專利名稱：一種穩定性高的人源抗vegf抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質工程領域，尤其是涉及治療用人源抗血管內皮細胞生長因子(VEGF)抗體的體外熱穩定性改造，具體地，涉及針對一株抗VEGF人源抗體，通過計算機分子模擬技術對抗體進行結構模建，并對影響抗體結構穩定性的氨基酸進行定點突變，通過實驗對突變體進行親和力和熱穩定性的評價，篩選獲得了熱穩定性明顯提高的突變體抗體。
背景技術：
與其他蛋白藥物相比，抗體藥物具有結構穩定、易于表達純化、易于儲存及體內半衰期長等特點，這也是其成為生物制藥領域領軍力量的重要原因之一。抗體的結構穩定性是影響其能否成為一個好的臨床藥物分子的重要因素之一，良好的結構穩定性是維持抗體與抗原特異性結合能力的基礎。抗體結構穩定性研究不僅是生物物理學中蛋白質折疊理論的重要組成部分，也是治療性抗體開發過程中必須面對的問題。結構穩定性不僅影響抗體的表達、純化和儲存，也影響其在體內與靶標抗原結合的親和力和特異性，從而導致其體內生物學活性的丟失或毒副作用的增加。
人們對抗體穩定性的關注伴隨著治療性抗體產業的整個發展過程。對影響抗體結構穩定性的因素以及引發其結構不穩定的機制也進行了較深入的研究。熱失活是抗體結構的不穩定最常見的形式， 評價抗體抗熱失活能力是評價其結構穩定性的重要指標。
抗體的熱穩定性從本質上是指,抗體的天然態(Native state)與其去折疊態(Unfolded state)之間的自由能之差，即折疊自由能。理論上,抗體熱穩定性越高,其抗熱失活能力越強，這對抗體的開發具體重要的意義。首先，抗體的熱穩性越高，則其新生肽鏈在細胞內裝配時產生錯折疊(mis-folding)的概率越低，從而可溶性表達量也越高。因此，提高抗體的穩定性，可以大幅降低生產成本，從而使得藥物便于普及。其次，近十年的研究還表明，抗體的熱穩定性與其在體內對各種蛋白酶的耐受性是相關的。抗體熱穩定性越高，則其結構折疊的越緊湊，進而其內部的蛋白酶切位點越不容易暴露在外，因此在體內越不容易被蛋白酶降解，從而使得其在相同體內清除速度下在體內的剩下有效成分越多，而這在客觀上使得在給藥劑量相同的情況下其血藥濃度越高。更重要的是，抗體的穩定性是其行使正確生物學功能的保障，抗體穩定性越高，其在體內保持生物活性的時間也越長。由此可見，較高的熱穩定性，是一株治療性抗體能否最終走上臨床并投放市場的關鍵因素之一。除此以外，抗體的熱穩定性對于其保質期及存放條件等性質也是至關重要的。熱穩定越高，則在相同條件下的保存時間也就越長，而且對保存環境的要求也相對較低一而這在一定程度上也降低了抗體的儲存和物流成本。因此，在保證抗體親和力、特異性及表達量等性質不受太大影響的情況下，最大程度上提高其熱穩定性，對于抗體藥物研發具有重要的現實意義與應用價值。
目前，針對抗體穩定性改造的比較經典的幾種方法包括:⑶R移植的方法，基于晶體結構的計算機輔助分子設計、基于抗體同源模建的計算機輔助分子設計、基于蛋白質折疊理論指導下的分子改造策略以及基于已有結構知識的分子改造策略等。在以往的研究中，針對抗體穩定性改造成功的報道很多，其所采用的方法也不盡相同。通過上述的一種或幾種方法的應用，均有成功案例的報道。盡管這些技術方法還未形成成熟的技術體系，但這些研究卻為更深入的了解抗體結構穩定性提供了大量的素材。
由于抗體包括輕、重鏈兩條鏈，因此其結構比較復雜，其整體結構的穩定性取決于:輕鏈和重鏈各自的穩定性、輕重鏈之間的界面穩定性及鉸鏈區穩定性等幾個方面，而輕重鏈的穩定性又細分為局部穩定性和整體穩定性。從影響蛋白結構穩定性的影響因素分析，影響局部穩定性因素包括局部結構熵、折疊和去折疊自由能、β轉角位置及類型、特殊氨基酸如Pro和Gly所處位置是否合理、內部和表面氨基酸與其所處環境十分和諧及增加關鍵部位的氫鍵和其他有利于結構穩定的作用力等，而分子的整體穩定性除了取決于局部穩定性之外，還應考慮分子整體的去折疊次序和去折疊能量勢壘等分子的熱動力學特征。這些都是指導抗體穩定性改造的重要思路和技術方法。
