調節nk細胞活性的組合物和方法

調節nk細胞活性的組合物和方法
【專利摘要】本發明涉及調節受試者免疫應答的新組合物和方法。本發明更具體地涉及調節哺乳動物受試者體內NK細胞活性、并允許NK細胞細胞毒性增強的特異性抗體。本發明也涉及這類抗體的片段和衍生物以及含有它們的藥物組合物、及其具體在治療中增加受試者體內NK細胞活性或細胞毒性中的用途。
【專利說明】調節NK細胞活性的組合物和方法
[0001]本申請是申請號為200480021897.0、申請日為2004年7月I日、發明名稱為“調節NK細胞活性的組合物和方法”的中國發明專利申請的分案申請。
發明領域[0002]本發明涉及與NK細胞表面存在的兩個或多個抑制性受體交叉反應、并增強哺乳動物受試者或生物樣品中NK細胞細胞毒性的抗體、抗體片段及其衍生物。本發明也涉及制作這類抗體、片段、變體和衍生物的方法；包含所述物質的藥物組合物；這類分子和組合物(具體在治療中)在增加受試者體內NK細胞活性或細胞毒性中的用途。[0003]背景[0004]自然殺傷(NK)細胞是參與非常規免疫的淋巴細胞亞群。可以通過多種本領域公知的多種技術從例如血液樣品、細胞提取法(cytapheresis)、收集庫(collection)等獲得NK細胞。[0005]NK細胞的特征和生物學特性包括:表達表面抗原，包括⑶16、⑶56、和/或⑶57 ；細胞表面缺乏α / β或Y / δ TCR復合物；通過活化特異性溶細胞酶結合并殺傷不表達“自身”MHC/HLA抗原的細胞的能力；殺傷表達NK活化受體-配體的腫瘤細胞或其它患病細胞的能力；釋放刺激或抑制免疫應答的細胞因子的能力；以及經歷多輪細胞分裂、產生具有與母細胞相似的生物學特性的子細胞的能力。在本發明文中，“活性”NK細胞指生物學活性NK細胞，更具體為具有裂解靶細胞的能力的NK細胞。例如，“活性”NK細胞能夠殺傷表達NK活化受體-配體、并且不表達“自身”MHC/HLA抗原的細胞(KIR不相容細胞)。[0006]基于其生物學特性，在本領域提出多種依賴于調節NK細胞的治療和免疫接種策略。然而，NK細胞活性由涉及刺激性和抑制性信號的復雜機制調節。因此，有效的NK細胞介導的治療可能要求刺激這些細胞并中和抑制性信號。[0007]NK細胞由主要組織相容性復合體(MHC) I類特異性抑制性受體負調節(KSrre等人，1986 ;0--1?η等人，1989)。這些特異性受體與其它細胞上存在的MHC I類分子或HLA的多態性決定簇結合，并抑制NK細胞裂解。在人類中，被稱為殺傷Ig樣受體(killer Ig-1ike receptors, KIRs)的受體家族的某些成員識別HLA I類等位基因。[0008]KIR是存在于某些淋巴細胞亞群(包括NK細胞)上的受體大家族。KIR命名法基于細胞外結構域的數量(KIR2D或KIR3D)以及胞質尾區是長(KIR2DL或KIR3DL)或是短(KIR2DS或KIR3DS)。在人類，在存在于單獨個體中的NK群內，給定KIR的存在或缺乏在NK細胞之間是可變的。在人群中也存在相對高水平的KIR分子多態性，某些KIR分子存在于一些(但并非全部)個體中。與適當的配體結合時，某些KIR基因產物引起淋巴細胞活性的刺激。已證實的刺激性KIR都具有含有帶電荷跨膜殘基的短胞質尾區，所述殘基與含有免疫刺激性基序(ITAM)的接頭分子結合。其它KIR基因產物實質上是抑制性的。所有經證實的抑制性KIR具有長胞質尾區，并且似乎根據KIR亞型與HLA抗原的不同亞群相互作用。抑制性KIR在其胞質內部分顯示一個或數個招募磷酸酶的抑制性基序。已知的抑制性KIR受體包括KIR2DL和KIR3DL亞家族成員。具有兩個Ig結構域的KIR受體(KIR2D)鑒定HLA-C同種異型:KIR2DL2(原來指定為p58.2)或密切相關的基因產物KIR2DL3識別由2組HLA-C同種異型(Cwl、3、7和8)共享的表位，而KIR2DL1 (ρ58.I)識別由交互的(reciprocal) I組HLA-C同種異型(Cw2、4、5和6)共享的表位。在HLA-C等位基因80位存在Lys殘基指示KIR2DL1識別。在80位存在Asn殘基指示KIR2DL2和KIR2DL3識別。重要的是，大多數HLA-C等位基因在80位具有Asn或Lys。一個具有三個Ig結構域的KIR，即KIR3DL1 (p70)，識別由HLA_Bw4等位基因共享的表位。最后，具有三個Ig結構域的分子的同型二聚體 KIR3DL2 (pl40)識別 HLA-A3 和 HLA-A11。
[0009]盡管抑制性KIR及其它I類抑制性受體(Moretta等人，1997 ；Valiante等人，1997a ；Lanier, 1998)可能由NK細胞共表達,在任何給定個體的NK庫(repertoire)中存在表達單個KIR的細胞，因此，相應的NK細胞僅被表達特定I類等位基因的組的細胞阻斷。
[0010]經顯示，KIR錯配的NK細胞群或克隆(即表達與宿主HLA分子不相容的KIR的NK細胞群)是見于異源移植的移植抗白血病作用的最可能的媒介(Ruggeri等人，2002)。在給定個體內重新產生這種作用的一種方法將是使用阻斷KIR/HLA相互作用的試劑。
[0011]經顯示，KIR2DL1特異性單克隆抗體阻斷KIR2DL1與Cw4(或類似物)等位基因的相互作用(Moretta等人，1993)。也有描述抗KIR2DL2/3單克隆抗體阻斷KIR2DL2/3與HLACw3(或類似物)等位基因相互作用(Moretta等人，1993)。然而,這類試劑在臨床情況中的使用將要求發展兩個治療性mAb來治療所有患者，無論任何給定患者是否表達I類或2類HLA-C等位基因。此外，在決定使用哪種治療性抗體之前，必須預先確定各患者表達的HLA型，從而導致昂貴很多的治療費用。
[0012]Watzl 等人，Tissue Antigens, 56, 240 頁(2000)制作了識別多個 KIR 同種型的交叉反應抗體，但是這些抗體沒有展示出NK細胞活性的增強。G.M.Spaggiara等人，Blood,100，4098-4107頁(2002)完成了利用許多抗多種KIR的單克隆抗體的實驗。據說這些抗體之一 (NKVSFl)識別 CD158a(KIR2DLl)、CD158b(KIR2DL2)和 ρ50.3 (KIR2DS4)的共同表位。沒有提示NKVSFl可以增強NK細胞活性，也沒有提示可以使用其用于治療。因此，本領域目前尚無調節NK細胞活性的可行性和有效途徑可利用，依然需要使用特異性試劑特異性干預HLA等位基因。
[0013]發明概述
[0014]本發明現提供新的抗體、組合物和方法以克服NK細胞活化中的現有困難，并提供額外的有利特征和益處。在一個示范性方面，本發明提供在幾乎所有人中促進人類NK細胞活化的單個抗體。更具體而言，本發明提供全新的特異性抗體，所述全新的特異性抗體與多種抑制性KIR組交叉反應并中和其抑制性信號，導致表達這類抑制性KIR受體的NK細胞中NK細胞細胞毒性增強。與多種KIR基因產物交叉反應的能力允許本發明的抗體在大多數人類受試者中有效地用于增加NK細胞活性，而沒有預先確定受試者HLA型的負擔或費用。
[0015]在第一個方面，本發明提供抗體、抗體片段及其任一的衍生物，其中所述抗體、抗體片段或衍生物與NK細胞表面的至少兩種抑制性KIR受體交叉反應，中和NK細胞的抑制性信號并增強NK細胞活性。該抗體更優選與人KIR2DL受體的共同決定簇結合。本發明的抗體甚至更明確地至少與KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3受體結合。為了本發明，術語“KIR2DL2/3”指KIR2DL2和KIR2DL3受體中任一或兩者。這兩個受體具有非常高的同源性，是假定的相同基因的等位基因形式，并且被本領域認為是可互換的。因此，為了本發明將KIR2DL2/3考慮為單一的抑制性KIR分子，因此僅與KIR2DL2和KIR2DL3而不與其它抑制性KIR受體交叉反應的抗體不在本發明范圍內。
[0016]本發明的抗體特異性抑制MHC或HLA分子與至少兩種抑制性KIR受體的結合并促進NK細胞活性。由此處所用的術語“中和KIR的抑制性活性”推斷兩種活性。在本發明文中本發明的抗體“促進NK細胞活性”、“促進NK細胞細胞毒性”、“促進NK細胞”、“增強NK細胞活性”、“增強NK細胞細胞毒性”或“增強NK細胞”的能力，指該抗體使在其表面表達抑制性KIR受體的NK細胞能夠裂解在其表面表達該特定抑制性KIR受體(例如特定的HLA抗原)的相應配體的細胞。在一個特定的方面，本發明提供特異性抑制HLA-C分子與KIR2DL1和KIR2DL2/3受體結合的抗體。在另一個特定的方面，本發明提供體內促進NK細胞活性的抗體。[0017]因為至少KIR2DL1或KID2DL2/3之一存在于至少約90%的人群中，本發明更優選的抗體能夠促進針對大多數HLA-C同種異型(分別為I組HLA-C同種異型和2組HLA-C同種異型)相關細胞的NK細胞活性。因此，本發明的組合物可以用于在大多數人類個體中(一般約90%人類個體或以上)有效活化或增強NK細胞。因此，根據本發明的單個抗體組合物可以用于治療大多數人類受試者，很少需要確定等位基因的類別或使用抗體混合物。
[0018]本發明首次證明可以生產抗抑制性KIR的交叉反應性及中和性抗體，而且這類抗體允許在廣泛范圍人群中有效活化NK細胞。
[0019]本發明的具體目的因此定位于抗體，其中所述抗體特異性結合KIR2DL1和KIR2DL2/3人類受體，并且逆轉由這些KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制。在一個實施方案中，該抗體與雜交瘤DF200產生的單克隆抗體DF200競爭。可選地，所述與抗體DF200競爭的抗體不是抗體DF200本身。
[0020]在另一個實施方案中，抗體與單克隆抗體NKVSFl競爭，可選地，其中與抗體NKVSFl競爭的抗體不是抗體NKVSFl。
[0021]在另一個實施方案中，該抗體與抗體1-7F9競爭。
[0022]所述抗體優選為嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
[0023]當涉及特定的單克隆抗體(例如DF200、NKVSFl、1-7F9、EB6、GL183)時，術語
“與......競爭”指抗體在結合測定中與單克隆抗體(例如DF200、NKVSFl、1-7F9、EB6、
GL183)競爭，所述結合測定使用重組KIR分子或表面表達的KIR分子。例如，在結合測定中如果抗體降低DF200與KIR分子的結合，該抗體與DF200 “競爭”。與DF200 “競爭”的抗體可以與DF200競爭結合KIR2DL1人類受體、KIR2DL2/3人類受體或KIR2DL1和KIR2DL2/3人類受體二者。
[0024]在優選的實施方案中，本發明提供結合KIR2DL1和KIR2DL2/3人類抗體、逆轉由這些KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制、并與DF200、1-7F9或NKVSFl競爭結合KIR2DL1人類受體、KIR2DL2/3人類受體或KIR2DL1和KIR2DL2/3人類受體二者的抗體。所述抗體可選地不是NKVSFl。該抗體可選為嵌合、人類或人源化抗體。
[0025]在另一個實施方案中，本發明提供結合KIR2DL1和KIR2DL2/3人類受體、逆轉由這些KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制、并與EB6競爭結合KIR2DL1人類受體、與GL183競爭結合KIR2DL2/3人類受體、或與EB6競爭結合KIR2DL1人類受體并與GL183競爭結合KIR2DL2/3人類受體的抗體。所述抗體可選地不是NKVSFl ;該抗體可選地不是DF200。該抗體可選為嵌合、人類或人源化抗體。
[0026]在有利的方面，本發明提供與DF200競爭的抗體，所述抗體與單克隆抗體DF200識另1J、結合基本相同或相同的KIR分子上的表位或“表位位點”,或對其中表位或“表位位點”具有免疫特異性。所述KIR分子優選為KIR2DL1人類受體或KIR2DL2/3人類受體。
[0027]本發明的具體目的定位于抗體，其中所述抗體結合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3人類受體上的共同決定簇，并逆轉由這些KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制。這些抗體更特異地與雜交瘤DF200產生的單克隆抗體DF200或雜交瘤NKVSFl產生的抗體NKVSFl結合KIR上基本相同的表位，其中所述抗體不是NKVSFl。
[0028]在優選的實施方案中，本發明的抗體是單克隆抗體。本發明最優選的抗體是由雜交瘤DF200產生的單克隆抗體DF200。
[0029]產生抗體DF200的雜交瘤以識別號“DF200”、注冊號CNCM 1-3224 (于2004年6 月 10 日注冊)保藏于 CNCM 保藏中心，Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes,Institut Pasteur,25, Rue du Docteur Roux, F_75724Paris Cedexl5,France。抗體 NKVSFl 可從 Serotec (Cergy Sainte-Christophe,France)獲得，目錄參考號MCA2243。在此也將 NKVSFl 稱為 pan2D mAb。
[0030]本發明也提供在此描述的抗體的功能性片段和衍生物，所述功能性片段和衍生物具有基本相同的抗原特異性和活性(例如可以與母抗體交叉反應以及增強表達抑制性KIR受體的NK細胞的細胞毒性活性)，包括(但是不限于)Fab片段、Fab’ 2片段、免疫粘附素、微型雙功能抗體(diabodies)、 ⑶R和ScFv。另外,本發明的抗體可以是人源化、人或嵌合的。
[0031]本發明也提供抗體衍生物，所述抗體衍生物包括與毒素、放射性核素、可檢測部分(例如熒光劑)或固體支持物綴合或共價結合的本發明的抗體。
[0032]本發明也提供包括上面公開的抗體、其片段或其任一的衍生物的藥物組合物。因此，本發明也涉及在此公開的抗體在藥物制造方法中的用途。在優選的實施方案中，所述藥物或藥物組合物用于治療癌癥或其它增生性疾病、感染、或用于移植。
[0033]在另一個實施方案中，本發明提供組合物，所述組合物包括至少與兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物結合的抗體，其中抗體能夠中和表達所述兩種不同的人類抑制性KIR受體中至少一種的NK細胞上由KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制，其中抗體整合到脂質體中。該組合物任選地包括額外物質，所述額外物質選自為基因治療輸送基因的核酸分子；為在NK細胞中抑制基因輸送反義RNA、RNAi或siRNA的核酸分子；或另外整合到所述脂質體中、靶向殺傷NK細胞的毒素或藥物。
[0034]本發明也提供體外、離體或體內調節人類NK細胞活性的方法,包括將人類NK細胞與治療有效量的本發明的抗體、這類抗體的片段、其任一的衍生物或至少包括上述任一項的藥物組合物接觸。優選的方法包括施用治療有效量的本發明的藥物組合物，并且針對在患有癌癥、感染性疾病或免疫性疾病的受試者中增加人類NK細胞的細胞毒性活性(最優選離體或體內)。
