專利名稱：一種提取三葉鬼針草根系分泌物的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種提取三葉鬼針草根系分泌物的方法，屬于外來入侵物種防治技術領域。
背景技術：
近幾十年來，隨著全球變化加劇以及我國對外貿易、旅游和交通的發展，外來植物入侵發生的頻度和危害的程度都在迅速增加。這些入侵者嚴重威脅著生物多樣性、經濟和環境。我國每年由外來種入侵造成的經濟損失超過70億美元。三葉鬼針草(Bidens pilosa L.)又名一包針、一把針、婆婆針、盲腸草等，為菊科鬼針草屬一年生草本植物，原產熱帶美洲，由于瘦果冠毛芒狀具倒刺，可附著于人、物上遠距離傳播。該草生長速度極快，可以作為家兔飼料加以利用；其味苦而無毒，具有清熱解毒，活血散瘀消腫之功效，可以用于治療痢疾、腹瀉、感冒、炎癥等。其有害的一面是入侵性非常強，對農田生產、果園、草坪、環境和生物多樣性等造成嚴重的影響，已廣泛分布于我國華東、華中、華南、中南、西南等地。
發明內容
本發明提出的是一種提取三葉鬼針草根系分泌物的方法，其目的是提升提取物含量，拓展對外來入侵物種的根系分泌物研究。本發明的技術解決方案:一種提取三葉鬼針草根系分泌物的方法，包括如下步驟:
一、三葉鬼針草根系分泌物的收集裝置設計；
二、三葉鬼針草根系分泌物的提純方法。本發明的優點:設計簡單，時間較短，造價低廉，形成閉合循環系統可多次重復利用；提取根系分泌物含量高，充分利用植物根系的生長階段；無破壞性，無污染；同時對于其他外來入侵物種的根系分泌物研究也有一定的借鑒意義。
圖1是三葉鬼針草根系分泌物收集流程示意圖。
具體實施例方式實施例，提取三葉鬼針草根系分泌物的方法，包括如下步驟:
一、三葉鬼針草根系分泌物收集裝置的設計；
二、三葉鬼針草根系分泌物的提純方法。所述的步驟一，三葉鬼針草根系分泌物收集裝置的設計；具體包括如下步驟，
1、實驗材料:
I)底部帶Teflon塞的玻璃瓶規格IOcmX 15cm ;螺動泵(BT100-1L)連接管路均采用Teflon材料；樹脂層析柱的規格為20mmX 250mm;樹脂選用AB-8大孔中性吸附樹脂；生長介質:石英砂為白色，無其他雜色，石英砂粒徑為0.5-1.0_，玻璃珠粒徑為10 _，石英砂和玻璃珠的粒徑比例為5:1;
2)實驗預培養15天齡的完整三葉鬼針草植株幼苗，莖高15cm，洗凈營養土待用；
3)配置Hoagland’s原液5L，用去離子水稀釋100倍為實驗營養液，實驗選用Hoagland’ s配方pH=6.0，取各藥品的質量濃度分別為:
硝酸鈣濃度為945mg/L，硝酸鉀濃度為506mg/L，硝酸銨濃度為80mg/L，磷酸二氫鉀濃度為136mg/L，硫酸鎂濃度為493mg/L，七水合硫酸亞鐵濃度為3.45mg/L,乙二胺四乙酸二鈉濃度為4.66mg/L ；
2、裝置預處理:
1)將帶Teflon塞的玻璃瓶、玻璃樹脂層析柱和Teflon材料的連接管路用0.5%質量的鹽酸浸泡24h ;取出用去離子水沖洗，然后用潔凈超純水潤洗12h ;放入烘箱烘干；分別將帶Teflon塞的玻璃瓶和玻璃樹脂層析柱用黑色不透明膠紙把瓶身包裹，使瓶壁和柱壁不透光；
2)石英砂和玻璃珠均用去離子水浸泡24h，放入烘箱烘干待用；
3)AB-8大孔中性吸附樹脂，首先，用0.5倍于樹脂柱體積的分析純無水乙醇潤洗，然后將潤洗后的AB-8大孔中性吸附樹脂浸泡于無水乙醇中24h ;其次，用2倍體積的無水乙醇沖洗浸泡后的AB-8大孔中性吸附樹脂，直至AB-8大孔中性吸附樹脂不再流出白色渾濁物為止；再次，用4-6倍體積的重量濃度為5%HC1溶液沖洗AB-8大孔中性吸附樹脂，浸泡2h后用去離子水洗至中性；再用2倍體積的重量濃度為2%NaOH溶液沖洗AB-8大孔中性吸附樹脂，浸泡2h，最后用去離子水洗至中性；