抗體分子是一類較特殊的蛋白分子，其結構除重鏈CDR3變化巨大外，其他5個CDR區及框架區的結構變化較小，大部分抗體在除HCDR3以外的部分具有較相似的標準化結構特征。抗體的這種結構特征，為將計算機輔助藥物設計(Computer Aided Drug Design,CADD)用于抗體的分子改造提供了可能。目前，通過計算機輔助分子設計的方法提高抗體結構穩定性的成功案例很多。從本質上來講，CADD是分子模擬(molecular modeling)方法在制藥領域的綜合應用。隨著分子模擬理論的完善及技術的進步，分子模擬方法正越來越多地被用于蛋白質結構-功能關系、蛋白質與配體的相互識別以及藥物設計的研究工作當中。現在，分子模擬方法在某些方面已經成為實驗研究難以替代的手段。按照分子模擬方法的理論基礎，可將其大致 分為三類，即基于牛頓力學，基于量子力學和基于知識的分子模擬方法。其中基于牛頓力學的分子模擬方法包括分子動力學模擬(molecular dynamicssimulation)、分子對接(molecular docking)和同源模建(homology modeling)等各種經典方法。其優點是理論基礎扎實，計算速度較快，且在絕大多數情況下計算結果可靠，因此成為了當今分子模擬領域的主流方法。
計算機輔助分子模擬為了解抗體及復合物的結構提供了良好的平臺支持，近年來，通過計算機輔助分子模擬對抗體分子進行設計或改造，尤其是對抗體進行體外親和力成熟的成功報道越來越多，證明該技術在抗體研制領域具有重要的作用，國際上甚至開始嘗試通過計算機模擬篩選的方法獲得所需要的目標抗體。然而，由于我國的抗體藥物開發起步較晚，相關的技術方法體系還處于建立初期，少有利用計算機分子分子設計進行抗體分子優化的報道，尤其尚未發現將其用于抗體穩定性改造的報道。
申請人一直從事原創性治療性抗體的研發工作，通過自構建的大容量人抗體資源庫技術獲得了一些原創性候選抗體品種。在VEGF靶標抗原治療性抗體的研究中，申請人獲得了一株在體外具有和貝伐單抗中和活性相當的抗體分子，有望成為全新的抗VEGF候選藥物。但其結構穩定性較差。因此需要獲得穩定性明顯改善的突變體抗體分子，為其進一步開發抗VEGF藥物奠定基礎，同時也希望完善對抗體分子物理結構穩定性的理論認識以及計算機輔助藥物分子設計在該領域的不足和缺陷，為其他抗體藥物的改造提供技術和理論支持。發明內容
本發明的目的在于提供熱穩定性明顯提高的抗VEGF抗體及其活性片段。
本發明的第二個目的在于提供抗VEGF抗體的應用。
本發明運用計算機分子模擬技術對一株熱穩定性和體外放置穩定性很差的抗VEGF功能抗體的可變區進行了全方面穩定性改造，通過親和力和穩定性篩選，最終獲得了多個親和力基本不變，但對該抗體穩定性具有正向作用的輕、重鏈突變位點，并進一步證實這些突變位點可以進一步通過疊加突變，使抗體熱穩定性進一步提高。最終其熱穩定性較親本抗體提高7°C以上。
本發明提供的抗體，各種抗體形式均包含在內。如，抗VEGF抗體可以是全抗體或抗體片段。進而，抗體可以被標記檢測標簽，固定在固相或交聯異源復合物(如細胞毒性物質)。抗體可以做診斷或治療用。在診斷應用時，本發明提供一種檢測VEGF蛋白存在的方法。用于這一用途，本發明提供一試劑盒，包括抗體和用于檢測的技術說明。
本發明提供的人源抗VEGF抗體，其輕鏈可變區的含有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，其重鏈可變區含有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；或
其輕鏈可變區含有如SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，其重鏈可變區含有如SEQID N0.2所示的氨基酸序列。
其中，SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列是發明人先期研發的人源抗VEGF抗體Amv6(其輕、重鏈可變區的氨基酸序列及編碼基因分別見SEQ ID N0.3、4和SEQ ID N0.9,11,Amv6抗體的相關序列也可參見中國專利ZL201210533178.3)的輕鏈可變區的氨基酸突變序列；SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列是Amv6抗體的重鏈可變區的氨基酸突變序列；SEQ IDN0.7所示的氨基酸序列是發明人先期研發的人源抗VEGF抗體Amv4 (其輕鏈可變區編碼基因見SEQ ID N0.10)的輕鏈可變區的氨基酸突變序列。