[0035]另一方面，本發明提供雜交瘤，包括:(a)來自哺乳動物宿主(一般為非人類哺乳動物宿主)的B細胞，其以含有抑制性KIR多肽上存在的表位的抗原免疫，所述B細胞與(b)永生化細胞系(例如骨髓瘤細胞)融合，其中所述雜交瘤產生單克隆抗體，該單克隆抗體結合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體、并且能夠至少基本中和在表達所述至少兩種不同的人類抑制性KIR受體的NK細胞群中由KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制。任選地，該雜交瘤不產生單克隆抗體NKVSFl。所述抗體優選結合KIR2DL1和KIR2DL2/3受體。該抗體優選結合KIR2DL1和KIR2DL2/3上存在的共同決定簇。所述雜交瘤優選產生抑制在80位具有Lys殘基的HLA-c等位基因分子與人類KIR2DL1受體結合、以及在80位具有Asn殘基的HLA-C等位基因分子與人類KIR2DL2/3受體結合的抗體。所述雜交瘤優選產生與雜交瘤DF200產生的單克隆抗體DF200結合KIR2DL1或KIR2DL2/3或KIR2DL1和KIR2DL2/3上基本相同的表位的抗體。這種雜交瘤的實例為DF200。
[0036]本發明也提供產生抗體的方法，所述抗體與多種KIR2DL基因產物交叉反應，并中和這類KIR的抑制性活性，所述方法包括步驟為:[0037](a)以含有KIR2DL多肽的免疫原免疫非人類哺乳動物；
[0038](b)從所述免疫哺乳動物制備抗體，其中所述抗體結合所述KIR2DL多肽，
[0039](c)選擇(b)中與至少兩種不同的KIR2DL基因產物交叉反應的抗體，以及
[0040](d)選擇(C)中增強NK細胞的抗體。在一個實施方案中，所述非人類哺乳動物是設計為表達人類抗體庫的轉基因動物(例如含有人類免疫球蛋白基因座并缺失天然免疫球蛋白基因的非人類哺乳動物，例如Xenomouse? (Abgenix-Fremont,CA，USA)，或含有人類Ig編碼基因小基因座位(minilocus)的非人類哺乳動物，例如HuMab-mouse?(Medarex-Princeton, NJ, USA))。該方法任選地另外包括選擇結合靈長動物(優選獼猴)NK細胞或KIR多肽的抗體。本發明任選地另外包括評價抗體的方法，其中根據上述方法產生的抗體被施用于靈長動物(優選獼猴)，優選對猴觀察抗體毒性指征的存在或缺乏。
[0041]
【發明者】也提供產生抗體的方法，所示抗體結合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物，其中所述抗體能夠中和在表達所述至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物的NK細胞群上由KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制，該方法包括步驟為:
[0042]a)以含有抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人類哺乳動物；
[0043]b)從所述經過免疫的動物制備抗體，其中所述抗體結合所述KIR多肽，
[0044]c)選擇(b)中與至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物交叉反應的抗體，以及
[0045]選擇(C)中能夠中和在表達所述至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物的NK細胞群上由KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制的抗體，其中步驟(c)和(d)的順序可任意顛倒，任意步驟任選重復I或多次。用于免疫的抑制性KIR多肽優選為KIR2DL多肽，選自步驟(c)的抗體至少與KIR2DL1和KIR2DL2/3交叉反應。該抗體優選識別存在于至少兩種不同的KIR受體基因產物上的共同決定簇；所述KIR最優選為KIR2DL1和KIR2DL2/3。該方法任選另外包括選擇與靈長動物(優選獼猴)NK細胞或KIR多肽結合的抗體。本發明任選地另外包括評價抗體的方法，其中根據上述方法產生的抗體被施用于靈長動物(優選獼猴)，優選對猴觀察抗體毒性指征的存在或缺乏。
[0046]上述方法中選自步驟c)或d)的抗體可選地不是NKVSFl。上述方法步驟(b)中制備的抗體優選為單克隆抗體。選自上述方法步驟(C)中的抗體優選抑制在80位具有Lys殘基的HLA-C等位基因分子與人類KIR2DL1受體的結合、以及在80位具有Asn殘基的HLA-C等位基因分子與人類KIR2DL2/3受體的結合。選自上述方法步驟(d)中的抗體優選引起NK細胞毒性的增強，例如NK細胞毒性的任何顯著增強、或增強至少5%、10%、20%、30%或更高，例如靶NK細胞毒性增強至少約50% (例如NK細胞細胞毒性增強至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95% (例如約65-100% ))。該抗體優選與單克隆抗體DF200結合KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上基本相同的表位。任選地，該方法也或另外含有制作所選單克隆抗體片段、制作所選單克隆抗體衍生物(例如通過與放射性核素、細胞毒性劑、報告分子等綴合)、或制作抗體片段衍生物的額外步驟，所述抗體片段從這類單克隆抗體產生或含有對應于這類單克隆抗體序列的序列。
[0047]本發明另外提供生產抗體的方法，所述抗體結合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物，其中所述抗體能夠中和在表達所述至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物的NK細胞群上由KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制，該方法包括步驟為:
[0048](a)從文庫或庫中選擇至少與兩種不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產物交叉反應的單克隆抗體或抗體片段，以及
[0049](b)選擇(a)中能夠中和在表達所述至少兩種不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產物的NK細胞群上由KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制的抗體。該抗體優選結合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇。選自步驟(b)的抗體可選地不是NKVSF1。選自步驟
(b)中的抗體優選抑制在80位具有Lys殘基的HLA-c等位基因分子與人類KIR2DL1受體的結合、以及在80位具有Asn殘基的HLA-C等位基因分子與人類KIR2DL2/3受體的結合。選自步驟(b)的抗體優選引起NK細胞毒性的增強，例如NK細胞毒性的任何顯著增強、或增強至少5 %、10 %、20 %、30 %或更高，例如靶NK細胞毒性增強至少約50 % (例如NK細胞細胞毒性增強至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%(例如約65-100% ))。該抗體優選 與單克隆抗體DF200結合KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上基本相同的表位。該方法任選地含有制作所選單克隆抗體片段、制作所選單克隆抗體衍生物、或制作所選單克隆抗體片段的衍生物的額外步驟。
[0050]另外，本發明提供生產抗體的方法，所述抗體結合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物，其中所述抗體能夠中和在表達所述至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物的NK細胞群中由KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制，該方法包括步驟為:
[0051]a)在允許所述單克隆抗體生產的條件下培養本發明的雜交瘤；以及
[0052]b)從該雜交瘤分離所述單克隆抗體。該方法任選地含有制作該單克隆抗體片段、制作單克隆抗體衍生物、或制作這類單克隆抗體片段的衍生物的額外步驟。抗體優選結合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇。
[0053]本發明也提供生產抗體的方法，所述抗體結合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物，其中所述抗體能夠中和在表達所述至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物的NK細胞群中由KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制，該方法包括步驟為:
[0054]a)從本發明的雜交瘤分離編碼所述單克隆抗體的核酸；
[0055]b)任選地修飾該核酸，從而獲得含有編碼修飾或衍生抗體的序列的修飾核酸，所述抗體含有對應于所述單克隆抗體功能序列或與其基本相似(例如與這類序列至少約65%、至少約75%、至少約85%、至少約90%、至少約95% (例如約70-99%) —致)的氨基酸序列，其中抗體選自人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、抗體的免疫反應性片段或含有這類免疫反應性片段的融合蛋白質；
[0056]c)將所述核酸或修飾核酸(或編碼相同氨基酸序列的有關核酸)插入表達載體，其中當該表達載體存在于在適宜條件下生長的宿主細胞中時，被編碼的抗體或抗體片段能夠得到表達；
[0057]d)以所述表達載體轉染宿主細胞，其中所述宿主細胞不另外產生免疫球蛋白蛋白質； [0058]e)在引起所述抗體或抗體片段表達的條件下培養所述轉染的宿主細胞；以及
[0059]f)分離由轉染的宿主細胞產生的抗體或抗體片段。抗體優選結合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇。
[0060]應當理解本發明也提供含有抗體的組合物，其中所述抗體結合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物，其中所述抗體能夠中和在至少表達所述兩種不同的人類抑制性KIR受體之一的NK細胞中由KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制，抗體以有效地可檢測地增強患者或含有NK細胞的生物樣品中NK細胞細胞毒性的量存在；還含有可藥用的載體或賦形劑。抗體優選與存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇結合。所述組合物可以任選地含有另一種治療劑，該治療劑選自例如免疫調節劑、荷爾蒙劑、化學治療劑、抗血管生成劑、凋亡劑、結合并抑制抑制性KIR受體的另一個抗體、抗感染劑、靶向劑或輔助性化合物(adjunct compound)。有利的免疫調節劑可以選自IL-1 a、IL-1 β、IL_2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、TGF-β、GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF- a、TNF- β、LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP、LIF、OSM、TMF,PDGF, IFN-a、IFN-β或IFN-y。所述化學治療劑的實例包括烷基化試劑、抗代謝藥、細胞毒性抗生素、阿霉素、放線菌素D、絲裂霉素、洋紅霉素、正定霉素、多柔比星、他莫西芬、泰素、泰索帝、長春新堿、長春堿、長春瑞濱、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環磷酰胺、塞替派、氨甲蝶呤、喜樹堿、放線菌素D、絲裂霉素C、順鉬(CDDP)、氨蝶呤、考布他汀、其它長春花生物堿及其衍生物或前藥。荷爾蒙劑的實例包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林、他莫西芬、托瑞米芬、氟他胺、尼魯米特、環丙孕酮比卡魯胺阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、fadrozole medroxy、氯地孕酮、甲地孕酮、其它LHRH激動劑、其它抗雌激素物質、其它抗雄激素物質、其它芳香酶抑制劑、以及其它孕激素。所述結合并抑制抑制性KIR受體的另一個抗體優選為結合抑制性KIR受體表位的抗體或其衍生物或片段，其中所述表位不同于與存在于至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物上的共同決定簇結合的抗體所結合的表位。
[0061]本發明另外提供在需要增強NK細胞活性的患者中可檢測地增強NK細胞活性的方法，包括為患者施用本發明的組合物的步驟。需要增強NK細胞活性的患者可以是任何患有疾病或紊亂的患者，其中，這種增強可能促進、增強和/或誘導治療作用(或至少在具有該疾病或紊亂、或具有基本相似特征的患者的顯著部分中促進、增強和/或誘導這樣的作用，可以通過例如臨床試驗測定)。需要這類治療的患者可能患有例如癌癥、其它增生性疾病、感染性疾病或免疫疾病。該方法優選包括為患者使用合適的額外治療劑的額外步驟，所述治療劑選自免疫調節劑、荷爾蒙劑、化學治療劑、抗血管生成劑、凋亡劑、結合并抑制抑制性KIR受體的另一個抗體、抗感染劑、靶向劑或輔助性化合物，其中所述額外治療劑與所述抗體一起以單劑形式、或以分開的劑型形式施用于患者。抗體(或抗體片段/衍生物)的劑量及額外治療劑的劑量整體足以在患者中可檢測地誘導、促進和/或增強(包括增強NK細胞活性)治療反應。分開施用時，在對患者產生可檢測的聯合治療效益的條件下(例如關于時間選擇、藥劑數量等)根據需要施用抗體、片段或衍生物以及額外治療劑。
[0062]本發明包含的其它內容是本發明的能夠特異性結合非人類靈長動物(優選猴)NK細胞和/或猴KIR受體的抗體。還包含評價作為候選藥物的本發明抗體的毒性、劑量和/或活性或功效的方法。一方面，本發明包含確定對動物或祀組織有毒的抗體劑量的方法，包括將本發明的抗體施用于具有NK細胞的非人類靈長動物受體，評定該試劑對動物或優選對靶組織的任何毒性或有害或不良作用。另一方面，本發明是鑒定對動物或靶組織有毒的抗體的方法，包括將本發明的抗體施用于具有NK細胞的非人類靈長動物受體，評定該試劑對動物或優選對靶組織的任何毒性或有害或不良作用。另一方面，本發明是鑒定治療感染者、疾病或腫瘤有效的抗體的方法，包括將本發明的抗體施用于非人類靈長動物的感染、疾病或癌癥模型，鑒定改善感染、疾病或癌癥、或其癥狀的抗體。本發明的抗體優選為(a)與至少兩種人類NK細胞表面的抑制性人類KIR受體交叉反應、以及(b)與非人類靈長動物的NK細胞或KIR受體交叉反應的抗體。
