專利名稱：一種熒光定量檢測羥基自由基的方法
技術領域：
本發明涉及一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，特別是涉及一種以苯五甲酸為熒光探針的熒光定量檢測羥基自由基的方法。
背景技術：
活性氧是指比分子狀態氧(空氣中存在的氧)反應性更活潑的、含有氧原子的分子或自由基，如羥基自由基(H0.)、超氧陰離子自由基(02_‘)、單線態氧(1O2)及過羥基自由基(H00‘)等。活性氧的測試涉及各個領域，包括紡織化學、造紙制漿、醫學、食品、環境中。在上述含氧類自由基中，羥基自由基是水溶液中最強的氧化劑之一，可引發誘導產生鏈反應，主要通過電子轉移、親電加成、脫氫反應等途徑無選擇性地與各種有機化合物直接作用并最終將其降解為CO2、H2O等無害物質。目前檢測羥基自由基的方法主要包括分光光度法、電子自旋法(ESR)、化學發光法、電化學法、高效液相色譜法(HPLC)等(Zhou KQ’et al., Food Chem.2006,95:446-457;Christopher J.,et al., Anal.Chem.2011, 83:261-268;Kilinc E., et al., Talanta, 2005，65:876-881; Chao T, et al.，Anal.Chim.Acta2004, 527:73 - 80;吳峰等，專利CN1412553A, 2003-4-23)，但以上檢測大部分在標準體系中進行，且都有不可避免的缺陷，難以實現快速準確檢測。分光光度法儀器易為一般實驗室采用，但測定的準確性較差，靈敏度較低，專一性不強；ESR儀器成本較高，靈敏度低，專一性不強；化學發光法經常產生人工活性氧干擾結果；電化學檢測則有電極面積及定位的限制，抗干擾能力不強，選擇性差，應用范圍有限；高效液相色譜法(HPLC)操作復雜耗時，且固定相的存在會引起自由基的各種反應而使自由基粹滅。突光分析法(Peter ff., et al., Free Radical Bi0.Med.，2007，43:995-1022)具有簡單快速、靈敏度高、易于實現自動化、可視化和在線檢測等特點，而且儀器廉價，在一般實驗室中較常見，因此近年來在羥基自由基檢測中備受關注。熒光分析法檢測羥基自由基的體系一般都需選用捕獲劑，利用捕獲劑與羥基自由基反應后底物熒光強度的改變，實現間接測定活性氧的濃度。目前采用的捕獲劑有水楊基熒光酮(任鳳蓮等，分析化學，2001，29(1):60-62)和羅丹明6G(Jing F，et al.，J.Fluoresc., 2007, 17:257 - 264)等熒光染料，利用羥基自由基的強氧化作用可使染料體系降解，熒光強度減弱，實現Fenton體系中羥基自由基的熒光檢測。但此類熒光減弱型檢測方法的選擇性和重現性較差，不適合于復雜體系如紡織品前處理高溫氧漂工藝體系中羥基自由基的檢測。二甲基亞砜也為一種羥基自由基捕獲劑，有人采用分光光度法(潘光建，中國造紙學報，2006，21(3):41-47)和熒光光度法(谷學新，分析科學學報，2002，18(6):460-462)研究了二甲基亞砜(DMSO)捕捉羥自由基的反應，但反應步驟較長，定量檢測不準確。另一類熒光增強型的常用捕獲劑為苯甲酸和對苯二甲酸，這類捕捉劑普遍被認為可與羥基自由基反應生成穩定的2-羥基苯甲酸，通過檢測羥基化產物的熒光可間接檢測輕基自由基的產生情況。苯甲酸首先被用于輕基自由基的突光檢測，Vidrio等人利用苯甲酸突光檢測環境中顆粒物導致的輕基自由基產生量(Vidrio, E., et al., Environ.Sc1.Technol.，2009, 43，922-927)。檢測原理是苯甲酸本身沒有熒光，但在捕捉羥基自由基發生加成反應后，生成熒光性產物鄰羥基苯甲酸，通過檢測熒光強度，可間接測定羥基自由基。從分子結構上可以看出，苯甲酸分子中苯環上有5個反應位點，因此羥基自由基的加成反應沒有選擇性，但只有加成在鄰位的羥基化衍生物才會產生熒光。由于苯甲酸分子的不對稱結構，苯甲酸與羥基自由基加成反應也可得到不發熒光的間位和對位羥基化衍生物，也就是說發生了對熒光沒有貢獻的無效加成，這使得通過熒光強度測定并不能準確檢測羥基自由基，捕捉效率低。為了克服苯甲酸分子不對稱結構導致的不能準確檢測羥基自由基的缺陷，隨后的研究發現使用分子結構對稱的對苯二甲酸替代苯甲酸，這樣保證了羥基的加成反應發生在鄰位，生成熒光性的鄰羥基對苯二甲酸，該方法因為引入對稱性消除了苯甲酸中可能發生無效加成的缺陷，使得測定羥基自由基的準確度有了提高，成為目前廣泛應用于生物環境中的輕基自由基突光檢測的方法。Tang等人(Tang B, et al., Talanta, 2005, 65, 769-775)利用對苯二甲酸為捕捉劑，進行了 Fenton體系中羥基自由基的熒光檢測；Page等人(Page, S.E.，et al.，J.Environ.Monit.，2010，12，1658-1665)基于以上反應體系研究了光化學反應中羥基自由基的產生情況。盡管對苯二甲酸分子中的對稱可消除無效的間位和對位加成，但仍然存在有4個反應位點,加成反應并不能保證僅有單輕基化衍生物，因此反應所得到的羥基化產物并不唯一，可能會生成單羥基、雙羥基、三羥基和四羥基化對苯二甲酸的多種衍生物。因為這些羥基化衍生物的熒光性能不同，顯然這種熒光測定羥基自由基的方法具有重現性比較差的缺陷。因此亟需開發一種專一性、重現性、穩定性均好且可用于評價復雜體系如紡織品前處理氧漂工藝體系中羥基自由基產生情況的新型熒光探針。
