽；(2)蛋白質材料與芳香胺類重氮鹽進行重氮偶合；(3)對上述重氮偶合產物進行光譜測試；(4)根據光譜特征建立吸光度與酪氨酸含量的標準曲線；(5)取待測樣品經上述前三個步驟處理后得到其重氮偶合產物的吸光度；(6)根據上述標準曲線的線性關系推導出其酪氨酸含量；(7)根據待測樣品的酪氨酸含量，推導出其蛋白質含量。優選的，所述的蛋白質材料為絲素粉、絲素膜、酪素、羊毛粉、真絲、合成蛋白質纖維或羽絨材料。優選的，所述的芳香胺類重氮鹽為苯胺重氮鹽、鄰硝基苯胺重氮鹽、間硝基苯胺重氮鹽、對硝基苯胺重氮鹽或者間苯二胺重氮鹽。優選的，所述的蛋白質材料為親水性，將蛋白質材料與重氮鹽進行浸染偶合工藝。
優選的，所述的蛋白質材料為疏水性，將蛋白質材料溶于有機溶劑后再與重氮鹽進行浸染偶合工藝。優選的，所述的吸光度采用分光光度計測試。采用本發明的技術方案，不需要對蛋白質材料進行水解，消除了水解過程對蛋白質測試精確度的影響，同時本發明還可以消除含N元素色素或染料對材料蛋白質分析結果的影響，本方法簡便易行、測量更準確、測試對象更廣，通過對偶合反應溫度和時間的控制，得到的重氮偶合產物較純，便于后面光譜測量的進行。對于蛋白質材料采取浸染偶和工藝使蛋白材料與重氮鹽充分發生偶合反應。對于親水性蛋白質材料，保證重氮鹽稍過量；對于疏水性蛋白質材料，將材料溶于有機溶劑，便于偶合反應的充分進行。本發明方法為蛋白質定量分析提供一種全新的思路，實驗操作簡便，具有重要的科學意義和實際應用的價值。
圖1是本發明酪氨酸殘基重氮偶合反應機理圖；圖2是本發明的偶合反應裝置，其中:1_攪拌機，2-溫度計，3-滴液漏斗，4-三口燒瓶，5-低溫浴槽；圖3是本發明實施例偶合產物的光譜側視圖；圖4是本發明根據光譜特征建立的吸光度與酪氨酸含量的標準曲線。
具體實施例方式芳香族伯胺和亞硝酸作用生成重氮鹽的反應稱為重氮化。Ar-NH2+2HX+NaN02- — Ar-N2X+NaX+2H20重氮化反應要在強酸中進行，實際上是亞硝酸作用于銨離子。由于亞硝酸不穩定，通常使用亞硝酸鈉和鹽酸或硫酸，使反應生成的亞硝酸立刻與芳伯胺反應，避免亞硝酸的分解。為了使反應能順利進行，必須首先把芳伯胺轉化為銨正離子。芳胺的堿性較弱，因此重氮化要在較強的酸中進行。有些芳胺堿性非常弱，要用特殊的方法才能進行重氮化。重氮化是放熱反應，重氮鹽對熱不穩定，因此要在冷卻的情況下進行，并調節亞硝酸鈉的加入速度，維持反應溫度在0°c附近，由于重氮鹽不穩定，一般就用它們的溶液，隨做隨用。自重氮化反應發現以來，人們為了弄清楚其反應的影響因素，對重氮化反應的機理進行了反復研究，已普遍接受了重氮化反應的亞硝化學說即重氮化反應是由亞硝酸產生的親電質點對游離芳伯胺基進行親電取代反應的機理。蛋白質材料中各氨基酸成分與比例是相對固定的，材料的聚集態結構，即無定形區的比例也是相對固定的。蛋白質材料特別是纖維材料的無定形區中，各氨基酸殘基可以表現出其特征的反應活性，如酪氨酸殘基對羥基苯亞甲基，即可發生特征的重氮偶合反應。本發明中蛋白質材料中酪氨酸殘基與重氮鹽發生重氮偶合特征反應后，其蛋白質母體將會產生特殊的光譜特性，通過酪氨酸重氮偶合產物特征波長下吸光度數值即可定量分析出酪氨酸殘基的含量，進而推導出蛋白質成分的含量。重氮偶合顯色反應機理如圖1所示。重氮偶合產物具有在紫外可見光譜中，具有特征吸收波長，吸收峰值與成分含量對應。1、制備芳香胺類重氮鹽:鄰硝基苯胺重氮鹽；在帶有電動攪拌機和冷凝器的三口燒瓶中，加入10± Iml濃鹽酸和10±2ml水，劇烈攪拌，然后緩緩加入0.03±0.0Olmol鄰硝基苯胺，加熱至75°C左右，攪拌使之充分溶解，然后加入冰水，將溫度降至0°C，稱取0.032mol亞硝酸鈉，溶解于水中，向含有鄰硝基苯胺的三口燒瓶中緩慢滴加亞硝酸鈉溶液，并將反應溫度保持在0°C，滴加結束后繼續反應20min，用淀粉-碘化鉀試紙檢測亞硝酸是否過量，待反應結束后，用尿素除去過量的亞硝酸，再攪拌lOmin，得到澄清透明的鄰硝基苯胺重氮鹽黃色溶液，最后保存在冰水中待用。