[0063]本發明包含的其它內容是檢測生物樣品或活生物體內存在其細胞表面具有抑制性KIR的NK細胞的方法，所述方法包括步驟:
[0064]a)將所述生物樣品或活生物體與本發明的抗體接觸，其中所述抗體與可檢測部分綴合或共價連接；以及
[0065]b)在生物樣品或活生物體中檢測該抗體的存在。
[0066]本發明也提供從樣品中純化在其細胞表面具有抑制性KIR的NK細胞的方法，包括步驟:
[0067]a)在允許其細胞表面具有抑制性KIR`的NK細胞與所述抗體結合的條件下，將所述樣品與本發明的抗體接觸，其中抗體與固體支持物(例如珠子、基質等)綴合或共價連接；以及
[0068]b)從與固體支持物綴合或共價連接的抗體洗脫結合的NK細胞。
[0069]另一方面，本發明提供抗體、抗體片段或其任一的衍生物，所述抗體、抗體片段或其任一的衍生物含有抗體DF200或抗體Pan2D的輕鏈可變區或一個或多個輕鏈可變區CDR，如圖12所示。另一方面，本發明提供抗體、抗體片段或其任一的衍生物，所述抗體、抗體片段或其任一的衍生物含有與DF200或Pan2D的輕鏈可變區序列或這些抗體之一或二者的一個或多個輕鏈可變區CDR的全部或基本全部高度相似的序列。
[0070]另一方面，本發明提供抗體、抗體片段或其任一的衍生物，所述抗體、抗體片段或其任一的衍生物含有抗體DF200的重鏈可變區或一個或多個輕鏈可變區⑶R，如圖13所示。另一方面，本發明提供抗體、抗體片段或其任一的衍生物，所述抗體、抗體片段或其任一的衍生物含有與DF200的重鏈可變區序列全部或基本全部高度相似的序列。
[0071]本發明的這些及其它有利方面和特點將在此另外進一步說明。
[0072]附圖簡述
[0073]圖1描述單克隆抗體DF200，所述抗體與多種人類KIR2DL受體的共同決定簇結合。
[0074]圖2描述單克隆抗體DF200，所述抗體中和在Cw4陽性靶細胞上由KIR2DL介導的KIR2DL1陽性NK細胞的細胞毒性抑制。[0075]圖3描述單克隆抗體DF200、DF200Fab片段以及KIR2DL1或KIR2DL2/3特異性常規抗體，所述抗體中和在Cw4陽性靶細胞上由KIR2DL介導的KIR2DL1陽性NK細胞的細胞毒性抑制、以及在Cw3陽性靶細胞上由KIR2DL介導的KIR2DL2/3陽性NK細胞的細胞毒性抑制。
[0076]圖4描述在DF200和EB6抗體F(ab’)2片段存在下，由HLA Cw4陽性靶細胞的NK克隆導致的細胞裂解。
[0077]圖5 和 6 描述單克隆抗體 DF200、NKVSFl (pan2D)、人抗體 1-7F9、1-4F1、1-6F5 和1-6F1、以及KIR2DL1或KIR2DL2/3特異性常規抗體，所述抗體中和在Cw4陽性靶細胞上由KIR2DL介導的KIR2DL1陽性NK細胞的細胞毒性抑制(圖5中為Cw4轉染細胞，圖6中為EBV細胞)。
[0078]圖7描述顯示競爭結合實驗結果的表位作圖，所述結果以針對KIR2DL1的抗KIR抗體通過表面等離子共振(BIAcore? )分析獲得，其中重疊的圓圈指結合KIR2DL1的重疊。結果顯示1-7F9在KIR2DL1上與EB6和1-4F1競爭，但是不與NKVSFl和DF200競爭。抗體 1-4F1 依次與 EB6、DF200、NKVSF1 和 1-7F9 競爭。抗體 NKVSFl 在 KIR2DL1 上與 DF200、1-4F1和EB6競爭，但是不與1-7F9競爭。DF200在KIR2DL1上與NKVSFlU-4FI和EB6競爭，但是不與1-7F9競爭。
[0079]圖8描述顯示競爭結合實驗結果的表位作圖，所述結果以針對KIR2DL3的抗KIR抗體通過BIAcore?分析獲得，其中重疊的圓圈指結合KIR2DL3的重疊。結果顯示1-4F1在 KIR2DL3 上與 NKVSFl、DF200、gll83 和 1-7F9 競爭。1-7F9 在 KIR2DL3 上與 DF200、gll83和1-4F1競爭，但是不與NKVSFl競爭。NKVSFl在KIR2DL3上與DF200、1_4F1和GL183競爭，但是不與1-7F9競爭。DF200在KIR2DL3上與NKVSF1、1-4F1和1-7F9競爭，但是不與GL183競爭。
[0080]圖9描述顯示競爭結合實驗結果的表位作圖，所述結果以針對KIR2DS1的抗KIR抗體通過BIAcore?*析獲得，其中重疊的圓圈指結合KIR2DS1的重疊。結果顯示抗體1-4F1 在 KIR2DS1 上與 NKVSFUDF200 和 1-7F9 競爭。抗體 1-7F9 在 KIR2DS1 上與 1-4F1 競爭，但是不與DF200和NKVSFl競爭。NKVSFl在KIR2DS1上與DF200和1-4F1競爭，但是不與1-7F9競爭。DF200在KIR2DS1上與NKVSFl和1-4F1競爭，但是不與1-7F9競爭。
[0081 ] 圖10描述證明NKVSFl (pan2D) mAb與獼猴NK細胞結合的NKVSFl (pan2D) mAb滴定。將獼猴NK細胞(總NK16天)與不同量的Pan2DmAb、隨后與PE綴合的山羊F(ab’)2片段抗小鼠IgG(H+L)抗體孵育。以同種型對照(純化的小鼠IgGl)確定陽性細胞百分率。將樣品一式兩份進行測定。平均熒光強度=MFI。
[0082]圖12提供抗體DF200和Pan2D mAb輕鏈可變區和輕鏈可變區⑶R氨基酸序列的比對。
[0083]圖13提供抗體DF200的重鏈可變區。
[0084]發明詳述
[0085]技述
[0086]本發明提供全新的抗體及其片段或衍生物，所述抗體及其片段或衍生物與人類抑制性KIR受體的共同決定簇(優選存在于至少兩種不同KIR2DL基因產物上的決定簇)結合，并引起至少表達那些KIR受體之一的NK細胞的增強。本發明首次公開這類交叉反應和中和抗體是可以生產的，這代表了出乎意料的結果，并且向基于NK的全新的有效治療(特別是在人類受試者中)打開了道路。在優選的實施方案中，抗體不是單克隆抗體NKVSFl。
[0087]在本發明文中，“共同決定簇”指由幾個人類抑制性KIR受體基因產物共享的決定簇或表位。共同決定簇優選由至少兩種KIR2DL受體組成員共享。該決定簇更優選由至少KIR2DL1和KIR2DL2/3共享。除了識別多個KIR2DL基因產物，本發明的某些抗體也可以識別存在于其它抑制性KIR上的決定簇，例如KIR3DL受體組的基因產物。決定簇或表位可以代表由所述成員共享的肽片段或構象表位。在更特定的實施方案中，本發明的抗體特異性結合與單克隆抗體DF200所識別的基本相同的表位。該決定簇存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上。
[0088]在本發明文中，術語“結合”共同決定簇的抗體指具有特異性和/或親合力地結合所述決定簇的抗體。
[0089]除非另外聲明或與上下文明顯矛盾，此處所用的術語“抗體”指多克隆和單克隆抗體、以及所述多克隆和單克隆抗體的片段和衍生物。根據重鏈恒定區的類型，一般將全長抗體指定為五個主類之一:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。將其中數個進一步劃分為亞類或同種型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等。分別將對應于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區稱為“ α ”、“ δ ”、“ ε ”、“ Y ”和“ μ ”。不同類免疫球蛋白的亞基結構和三維構型廣為人知。IgG和/或IgM是本發明中采用抗體的優選類，因為它們是生理狀態下最普通的抗體并且因為它們最容易在實驗室環境中產生。本發明的抗體優選為單克隆抗體。因為本發明的目標之一是體內阻斷抑制性KIR與其相應HLA配體的相互作用而不消耗NK細胞，一般優選對應于介導低效應物功能的Fe受體的同種型，例如IgG4。
[0090]可以通過多種本領域已知的技術生產本發明的抗體。一般通過以含有抑制性KIR多肽(優選KIR2DL多肽、更優選人類KIR2DL多肽)的免疫原免疫非人類動物(優選小鼠)生產本發明的抗體。抑制性KIR多肽可以含有人類抑制性KIR多肽的全長序列或其片段或衍生物，一般為免疫原性片段，即含有暴露于表達抑制性KIR受體的細胞表面的表位的多肽部分。這類片段一般至少含有成熟多`肽序列的大約7個連續氨基酸，甚至更優選其至少大約10個連續氨基酸。片段一般基本衍生自受體的細胞外結構域。更優選的是人類KIR2DL多肽，該多肽包括全長KIRDL多肽的至少一個(更優選兩個)細胞外Ig結構域，并且能夠模擬至少一個存在于KIR2DL受體中的構象表位。在另一個實施方案中，該多肽至少含有KIR2DL1多肽氨基酸1-224位的細胞外Ig結構域的大約8個連續氨基酸(氨基酸編碼根據描述 KIR 基因家族的 PROff 網站 http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082.htm)。
[0091]在最優選的實施方案中，免疫原含有脂膜中(一般在細胞表面)的野生型人類KIR2DL多肽。在特定的實施方案中，免疫原含有完整的NK細胞，具體為任選經過處理或裂解的完整人類NK細胞。
[0092]可以用本領域熟知的刺激小鼠生產抗體的任何方式(見例如E.Harlow和D.Lane,((Antibodies:A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Labora tory Pres s,Cold Spring Harbor,NY(1988))執行以抗原免疫非人類哺乳動物的步驟。將免疫原任選地與佐劑(例如完全弗氏佐劑)懸浮或溶解于緩沖液中。確定免疫原的量、緩沖液類型和佐劑量的方法為本領域技術人員所熟知，并且不以任何形式限制本發明。對于不同的免疫原，這些參數可能不同但是易于闡明。
[0093]類似地，本領域也熟知足以刺激抗體生產的免疫位置和頻率。在典型的免疫方案中，在第一天和約一周后以抗原腹膜內注射非人類動物。隨后為約第20天的抗原記憶注射(recall injection),任選地含有佐劑例如弗氏不完全佐劑。靜脈內執行記憶注射，并且可以連續數天重復。此后為第40天靜脈內或腹膜內加強注射，一般不含佐劑。該方案在約40天后引起產生抗原特異性抗體的B細胞的產生。也可以利用其它方案，只要它們引起B細胞的產生，所述B細胞表達針對用于免疫的抗原的抗體。 [0094]對于制備多克隆抗體，從免疫的非人類動物獲得血清，通過公知的技術分離其中存在的抗體。可以使用連接到固體支持物的上述任何免疫原對血清親合純化，從而獲得與抑制性KIR受體反應的抗體。
[0095]在替代實施方案中，分離并體外培養未免疫的非人類哺乳動物淋巴細胞。然后將其在細胞培養物中暴露于免疫原。然后收獲淋巴細胞，執行下述融合步驟。
[0096]對于單克隆抗體，下一步是從免疫的非人類哺乳動物分離脾細胞、以及隨后將那些脾細胞與永生化細胞融合以形成產生抗體的雜交瘤。從非人類哺乳動物分離脾細胞為本領域所熟知，一般涉及從麻醉的非人類哺乳動物取出脾臟、將其切成小塊、將脾細胞擠壓出脾被膜并穿過細胞濾網的尼龍網孔進入合適的緩沖液中從而產生單細胞懸液。將細胞洗滌、離心并重懸于裂解任何紅細胞的緩沖液中。將溶液再次離心，并將保留在沉淀中的淋巴細胞最終重懸于新鮮緩沖液中。
[0097]一旦分離并以單細胞懸液存在，淋巴細胞可以與永生化細胞系融合。盡管本領域公知許多其它用于產生雜交瘤的永生化細胞系，其一般為小鼠骨髓瘤細胞系。優選的鼠科骨髓瘤系包括(但是不限于)可以從SalkInstitute Cell Distribution Center, SanDiego, Calif.U.S.A.，X63Ag8653獲得的衍生自M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤的那些、以及可以從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection), Rockville,Maryland U.S.A獲得的SP_2細胞。使用聚乙二醇等實現融合。然后將產生的雜交瘤在含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長的物質的選擇性培養基上培養。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養基一般將含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養基)，這些物質阻止HGPRT缺陷細胞的生長。
[0098]一般在巨噬細胞飼養層上培養雜交瘤。巨噬細胞優選來自用于分離脾細胞的非人類哺乳動物的同窩出生仔畜，一般在接種雜交瘤前數日以弗氏不完全佐劑等引發。在Goding,《Monoclonal Ant ibodies !Principles and Practice》，59-103 頁(AcademicPress, 1986)中描述了融合方法，其公開內容在此引用作為參考。
[0099]允許細胞在選擇培養基上生長足夠形成克隆并產生抗體的時間。通常在約7至約14天之間。然后測定雜交瘤克隆產生與多種抑制性KIR受體基因產物交叉反應的抗體。盡管可以采用任何能夠適應于培養雜交瘤的孔的測定法，該測定法一般為比色ELISA型測定。其它測定包括免疫沉淀和放射性免疫測定。檢查所需抗體生產為陽性的孔是否出現一個或多個不同克隆。如果存在多于一個克隆，可以將細胞再次克隆并培養，以保證產生所需抗體的克隆僅由單個細胞產生。一般將具有單個明顯克隆的陽性孔再次克隆并再次測定，以保證僅檢測并產生一種單克隆抗體。[0100]也可以通過選擇免疫球蛋白組合文庫生產抗體，如Ward等人，Nature,341(1989)544頁中所公開。
[0101]本發明的抗體也可以中和KIR介導的NK細胞細胞毒性抑制；具體由KIR2DL受體介導的抑制以及更具體的至少KIR2DL1和KIR2DL2/3抑制。這些抗體因此為“中和”或“抑制性”抗體，就此意義而言，當其與MHC I類分子相互作用時，它們至少部分地或可檢測地阻斷由KIR受體介導的抑制性信號通路。更重要地，該抑制性活性涉及幾型抑制性KIR受體，優選幾種KIR2DL受體基因產物，更優選至少KIR2DL1和KIR2DL2/3，從而可以將這些抗體高效地用于多種受試者。可以通過多種測定或測試(例如結合或細胞測定)評定對KIR介導的NK細胞細胞毒性抑制的抑制。
[0102]一旦確定了與多種抑制性KIR受體交叉反應的抗體，可以測試其中和完整NK細胞中的那些KIR受體的抑制性作用的能力。在特定的變體中，可以通過所述抗體再現由KIR2DL陽性NK克隆造成HLA-C陽性靶細胞裂解的能力來闡明中和活性。在另一個特定的實施方案中，通過抗體抑制HLA-C分子與KIR2DL1和KIR2DL3 (或關系密切的KIR2DL2)受體結合的能力將該抗體的中和活性另外優選地定義為該抗體改變:
[0103]-HLA-C分子與KIR2DL2/3結合，所述HLA-C分子選自Cwl、Cw3、Cw7和Cw8 (或在80位具有Asn殘基的HLA-C分子);以及
