專利名稱：一種快速測定胰蛋白酶的比色分析方法
技術領域：
本發明涉及胰蛋白酶檢測技術領域，特別涉及一種快速測定胰蛋白酶的比色分析方法。
背景技術：
胰蛋白酶是胰液的一種成分,是胰腺分泌的一種蛋白水解酶。作為一種肽鏈內切酶，它能夠切斷多肽鏈中賴氨酸與精氨酸殘基中的羥基側。胰蛋白酶是一種重要的蛋白質消化酶，能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶。它在醫藥、食品、生化研究中有著廣泛的應用。另外，胰蛋白酶的含量也是胰腺類相關疾病的臨床診斷的一個重要標志物。因此，胰蛋白酶的定量檢測對于人體健康、生產質量控制等領域有著重要的作用。現在常見的檢測胰蛋白酶的方法有熒光光度法、電化學法、石英晶體微量天平傳感器等。上述方法大多需要大型、較昂貴設備的支持，檢測成本較高，不適合常規的分析檢測，因此需要發展一種簡單、成本低又靈敏的檢測方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測胰蛋白酶的即簡單又靈敏的方法，本發明所述方法對胰蛋白酶含量的檢測選擇性強。本發明提供一種快速測定胰蛋白酶的比色分析方法，包括以下步驟:步驟一，利用表面修飾劑和還原劑合成多肽修飾的銀納米顆粒；步驟二，檢測多肽修飾的銀納米顆粒的紫外-可見光譜；步驟三，將胰蛋白酶與合成的銀納米顆粒進行顯色反應；步驟四，顯色反應終點再檢測反應產物的紫外-可見光譜；步驟五，計算合成的納米材料的吸光值峰值與反應產物的吸光值峰值的差值，根據差值與預定的標準曲線比對，得到胰蛋白酶的含量。優選的，所述多肽包含賴氨酸，且所述多肽至少一個末端為半胱氨酸，其濃度為
0.1 u M-5 u M0優選的，所述利用表面修飾劑和還原劑將多肽與銀離子合成銀納米顆粒還包括以下步驟:a、將表面修飾劑于銀離子可溶性鹽溶液混合，進行電磁攪拌；b、將還原劑加入上述混合溶液中，反應得到表面修飾劑修飾的水溶性銀納米顆粒;C、將多肽分子與銀納米顆粒溶液混合，進行攪拌，通過半胱氨酸側鏈的巰基共價連接到銀納米顆粒表面。優選的，所述的表面修飾劑可選擇巰基乙酸、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、十六烷基三甲基溴化銨、朽1檬酸三鈉中的任一種。優選的，所述的銀離子的可溶性鹽可選擇氟化銀，硝酸銀，高氯酸銀中的任一種或混合物。優選的，所述的還原劑為硼氫化鈉、抗壞血酸、水合肼、葡萄糖、甲醇、甲酸或甲醛任一種。本發明提供一種胰蛋白酶含量的檢測方法，包括以下步驟:檢測多肽修飾的銀納米顆粒的紫外-可見光譜；將胰蛋白酶與合成的銀納米顆粒進行顯色反應；顯色反應終點再檢測反應產物的紫外-可見光譜；計算合成的納米材料的吸光值峰值與反應產物的吸光值峰值的差值，根據差值與預定的標準曲線比對，得到胰蛋白酶的含量。本發明提供的方法以銀納米顆粒為檢測手段，所述銀納米顆粒包含多肽和銀離子，利用胰蛋白酶使銀納米顆粒空間分布的變化導致吸光度的變化的性質，采用顯色反應和紫外-可見光譜對胰蛋白酶的含量進行檢測。胰蛋白酶通過作用于附著在銀納米顆粒上的多肽使銀納米顆粒的空間分布發生變化，從而使反應產物出現顏色變化。本發明的有益效果是，本發明的銀納米顆粒對于可見光范圍的光具有非常強的吸收，對胰蛋白酶具有非常靈敏的選擇性相應。此外，本發明所用銀納米顆粒制備方法簡單，常溫下即可進行，成本低，測定簡便快捷。本發明所述比色法是一種非常簡便的分析方法，通過比色法中所述顯色反應可以用肉眼直接判斷出反應是否停止，即可準確判斷反應終點，操作簡單。本發明所述的比色法對胰蛋白酶具有高靈敏的選擇性響應，最低檢測濃度達到2ng/mL。本發明提供的檢測方法無須進行復雜的化學修飾或信號標記，抗干擾能力強，能快速、精確的實現對胰蛋白酶的檢測，適于在臨床應用，如胰腺炎等疾病的診斷。
圖1是本發明制備的銀納米顆粒在不同蛋白質存在時的吸光度變化圖。圖2是本發明實施例中制備的銀納米顆粒在加入胰蛋白酶前后的吸收光譜圖對比。圖3是本發明實施例中預定的標準曲線。