2、蛋白質材料與芳香胺類重氮鹽進行重氮偶合；如圖2所示，在帶有電動攪拌機I和冷凝器6的三口燒瓶4中，把絲素粉混合物加入到含有碳酸鈉的溶液，由溫度計2觀察反應溫度，并通過低溫浴槽5使反應溫度控制在2°C;劇烈攪拌，然后通過滴液漏斗3逐滴加入鄰硝基苯胺重氮鹽溶液，滴加結束后繼續反應2h，最后用滲圈法檢測反應終點。反應結束后將其酸析、靜置，隔夜抽濾，室溫下陰干得到黃色重氮偶合產物。3、對上述重氮偶合產物進行光譜測試；通過分光光度計的測試，鄰硝基苯胺重氮鹽與絲素粉的偶合產物在DMF中的吸收光譜如圖3所示，最大吸收波長處在紫外線的UVA波段，在328nm處有最大吸收峰，記錄此處的吸光度值。4、根據光譜特征建立吸光度與酪氨酸含量的標準曲線；絲素粉中酪氨酸含量是公知的，從而在已知絲素粉混合物濃度的情況下可計算出酪氨酸的濃度。再通過上述方法測量不同絲素粉混合物濃度下重氮偶合產物的特征(最大吸收峰值)吸光度值，繪制吸光度-酪氨酸含量標準曲線，如圖4所示。5、取待測樣品經上述前三個步驟處理后得到其重氮偶合產物的吸光度，即特征(最大吸收峰值)吸光度值。6、根據上述標準曲線的線性關系推導出其酪氨酸含量，即通過吸光度值，根據吸光度-酪氨酸含量標準曲線圖可得出其對應的酪氨酸含量。7、根據待測樣品的酪氨酸含量，推導出其蛋白質含量。酪氨酸含量在蛋白中的占比是固定的，通過氨基酸分析儀測定待測樣品中酪氨酸的占比，進而通過酪氨酸的含量除以該占比即可推導出蛋白質含量。
權利要求
1.一種蛋白質定量分析方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)制備芳香胺類重氮鹽； (2)蛋白質材料與芳香胺類重氮鹽進行重氮偶合； (3)對上述重氮偶合產物進行光譜測試； (4)根據光譜特征建立吸光度與酪氨酸含量的標準曲線； (5)取待測樣品經上述前三個步驟處理后得到其重氮偶合產物的吸光度； (6)根據上述標準 曲線的線性關系推導出其酪氨酸含量； 根據待測樣品的酪氨酸含量，推導出其蛋白質含量。
2.按照權利要求1所述的一種蛋白質定量分析方法，其特征在于:所述的蛋白質材料為絲素粉、絲素膜、酪 素、羊毛粉、真絲、合成蛋白質纖維或者羽絨材料。
3.按照權利要求1或2所述的一種蛋白質定量分析方法，其特征在于:所述的芳香胺類重氮鹽為苯胺重氮鹽、鄰硝基苯胺重氮鹽、間硝基苯胺重氮鹽、對硝基苯胺重氮鹽或者間苯二胺重氮鹽。
4.按照權利要求1或2所述的一種蛋白質定量分析方法，其特征在于:所述的蛋白質材料為親水性，將蛋白質材料與重氮鹽進行浸染偶合工藝。
5.按照權利要求1或2所述的一種蛋白質定量分析方法，其特征在于:所述的蛋白質材料為疏水性，將蛋白質材料溶于有機溶劑后再與重氮鹽進行浸染偶合工藝。
6.按照權利要求1所述的一種蛋白質定量分析方法，其特征在于:所述的吸光度采用分光光度計測試。
全文摘要
本發明公開了一種蛋白質定量分析方法，屬于蛋白質材料分析領域，利用蛋白質中游離酪氨酸或酪氨酸殘基重氮偶合產物的紫外可見光譜特性，建立吸光度與酪氨酸含量的標準曲線，實現對酪氨酸的定量分析，進而推導出蛋白質成分的含量，本發明測試對象廣，不需要對蛋白質材料進行水解，消除了水解過程對蛋白質測試精確度的影響，消除含N元素色素或染料對材料蛋白質分析結果的影響，測量簡便易行、準確度高。
文檔編號G01N21/31GK103207154SQ20131008444
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者王宗乾, 李長龍, 陳維國, 孫瑞霞 申請人:安徽工程大學