[0104]-HLA-C分子與KIR2DL1結合，所述HLA-C分子選自Cw2、Cw4、Cw5和Cw6 (或在80位具有Lys殘基的HLA-C分子)的能力。
[0105]在另一個變體中，可以在基于細胞的細胞毒性測定中評定本發明的抗體的抑制性活性，如在此提供的實施例中所公開。
[0106]在另一個變體中，可以 在細胞因子釋放測定中評定本發明抗體的抑制性活性，其中將NK細胞與測試抗體及表達一種被NK群KIR分子識別的HLA-C等位基因的靶細胞系孵育，刺激NK細胞產生細胞因子(例如產生IFN-Y和/或GM-CSF)。在示范性方案中，培養約4天后，通過細胞表面和細胞質內染色及流式細胞術分析評價從PBMC產生的IFN-Y。簡而言之，可以在孵育的最后約4小時加入終濃度約為5μ g/ml的BrefeldinA (Sigma Aldrich)。然后可以在透化(IntraPrep? ;Beckman Coulter)前將細胞與抗 CD3和抗CD56mAb孵育，并以PE-抗IFN-Y或PE-1gGl (Pharmingen)染色。可以使用ELISA在上清中測量由多克隆活化的NK細胞產生的GM-CSF和IFN- y (GM-CSF =DuoSet Elisa, R&DSystems, Minneapolis, MN ；IFN- y:OptElA set, Pharmingen)。
[0107]本發明的抗體可以部分或完全中和KIR介導的NK細胞細胞毒性抑制。此處所用的術語“中和KIR介導的NK細胞細胞毒性抑制”指當表達給定KIR的NK細胞群與表達相關MHC I類分子(由NK細胞上表達的KIR識別)的靶細胞接觸時，與不含抗體所獲得的特異性裂解水平相比，以未因其KIR阻斷的NK細胞或NK細胞系的相同比率所獲得的特異性裂解增加至少約20 %、優選至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %或以上(例如約25-100 % )的能力(通過細胞毒性經典鉻釋放測試測量)。例如，本發明優選的抗體能夠誘導匹配的或HLA相容的或自體靶細胞群(即缺乏所述抗體時將不被NK細胞有效裂解的細胞群)的裂解。因此，也可以將本發明的抗體定義為促進NK細胞體內活性。
[0108]另外，術語“中和KIR介導的抑制”指在鉻測定中以抗體獲得的細胞毒性水平應當是以已知的阻斷性抗MHC I類分子(例如W6/32抗MHC I類抗體)獲得的細胞毒性的至少約20%、優選至少約30%、至少約40%、至少約50% (例如約25-100%)或更多，其中鉻測定使用表達一種或幾種抑制性KIR的NK細胞克隆或轉染子以及僅表達一種被NK細胞KIR之一識別的HLA等位基因的靶細胞。
[0109]在特定的實施方案中，該抗體與單克隆抗體DF200(由雜交瘤DF200產生)結合基本相同的表位。在此將這類抗體稱為“DF200樣抗體”。在另一個優選的實施方案中，抗體為單克隆抗體。本發明更優選的“DF200樣抗體”是除單克隆抗體NKVSFl之外的抗體。最優選單克隆抗體DF200 (由雜交瘤DF200產生)。
[0110]術語與目的抗體“結合基本相同的表位或決定簇”指抗體與所述目的抗體“競爭”。術語與單克隆抗體DF200 “結合基本相同的表位或決定簇”指抗體與DF200 “競爭”。通常，與目的單克隆抗體(例如DF200、NKVSF1、17F9) “結合基本相同表位或決定簇”的抗體指抗體與所述目的抗體競爭多個KIR分子中任一個(優選選自KIR2DL1和KIR2DL2/3的KIR分子)。在其它實施例中，與目的抗體結合KIR2DL1分子上基本相同的表位或決定簇的抗體與目的抗體“競爭”結合KIR2DL1。與目的抗體結合KIR2DL2/3分子上基本相同表位或決定簇的抗體與目的抗體“競爭”結合KIR2DL2/3。
[0111]術語與目的抗體“結合本質相同的表位或決定簇”指抗體與所述目的抗體“競爭”該目的抗體特異性結合的任何及所有KIR分子。術語與單克隆抗體DF200“結合本質相同的表位或決定簇”指抗體與DF200 “競爭”DF200特異性結合的任何及所有KIR分子。例如，與單克隆抗體DF200或NKVSFl結合本質相同的表位或決定簇的抗體分別與DF200或NKVSFl競爭結合 KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DS1 和 KIR2DS2。
[0112]使用多種可評定抗體競爭的免疫學篩選測定法中的任何一種，可以容易地確定一種或多種抗體的身份，所述抗體與在此描述的單克隆抗體識別基本或本質相同的表位。許多這樣的實驗被本領域常規 實施并熟知(見例如1997年8月26日公布的美國專利N0.5，660，827，該專利在此明確引用作為參考)。應當理解，實際上并不以任何方式要求確定在此描述的抗體的結合表位以鑒定與在此描述的單克隆抗體結合相同或基本相同表位的抗體。
[0113]例如，當待檢查的測試抗體獲自不同來源的動物、或甚至是不同Ig同種型時，可以采用簡單的競爭測定，其中，將對照(例如DF200)和測試抗體混合(或預先吸附)，并施加于含有KIR2DL1和KIR2DL2/3 (各已知被DF200結合)的樣品。基于ELISA、放射性免疫測定、蛋白質印跡的方案以及BIACORE分析(列舉于例如實施例部分中)的使用適合用于這類簡單的競爭研究中。
[0114]在某些實施方案中，在施加于抑制性KIR抗原樣品之前，應當把對照抗體(例如DF200)與不同量的測試抗體(例如約1: 10或約1: 100)預先混合一段時期。在其它實施方案中，可以在暴露于KIR抗原樣品期間將對照和不同量的測試抗體簡單混合。只要能夠區分結合的與游離的抗體(例如使用分離或清洗技術消除未結合的抗體)、并區分DF200與測試抗體(例如使用種特異性或同種型特異性二級抗體或以可檢測標簽特異性標記DF200)，將能夠確定測試抗體是否降低DF200與這兩種不同KIR2DL抗原的結合，從而說明測試抗體與DF200識別基本相同的表位。在不存在完全無關的抗體時，(標記的)對照抗體的結合可以作為對照高值。將標記的(DF200)抗體與未標記的完全同型抗體(DF200)孵育(在此將出現競爭，并降低標記抗體的結合)，可以獲得對照低值。在測試測定中，標記抗體的反應性在測試抗體存在下的顯著降低，表明了識別基本相同表位的測試抗體(即與標記(DF200)抗體“交叉反應”的抗體)。在DF200:測試抗體為大約1: 10和大約1: 100之間的任何比值下，將DF200與KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原中每一個的結合降低至少約50%、例如至少約60%、或更優選至少約70% (例如約65-100% )的測試抗體，被認為是與DF200結合基本相同表位或決定簇的抗體。這類測試抗體優選將DF200與KIR2DL抗原中每個的結合降低至少約90% (例如約95% )。
[0115]可以通過例如流式細胞術測試評定競爭。在這樣的測試中，可以首先將具有給定KIR的細胞與例如DF200、然后與熒光染料或生物素標記的測試抗體孵育。如果在以飽和量DF200預孵育時獲得的結合是抗體在沒有以DF200預孵育時所獲結合的約80%、優選約50%、約40%或更低(例如約30%)(通過熒光測定)，則稱該抗體與DF200競爭。另外，如果在與飽和量測試抗體預孵育的細胞上以(用熒光染料或生物素)標記的DF200獲得的結合是沒有以該抗體預孵育所獲結合的約80%、優選約50%、約40%或更低(例如約30%)，則稱該抗體與DF200競爭。
[0116]也可以有利地采用簡單競爭測定，在該測定中，將測試抗體以飽和濃度預先吸附并施加到也固定了 KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面上。簡單競爭測定中的表面優選BIACORE芯片(或其它適于表面等離子共振分析的介質)。然后將對照抗體(例如DF200)以對KIR2DL1和KIR2DL2/3飽和的濃度與表面接觸，測量對照抗體的KIR2DL1和KIR2DL2/3表面結合。將所述對照抗體的結合與不存在測試抗體時對照抗體與含有KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面的結合比較。在測試實驗中，由對照抗體在測試抗體的存在下顯著降低含有KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面的結合指示該測試抗體與對照抗體識別基本相同的表位，所以該測試抗體與對照抗體“交叉反應”。將對照(例如DF200)抗體與KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原中每個的結合降低至少約30%或更優選約40%的測試抗體可被認為是與對照(例如DF200)結合基本相同表位或決定簇的抗體。這類測試抗體優選將對照抗體(例如DF200)與KIR2DL抗原中每個的結合降低至少約50% (例如至少約60%·、至少約70%或更多)。應當理解，可以顛倒對照和測試抗體的順序:即在競爭測定中，可以首先將對照抗體結合到表面，其后將測試抗體與表面接觸。對KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原具有高親合力的抗體優選首先結合到含有KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面，因為預期第二抗體(假定抗體是交叉反應的)的結合將降低更大的數量。在實施例及例如 Saunal 和 Regenmortel, (1995) J.1mmunol.Methodsl83:33-41中提供了這類測定的其它實例，其中Saunal和Regenmortel, (1995) J.1mmunol.Methodsl83:33-41的公開內容在此引用作為參考。
[0117]盡管為了示范以DF200為例進行說明，應當理解，上述免疫學篩選測定也可以用于鑒定與NKVSFl、1-7F9、EB6、GL183競爭的抗體及其它本發明的抗體。
[0118]在脊椎動物或細胞的免疫和抗體生產后，可以執行特定的選擇步驟分離本發明抗體。關于這一點，在特定的實施方案中，本發明也涉及生產這類抗體的方法，包括:
[0119](a)以含有抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人類哺乳動物；
[0120](b)從所述免疫動物制備抗體，其中所述抗體結合所述KIR多肽，
[0121](c)選擇(b)的抗體，所述抗體與至少兩種不同的抑制性KI R基因產物交叉反應，及
[0122](d)選擇(C)的抗體，所述抗體能夠中和在表達所述至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物的NK細胞群上由KIR介導的NK細胞細胞毒性的抑制。
[0123]可以通過篩選抗兩種或多種不同的抑制性KIR抗原的抗體實現對與至少兩種不同的抑制性KIR基因產物交叉反應的抗體的選擇，例如上文所述。
[0124]在更優選的實施方案中，步驟(b)中制備的抗體是單克隆抗體。因此，在此使用的術語“從所述免疫動物制備抗體”包括從免疫動物獲得B細胞及使用那些B細胞生產表達抗體的雜交瘤，以及直接從免疫動物血清獲得抗體。在另一個優選的實施方案中，在步驟(C)中選擇的抗體是至少與KIR2DL1和KIR2DL2/3交叉反應的抗體。
[0125]在另一個優選的實施方案中，如標準鉻釋放測定中所測量，同以未被其KIR阻斷的NK細胞以相同的效應細胞/靶細胞比獲得的裂解或細胞毒性相比，步驟(d)中選擇的抗體引起由NK細胞向靶細胞介導的至少約10%的特異性裂解，優選至少約40%的特異性裂解、至少約50%的特異性裂解或更優選至少約70%特異性裂解(例如約60-100%的特異性裂解)，所述NK細胞展示至少一種由該抗體識別的KIR，所述靶細胞表達相關HLA I類分子。另外，當步驟(d)中選擇的抗體用于鉻試驗時，以該抗體獲得的細胞毒性水平應當是以阻斷性抗MHC I類mAb (例如W6/32抗MHC I類抗體)獲得的細胞毒性的至少約20%、優選至少約30 %或更多，所述鉻試驗采用表達一種或幾種抑制性KIR的NK細胞克隆以及僅表達一種由NK克隆上的KIR之一識別的HLA等位基因的靶細胞。
[0126]上文剛剛所述方法的步驟(C)和(d)的順序可以改變。任選地，該方法也或可能另外包括制作單克隆抗體片段或單克隆抗體或這類片段的衍生物的額外步驟，例如在此另外所述。
[0127]在優選的實施方案中，根據本發明的可適用方法用于生產抗體的非人類動物是哺乳動物，例如嚙齒動物(例如小鼠、大鼠等)、牛、豬、馬、兔、山羊、綿羊等。非人類哺乳動物也可以經過遺傳修飾或經改造產生“人類”抗體，例如Xenomouse?(Abgenix)或HuMAb-Mouse? (Medarex)。
[0128]在另一個變體中，本發明提供獲得抗體的方法，包括:
[0129](a)從文庫或庫中選擇單克隆抗體、單克隆抗體片段或其任一的衍生物，所述單克隆抗體、單克隆抗體片段或其任一的衍生物與至少兩種不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產物交叉反應，并
[0130](b)選擇(a)中的抗體、片段或衍生物，所述抗體、片段或衍生物能夠中和在表達所述至少兩種不同人類抑制性KIR2DL受體基因產物的NK細胞群上由KIR介導的NK細胞細胞毒性抑制。
[0131]所述庫可以是抗體或其片段的任何(重組)庫，任選地由任何適當結構(例如噬菌體、細菌、合成復合物等)展示。抑制性抗體的選擇可以按照上文所公開的執行，并在實施例中得到進一步闡述。
[0132]根據另一個實施方案，本發明提供含有非人類宿主B細胞的雜交瘤，其中所述B細胞產生與存在于至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物上的決定簇結合的抗體，所述抗體能夠中和該受體的抑制性活性。本發明此方面的雜交瘤更優選不是產生單克隆抗體NKVSFl的雜交瘤。可以如上所述將免疫的非人類哺乳動物脾細胞與永生化細胞系融合產生本發明此方面的雜交瘤。可以對通過該融合產生的雜交瘤篩選如本文另外所述的這類交叉反應抗體的存在。雜交瘤優選產生識別至少存在于兩種不同KIR2DL基因產物上的決定簇的抗體，所述抗體引起表達至少那些KIR受體之一的NK細胞的增強。雜交瘤更優選產生與DF200結合基本相同的表位或決定簇、并且增強NK細胞活性的抗體。雜交瘤最優選為生產單克隆抗體DF200的雜交瘤DF200。
[0133] 可以在合適的培養基(例如DMEM或RPM1-1640)中大量培養經證實產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤。另外，可以將雜交瘤細胞作為動物腹水腫瘤體內培養。
[0134]充分培養產生所需單克隆抗體后，將含有單克隆抗體的生長培養基(或腹水液體)與細胞分離，純化其中存在的單克隆抗體。一般通過凝膠電泳、透析、色譜實現純化，其中色譜使用蛋白質A或蛋白質G-Sepharose、或與固體支持物例如瓊脂糖或Sepharose珠子連接的抗小鼠Ig(所有都在例如《Antibody Purification Handbook)),Amersham Biosciences,出版號N0.18-1037-46,AC版中說明，其中《AntibodyPurificationHandbook))在此引用作為參考)。一般使用低pH緩沖液(pH3.0或更低的甘氨酸或醋酸緩沖液)通過直接中和含抗體級份從蛋白質A/蛋白質G柱洗脫結合的抗體。根據需要將這些級份集中、透析并濃縮。