進一步，本發明提供的穩定性高的抗VEGF抗體，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，其重鏈可變區的氨基酸如SEQ ID N0.4所示。其中SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列為本發明發現的突變位點疊加后的輕鏈可變區，這些突變位點包括:這些突變位點包括:L21突變為I，V29突變為I，G52突變為A，S54突變為N，T57突變為P，A61突變為D，G97突變為P ；SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列為Amv6抗體的重鏈可變區。
本發明提供的穩定性高的抗VEGF抗體，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ IDN0.3所示，其重鏈可變區的氨基酸如SEQ ID N0.6所示。SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列為Amv6抗體的輕鏈可變區，SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列為本發明發現的突變位點疊加后的重鏈可變區，這些突變位點包括:S31突變為D，G53突變為P，A88突變為P。
更優選地，本發明的輕、重鏈上的這些單點定向突變可以進一步疊加，最終產生如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的輕鏈和重鏈氨基酸序列。其與親本抗體的重鏈即SEQID N0.4、輕鏈即SEQ ID N0.3組合后抗體的熱穩定性進一步提高。
SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6組合后所產生的抗體其熱穩定性最高，較親本抗體提高TC以上。熱穩定性提高的突變體抗體，其體外血清放置穩定性和長期放置穩定性也隨之提聞。
本發明提供的穩定性高的抗VEGF抗體，其輕鏈可變區的氨基酸序列還可以如SEQID N0.3所示，其重鏈可變區的氨基酸序列選自SEQ ID N0.2所示的任一個或多個單點突變的序列。此處所述的單點突變是指抗體重鏈可變區相對于親本重鏈可變區(SEQ ID N0.4所示)只有一個突變位點。
本發明提供的穩定性高的抗VEGF抗體，其輕鏈可變區的氨基酸序列選自SEQ IDN0.1所示的任一個或多個單點突變的序列，其重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。此處所述的單點突變是指抗體輕鏈可變區相對于親本輕鏈可變區(SEQ ID N0.3所示)只有一個突變位點。
本發明提供的穩定性高的抗VEGF抗體，其輕鏈可變區的氨基酸序列選自SEQ IDN0.1所示的任一個或多個單點突變的序列，所述多個為小于7個；其重鏈可變區的氨基酸序列選自SEQ ID N0.2所示的任一個或兩個單點突變的序列。
更進一步地，其輕鏈定點突變體熱穩定性提高的特點，具有一定的普適性，同樣適用于另一株抗VEGF突變體抗體Amv4，即以SEQ ID N0.8與SEQ ID N0.4為輕、重鏈可變區組成的抗體。
本發明提供的穩定性高的抗VEGF抗體，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ IDN0.8所示,其重鏈可變區的氨基酸如SEQ ID N0.4所示。SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列是Amv4抗體的輕鏈可變區發生突變疊加后的氨基酸序列。
進一步地，本發明的抗體，其輕鏈可變區的氨基酸序列選自SEQ ID N0.7所示的任一個單點突變的序列，其重鏈可變區的氨基酸如SEQ ID N0.4所示。
本發明提供了上述抗體在制備以VEGF為靶標的疾病治療藥物中的應用。
本發明還提供了上述抗體的藥物或檢測試劑。
在本發明中，親本抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區氨基酸序列分別如SEQ IDN0.3和4所示。其中輕鏈上多個單點氨基酸的定向突變可以提高抗體的熱穩定性，這些定向突變包括，L21突變為I，V29突變為I，G52突變為A，S54突變為N，T57突變為P，A61突變為D，G97突變為P ;重鏈上也有多個單點氨基酸的定向突變可以提高抗體的熱穩定性，這些定向突變包括，S31突變為D，G53突變為P，A88突變為P。