3、裝置組裝:
1)將15天齡的三葉鬼針草幼苗取出40株，放入事先放入玻璃珠的帶Teflon塞的玻璃瓶內，用處理過的石英砂固定并包埋，加入稀釋100倍的Hoagland’ s營養液250mL ；
2)用2倍體積的稀釋100倍的Hoagland’s營養液沖洗AB-8大孔中性吸附樹脂，然后接在帶Teflon塞的玻璃瓶下；
3)用Teflon材料的連接管路將AB-8大孔中性吸附樹脂與帶Teflon塞的玻璃瓶相互連接，形成回路；
4)接入BT100-1L型蠕動泵，設置流速為5mL/min，保持實際滴速為30滴/min，打開各個閥門，打開蠕動泵，營養液開始循環，閉合回路開始工作。所述的步驟二、三葉鬼針草根系分泌物的提純方法，具體如下步驟包括，
1)裝置運行兩天后，關閉閥門和蠕動泵，取下AB-8大孔中性吸附樹脂；
2)每根AB-8大孔中性吸附樹脂分別用分析純甲醇溶液作為洗脫液，以2倍AB-8大孔中性吸附樹脂體積的甲醇洗脫樹脂；
3)平均每柱分析純甲醇洗脫液為50mL，將洗脫液收集轉移入心形瓶中；
4)將心形瓶接入BUCHI旋轉蒸發儀(R210/R215)上，BUCHI旋轉蒸發儀(R210/R215)設置的旋蒸氣體為甲醇，恒定水溫45°C，轉速為BUCHI旋轉蒸發儀(R210/R215)上標注的2檔，系統壓強200-220mbar ；
5)旋轉蒸發洗脫液至其不再減少時停止旋蒸，將旋蒸后的洗脫液轉移入50mL離心管中，用去離子水沖洗心形瓶；
6)將50mL離心管密封，放入_70°C的低溫冰箱中冷凍，約72h后取出；
7)將50mL離心管放入ChristALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥儀中，將固態水分全部抽出，得到粉末狀的根系分泌物提取物；
實驗得到根系分泌物的數據參考，每管為40個植株2天的根系分泌物收集量:
權利要求
1.一種提取三葉鬼針草根系分泌物的方法，其特征是該方法包括如下步驟: 一、三葉鬼針草根系分泌物收集裝置的設計； 二、三葉鬼針草根系分泌物的提純方法。
2.根據權利要求1所述的一種提取三葉鬼針草根系分泌物的方法，其特征是所述的步驟一，三葉鬼針草根系分泌物收集裝置的設計；具體包括如下步驟， 1、實驗材料: O底部帶Teflon塞的玻璃瓶規格IOcmX 15cm ；BT100-1L型蠕動泵連接管路均采用Teflon材料；樹脂層析柱的規格為20mmX 250mm;樹脂選用AB-8大孔中性吸附樹脂；生長介質:石英砂為白色，無其他雜色，石英砂粒徑為0.5-1.0_，玻璃珠粒徑為10 _，石英砂和玻璃珠的粒徑比例為5:1; 2)實驗預培養15天齡的完整三葉鬼針草植株幼苗，莖高15cm，洗凈營養土待用； 3)配置Hoagland’s原液5L，用去離子水稀釋100倍為實驗營養液，實驗選用Hoagland’ s配方pH=6.0，取各藥品的質量濃度分別為: 硝酸鈣濃度為945mg/L，硝酸鉀濃度為506mg/L，硝酸銨濃度為80mg/L，磷酸二氫鉀濃度為136mg/L，硫酸鎂濃度為493mg/L，七水合硫酸亞鐵濃度為3.45mg/L,乙二胺四乙酸二鈉濃度為4.66mg/L ； 2、裝置預處理: 1)將帶Teflon塞的玻璃瓶、玻璃樹脂層析柱和Teflon材料的連接管路用0.5%質量的鹽酸浸泡24h ;取出用去離子水沖洗，然后用潔凈超純水潤洗12h ;放入烘箱烘干；分別將帶Teflon塞的玻璃瓶和玻璃樹脂層析柱用黑色不透明膠紙把瓶身包裹，使瓶壁和柱壁不透光； 2)石英砂和玻璃珠均用去離子水浸泡24h，放入烘箱烘干待用； 3)AB-8大孔中性吸附樹脂，首先，用0.5倍于樹脂柱體積的分析純無水乙醇潤洗，然后將潤洗后的AB-8大孔中性吸附樹脂浸泡于無水乙醇中24h ;其次，用2倍體積的無水乙醇沖洗浸泡后的AB-8大孔中性吸附樹脂，直至AB-8大孔中性吸附樹脂不再流出白色渾濁物為止；再次，用4-6倍體積的重量濃度為5%HC1溶液沖洗AB-8大孔中性吸附樹脂，浸泡2h后用去離子水洗至中性；再用2倍體積的重量濃度為2%NaOH溶液沖洗AB-8大孔中性吸附樹脂，浸泡2h，最后用去離子水洗至中性； 3、裝置組裝: 1)將15天齡的三葉鬼針草幼苗取出40株，放入事先放入玻璃珠的帶Teflon塞的玻璃瓶內，用處理過的石英砂固定并包埋，加入稀釋100倍的Hoagland’ s營養液250mL ； 2)用2倍體積的稀釋100倍的Hoagland’s營養液沖洗AB-8大孔中性吸附樹脂，然后接在帶Teflon塞的玻璃瓶下； 3)用Teflon材料的連接管路將AB-8大孔中性吸附樹脂與帶Teflon塞的玻璃瓶相互連接，形成回路； 4)接入BT100-1L型蠕動泵，設置流速為5mL/min，保持實際滴速為30滴/min，打開各個閥門，打開蠕動泵，營養液開始循環，閉合回路開始工作。
3.根據權利要求1所述的一種提取三葉鬼針草根系分泌物的方法，其特征是所述的步驟二、三葉鬼針草根系分泌物的提純方法，具體如下步驟包括，1)裝置運行兩天后，關閉閥門和蠕動泵，取下AB-8大孔中性吸附樹脂； 2)每根AB-8大孔中性吸附樹脂分別用分析純甲醇溶液作為洗脫液，以2倍AB-8大孔中性吸附樹脂體積的甲醇洗脫樹脂； 3)平均每柱分析純甲醇洗脫液為50mL，將洗脫液收集轉移入心形瓶中； 4)將心形瓶接入BUCHI旋轉蒸發儀上，BUCHI旋轉蒸發儀設置的旋蒸氣體為甲醇，恒定水溫45°C，轉速為BUCHI旋轉蒸發儀上標注的2檔，系統壓強200_220mbar ； 5)旋轉蒸發洗脫液至其不再減少時停止旋蒸，將旋蒸后的洗脫液轉移入50mL離心管中，用去離子水沖洗心形瓶； 6)將50mL離心管密封，放入_70°C的低溫冰箱中冷凍，約72h后取出； 7)將50mL離心管放入ChristALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥儀中，將固態水分全部抽出，得到粉末狀的根系分泌物提取物； 實驗得到根系分泌物的數據參考，每管為40個植株2天的根系分泌物收集量: I號瓶處理前12.5222g，處理后12.5582g，有效質量0.036g ； 2號瓶處理前12.1084g ，處理后12.1434g，有效質量0.035g。
全文摘要
本發明是一種提取三葉鬼針草根系分泌物的方法，包括如下步驟一、三葉鬼針草根系分泌物的收集裝置設計；二、三葉鬼針草根系分泌物的提純方法。本發明的優點設計簡單，時間較短，造價低廉，形成閉合循環系統可多次重復利用；提取根系分泌物含量高，充分利用植物根系的生長階段；無破壞性，無污染；同時對于其他外來入侵物種的根系分泌物研究也有一定的借鑒意義。
文檔編號G01N1/34GK103115794SQ20131007201
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月7日 優先權日2013年3月7日
發明者沈羽, 張開梅, 方炎明, 劉穎 申請人:南京林業大學