[0135]根據備選的實施方案，從本發明的雜交瘤分離編碼抗體的DNA，并將其置入轉染合適宿主的適宜的表達載體，所述抗體結合存在于至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物上的決定簇。然后將宿主用于重組生產抗體或其變體(例如該單克隆抗體的人源化形式、該抗體的活性片段或含有該抗體的抗原識別部位的嵌合抗體)。用于該實施方案的DNA優選編碼識別存在于至少兩種不同KIR2DL基因產物上的決定簇的抗體，所述抗體引起表達至少那些KIR受體之一的NK細胞的增強。該DNA更優選編碼與DF200結合基本相同表位并增強NK細胞活性的抗體。該DNA最優選編碼單克隆抗體DF200。
[0136]使用常規方案易于將編碼本發明的單克隆抗體的DNA分離并測序(例如使用能夠特異性結合編碼鼠抗體重和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。一旦分離，可以將DNA置入表達載體，該表達載體然后被轉染到宿主細胞(例如不另外產生免疫球蛋白的大腸桿菌(E.coli)細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，得到單克隆抗體在重組宿主細胞內的合成。抗體編碼DNA在細菌中的重組表達為本領域所熟知(見例如Skerra 等人，Curr.0pinion in Tmmunol.,5, 256頁 (1993) ；Pluckthun, Tmmunol.Revs.,130，151 頁(1992)。
[0137]單克隆抗體片段及衍生物
[0138]可以通過本領域公知的技術產生本發明的抗體片段和衍生物(除非另外聲明或與上下文明顯矛盾，本申請中所用的術語“抗體”包含抗體片段和衍生物)，優選DF-200樣抗體。“免疫反應性片段”含有完整抗體的一部分，通常為抗原結合位點或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、Fab' _SH、F(ab' ) 2和Fv片段；微型雙功能抗體；任何抗體片段，所述抗體片段是一級結構具有連續氨基酸殘基的不間斷序列的多肽(在此稱為“單鏈抗體片段”或“單鏈多肽”)，包括但不限于(I)單鏈Fv(ScFv)分子(2)含有僅一個輕鏈可變結構域的單鏈多肽，或其含有輕鏈可變結構域的三個CDR、沒有相關重鏈部分的片段以及
(3)含有僅一個重鏈可變結構域的單鏈多肽，或其含有重鏈可變結構域的三個CDR、沒有相關輕鏈部分的片段；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。例如，可以根據常規技術通過蛋白酶消化分離的抗體產生Fab或F(ab’)2片段。應當理解，可以使用已知方法修飾免疫反應性片段，從而例如延緩體內清除并得到更需要的藥物代謝動力學特征。可以以聚乙二醇(PEG)修飾片段。在例如 Leong 等人，Cytokinel6 (3):106-119 (2001)和 Delgado 等人，Br.T.Cancer73 (2):175-182(1996)中描述了 PEG向Fab’片段的耦連和位點特異性綴合方法，Leong等人及Delgado等人的公開內容在此引用作為參考。
[0139]在特定的方面，本發明提供含有圖12中列出的DF200輕鏈可變區序列的抗體、抗體片段及抗體衍生物。另一個特定方面，本發明提供含有圖12中列出的Pan2D輕鏈可變區序列的抗體、抗體片段及抗體衍生物。另一方面，本發明提供含有圖12中列出的DF200的一個或多個輕鏈可變區CDR的抗體、抗體片段及其衍生物。另一方面，本發明提供含有圖12中列出的Pan2D的一個或多個輕鏈可變區CDR的抗體、抗體片段及其衍生物。可以使用標準技術(還可進行序列比較)通過在這些公開的氨基酸序列中進行合適的取代、添加、和/或刪除以產生這類序列的功能性變體/類似物。因此，例如，Pan2D和DF-200之間保守的CDR殘基可能是合適的修飾靶，因為這類殘基可能對這些抗體關于其它在此公開的抗體的競爭中的不同特征沒有貢獻(盡管Pan2D和DF-200競爭)，因此可能對這些抗體對于其各自特定表位的特異性沒有貢獻。另一方面，在殘基存在于這些抗體之一的序列中(而非另一個)的位置，該位置可能適于刪除、取代和/或插入。
[0140]在特定的方面，本發明提供含有圖13中列出的DF200重鏈可變區序列的抗體、抗體片段及抗體衍生物。另一方面，本發明提供含有圖13中列出的DF200的一個或多個重鏈可變區⑶R的抗體、抗體片段及其衍生物。可以使用標準技術通過在這些公開的氨基酸序列中制作合適的取代、添加、和/或刪除以產生這類序列的功能性變體/類似物，這將得益于序列比較。另一方面，那些其中殘基存在于這些抗體之一的序列中但不存在于其它序列的位置可能適于刪除、取代和/或插入。
[0141]另外，可以修飾產生本發明的抗體(優選DF-200樣抗體)的雜交瘤DNA從而編碼本發明的片段。然后將修飾DNA插入表達載體并用于轉化或轉染合適的細胞，所述細胞然后表達所需片段。
[0142]在備選實施方案中，可以在插入表達載體之前，通過例如以人類重和輕鏈恒定結構域編碼序列取代同源非人類序列(例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,81,6851頁(1984))、或通過將全部或部分非免疫球蛋白多肽編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接修飾產生本發明的抗體(優選DF-200樣抗體)的雜交瘤DNA。在這種形式中，制備具有原始抗體結合特異性的“嵌合”或“雜交”抗體。一般，以這類非免疫球蛋白多肽置換本發明的抗體的恒定結構域。
[0143]因此，根據另一個實施方案，本發明的抗體(優選DF-200樣抗體)是人源化的。根據本發明的抗體的“人源化”形式是含有衍生自鼠免疫球蛋白的最小序列的特異性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如抗體的Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2、或其它抗原結合子序列)。大多數情況下，人源化抗體是人類免疫球蛋白(受者抗體)，所述人類免疫球蛋白中，來自受者互補決定區(CDR)的殘基被來自原始抗體(供者抗體)CDR的殘基取代，同時保留原始抗體的所需特異性、親合力和能力。在一些實例中，可以用相應的非人類殘基取代人類免疫球蛋白的Fv構架殘基。另外，人源化抗體可以含有受體抗體中或引入的CDR或構架序列中沒有的殘基。制造這些修飾以進一步精制和優化抗體性能。通常，人源化抗體將包括幾乎所有至少一個(一般為兩個)可變結構域，在所述可變結構域中所有或幾乎所有CDR區對應于原始抗體的CDR區，并且所有或幾乎所有FR區是人類免疫球蛋白一致序列的FR區。人源化抗體最好也將包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(Fe)(—般為人類免疫球蛋白恒定區)。進一步細節見.Tones等人，Nature, 321, 522頁(1986) ;Reichmann等人，Nature, 332, 323 頁(1988):以及 Presta, Curr.0p.Struct.Biol., 2, 593 頁(1992)。
[0144]將本發明的抗體人源化的方法為本領域所熟知。通常，根據本發明的人源化抗體具有一個或多個從原始抗體引入其中的氨基酸殘基。常把這些鼠科或其它非人類氨基酸殘基稱為“引入的”殘基，一般取自“引入的”可變結構域。可以基本按照Winter與同事的方法(Tones 等人，Nature, 321, 522 頁(1986):Riechmann 等人，Nature, 332, 323 頁(1988)；Verhoeyen等人，Science, 239,1534頁(1988))執行人源化。因此,這類“人源化”抗體是嵌合抗體，由原始抗體的相應序列取代基本小于完整的人類可變結構域(Cabilly等人，美國專利N0.4，816，567)。實際上，根據本發明的人源化抗體一般為人類抗體，所述人類抗體中一些⑶R殘基及可能一些FR殘基被原始抗體相似位點的殘基置換。
[0145]用于制作人源化抗體的人類可變結構域(輕和重鏈)的選擇對于降低抗原性非常重要。根據所謂的“最適合”方法，對已知人類可變結構域序列的完整文庫篩選本發明的抗體的可變結構域序列。然后接受與小鼠序列最接近的人類序列作為人源化抗體人類構架(FR) (Sims 等人，T.1mmunol., 151,2296 I (1993) ；Chothia 和 Lesk, T.Mol.Biol.，196，901頁(1987))。另一個方法使用來自輕或重鏈特定亞群的所有人類抗體的一致序列的特定構架。相同構架可以用于幾個不同的人源化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,89,4285 I (1992):Presta 等人，T.1mmunol.,51,1993 等人))。
[0146]更為重要的是將抗體人源化而保持對多種抑制性KIR受體的高親合力和其它有利的生物學特性。為了實現這個目標，根據優選的方法，通過使用母本和人源化序列的三維模型分析母本序列及多種概念上的人源化產物的方法制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型一般可獲得，并且是本領域技術人員所熟悉的。可以獲得圖解并展示所選候選免疫球蛋白序列的可能的三維構象結構的計算機程序。這些展示的檢查允許分析殘基在候選免疫球蛋白機能中的可能角色，即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合能力的殘基。這樣，可以從一致和引入序列中選擇并組合FR殘基，從而實現所需的抗體特征，例如對靶抗原的親合力增加。通常，CDR殘基直接并最主要涉及影響抗原結合。
[0147]制作“人源化”單克隆抗體的另一種方法是使用XenoMoilS e? (Abgenix,Fremont, CA)作為免疫小鼠。XenoMouse是根據本發明的鼠科宿主，其免疫球蛋白基因被功能性人類免疫球蛋白基因取代。因此，由該小鼠或由該小鼠B細胞制作的雜交瘤產生的抗體已經經過人源化。在美國專利N0.6，162,963中描述了 XenoMouse，其中美國專利N0.6，162，963在此全文引用作為參考。使用HuMAb-Mouse?(Medarex)可以完成類似方法。
[0148]也可以根據多種其它技術產生人類抗體，例如使用經設計表達人類抗體庫的其它轉基因動物用于免疫(Jakobovitz等人，Nature362(1993)255)，或使用噬菌體展示方法選擇抗體庫。這類技術為技術人員公知，并可以從本申請公開的單克隆抗體開始執行。
[0149]也可以將本發明的抗體(優選DF-200樣抗體)衍生為“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，只要它們顯示所需的生物學活性，所述“嵌合”抗體中重和/或輕鏈的一部分與原始抗體的相應序列一致或同源，而鏈的剩余部分與衍生自其它物種或屬于其它抗體類或亞類的抗體、以及這類抗體的片段的相應序列一致或同源(Cabilly等人,如上；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,81,6851 頁，(1984))。[0150]在本發明范圍內的其它衍生物包括功能化抗體，即與毒素(例如蓖麻毒素、白喉毒素、相思豆毒蛋白和假單胞菌(Pseudomonas)外毒素)；可檢測部分(例如熒光部分、放射性同位素或成像劑)；或固體支持物(例如瓊脂糖珠子等)綴合或共價連接的抗體。這些其它試劑與抗體綴合或共價連接的方法為本領域熟知。 [0151]與毒素綴合有益于在其細胞表面展示交叉反應性KIR受體之一的NK細胞的靶向殺傷。本發明的抗體一旦與這類細胞的細胞表面結合，它將被內化，毒素被釋放到細胞內，選擇性殺傷該細胞。這類用途是本發明的備選實施方案。
[0152]當本發明的抗體用于診斷目的時，與可檢測部分綴合是有用的。這類目的包括(但是不限于)對生物樣品測定在其細胞表面具有交叉反應性KIR的NK細胞的存在、以及在活生物體內檢測具有交叉反應性KIR的NK細胞的存在。這類測定和檢測方法也是本發明的備選實施方案。
[0153]作為從來源(例如生物液體)親合純化在其細胞表面具有交叉反應性KIR的NK細胞的工具，本發明的抗體與固體支持物綴合是有用的。如產生的純化的NK細胞群一樣，所述純化方法是本發明的另一個備選實施方案。
[0154]在備選實施方案中，可以將抗體(包括NKVSF1)單獨或與另一種用于向動物靶向輸送的物質一起整合到脂質體(“免疫脂質體”)中，其中所述抗體與存在于至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產物上的共同決定簇結合，能夠中和在至少表達所述本發明兩種不同的人類抑制性KIR受體之一的NK細胞上由KIR介導的NK細胞細胞毒性抑制。這類其它物質包括為基因治療輸送基因、或為在NK細胞中抑制基因輸送反義RNA、RNAi或siRNA的核酸；或用于NK細胞靶向殺傷的毒素或藥物。
[0155]基于其發表的晶體結構(Maenaka等人，(1999), Fan等人，(2001), Boyington等人，(2000))，KIR2DL1、2和3(KIR2DLl-3)細胞外結構域的計算機模擬預測了涉及KIR2DL1與KIR2DL1-3交叉反應性小鼠單克隆抗體DF200和NKVSFl之間相互作用的某些區域或KIR2DL1、2和3。因此，在一個實施方案中，本發明提供在由氨基酸殘基(105、106、107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181、192)定義的區域內與KIR2DL1專一結合的抗體。在另一個實施方案中，本發明提供與KIR2DL1和KIR2DL2/3結合而不與由殘基(105、106、107、108、109、110、
I11、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181、192)定義的區域之外的氨基酸殘基相互作用的抗體。
[0156]在另一個實施方案中，本發明提供與KIR2DL1結合并且不與KIR2DL1突變體結合的抗體，所述KIR2DL1突變體中，R131為Ala。
[0157]在另一個實施方案中，本發明提供與KIR2DL1結合并且不與KIR2DL1突變體結合的抗體，所述KIR2DL1突變體中，R157為Ala。
[0158]在另一個實施方案中，本發明提供與KIR2DL1結合并且不與KIR2DL1突變體結合的抗體，所述KIR2DL1突變體中，R158為Ala。
[0159]在另一個實施方案中，本發明提供與KIR2DL1殘基(131、157、158)結合的抗體。
[0160]在另一個實施方案中，本發明提供與KIR2DS3(R131W)結合、但是不與野生型KIR2DS3結合的抗體。
