專利名稱：一種群勃龍殘留快速檢測試紙卡及其制備方法
技術領域：
本發明屬于免疫化學檢測技術領域，具體涉及ー種群勃龍殘留快速檢測試紙卡及其制備方法。
背景技術：
群勃龍(Trenbolone,TRE),俗稱追寶龍,化學名稱為去甲雄三烯醇酮(17-P -hydroxyestra-4, 9，ll-trien-3-one-17_acetate),是ー種人工合成的促蛋白同化激素。群勃龍在臨床上可用于治療嚴重的營養缺乏、骨質疏松癥及重度燒傷等疾病，由于具有合成代謝和雄激素的功效，用其喂養畜禽時可使營養成分由脂肪組織向肌肉組織轉移，從而促進肌肉生長和提高食欲。它還可以增加蛋白質合成，促進肌肉發達和紅細胞生成，增強體力和耐力，因此在運動會和動物競技比賽中被用作興奮劑，這嚴重違背了體育競賽的公平精神。群勃龍殘留的危害包括對動物本身產生的危害和由于群勃龍在動物源食品中的殘留對人體產生的危害，其副作用包括皮膚痤瘡、性功能減退以及睪丸萎縮，女性使用者則是體毛增長、胸部變小及經期不規律等。長期食用時會嚴重干擾人體的自然激素平衡，導致內分泌失調、生育能力下降，并具有潛在的致癌性和發育毒性。由于這些有害的毒副作用，TRE的使用在許多國家得到了嚴格的監管。國際食品法典委員會(CAC)、美國、日本等組織和國家對動物食品中蛋白同化類激素的殘留都有嚴格的要求。FAO / WHO食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)在文件“TRS788-JECFA34/40”中規定:TRE在動物肌肉和肝臟中的最大殘留限量(MRLs)分別為2 ng/g和10 ng/g。2004年歐盟對我國畜禽產品提出了 18個種類的獸藥殘留、抗生素檢測監控要求，其中明確指出，動物源性食品藥物殘留中，群勃龍不得檢出。我國農業部2002年4月發布的第193號公告《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清単》也明確表示，性激素類原料藥及其單方、復方制劑產品不準以抗應激、提高飼料報酬、促進動物生長為目的在所有食源動物的飼養過程中使用。因此，迫切需要建立方便、快捷、靈敏的檢測方法，來監控TRE在動物飼料和組織的殘留。TRE殘留常用的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜ー質譜法(GC-MS)和液相色譜ー質譜法(LC-MS)等。這些方法靈敏度高，定性準確，可以確定化合物的分子量、分子式，甚至官能團，適合定量檢測TRE含量。但這些方法成本高，需要專業的技術人員，昂貴的實驗儀器及長時間的前期準備工作。而免疫學檢測方法建立在抗體對抗原的分子識別上，其主要優點是抗原抗體的親合力高、檢測快速、經濟實用，能夠實現對生物液體的小體積、大通量檢測，是最靈敏的方法之一。膠體金標記免疫分析法是近年來迅速發展的ー種新型分析技術，其特點是簡便快速、成本低、無污染、無需培訓，非常適合于現場檢測。與ELISA相比，具有樣品前處理簡単，顯色時間短(3-5 min)，且所有試劑包含在一根試紙條上，無需使用儀器等優點，具有廣闊的市場前景和應用價值。因此，研制快速、靈敏、高效的群勃龍殘留快速檢測試紙卡對于保障動物性食品安全具有十分重要的意義。本項目也得到2012年度國家自然科學基金項目(U1204310)資金支持。
發明內容