發明內容
本發明克服了現有技術中的不足，提供一種選擇性、穩定性、重現性、靈敏性高的熒光檢測H0.的新方法，為了克服以上苯甲酸和對苯二甲酸熒光測定H0.的缺陷，本發明采用了苯五甲酸作為捕捉劑:苯五甲酸是一個不對稱分子，其中苯環上只有一個可供H0.加成的反應位點，捕獲HO‘發生加成反應后，僅有一種結構確定的熒光性羥基化衍生物生成，也即生成了唯一的熒光性羥基化產物-羥基苯五甲酸，因而可通過測量熒光強度實現準確定量檢測羥基自由基，彌補上述苯甲酸和對苯二甲酸系列中準確度低和重現性差的缺陷。通過ES1-MS分析反應體系，唯一羥基苯五甲酸得以確認；同時對苯二甲酸體系的ES1-MS分析結果則表明，有多種羥基化產物生成。本發明中涉及的苯五甲酸探針適用于一切羥基自由基產生的體系，通過測量羥基苯五甲酸的熒光強度，可計算出體系中產生的羥基自由基。熒光性羥基化產物-羥基苯五甲酸即使在高溫(80°C )堿性條件下穩定性也很高，長時間放置熒光信號無明顯減弱。苯五甲酸對HO‘選擇性很高，多次平行實驗重現性好，靈敏度較高。另外本發明采用的苯五甲酸在廣泛PH范圍(pH >4)水溶液中溶解性很好，保證了該方法在實際生產工藝中的應用范圍。本發明的一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征是:所述方法的熒光探針為苯五甲酸，其分子結構式為
權利要求
1.一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征是:所述方法的熒光探針為苯五甲酸，其分子結構式為
2.根據權利要求1所述的一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征在于，具體步驟為:將捕捉劑苯五甲酸加入待測體系中，使其摩爾濃度為羥基自由基產生物摩爾濃度的I倍及I倍以上；捕捉反應結束后調節待測體系PH為9 10 ;檢測待測體系的熒光強度，根據熒光強度與羥基苯五甲酸濃度的線性關系及羥基自由基與羥基苯五甲酸的一一對應關系，由熒光強度計算出此時待測體系中羥基自由基的產生量。
3.根據權利要求2所述的一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征在于，所述苯五甲酸加入待測體系中的摩爾濃度為羥基自由基產生物摩爾濃度的I 3倍。
4.根據權利要求2所述的一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征在于，所述待測體系中定量檢測的羥基自由基濃度范圍為0.00414 5.52 μ mo I/L ； 所述計算按照羥基自由基濃度與熒光強度的線性關系，為: 羥基自由基濃度為 0.00414 0.4923 μ mol/L 時，Y=353.68304Χ-0.02765 ； 羥基自由基濃度為 0.4923 5.52 μ mol/L 時，Y=204.17159Χ+79.88334 ； 其中Y為熒光強度； X為羥基自由基濃度，單位為μ mol/L。
5.根據權利要求2所述的一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征在于，所述待測體系的溫度范圍為20 98°C，pH彡5。
6.根據權利要求2所述的一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征在于，所述的檢測熒光強度是采用熒光分光光度計。
7.根據權利要求6所述的一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征在于，所述熒光分光光度計的型號為F-7000。
8.根據權利要求2所述的一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征在于，所述苯五甲酸溶于緩沖液或堿性溶液形成苯五甲酸溶液后加入到待測體系中。
9.根據權利要求8所述的一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征在于，所述的緩沖液為磷酸鹽或硼酸鹽溶液；所述堿性溶液為NaOH或KOH溶液。
10.根據權利要求8所述的一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，其特征在于，所述的苯五甲酸溶液中苯五甲酸的濃度為10< 0.2mol/Lo
全文摘要
本發明涉及一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，特別是涉及一種以苯五甲酸為熒光探針的熒光定量檢測羥基自由基的方法，具體步驟為將捕捉劑苯五甲酸加入待測體系中，使其摩爾濃度為羥基自由基產生物摩爾濃度的1倍及1倍以上；檢測待測體系熒光強度，由熒光強度計算此時待測體系中羥基自由基的產生量。苯五甲酸苯環結構僅含一個反應位點，與羥基自由基加成后生成唯一熒光性產物—羥基苯五甲酸，使定量檢測更準確。本發明可在20～98℃對產生羥基自由基的體系(pH≥5)進行定量檢測。本發明操作簡單快速、專一性強、靈敏度高。有助于探究紡織化學、環境化學、制漿造紙等產生羥基自由基工藝體系的機理，從而更好地指導生態生產工藝。
文檔編號G01N21/64GK103149188SQ201310069048
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者張煊, 司芳, 閻克路 申請人:東華大學