本研究首先采用ZDock方法對Amv6與VEGF的相互作用進行了限制性剛性分子對接，并在此基礎上采用Rosetta SnugDock方法對復合物的結構重新進行了柔性的局部對接和復合物優化，最后 用Rosetta Antibody程序對Amv6的Fv區的分子結構進行詳細的分析，避開與VEGF結合的區域和氨基酸殘基，主要從影響抗體結構的多個角度進行突變體的設計，包括抗體與標準結構的差異比較、氨基酸使用頻率統計分析、β轉角位置及類型、特殊氨基酸如Pro和Gly所處位置是否合理、分子局部穩定性和分子去折疊的熱動力學特征等，以及輕重鏈界面穩定性等多個角度，給出不同的設計方案，提高了突變體設計的準確性，共設計突變體抗體42個，其中對穩定性有改善作用的突變位點為18個，準確率達到40%以上。
本發明充分運用計算機分子模擬技術，從影響抗體蛋白穩定性的各個角度進行綜合考慮，采用基于經驗、基于結構和基于統計分析等多種方法，對抗VEGF抗體Amv6的輕重鏈分別進行了數十株突變體的設計、構建與篩選，最終獲得了對熱穩定性有改善作用的11個輕鏈定向突變位點和7個重鏈定向突變位點，進一步對這些位點進行疊加突變，實現了輕鏈上的7個疊加突變，重鏈上的3個疊加突變，疊加突變體的熱穩定性進一步改善，最終的突變體抗體熱穩定性較親本抗體提高了 7°C以上，為改善該功能抗體的結構穩定性和理化性質提供了更好的選擇。
圖1所示為pABGl載體信息示意圖2所示為pAB K -Amv6L和pABGl_Amv6H載體信息示意圖3所示為Amv6血清放置穩定性分析；
圖4所示為Amv6長期放置穩定性加速實驗結果分析；
圖5所示為Amv6熱穩定性測定結果分析；
圖6所示為預測的Amv6的Fab與VEGF結合復合物模型圖7所示為輕鏈單點突變體與Amv6熱穩定性的比較；
圖8所示為重鏈單點突變體與Amv6熱穩定性的比較；
圖9所示為輕鏈多點聯合突變體熱穩定性的變化情況；
1:阿伐斯汀；2:amv6-L97P ；3:Amv6-L52G-L57P-L97P ；
4:Amv6-L211-L52G-L57P-L61D ；5:Amv6-L211-L291-L52G-L57P-L61D ；
6:Amv6-L211-L291-L52G-L57P-L61D-L97P ；
7:Amv6-L211-L291-L52G-L54N-L57P-L61D-L97P ；
圖10所示為重鏈多點聯合突變體與Amv6熱穩定性的比較；
圖11所示為輕、重鏈多點聯合突變體熱穩定性變化情況；
1:阿伐斯汀；2:Amv6-L211-L52G-L57P-L61D ；
3:Amv6-L211-L52G-L57P-L61D-L97P ；
4:Amv6-L211-L291-L52G-L54N-L57P-L61D-L97P ；
5:Amv6-L211-L52G-L57P-L61D-H31D-H53P-H88P ；
6:Amv6-L211-L52G-L57P-L61D-L97P-H31D-H53P-H88P ；
7:Amv6-L211-L291-L52G-L54N-L57P-L61D-L97P-H31D-H53P-H88P ；
8:Amv6-H31D-H53P-H88P
圖12所示為熱穩定性提高對抗體長期放置穩定性的影響；
圖13所示為Amv4輕鏈單點及疊加突變的突變體與Amv4熱穩定性的比較。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例1抗VEGF抗體Amv6穩定性研究
一、材料與方法
1、材料:哺乳動物細胞HEK293T細胞購自invitrogen公司，無血清培養基Freestyle 293 表達培養基(貨號:1233 8-026)和轉染介質 Opt1-MEMI (貨號:31985-070)為 Gibco 公司產品，轉染試劑 293fectin reagent (貨號:12347-019)也為 Invitrogen 公司產品。高保真DNA聚合酶primeStar DNA聚合酶(Takara公司產品)，引物合成由上海生工完成。HRP-羊抗人IgG抗體購自中杉金橋生物有限公司。96孔ELISA為Cornning公司產品。純化介質ProteinAlml預裝柱為Invitrogen公司產品。重組VEGF165蛋白純品為HEK293T瞬時表達純化獲得。Amv6抗體輕重鏈表達載體pAB κ -Amv6L和pABGl_Amv6H為本室保存，載體信息見圖1和2。對照抗體阿伐斯汀為羅氏公司產品。