具體實施例方式本發明提供一種快速測定胰蛋白酶的比色分析方法，包括以下步驟:步驟一，利用表面修飾劑和還原劑將合成多肽修飾的銀納米顆粒；步驟二，檢測多肽修飾的銀納米顆粒的紫外-可見光譜；步驟三，將胰蛋白酶與合成的銀納米顆粒進行顯色反應；步驟四，顯色反應終點再檢測反應產物的紫外-可見光譜；步驟五，計算合成的納米材料的吸光值峰值與反應產物的吸光值峰值的差值，根據差值與預定的標準曲線比對，得到胰蛋白酶的含量。胰蛋白酶是胰液的一種成分，是胰腺分泌的一種蛋白水解酶。作為一種肽鏈內切酶，它能夠切斷多肽鏈中賴氨酸與精氨酸殘基中的羥基側。胰蛋白酶是一種重要的蛋白質消化酶，能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶。它在醫藥、食品、生化研究中有著廣泛的應用。本發明提供的方法以銀納米顆粒為檢測手段，所述銀納米顆粒包含多肽和銀，利用胰蛋白酶使銀納米顆粒空間分布的變化導致吸光度的變化的性質，采用顯色反應和紫外-可見光譜對胰蛋白酶的含量進行檢測。本發明所述利用表面修飾劑和還原劑將多肽與銀離子合成銀納米顆粒還包括以下步驟:a、將表面修飾劑于銀離子可溶性鹽溶液混合，進行電磁攪拌；b、將還原劑加入上述混合溶液中，反應得到表面修飾劑修飾的水溶性銀納米顆粒;C、將多肽分子與銀納米顆粒溶液混合，進行攪拌，通過半胱氨酸側鏈的巰基共價連接到銀納米顆粒表面。本發明所述銀納米顆粒具有獨特的光學性質:摩爾吸光系數大，并且局部表面等離子光譜與銀納米顆粒間的距離相關。本發明所述，當銀納米顆粒與待測樣品混合后，在待測樣品中存在的胰蛋白酶的催化作用下，多肽發生斷裂，殘留在銀納米顆粒表面的多肽電性與銀納米顆粒表面的電性相反，起到中和作用，因此銀納米顆粒之間的靜電排斥力削弱，從而銀納米顆粒出現聚集的現象，使得銀納米顆粒的局域表面等離子體共振光譜發生變化，從而可以通過該光譜分析銀納米顆粒的微觀結構特性，實現對胰蛋白酶的定量分析。在本發明中，所述多肽包含氨基酸數量優選為2 50個，含氨基酸數量更優選為3 20個，多肽包含氨基酸數量決定著銀納米顆粒的空間結構的復雜程度，越短的多肽鏈越容易被胰蛋白酶水解，達到檢測胰蛋白酶濃度的目的；所述多肽包含氨基酸種類優選為賴氨酸，且所述多肽至少一個末端為半胱氨酸，其濃度為0.1 μ Μ-5 μ Mo所述的銀離子的可溶性鹽優選為氟化銀，硝酸銀，高氯酸銀中的任一種或混合物，更優選為硝酸銀，因為硝酸銀是實驗室條件下最常見的銀離子的可溶性鹽；所述的表面修飾劑優選為巰基乙酸、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、十六烷基三甲基溴化銨、檸檬酸三鈉中的任一種，更優選為檸檬酸三鈉，檸檬酸三鈉為無機鹽，較其他表面修飾劑化學性質穩定，容易存放，價格低；所述的還原劑優選為硼氫化鈉、抗壞血酸、水合肼、葡萄糖、甲醇、甲酸或甲醛任一種。得到混合溶液以后，本發明將所述混合溶液置于20°C 100°C的溫度下并攪拌，使所述銀離子與所述多肽進行初步反應，所述反應的時間優選為30分鐘 480分鐘，所述顯色反應時間為I分鐘 30分鐘。本發明對所述攪拌沒有特殊限制，采用本領域技術人員熟知的攪拌的技術方案即可，所述步驟a中電磁攪拌的目的是使表面修飾劑可以修飾于銀離子表面，步驟c中攪拌的目的是讓反應更充分，也減少了反應時間。得到銀納米顆粒后，檢測得到銀納米顆粒的紫外-可見光譜，本發明對所述銀納米顆粒的紫外-可見光譜檢測方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員熟知的紫外-可見光譜法即可。在本發明中，優選將所述銀納米顆粒置于室溫，靜置后測定其吸光度值。本發明對所述銀納米顆粒水溶液的濃度沒有特殊限制，采用本領域技術人員熟知的銀納米顆粒水溶液的濃度即可，所述測定的可見光波長優選為300nm 500nm,更優選為350nm 450nmo