[0161]在另一個實施方案中，本發明提供與KIR2DL1和KIR2DL2/3以及KIR2DS4結合的抗體。
[0162]在另一個實施方案中，本發明提供與KIR2DL1和KIR2DL2/3結合、但是不與KIR2DS4結合的抗體。
[0163]可以用本領域技術人員公知的方法進行確定抗體是否在上述定義的表位區之一內結合。作為這類作圖/表征方法的一個實例，可以使用KIR2DL1或KIR2DL2/3蛋白質中暴露的氨基/羧基的化學修飾通過表位“足跡法(foot-printing) ”確定抗KIR抗體的表位區。這類足跡法技術的一個特定實例是使用HXMS (質譜法檢測的氫-氘交換)，其中出現受體和配體蛋白質酰氨質子的氫/氣交換、結合和換回(back exchange),其中參與蛋白質結合的骨架酰氨基團受保護免于換回，因而將保持氘化。通過胃蛋白酶蛋白質水解、快速微孔高效液相色譜分離和/或電噴霧離子化質譜法可以在該點鑒定有關區域。見例如EhringH，Analytical Biochemistry, Vol.267 (2) 252-259 頁(1999)和 / 或 Engen, J.R.和 Smith,D.L.(2001) Ahal.Chem.73，256A-265A。合適的表位鑒定技術的另一個實例是核磁共振表位作圖(NMR)，一般比較二維NMR譜中游離抗原和與抗原結合肽(例如抗體)復合的抗原的信號位置。一般以15N選擇性同位素標記抗原，因此NMR譜上僅見對應于抗原的信號，而沒有來自抗原結合肽的信號。與游離抗原譜相比，源自涉及與抗原結合肽相互作用的氨基酸的抗原信號一般將在復合物譜中位移，這樣可以鑒定涉及結合的氨基酸。見例如ErnstSchering Res Found Workshop.2004 ； (44):149-67 ;Huang 等人，Journal of Molecul arBiology, Vol.281 (I) 61-67 頁(1998);以及 Saito 和 Patterson, Methods.1996Jun ；9 (3):516-24。[0164]也可使用質譜方法執行表位作圖/表征。見例如Downward, J MassSpectrom.2000Apr ；35 (4):493-503 及 Kiselar 和 Downard, Anal Chem.1999Mayl ；71 (9):1792-801 ο
[0165]蛋白酶消化在表位作圖和鑒定中也可以是有用的。可以通過蛋白酶消化(例如，用與KIR2DL1或KIR2DL2/3大約1: 50的比例使用胰蛋白酶于37°C和ρΗ7_8ο/η消化)及隨后的肽鑒定質譜(MS)分析，確定抗原決定簇相關區域/序列。隨后可以通過比較經受胰蛋白酶消化的樣品和與抗體孵育、然后經受例如胰蛋白酶消化的樣品(從而為結合物展示足跡)，鑒定由抗KIR結合物保護免于胰蛋白酶切割的肽。像糜蛋白酶、胃蛋白酶等其它酶也或另外可以用于類似的表位表征方法。此外，酶消化可以提供快速方法，用于分析非表面暴露并因此最可能與免疫原性/抗原性無關的抗-KIR多肽情況下KIR2DL1區域內是否存在潛在的抗原決定簇序列。類似技術的討論見例如Manca, Ann 1st Super Sanita.1991 ；27(1):15-9。
[0166]與獼猴的交叉反應性
[0167]發現抗體NKVSFl也與獼猴NK細胞結合，見實施例7。本發明因此提供抗體及其片段和衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物與人類NK細胞表面至少兩種抑制性人類KIR受體交叉反應，而且結合獼猴NK細胞。在一個實施方案中，該抗體不是抗體NKVSFl。本發明也提供測試抗體及其片段和衍生物毒性的方法，其中所述抗體、片段或衍生物與人類NK細胞表面至少兩種抑制性人類KIR受體交叉反應，其中方法包括在獼猴中測試該抗體。
[0168]組合物及施用
[0169]本發明也在合適的載體中以可檢測地增強患者或含有NK細胞的生物樣品的NK細胞細胞毒性的有效量提供含有抗體及其片段和衍生物的藥物組合物，其中所述抗體、片段或衍生物與NK細胞表面至少兩種抑制性KIR受體交叉反應、中和其抑制性信號并增強那些細胞的活性。該組合物另外含有可藥用載體。也將這類組合物稱為“本發明的抗體組合物”。在一個實施方案中，本發明的抗體組合物含有上文抗體實施方案中公開的抗體。抗體NKVSFl包括在可能出現于本發明的抗體組合物中的抗體范圍內。
[0170]此處所用的術語“生物樣品”包括但是不限于生物液體(例如血清、淋巴液、血液)、細胞樣品或組織樣品(例如骨髓)。
[0171]可用于這些組合物的可藥用載體包括(但是不限于)離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白質(例如人血清白蛋白)、緩沖物質例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質，例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
[0172]在增強患者或生物樣品NK細胞活性的方法中可以采用本發明的組合物。該方法包括將組合物與患者或生物樣品接觸的步驟。這類方法將有益于診斷和治療目的。
[0173]對于結合生物樣品使用，依賴于樣品性質(液體或固體)，可以與樣品簡單混合或直接應用于樣品而施用抗體組合物。可以在任何合適的裝置(板、袋、瓶等)中將生物樣品與抗體直接接觸。對于結合患者使用，該組合物必須經過配制施用于患者。
[0174]可以口服、胃腸外、通過吸入噴霧、局部、經直腸、經鼻、經口腔、經陰道或通過植入C:庫(implanted reservoir)施用本發明的組合物。此處所用的術語“胃腸外”包括皮下、靜脈內、肌肉內、關節內、滑液內、胸骨內、鞘內、肝內、病灶內和顱內注射或輸液技術。優選口服、腹膜內或靜脈內施用該組合物。
[0175]本發明的組合物 的消毒可注射形式可以是水性或油性懸浮液。可以根據本領域公知的技術使用合適的分散或潤濕劑和懸浮劑配制懸浮液。消毒可注射劑也可以是胃腸外可接受的無毒稀釋劑或溶劑中的消毒可注射溶液或懸浮液，例如1，3_ 丁二醇中的溶液。在可接受的載體和溶劑中可采用的是水、Ringer溶液和等張氯化鈉溶液。另外,常規采用消毒的固定油作為溶劑或懸浮介質。為此，可以采用任何溫和的固定油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。脂肪酸(例如油酸及其甘油酯衍生物)在注射劑的制備中是有用的，如天然可藥用油(例如橄欖油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙基化形式。這些油溶液或懸浮液也可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，例如常用于配制包括乳劑和懸浮液在內的可藥用劑量形式的羧甲基纖維素或類似分散劑。其它常用的表面活性劑(例如常用于制造可藥用固體、液體或其它劑量形式的Tween、Span和其它乳化劑或生物利用度增強物)也可以用于配制目的。
[0176]可以以任何口服可接受的劑量形式口服施用本發明的組合物，所述口服可接受的劑量形式包括(但是不限于)膠囊、片劑、水性懸浮液或溶液。在口服使用片劑的情況下，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般也加入潤滑劑，例如硬脂酸鎂。對于以膠囊形式口服施用，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥玉米淀粉。當要求水性懸浮液口服使用時，將活性成分與乳化劑和懸浮劑組合。如果需要，也可以加入某些甜味劑、調味劑或著色劑。
[0177]另外，可以以直腸施用的栓劑形式施用本發明的組合物。可以通過將試劑與合適的無刺激性賦形劑混合制備這些，所述合適的無刺激性賦形劑在室溫為固體，但是在直腸溫度為液體，因此將在直腸中融化釋放藥物。這類原料包括可可油、蜂蠟和聚乙二醇。[0178]也可以局部施用本發明的組合物，尤其是當治療靶標包含局部應用易于到達的區域或器官時(包括眼、皮膚、或下腸道疾病)。易于為這些區域或器官中的每個制備合適的局部制劑。
[0179]可以通過直腸栓劑制劑(見上)或通過合適的灌腸劑制劑實現下腸道局部應用。也可以使用局部透皮貼劑。
[0180]對于局部應用，可以將該組合物配制在合適的軟膏中，所述軟膏含有懸浮或溶解于一種或多種載體中的活性成分。用于局部施用本發明的化合物的載體包括(但是不限于)礦物油、液體礦脂(liquid petrolatum)、白礦脂、丙二醇、聚環氧乙燒、聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水。另外，可以將該組合物配制在合適的洗劑或乳膏中，所述洗劑或乳膏含有懸浮或溶解于一種或多種可藥用載體中的活性成分。合適的載體包括(但是不限于)礦物油、失水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚山梨酸酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
[0181]對于眼科使用，可以將該組合物配制為調節pH的等張消毒鹽溶液中的微粉化懸浮液，或優選調節pH的等張消毒鹽溶液中的溶液，含有或不含諸如benzylalkoniumchloride這類防腐劑。另外，對于眼科使用，可以將該組合物配制在軟膏中，例如礦脂。
[0182]也可以通過鼻氣溶膠或吸入劑施用本發明的組合物。根據藥物制劑領域眾所周知的技術制備這類組合物，并可采用苯甲醇或其它合適的防腐劑、增強生物利用度的吸收促進劑、碳氟化合物和/或其它常規增溶或分散劑在鹽溶液中制備為溶液。
[0183]幾種單克隆抗體顯示在臨床狀態中有效，例如Rituxan (Rituximab)、Herceptin (Trastuzumab)或Xolair(Omalizumab),可以對本發明的抗體使用類似的施用方案(即制劑和/或劑量和/或施用方法)。可以根據關于這些產物的已知方法(例如使用廠商說明書)確定施用本發明的藥物組合物中抗體的方案和劑量。例如，可以將本發明的藥物組合物中存在的抗體以10mg/mL的濃度儲備在IOOmg(IOmL)或500mg(50mL) —次性使用瓶中。將產品配制在9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL檸檬酸鈉二水合物、0.7mg/mL聚山梨酸酯80和用于注射的消毒水中用于I V施用。調節pH至6.5。本發明的藥物組合物中抗體的合適的示范性劑量范圍可以在大約10mg/m2和500mg/m2之間。然而，應當理解，這些方案是示范性的，可以考慮藥物組合物中特定抗體的親合力和耐受性調整最佳方案，所述藥物組合物中特定抗體的親合力和耐受性是臨床試驗中必須確定的。將考慮抗體親合力及其藥物代謝動力學參數確定注射本發明的藥物組合物中的抗體浸透NK細胞24小時、48小時、72小時或一周或一個月的量和方案。
[0184]根據另一個實施方案，本發明的抗體組合物可以另外含有另一種治療劑，包括通常用于施用所述抗體的特定治療目的的試劑。額外的治療劑通常以該試劑在治療特定疾病或病癥的單一療法中的一般用量出現在組合物中。這類治療劑包括(但是不限于)用于癌癥治療的治療劑、用于治療感染性疾病的治療劑、用于其它免疫治療的治療劑、細胞因子(例如IL-2或IL-15)、其它抗體及其它抗體的片段。
[0185]例如，可以 利用許多癌癥治療的治療劑。本發明的抗體組合物和方法可以與任何常用于治療特定疾病(具體為腫瘤、癌癥疾病或患者表現的其它疾病或紊亂)的其它方法組合。只要知道特定的治療方法本質上對患者無害，并且不顯著抵消本發明的組合物中的抗體活性，設想將其與本發明組合。[0186]關于實體瘤治療，可以與經典方法(例如手術、放射治療、化學治療等)組合使用本發明的藥物組合物。本發明因此提供組合治療，其中，在手術或放射治療同時、之前或之后使用本發明的藥物組合物；或在常規化學治療、放射治療或抗血管生成劑、或靶向的免疫毒素或coaguligand的同時、之前或之后施用于患者。
[0187]在治療方案中一種或多種試劑與本發明含有抗體的組合物組合使用時，不要求組合的結果是單獨執行每個治療時觀察到的作用的加成。盡管通常需要至少加成作用，任何比一種單獨治療增加的抗癌作用將是有利的。同樣，對組合治療沒有特定要求表現協同作用，盡管這是的確可能并且有利的。
[0188]為了實行組合抗癌治療，與另一種抗癌劑組合、以能夠在動物體內有效引起其組合的抗癌作用的方式給動物簡單施用本發明的抗體組合物。因此以能夠引起其在腫瘤血管內的組合出現以及在腫瘤環境中的組合作用的有效量和有效時期提供該試劑。為了實現此目標，可以將本發明的抗體組合物和抗癌劑以單個組合的組合物或作為兩種不同組合物使用不同施用途徑同時施用于動物。
[0189]另外，可以以例如從數分鐘至周和月范圍內的間隔在抗癌劑治療之前或之后施用本發明的抗體組合物。人們將確保抗癌劑和本發明的抗體組合物中的抗體對癌癥發揮有利的組合效果。
[0190]在抗血管生成治療中大多數抗癌劑將在本發明的抑制性KIR抗體組合物之前給予。然而，當在本發明的抗體組合物中使用抗體的免疫綴合物時，可以同時或隨后施用多種抗癌劑。
[0191]在有些情況下，甚至可能需要顯著延長治療時程，在分別施用抗癌劑或抗癌治療與施用本發明的抗體組合物之間間隔數天(2、3、4、5、6或7)、數周(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至數月(1、2、3、·4、5、6、7或8)。在抗癌治療旨在基本破壞腫瘤(例如手術或化學治療)、施用本發明的抗體組合物旨在防止微小轉移或腫瘤再生長的情況下，這將是有利的。
[0192]也預想將利用一次以上施用本發明的基于抑制性KIR抗體的組合物或抗癌劑。可以在交替的天或周；或本發明的抑制性KIR抗體組合物治療周期繼之以抗癌劑治療周期交替施用這些試劑。無論如何，為了使用組合治療實現腫瘤抑制，無論施用次數，所有要求是輸送兩種試劑有效發揮抗腫瘤作用的組合量。
[0193]關于手術，可以與本發明組合實行任何手術干預。關于放射治療，考慮在癌細胞內誘導DNA局部損傷的任何機制，例如Y放射、X射線、UV放射、微波甚至電子發射等。也考慮將放射性同位素靶向輸送至癌細胞，這可以與靶向抗體或其它靶向手段聯合使用。
[0194]在其它方面，可以與本發明的抗體組合物組合或作為其部分施用免疫調節化合物或方案。免疫調節化合物的優選實例包括細胞因子。在這類組合方法中可以采用多種細胞因子。在本發明設想的組合中有用的細胞因子實例包括IL-1a、IL-1 β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8,IL-9,IL-10,IL-1UIL-12,IL-13,IL-15,IL-21,TGF-β、GM_CSF、M-CSF, G-CSF, TNF- a、TNF- β、LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP、LIF、OSM、TMF, PDGF,IFN-a ,IFN-β、IFN_ 。根據與臨床指征(例如患者病癥)及細胞因子相對毒性一致的標準方案施用用于本發明的組合治療或組合物中的細胞因子。