2、方法
2.1重組蛋白抗原VEGF165的制備:
將VEGF165基因(由軍事醫學科學院生物工程研究所師明磊博士惠贈，具體來源及序列可見師明磊博士論文:重組VEGF可溶性受體的構建表達與鑒定，中國人民解放軍軍事醫學科學院，2008)利用常規分子克隆方法克隆入真核瞬時表達載體pABGl (圖2)。具體而言，利用酶切位點EcoR I和BamH I克隆入載體，構建重組表達質粒，并利用HEK293T細胞對重組質粒進行表達，利用在VEGF165的C端引入的6個His的組氨酸標簽進行純化，獲得蛋白純品，蛋白定量后分裝凍存。
2.2Amv6抗體的表達與純化
將重組質粒ρΑΒ κ -Amv6L和pABGl_Amv6H以摩爾比1:1轉染HEK293T細胞，進行全抗體的瞬時表達，3天后收集細胞培養上清,經ProteinA親和層析柱對表達上清進行純化，純化后抗體樣品脫鹽于PH7.4的PBS中。并利用分光光度計測定其在280nM的吸光度值，其除以消光系數1.35后即為抗體的濃度。純化后抗體放于4°C保存。
2.3抗體的血清放置穩定性分析
待測抗體獨立分裝于含50%血清的無菌PBS緩沖液中，濃度為5ug/ml，50ul/管分裝于無菌PCR管，密封后放置于37°C，于不同的時間點收取一份樣品，凍存于-20°C，最后通過ELISA方法分析不同取樣點樣品與VEGF的反應性。即，VEGF以lug/ML濃度包被50ul于96孔板，4°C包被過夜，次日用脫脂奶粉封閉處理，將待檢測抗體用封閉液稀釋至50ng/ML的檢測濃度，加入封閉后的96孔板，37°C作用Ih后，用PBST洗滌5遍后加入脫脂奶粉預封閉的HRP-羊抗人IgG，37°C作用30min后，PBST洗滌5遍，加入底物顯色液顯色，并于5min后用2M的H2S04終止反應并與4°C放置的樣品進行比較，評價抗體在37°C血清中放置的穩定性。
2.4抗體的長期放置穩定性(加速試驗)
將抗體獨立分裝于無菌 的pH7.0的PBS緩沖液中，濃度為5 μ g/ml，50 μ I/管，密封后放于37°C，于不同時間點收取I份樣品，凍存于_20°C，最后通過ELISA方法分析不同取樣點樣品與VEGF的反應性。具體ELISA信息見2.3。
2.5抗體的熱穩定性分析
(I)樣品制備:將待測抗體以PBS稀釋至5ug/ml的工作濃度，分裝至PCR管，50ul/管；(2)加熱:用梯度PCR程序加熱樣品并持續2小時。溫度范圍根據經驗一般選擇45 70°C，溫度梯度一般不超過2°C。(3) ELISA檢測:采用常規ELISA方法分析處理后抗體樣品與VEGF的反應性，具體ELISA信息見2.3 ； (4)數據分析:做溫度-樣品ELISA顯色值相關曲線，分析不同樣品在加熱處理后與VEGF抗原結合能力的變化。
二、結果
1.Amv6的血清放置穩定性
將Amv6和對照抗體阿伐斯汀按方法2.3進行處理后ELISA分析Amv6與VEGF的結合活性，結果表明(圖3)，Amv6在血清中放置不穩定，呈現逐步的活性丟失趨勢，而對照抗體阿伐斯汀在血清中穩定存在。
2.Amv6的放置穩定性
將Amv6對照抗體阿伐斯汀按方法2.4進行處理后ELISA分析Amv6與VEGF的結合活性，結果表明(圖4)，Amv6在37°C長期放置不穩定，呈現逐步的活性丟失趨勢，而對照抗體阿伐斯汀穩定性較好。
3.Amv6的熱穩定性
將Amv6和對照抗體阿伐斯汀按方法2.4進行處理后ELISA分析Amv6與VEGF的反應性，結果表明(圖5)，Amv6熱穩定性遠低于對照抗體阿伐斯汀，其半失活穩定約為58°C。
上述結果提示，Amv6分子體外穩定性較差，表現為在pH7.0的PBS和血清中37°C長期放置不穩定，而抗體的熱穩定性是評價分子穩定性的重要指標，熱穩定性分析結果提示Amv6熱穩定性較差。
實施例2Amv6輕鏈突變對熱穩定性的影響
一、方法
l.Amv6可變區結構模建