得到銀納米顆粒后，本發明將胰蛋白酶與銀納米顆粒混合，得到混合溶液，進行反應得到反應產物，檢測所述反應產物的紫外-可見光譜。本發明所述檢測方法，所述胰蛋白酶與銀納米顆粒混合溶液中，銀納米顆粒與胰蛋白酶發生反應，具體為在胰蛋白酶的催化作用下，多肽發生斷裂，殘留在銀納米顆粒表面的多肽電性與銀納米顆粒表面的電性相反，起到中和作用，因此銀納米顆粒之間的靜電排斥力削弱，從而使銀納米顆粒發生聚集，銀納米顆粒空間分布上的變化導致出現顯色反應，得到胰蛋白酶與銀納米顆粒的反應產物后，根據顯色反應終點，檢測所述反應產物的紫外-可見光譜。本發明對所述反應產物紫外-可見光譜的檢測方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員熟知的紫外-可見光譜的測定方法即可，在本發明中，所述反應產物的紫外-可見光譜的測定與上述技術方案中檢測銀納米顆粒的紫外-可見光譜的過程相同。根據上述技術方案得到反應產物的紫外-可見光譜后，本發明計算所述銀納米顆粒的紫外-可見光譜的峰值與所述反應產物的紫外-可見光譜峰值的差值，根據所述差值與預定的標準曲線，得到胰蛋白酶的含量。在本發明中，所述標準曲線優選按照以下方法獲得:檢測得到銀納米顆粒的紫外-可見光譜；將用待測樣品配置的胰蛋白酶的標準溶液與銀納米顆粒反應，得到反應產物，檢測所述反應產物的紫外-可見光譜；計算所述銀納米顆粒的紫外-可見光譜的峰值與所述反應產物的紫外-可見光譜的峰值的差值，根據所述差值與胰蛋白酶標準溶液的濃度，得到標準曲線。在本發明中，獲得標準曲線中對銀納米顆粒紫外-可見光譜的檢測方法與上述技術方案中所述檢測銀納米顆粒紫外-可見光譜的過程相同。本發明將胰蛋白酶的標準溶液與銀納米顆粒反應，得到反應產物，檢測所述反應產物的紫外-可見光譜。根據每次檢測樣品的不同要繪制不同的標準曲線，本發明對所述胰蛋白酶標準溶液的配制沒有特殊限制，采用本領域技術人員熟知的胰蛋白酶標準溶液的配制方案即可。在本發明中，根據上述技術方案得到胰蛋白酶標準溶液與銀納米顆粒的反應產物后，本發明檢測所述反應產物的紫外-可見光譜，得到銀納米顆粒與胰蛋白酶標準溶液的反應產物的紫外-可見光譜。本發明所述檢測反應產物紫外-可見光譜的過程與上述技術方案中對胰蛋白酶與銀納米顆粒反應產物的紫外-可見光譜的檢測過程相同。根據上述技術方案得到銀納米顆粒與所述反應產物的紫外-可見光譜后，計算得到所述銀納米顆粒的紫外-可見光譜的峰值與所述反應產物的紫外-可見光譜的的峰值的差值，根據所述胰蛋白酶標準溶液的質量濃度與其對應的差值，得到標準曲線。在本發明中，以所述胰蛋白酶標準溶液質量濃度為橫坐標，以所述銀納米顆粒的紫外-可見光譜的峰值與所述反應產物的紫外-可見光譜的峰值的差值為縱坐標，繪制得到標準曲線。得到標準曲線后，根據所述標準曲線與上述技術方案得到的銀納米顆粒的紫外-可見光譜的峰值與胰蛋白酶的紫外-可見光譜的峰值的差值，得到胰蛋白酶的含量。為了進一步說明本發明，以下結合實施例和附圖對本發明提供的胰蛋白酶含量的檢測方法進行詳細描述，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施，但不能將他們理解為對本發明保護范圍的限定。如圖2所示
實施例1:a、將硝酸銀水溶液與檸檬酸三鈉溶液混合成IOOmL溶液，終濃度均為0.25mM,并進行電磁攪拌；b、將3mLNaBH4 (IOmM)溶液加入到上述溶液中，常溫下攪拌，反應30分鐘，得到水溶性銀納米顆粒。c、0.2μM含3個氨基酸的多肽與銀納米顆粒混合，24小時后，將未共價吸附在銀納米顆粒表面的多肽通過離心法去除。d、將上述溶液與含有胰蛋白酶的待測溶液混合，顯色反應10分鐘后觀察顏色，并記錄吸收光譜。本實施例中顯色反應混合溶液由黃色逐漸變為無色；根據圖2得到的銀納米顆粒的吸光度值峰值、反應產物的吸光度值峰值分別為0.45,1.40，計算得到兩者的差值是