[0195]在某些實施方案中，本發明的含有交叉反應抑制性K I R抗體的治療組合物可以與化學治療或荷爾蒙治療劑組合施用，或者可以另外含有所述化學治療或荷爾蒙治療劑。在此公開的組合治療方法中可以使用多種荷爾蒙治療和化學治療劑。考慮為示范性的化學治療劑包括(但是不限于)烷基化試劑、抗代謝物、細胞毒性抗體、長春花生物堿、例如阿霉素、放線菌素D、絲裂霉素、洋紅霉素、正定霉素、多柔比星、他莫西芬、泰素、泰索帝、長春新堿、長春堿、長春瑞濱、依托泊苷(VP-16)、5_氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環磷酰胺、塞替派、氨甲蝶呤、喜樹堿、放線菌素D、絲裂霉素C、順鉬(CDDP)、氨蝶呤、考布他汀及其衍生物和前藥。
[0196]荷爾蒙劑包括(但是不限于)例如LHRH拮抗劑，例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林和布舍瑞林；抗雌激素例如他莫西芬和托瑞米芬；抗雄激素例如氟他胺、尼魯米特、環丙孕酮和比卡魯胺；芳香酶抑制劑例如阿那曲唑、依西美坦、來曲唑和法倔唑；以及孕激素例如medroxy、氯地孕酮和甲地孕酮。[0197]如本領域普通技術人員將理解的，化學治療劑的合適劑量將接近臨床治療中已經采用的劑量，其中化學治療劑單獨或與其它化學治療藥物組合施用。僅作為實例，可以使用例如順鉬和其它DNA烷基化試劑。順鉬已被廣泛用于治療癌癥，以用于臨床應用中的有效劑量20mg/m2每三周使用5天，總共三個療程。順鉬口服不吸收，因此必須通過靜脈內、皮下、腫瘤內或腹膜內注射輸送。
[0198]其它有用的化學治療劑包括干擾DNA復制、有絲分裂和染色體分離的化合物、以及破壞多核苷酸前體合成和保真度的試劑。許多用于組合治療的示范性化學治療劑列舉在美國專利N0.6，524，583的表C中，所述美國專利N0.6，524，583的試劑和說明的公開內容在此明確引用作為參考。每個列出的試劑是示范性的，并且是非限制性的。技術人員受《Remington' s Pharmaceutical Sciences》第十五版,第 33 章，具體為 624-652 頁指導。根據所治療的病癥，可能出現劑量變化。施用治療的醫師將能夠為個體受試者確定合適的劑量。
[0199]本發明的交叉反應抑制性KIR抗體組合物可以與一種或多種其它抗血管生成治療組合使用，或另外含有抗血管生成劑。這類試劑的實例包括各針對VEGF或VEGF受體的中和抗體、反義RNA、siRNA、RNA1、RNA aptamer和核酶(美國專利N0.6，524，583，其公開內容在此引用作為參考)。也可以采用具有拮抗性質的VEGF變體，如W098/16551中所描述，其中W098/16551在此引用作為參考。對于組合治療有用的其它示范性抗血管生成劑列舉在美國專利N0.6，524，583的表D中，所述美國專利N0.6，524，583的試劑和指征的公開內容在此明確引用作為參考。
[0200]本發明的抑制性KIR抗體組合物也可以有利地與誘導凋亡的方法組合使用，或含有凋亡劑。例如，許多抑制凋亡或程序性細胞死亡的癌基因得到鑒定。該范疇內的示范性癌基因包括(但是不限于)bcr-abl, bcl_2 (不同于bcl_l、細胞周期蛋白Dl ；GenBank登錄號M14745、X06487 ;美國專利N0.5，650，491 ;及5，539，094 ;每個在此引用作為參考)以及家族成員，包括Bcl-Xl、Mcl-l、Bak、Al和A20。在T細胞淋巴瘤中首先發現了 bcl_2的過表達。癌基因bcl-2通過結合并失活凋亡途徑中的蛋白質Bax起作用。抑制bcl-2的功能阻止Bax的失活，并允許凋亡途徑進行。考慮使用例如反義核苷酸序列、RNAi, siRNA或小分子化學化合物抑制這類癌基因，用于本發明以增加凋亡(美國專利N0.5，650，491 ；5，539，094 ;及5，583，034 ;每個在此引用作為參考)。
[0201]本發明的抑制性KIR抗體組合物也可以包含含有靶向部分的分子(例如抗體、配體或其綴合物)或與所述分子組合使用，所述含有靶向部分的分子針對靶細胞(例如靶腫瘤細胞)特異性標志(“靶向劑”)。一般而言，用于本發明這些額外方面的靶向劑將優選識別可接近的腫瘤抗原，所述腫瘤抗原優選或特異性表達于腫瘤位點。靶向劑一般將結合腫瘤細胞的表面表達的、表面可及的或表面定位的成分。靶向劑也將優選展示高親合特性；并且不會在體內對維持生命的正常組織發揮顯著副作用，所述維持生命的正常組織例如選自心、腎、腦、肝、骨髓、結腸、乳腺、前列腺、甲狀腺、膽囊、肺、腎上腺、肌肉、神經纖維、胰腺、皮膚中的一個或多個組織、或人體內其它維持生命的器官或組織。此處所用的術語“不發揮顯著副作用”指靶向劑被體內施用時將僅產生可忽略的或臨床可以處理的副作用(例如化學治療期間通常遇到的那些)的事實。
[0202]在腫瘤治療中，本發明的抗體組合物可以另外含有輔助化合物或與其組合使用。作為實例，輔助化合物可以包括止吐藥例如5-羥色胺拮抗劑及治療劑例如吩噻嗪、取代的苯甲酰胺、抗組胺劑、丁酰苯類、皮質類固醇類、苯二氮雜革類和大麻素類；雙膦酸化合物例如唑來膦酸和帕米膦酸；以及造血生長因子例如促紅細胞生成素和G-CSF，例如非格司亭、來格司亭和達比波亭(darbepoietin)。
[0203]在另一個實施方案中，可以將本發明的兩個或多個具有不同交叉反應性的抗體(包括NKVSF1)組合在單個組合物中，從而中和盡可能多的抑制性KIR基因產物的抑制性作用。含有本發明的交叉反應抑制性KIR抗體或其片段或衍生物組合的組合物將允許更廣泛的效用，因為可能缺乏被單個交叉反應性抗體識別的每個抑制性KIR基因產物的人群的低百分率可能存在。類似地，本發明的組合物可以另外含有一種或多種識別單個抑制性KIR亞型的抗體。這類組合將再次在治療情況下提供更廣泛的效用。
[0204]本發明也提供在需要增強NK細胞活性的患者體內增強NK細胞活性的方法，包括給所述患者施用根據本發明的組合物的步驟。該方法更具體地針對在患有疾病的患者體內增強NK細胞活性，所述疾病中，增加患者NK細胞活性是有益的，該疾病涉及、影響或由對NK細胞造成的裂解易感的細胞引起，或者該疾病由NK細胞活性不足引起、或以其為特征(例如癌癥、另一種增生性疾病、感染性疾病或免疫紊亂)。本發明的方法更具體地用于治療多種癌癥和其它增生性疾病，包括(但是不限于)膀胱、乳腺、結腸、腎、肝、肺、卵巢、前列腺、胰腺、胃、子宮頸、甲狀腺和皮膚(包括鱗狀上皮細胞癌)癌；淋巴系造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤；髓系造血腫瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和早幼粒細胞白血病；間葉細胞來源的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；其它腫瘤，包括黑素瘤、精原細胞瘤、畸胎瘤、神經母細胞瘤和神經膠質瘤；中樞和周圍神經系統腫瘤，包括星細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤和神經鞘瘤(schwannomas);間葉細胞來源的腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤；以及其它腫瘤，包括黑素瘤、著色性干皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌和畸胎瘤。
[0205]可以根據本發明治療的優選疾病包括淋巴系造血腫瘤，例如T細胞和B細胞腫瘤(包括但是不限于T細胞疾病例如T前淋巴細胞白血病(T-PLL)，包括小細胞和腦回樣細胞型的；優選T細胞型的大顆粒淋巴細胞白血病(LGL) ;Sezary綜合征(SS);成人T細胞白血病淋巴瘤(ATLL) ；a/d T-NHL肝脾細胞淋巴瘤；外周/胸腺后T細胞淋巴瘤(多形性和免疫母細胞性亞型)；血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤；血管中心性(鼻性)T細胞淋巴瘤；間變性(Kil+)大細胞淋巴瘤；腸1'細胞淋巴瘤；T淋巴母細胞性；以及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。
[0206]也可以根據本發明治療其它增生性疾病，包括例如增生、纖維化(尤其是肺部、但是包括其它類型的纖維化，例如腎纖維化)、血管生成、牛皮癬、動脈粥樣硬化和血管內平滑肌增生，例如狹窄或血管成形術后再狹窄。本發明的交叉反應抑制性KIR抗體可以用于治療或預防感染性疾病，優選地包括任何由病毒、細菌、原生動物、霉菌或真菌引起的感染。這類病毒性感染性生物包括(但是不限于)甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流行性感冒病毒、水痘病毒、腺病毒、I型單純皰疹(HSV-1)、2型單純皰疹(HSV-2)、牛瘟病毒、鼻病毒、歐可病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒(papilloma virus)、巨細胞病毒、echinovirus、蟲媒病毒(arboyirus)、huntavirus、柯薩奇病毒、腿腺炎病毒、麻疫病毒、風疹病毒、小兒麻痹癥病毒(polio virus)和I型或2型人類免疫缺陷病毒(HIV-1，HIV-2)。
[0207]可以根據本發明治療的細菌感染包括(但是不限于)由下列引起的感染:葡萄球菌；鏈球菌，包括化膿性鏈球菌(S.pyogenes);腸球菌；芽孢桿菌，包括炭疽桿菌(Bacillusanthracis)和乳酸桿菌；利斯特菌；白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)；加德納菌，包括陰道加德納菌(G.vaginalis);諾卡氏菌；鏈霉菌；普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris);密螺旋體屬；彎曲桿菌；假單胞菌，包括Raeruginosa ;軍團菌；奈瑟菌，包括淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟菌(N.meningitides)；黃桿菌，包括腦膜膿毒血性黃桿菌(F.meningosepticum)和氣味黃桿菌(F.0doraturn)；布魯氏菌；博德特氏菌，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)和支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica);埃希氏菌,包括大腸桿菌(E.coli)、克雷伯菌；腸桿菌、沙雷氏菌，包括粘質沙雷氏菌(S.marcescens)和液化沙雷氏菌(S.1iquefaciens);愛德華氏菌；變形桿菌，包括奇異變形桿菌(P.mirabilis)和普通變形桿菌(P.vulgaris);鏈桿菌；立克次體，包括R.fickettsfi,衣原體,包括鶴踏熱衣原體(C.psittaci)和砂眼衣原體(C.trachomatis);分枝桿菌,包括結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、胞內分枝桿菌(M.1ntracellulare)、M.folluiturn、麻風分枝桿菌(M.1aprae)、鳥分枝桿菌(M.avium)、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、胞內分枝桿菌(M.1ntracellulare)及鼠麻瘋分枝桿菌(M.1epraemurium);以及諾卡氏菌。
[0208]根據本發明可以治療的原生動物感染包括(但是不限于)由利氏曼原蟲(Ieishmania)、kokzidioa以及錐形蟲(trypanosoma)引起的感染。在疾病控制中心(O)C)的國家傳染病中心(NCID) (http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/)網站可見感染性疾病的完整列表，所述完整列表在此引用作為參考。上述所有疾病都是使用本發明的交叉反應抑制性KIR抗體治療的候選疾病。
[0209]這類治療多種感染性疾病的方法可以單獨或與其它治療和/或已知用于治療這類疾病的治療劑組合采用本發明的抗體，所述治療試劑包括抗病毒劑、抗真菌劑、抗細菌劑、抗生素、抗寄生蟲劑和抗原生動物劑。當這些方法涉及使用額外治療劑的額外治療時，可以將這些試劑與本發明的抗體一起以單劑形式或以分離的、多劑形式施用。當以分離的劑量形式施用時，可以在施用本發明的抗體之前、同時或隨后施用額外的試劑。
[0210]本發明的其它方面和優點將在下面的實驗部分公開，所述實驗部分應視為說明性的，而非限制本申請的范圍。
[0211]實施例1
[0212]PBL的純化及多克隆或克隆NK細胞系的產生。
[0213]通過Ficoll Hypaque梯度及耗盡粘附塑料的細胞從健康供體獲得PBL。為了獲得富集的NK細胞，將PBL與抗⑶3、抗⑶4和抗HLA-DRmAb (4°C，30分鐘)孵育，隨后為山羊抗小鼠磁珠(Dynal) (4°C，30分鐘)以及使用本領域已知方法的免疫磁選擇(Pende等人，1999) ο在經過照射的飼養細胞和100U/ml白介素2 (Proleukin, Chiron Corporation)和
1.5ng/ml植物凝集素A(Gibco BRL)上培養CD3_、CD4_、DR—細胞以獲得多克隆NK細胞群。通過有限稀釋克隆NK細胞，并通過流式細胞術關于細胞表面受體表征NK細胞克隆。
[0214]使用的mAb 是 JT3A(IgG2a、抗 CD3)、EB6 和 GL183(IgGl，分別抗 KIR2DL1 和KIR2DL3)、XA-141IgM(以與 EB6 相同的特異性抗 KIR2DL1)、抗 CD4(HP2.6)、以及抗DR(D1.12、IgG2a)。可以使用可通過商業途徑獲得、具有相同特異性的mAb (BeckmanCoulter Inc., Fullerton, CA)取代由 申請人:生產的 JT3A、HP2.6 及 DRl.12。EB6 和 GL183可通過商業途徑獲得(Beckman Coulter Inc.,Fullerton,CA.XA-141不可通過商業途徑獲得，但是可以按照(Moretta等人，1993)中所述使用EB6作為對照再現裂解)。
[0215]用合適的抗體(4°C，30分鐘)繼之以PE或FI TC綴合的多克隆抗小鼠抗體(Southern Biotechnology Associates Inc)染細胞。在FACSAN儀器(Becton Dickinson,Mountain View, CA)上通過細 胞突光測定分析法分析樣品。
[0216]在該研究中使用下列克隆。CP11、CN5和CN505為KIR2DL1陽性克隆，由EB6 (IgGl抗KIR2DL1)或XA-141(與EB6抗體相比具有相同特異性的IgM抗KIR2DL1)染色。CNl2和CP502為KIR2DL3陽性克隆，由GL183抗體(IgGl抗KIR2DL3)染色。