抗體是一類被廣泛研究的功能性蛋白，通過對抗體的結構信息的總結與分析，目前已經歸納出了一套有效的結構預測及篩選方案，可比較準確地模建出抗體的可變區。在本發明中，對Rosetta Antibody中部分代碼進行了修改并進行了并行化處理，使之適合計算環境。在實際工作中，采用本地化的Rosetta Antibody軟件對Amv6的可變區進行模建，模建共生成5000個模型。對這些模型進行打分排序，挑選打分排在前10的模型進行細致的分析，選取綜合性質最優的模型作為最終的模型。利用該方法，可以非常準確的模建出除重鏈⑶R3以外的所有⑶R區，對于較短 (12個殘基以內)的重鏈⑶R3區，也可以給出相對準確的模型。
2.Amv6-VEGF結合模式預測
本發明的目的是在不影響Amv6與VEGF間親和力及特異性的前提下大幅提高其穩定性，因此有必要模建出Amv6與VEGF的復合物結構。通過前期的丙氨酸掃描(Ala-scan)及大量的定點突變實驗(專利申請號:201210533178.3)，已經比較清楚的獲得了 Amv6與VEGF的結合界面信息，因此可以通過限制性對接對Amv6-VEGF的復合物進行預測。首先，利用ZDock對Amv6可變區與VEGF進行限制性對接，并對結果進行聚類分析，從中選取打分和聚類性質最優的結果作為可能的結合模式；然后，利用Rosetta SnugDock對ZDock獲得的剛性對接結果重新進行局部對接及優化，根據打分及實驗信息選取復合物模型。最終確認以最適復合物模型如圖6所示為依據進行突變體設計。
3.突變體設計
在本發明中，主要采用了經驗法、局部結構熵法及結構分析法等3種突變體設計方法以提高Amv6的穩定性。經驗法是指利用統計信息和以往設計積累下的經驗進行蛋白質改造的方法，比如在將轉角處的氨基酸殘基替換成Gly、Ser及Ρι.ο等高頻氨基酸殘基。局部結構熵(Local structure entropy, LSE)法是根據對PDB結果數據庫中的結構進行統計分析并根據計算結果對蛋白質進行改造的一種方法。通過計算出一定長度(通常為4個氨基酸殘基)肽段在某一位置的出現頻次，可根據公式推斷出一條特定的氨基酸序列的LSE，LSE越低說明該擁有該序列的結構越穩定。結構分析法實際上是根據對蛋白結構的綜合分析對蛋白質穩定性進行改造的方法，一般都以基于物理及半經驗打分函數對設計的突變體進行打分，并挑選打分較好的突變體進行實驗驗證。具體設計結果詳見結果。
4.突變體抗體的載體構建、蛋白表達及純化
突變體輕、重鏈重組載體構建采用質粒快速定點突變的方法進行，參照文獻[王榮浩，陳瑞川，劉潤忠。快速點突變的優化方法。廈門大學學報(自然科學版)，2008，Vol47,sup2, 282-285]。具體到本實驗為:分別以Amv6輕、重鏈重組載體為質粒模板，每個突變位點設計一對突變引物(具體引物信息略，設計原則參照上述參考文獻)，對輕重鏈基因進行定點突變，采用含有突變位點的成對引物，以親本抗體的質粒為模板，進行常規PCR (DNA高保真聚合酶和dNTP等均為Takara公司產品)，PCR產物直接用Dpn I酶進行處理，之后用PCR試劑盒進行回收，將回收的突變基因產物轉化大腸桿菌感受態，獲得突變后的重組載體，經測序確認正確后用于突變體的瞬時表達；突變體的瞬時表達和純化按實施例1的2.2進行。
5.ForteBio QKe系統測定突變體抗體親和力
將VEGF165利用生物素試劑盒(GE公司產品，貨號:)進行生物素化，將生物素化的VEGF以PBS稀釋至IOOnM的濃度，包被于鏈親和素傳感器表面(ForteB10，a division ofPall Life Sciences，貨號:18-5020)，時間為 20min，使用 HEPES EP 對傳感器清洗 5min，將待測突變體抗體和親本抗體Amv6均以50nM的濃度放于檢測孔中，并使其與清洗后的鏈親和素傳感器表面的VEGF結合，結合時間為lOmin，待結合達到平衡態后將復合物在HEPESEP中進行解離,解離時間為20min。采用ForteBio軟件包進行親和力分析。
6.突變體抗體熱穩定性分析
方法與實施例1中的2.5相同。
三、結果
以Amv6輕鏈可變區序列(SEQ ID N0.3)為對象，共設計輕鏈單點突變28個，對每個單點突變體進行表達純化及蛋白定量后，采用Fortebio蛋白相互作用系統進行相對親和力的測定，評價其親和力與親本抗體Amv6的差別，統計結果如表I所示。對親和力基本保持不變的突變體抗體進行進一步的熱穩定性評價，統計結果見表I。其中，有11個單點突變體熱穩定性較親本抗體有所提高，部分結果如圖7所示。其中，熱穩定性改善最明顯的是L97P這個位點。