0.95，根據圖3得到待測樣品胰蛋白酶含量為285ng/mL。實施例2:a、將硝酸銀水溶液與檸檬酸三鈉溶液混合成IOOmL溶液，終濃度均為0.25mM,并進行電磁攪拌；b、將3mLNaBH4 (IOmM)溶液加入到上述溶液中，常溫下攪拌，反應30分鐘，得到水溶性銀納米顆粒。(:、0.2 4]\1含3個氨基酸的多肽與銀納米顆粒混合，24小時后，將未共價吸附在銀納米顆粒表面的多肽通過離心法去除。d、將上述溶液與含有堿性磷酸酶ALP待測溶液混合，顯色反應10分鐘后觀察顏色，并記錄吸收光譜。本實施例中顯色反應混合溶液顏色幾乎無變化；得到的反應產物的吸光度值峰值、銀納米顆粒的吸光度值峰值和兩者的差值分別為0.45，0.45，0.00，與標準曲線對比得到結果是，待測樣品胰蛋白酶含量為Ong/mL。如圖1所示，實施例1和實施例2進行的對比實驗，證明了本檢測方法對胰蛋白酶的特異性檢測。盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的實施例。
權利要求
1.一種快速測定胰蛋白酶的比色分析方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一，利用表面修飾劑和還原劑合成多肽修飾的銀納米顆粒； 步驟二，檢測多肽修飾的銀納米顆粒的紫外-可見光譜； 步驟三，將胰蛋白酶與合成銀納米顆粒進行顯色反應； 步驟四，顯色反應終點再檢測反應產物的紫外-可見光譜； 步驟五，計算合成的銀納米顆粒的吸光值峰值與反應產物的吸光值峰值的差值，根據差值與預定的標準曲線比對，得到胰蛋白酶的含量。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述多肽所含氨基酸數量為2 50個。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述多肽所含氨基酸數量為3 20個。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述多肽包含賴氨酸，且所述多肽至少一個末端為半胱氨酸，其濃度為0.1 μ Μ-5 μ Μ。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟一還包括以下步驟: a、將表面修飾劑于銀離子可溶性鹽溶液混合，進行電磁攪拌； b、將還原劑加入上述混合溶液中，反應得到表面修飾劑修飾的水溶性銀納米顆粒； C、將多肽分子與銀納米顆粒溶液混合，進行攪拌，通過半胱氨酸側鏈的巰基共價連接到銀納米顆粒表面。
6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述的表面修飾劑可選擇巰基乙酸、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、十六烷基三甲基溴化銨、檸檬酸三鈉中的任一種。
7.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述的銀離子的可溶性鹽可選擇氟化銀，硝酸銀，高氯酸銀中的任一種或其混合物。
8.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所用的還原劑為硼氫化鈉、抗壞血酸、水合肼、葡萄糖、甲醇、甲酸或甲醛任一種。
全文摘要
本發明公開了一種快速測定胰蛋白酶的比色分析方法。包括以下步驟檢測銀納米顆粒的紫外-可見光譜；將胰蛋白酶與多肽修飾銀納米顆粒進行顯色反應；顯色反應終點再檢測反應產物的紫外-可見光譜；計算銀納米顆粒的吸光值峰值與反應產物的吸光值峰值的差值，根據差值與預定的標準曲線比對，得到胰蛋白酶的含量。本發明提供的檢測方法對胰蛋白酶具有高靈敏的選擇性響應，最低檢測濃度達到2ng/mL，本發明提供的檢測方法無須進行復雜的化學修飾或信號標記，抗干擾能力強，能快速、精確的實現對胰蛋白酶的檢測，適于在臨床應用，如胰腺炎等疾病的診斷。
文檔編號G01N21/31GK103175800SQ20131007695
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月11日 優先權日2013年3月11日
發明者繆鵬, 韓坤, 程文播, 劉濤, 殷建 申請人:中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所