[0217]通過標準4小時51Cr釋放測定評定NK克隆的溶細胞活性，在所述標準4小時51Cr釋放測定中，在已知其對NK細胞裂解的靈敏度的Cw3或Cw4陽性細胞系上測試效應NK細胞。以微滴定板中每孔5000個細胞使用所有靶細胞，效應細胞:靶細胞比顯示于圖中(通常每個靶細胞4個效應細胞)。使用或不使用1/2稀釋的所示單克隆抗體上清執行溶細胞測定。程序與(Moretta等人，1993)中所述基本相同。
[0218]實施例2
[0219]新mAb的產牛
[0220]按照(Moretta等人，1990)中所述，以活化的多克隆或單克隆NK細胞系免疫5周齡Balb C小鼠以產生mAb。不同細胞融合后，首先對其與EB6和GL183陽性NK細胞系和克隆交叉反應的能力選擇mAb。對其再現分別由EB6陽性或GL183陽性NK克隆造成的Cw4或Cw3陽性靶細胞裂解的能力進一步篩選陽性單克隆抗體。
[0221]如下執行細胞染色。以一組抗體(I μ g/ml或50 μ I上清，4°C，30分鐘)繼之為PE綴合的山羊F (ab’)2片段抗小鼠IgG (H+L)或PE綴合的山羊F (ab’)2片段抗人IgG (Fe Y )抗體(Beckman Coulter)染細胞。在 Epics XL.MCL 儀器(Beckman Coulter)上執行細胞熒光測定分析。
[0222]單克隆抗體之一(DF200mAb)與包括KIR2DL1、KIR2DL2/3的多個KIR家族成員反應。KIR2DL1+ 和 KIR2DL2/3+NK 細胞均被 DF200mAb 亮染(圖1)。
[0223]使用表達這些HLA I類特異性抑制性受體中一種或另一種(或甚至兩種)的NK克隆作為針對表達一種或多種HLA-C等位基因的靶細胞的效應細胞。如下執行細胞毒性測定。通過標準4小時51Cr釋放測定評定YTS-KIR2DL1或YTS-Eco細胞系的溶細胞活性。在HLA-Cw4陽性或陰性EBV細胞系和HLA_Cw4轉染的721.221細胞上測試效應細胞。以微滴定板中每孔3000個細胞使用所有靶細胞。效應細胞/靶細胞比顯示于圖中。使用或不使用所示單克隆小鼠或人類抗體的全長或F(ab’)2片段執行溶細胞測定。KIR2DL1+NK克隆如期對表達HLA-Cw4的靶細胞展示即使有也很少的溶細胞活性，KIR2DL3+NK克隆在Cw3陽性靶細胞上展示很少或者沒有活性。然而，在DF200mAb (用于掩蓋其KIR2DL受體)存在下，NK細胞變得不能識別其HLA-C配體，并對Cw3或Cw4靶細胞表現出強烈的溶細胞活性。
[0224]例如ClR 細胞系(CW4+EBV 細胞系，ATCC n。CRL1993)不被 KIR2DL1+NK 克隆(CN5/CN505)殺傷，但是使用DF200或常規抗KIR2DLlmAb可以有效逆轉該抑制。另一方面，表達KIR2DL2/3+KIR2DLr表型的NK克隆(CN12)有效殺傷ClR細胞，而且這種殺傷不受DF200mAb影響(圖2)。以KIR2DL2或KIR2DL3陽性NK克隆在Cw3陽性靶細胞上獲得類似結果。
[0225]類似地，Cw4+221EBV細胞系不被KIR2DL1+轉染的NK細胞殺傷，但是使用DF200、DF200Fab片段或常規抗KIR2DLlmAb EB6或XA141可以有效逆轉該抑制。同樣，Cw3+221EBV細胞系不被KIR2DL2+NK細胞殺傷，但是使用DF200或DF200Fab片段可以逆轉該抑制。最后，后面的CW3+221EBV細胞系不被KIR2DL3+NK細胞殺傷，但是使用DF200Fab片段或常規KIR2DL3mAb GL183或Y249可以逆轉該抑制。結果顯示于圖3中。
[0226]對F(ab’)2片段測試其再現Cw4陽性靶細胞裂解的能力。DF200和EB6抗體的F(ab’)2片段都能逆轉對KIR2DL1轉染的NK細胞裂解Cw4轉染的221細胞系和CW4+TUB0EBV細胞系的抑制。結果顯不于圖4中。
[0227]實施例4`
[0228]新的人類mAb的產生
[0229]通過以重組KIR蛋白質免疫經改造表達人類抗體庫的轉基因小鼠產生人類抗KIR單克隆抗體。不同細胞融合后，首先對其與固定的KIR2DL1和KIR2DL2蛋白質交叉反應的能力選擇mAb。幾種單克隆抗體(包括1-7F9、1-4F1、1-6F5和1-6F1)與KIR2DL1和KIR2DL2/3反應。
[0230]對其再現由表達KIR2DL1的EB6陽性NK轉染子造成的Cw4陽性靶細胞裂解的能力進一步篩選陽性單克隆抗體。使用表達HLA I類特異性抑制性抗體的NK細胞作為針對表達一種或多種HLA-C等位基因的靶細胞的效應細胞(圖5和6)。如上所述執行細胞毒性測定。效應細胞/祀細胞比顯示于圖中，以10ug/ml或30ug/ml使用抗體。
[0231]KIR2DL1+NK細胞如期對表達HLA_Cw4的靶細胞展示出即使有也很少的溶細胞活性。然而，在I 一 7F9mAb存在下，NK細胞變得不能識別其HLA-C配體，并對Cw4靶細胞展示強烈的溶細胞活性。例如，測試的兩個細胞系(HLA-Cw4轉染的721.221和CW4+EBV細胞系)不被KIR2DL1+NK細胞殺傷，但是使用mAbl-7F9或常規抗KIR2DLlmAb EB6可以有效逆轉該抑制。將抗體DF200和panKIR(也稱為NKVSF1)與1-7F9比較。另一方面，抗體1-4F1、1-6F5和1-6F1不能再現NK細胞造成的Cw4陽性靶細胞細胞裂解。
[0232]實施例5
[0233]DF200mAb/KIR2DLl 與 DF200mAb/KIR2DL3 相互作用的 Biacore 分析
[0234]重組蛋白質的生產和純化[0235]在大腸桿菌中生產KIR2DL1和KIR2DL3重組蛋白質。使用PCR分別從pCDM8克隆47.11 載體(Biassoni 等人，1993)和 RSVS (gpt) 183 克隆 6 載體(Wagtman 等人，1995)擴增編碼KIR2DL1和KIR2DL3完整細胞外結構域的cDNA，使用下列引物:
[0236]有義:5，-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3，
[0237]反義:5’-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3’
[0238]將其與編碼生物素化信號的序列按讀碼框克隆到pMLl表達載體中(Saulquin等人，2003)。
[0239]在BL21 (DE3)菌株(Invitrogen)中執行蛋白質表達。在添加氨節青霉素(100 μ g/ml)的培養基中于37°C將轉染的細菌培養至OD6tltl = 0.6，以ImM IPTG誘導表達。
[0240]在變性條件下(8M尿素)從包涵體回收蛋白質。通過在六步透析(分別為4、3、
2、1、0.5和OM尿素)中降低尿素濃度，在含有L-精氨酸(400mM，Sigma)和β-巰基乙醇(ImM)的20mM Tris, pH7.8，NaC1150mM緩沖液中于室溫進行重組蛋白質的再折疊。在0.5和OM尿素透析步驟期間加入還原型和氧化型谷胱甘肽(分別為5mM和0.5mM, Sigma)。最后，針對IOmM Tris、pH7.5、NaC1150mM緩沖液大量透析蛋白質。濃縮并然后在Superdex200大小排阻柱上(Pharmacia ;AKTA系統)純化可溶性再折疊蛋白質。
[0241]在Biacore儀 器(Biacore)上執行表面等離子共振測量。在所有Biacore實驗中，以添加0.05%表面活性劑P20的HBS緩沖液作為運行緩沖液。
[0242]蛋白質固定。
[0243]將如上所述產生的重組KIR2DL1和KIR2DL3蛋白質共價固定至傳感器芯片(Sensor Chip) CM5 (Biacore)葡聚糖層的羧基上。以 EDC/NHS (N-乙基-N’- (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，Biacore)活化傳感器芯片表面。注射偶聯緩沖液(IOmM醋酸，pH4.5)中的蛋白質。使用IOOmM乙醇氨pH8 (Biacore)執行殘余活化基團的鈍化。
[0244]親合力測量。
[0245]對于動力學測量，將多種濃度的可溶性抗體施加于固定的樣品上。以20 μ I/分鐘的連續流速執行測量。對于每個循環，注射5 μ IlOmM NaOH pHll再生傳感器芯片表面。使用 BIAlogue Kinetics Evaluation 程序(BIAevaluation3.1，Biacore)分析數據。在含有500或540個反射系數單位(RU)及分別1000或700RU的KIR2DL1和KIR2DL3的葡聚糖層上，以20 μ I/分鐘的流速注射HBS緩沖液中的可溶性分析物(多種濃度，40μ1)。數據代表六個獨立實驗。結果顯示于表1中，見下。
[0246]表1.DF200mAb 結合固定的 KIR2DL1 和 KIR2DL3 的 BIAcore 分析。
[0247]


蛋白質 |KD( 10_9M)


KIR2DL1 10.9+/-3.8

KIR2DL3 2.0+/-1.9
[0248]Kd:解離常數。
[0249]實施例6[0250]鼠和人類抗KIR抗體的Biacore競爭性結合分析[0251]按照前面說明(Gauthier等人 1999, Sauna I 及 van Regenmortell995),在固定的 KIR2DL1 (900RU)、KIR2DL3 (2000RU)和 KIR2DS1 (1000RU)上以小鼠抗 KIR2D 抗體 DF200、Pan2D、gl 183和EB6以及人抗KIR2D抗體1-4F1、1-6F1、1-6F5和1-7F9實施表位作圖分析。[0252]用15 μ g/ml的不同抗體的兩分鐘注射在HBS緩沖液中于5 μ I/分鐘的流速完成所有實驗。分兩個步驟對每對抗體進行競爭性結合分析。第一個步驟中，將第一個單克隆抗體(mAb)注射到KIR2D靶蛋白質上，隨后為第二個mAb (不去除第一個mAb)，并監測第二個mAb的RU值(RU2)。在第二步中，首先將第二個mAb直接注射到裸露的KIR2D蛋白質上，并監測mAb的RU值(RUl)。通過100* (1-RU2/RU1)計算由第一個mAb造成的第二個mAb對KIR2D蛋白質結合的抑制百分數。[0253]結果顯示于表2、3和4中，其中指定為“第一個抗體”的抗體列于垂直欄內，“第二個抗體”列于水平欄內。對于測試的每個抗體組合，抗體對芯片直接結合水平的值(RU)列于表中，其中第二個抗體對KIR2D芯片的直接結合列于格的上部，第一個抗體存在時第二個抗體對KIR2D芯片結合的值列于格的下部。列于各格右側的是第二個抗體結合的抑制百分比。表2顯示KIR2DL1芯片上的結合，表3顯示抗體對KIR2DL3芯片的結合，表4顯示抗體對KIR2DS1芯片的結合。[0254]評定鼠抗體DF200、NKVSFl和EB6、以及人抗體1_4F1、1_7F9和1-6F1對固定的KIR2DLUKIR2DL2/3和KIR2DS1的競爭性結合。來自抗KIR抗體結合KIR2DL1實驗的表位作圖(圖7)顯示(a)抗體1-7F9與EB6和1-4F1競爭，但是不與NKVSFl和DF200競爭；(b)抗體 1-4F1 依次與 EB6、DF200、NKVSF1 和 1-7F9 競爭；(c) NKVSFl 與 DF200、1_4F1 和 EB6 競爭，但是不與1-7F9競爭；以及(d)DF200與NKVSF1、1-4F1和EB6競爭，但是不與1-7F9競爭。來自抗KIR抗體結合KIR2DL3實驗的表位作圖(圖8)顯示(a) 1-4F1與NKVSF1、DF200、gll83 和 1-7F9 競爭；(b) 1-7F9 與 DF200、gll83 和 1-4F1 競爭，但是不與 NKVSFl 競爭；(c)NKVSFl 與 DF200U-4F1 和 GL183 競爭，但是不與 1-7F9 競爭；以及(d)DF200 與 NKVSFl、1-4F1和1-7F9競爭，但是不與GL183競爭。來自抗KIR抗體結合KIR2DS1實驗的表位作圖(圖9)顯示(a) 1-4F1與NKVSFl、DF200和1-7F9競爭；(b) 1-7F9與1-4F1競爭但是不與DF200和NKVSFl競爭；(c) NKVSFl與DF200和1-4F1競爭，但是不與1-7F9競爭；以及(d)DF200與NKVSFl和1-4F1競爭，但是不與1-7F9競爭。[0255]實施例7[0256]以獼猴NK細朐滴定杭KIR mAb[0257]測試抗KIR抗體NKVSFl結合獼猴NK細胞的能力。抗體與猴NK細胞的結合顯示于圖10中。[0258]猴PBMC的純化及總的多克隆NK細胞的產生。[0259]從檸檬酸鈉CPT管(Becton Die kinson)制備稱猴PBMC。使用負消耗法(negativedepletion)執行NK細胞純化(稱猴NK細胞富集試劑盒，Stem Cell Technology)。在經放射處理的人類飼養細胞、300U/ml白介素2 (Proleukin, Chiron Corporat ion)和lng/ml植物凝集素A(Invitrogen，Gibco)上培養NK細胞以獲得多克隆NK細胞群。[0260]以獼猴NK細朐滴定Pan2D mAb。[0261]將獼猴NK細胞(總NK16天)與不同量的Pan2D mAb以及繼之以PE綴合的山羊F(ab')2片段抗小IgG(H+L)抗體孵育。用同種型對照（純化的小鼠IgGl)確定陽性細胞百分率。一式兩份處理樣品。平均熒光強度=MFI
【權利要求】
1.產生抗體的方法，所述抗體與多種KIR2DL基因產物交叉反應并中和這類KIR的抑制活性，所述方法包括步驟: (a)以含有KIR2DL多肽的免疫原免疫非人類哺乳動物； (b)從所述免疫的哺乳動物制備抗體，其中所述抗體與所述KIR2DL多肽結合， (c)選擇(b)中的抗體，所述抗體與至少兩種不同的KIR2DL基因產物交叉反應，并且 (d)選擇(c)中的抗體，所述抗體增強NK細胞 (e)選擇抗體，所述抗體與靈長動物NK細胞或KIR多肽結合。
2.根據權利要求1的方法，其中步驟(e)中的靈長動物是獼猴。
3.評估抗體毒性的方法，其中將根據權利要求1或2的方法產生的抗體施用于靈長動物。
4.根據權利要求3的方法，其中靈長動物是獼猴。
5.抗體、抗體片段或抗體衍生物，所述抗體、抗體片段或抗體衍生物含有圖12中列出的DF-200的輕鏈可變區序列。
6.抗體、抗體片段或抗體衍生物，所述抗體、抗體片段或抗體衍生物含有圖12中列出的Pan2D的輕鏈可變區序列。
7.抗體、抗體片段或抗·體衍生物，所述抗體、抗體片段或抗體衍生物含有圖12中列出的DF-200的一個或多個輕鏈可變區⑶R。
8.抗體、抗體片段或抗體衍生物，所述抗體、抗體片段或抗體衍生物含有圖12中列出的Pan2D的一個或多個輕鏈可變區⑶R。
9.抗體、抗體片段或抗體衍生物，所述抗體、抗體片段或抗體衍生物含有圖13中列出的DF-200的重鏈可變區序列。
10.抗體、抗體片段或抗體衍生物，所述抗體、抗體片段或抗體衍生物含有圖13中列出的DF-200的一個或多個重鏈可變區⑶R。
【文檔編號】G01N33/569GK103588880SQ201310057089
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2004年7月1日 優先權日:2003年7月2日
【發明者】S·B·帕德克杰爾, A·莫雷塔, M·D·謝薩, P·安德烈, L·戈捷, P·A·N·R·瓦格特曼 申請人:諾沃挪第克公司, 伊納特醫藥兩合公司, 熱納亞大學