表lAmv6輕鏈單點定向突變對Amv6親和力和熱穩定性的影響
權利要求
1.一種人源抗VEGF抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的含有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，其重鏈可變區含有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；或 其輕鏈可變區含有如SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，其重鏈可變區含有如SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。
2.如權利要求1所述抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQID N0.5所示，其重鏈可變區的氨基酸如SEQ ID N0.4所示。
3.如權利要求1所述抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQID N0.3所示，其重鏈可變區的氨基酸如SEQ ID N0.6所示。
4.如權利要求1所述突變體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQID N0.5所示，其重鏈可變區的氨基酸如SEQ ID N0.6所示。
5.如權利要求1所述抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQID N0.3所示，其重鏈可變區的氨基酸序列選自SEQ ID N0.2所示的任一個或多個單點突變的序列。
6.如權利要求1所述抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列選自SEQID N0.1所示的任一個或多個單點突變的序列，其重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
7.如權利要求1所述抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列選自SEQID N0.1所示的任一個或多個單點突變的序列，所述多個為小 于7個；其重鏈可變區的氨基酸序列選自SEQ ID N0.2所示的任一個或兩個單點突變的序列。
8.如權利要求1所述抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQID N0.8所示，其重鏈可變區的氨基酸如SEQ ID N0.4所示。
9.如權利要求1所述抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列選自SEQID N0.7所示的任一個或多個單點突變的序列，其重鏈可變區的氨基酸如SEQ ID N0.4所示。
10.權利要求1 9任一項所述抗體在制備以VEGF為靶標的疾病治療藥物中的應用。
11.含有權利要求1 9任一項所述抗體的藥物或檢測試劑。
全文摘要
本發明提供了一種穩定性高的人源抗VEGF抗體及其應用。通過計算機輔助分子設計結合實驗驗證，對一株抗VEGF功能抗體的輕重鏈可變區進行熱穩定性改造，在不降低抗體親和力的前提下，獲得了熱穩定性更好的突變體抗體，將各突變位點進行疊加突變，獲得的突變體抗體熱穩定性較親本抗體最高提高7℃以上。本發明獲得的穩定性高的突變體抗體分子，有利于該抗體成藥后的儲存，同時為其他抗體的穩定性改造提供可供借鑒的經驗。
文檔編號G01N33/68GK103204933SQ20131007526
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月8日 優先權日2013年3月8日
發明者王雙, 孫志偉, 曾大地, 常紅艷, 仇瑋祎, 孫九如, 范志和, 楊濤, 范鐵炯 申請人:上海賽倫生物技術有限公司, 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所