本發明解決的技術問題是提供了ー種操作簡便、快速準確、靈敏度高、特異性強、成本低廉、穩定性好且可進行批量檢測的群勃龍殘留快速檢測試紙卡。本發明解決的另一個技術問題是提供了ー種群勃龍殘留快速檢測試紙卡的制備方法。本發明的技術方案是:ー種群勃龍殘留快速檢測試紙卡，其特征在于:所述的群勃龍殘留快速檢測試紙卡包括塑料盒體和封裝于塑料盒體內的試紙條，所述試紙條的底層為支撐層，該支撐層上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的塑料盒體上開有加樣孔和觀察窗，該加樣孔的位置與試紙條上的樣品墊位置相對應，觀察窗與試紙條上的硝酸纖維素膜位置相對應，所述的硝酸纖維素膜上有群勃龍ー雞卵清白蛋白偶聯物溶液印制的檢測線和羊抗鼠IgG溶液印制的質控線，所述的金標抗體結合墊上灌注有膠體金標記的抗群勃龍特異性單克隆抗體。本發明所述的支撐層為PVC板。本發明所述的吸收墊是以植物長纖維為原材料制成的純白濾紙。本發明所述的樣品墊和金標抗體結合墊是由玻璃纖維棉制作而成的。本發明所述的樣品墊和金標抗體結合墊的疊壓寬度為2 _，吸收墊與硝酸纖維素膜的疊壓寬度為2 mm。本發明所述的樣品墊、金標抗體結合墊和吸收墊上方覆蓋有膠膜保護層。本發明所述的硝酸纖維素膜兩端分界處有標記線。本發明所述的膠體金標記的抗群勃龍特異性單克隆抗體是由群勃龍ー牛血清白蛋白偶聯物免疫Balb/C小鼠制備而來的。ー種群勃龍殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于:首先將樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊按照由左到右的順序附著干支撐層上，所述的硝酸纖維素膜上有群勃龍ー雞卵清白蛋白偶聯物溶液印制的檢測線和羊抗鼠IgG溶液印制的質控線，然后用切割機制成試紙條，再將試紙條封裝于帶有加樣孔和觀察窗的塑料盒體內，這樣就制得了群勃龍殘留快速檢測試紙卡。本發明所述的樣品墊的制備方法為:將玻璃纖維棉用含有質量濃度為2%的BSA、質量濃度為1%的蔗糖、質量濃度為0.5%的硼酸鈉和質量濃度為0.1%的NaN3的PBS緩沖液處理后，干燥備用，即為樣品墊。本發明所述的金標抗體結合墊的制備方法為:將玻璃纖維棉裁成4 mm寬的細條，放入含有質量濃度為5%的BSA、質量濃度為2%的蔗糖、質量濃度為0.8%的NaCl和質量濃度為0.05%的NaN3的PBS緩沖液中20 min, 37で恒溫烘干，然后將金標抗體灌注于已處理好的玻璃纖維棉上，真空凍干4 h，即為金標抗體結合墊。本發明所述的硝酸纖維素膜的制備方法為:將硝酸纖維素膜置于X-only單向噴點儀平臺上，檢測抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平壓紫，開機后將抗原和ニ抗分別點射于硝酸纖維素膜上，形成檢測線和質控線，室溫自然干燥后，將其浸入BSA質量濃度為1%的PBS緩沖液，pH值為7.4的封閉液中30 min, 37で烘干后，加入干燥劑，4で密封保存。本發明所述的群勃龍ー雞卵清白蛋白偶聯物的制備方法為:準確稱取TRE 100 mg和琥珀酸酐180 mg，溶于10 ml無水吡啶，50で避光攪拌反應24 h，反應產物用氮吹儀濃縮，獲得淡黃色膏狀物；用質量濃度為5%的NaHCO3溶液溶解后，こ醚萃取，H2SO4酸化，離心后棄上清，殘余物用無水硫酸鈉干燥，重結晶得TRE琥珀酸酷；混合酸酐法將37.2 mg TRE琥珀酸酷溶解在2 ml N，N-ニ甲基甲酰胺(DMF)中，置4°C冰箱中預冷10 min，然后于冰浴磁力攪拌下，加入10 三こ胺，4で冰浴條件下反應I h，然后加入30 氯甲酸異丁酷，繼續冰浴攪拌反應I h;將40 mg的OVA溶于2 ml碳酸鹽緩沖溶液中(CBS，0.05 mol/L, pH 9.6)，冰浴、攪拌條件下將上述反應產物逐滴加入OVA溶液中，加完后在4で下振蕩反應6 h。反應產物充分透析，即得TRE-OVA檢測抗原溶液，將其冷凍干燥保存備用。本發明所述的吸收墊的制備方法為:將以植物長纖維為原材料制作的純白濾紙用切割機切成4 mm寬的細條，并用膠膜進行一側封閉，干燥備用，即為吸收墊。本發明的群勃龍殘留快速檢測試紙卡具有如下優點:
(1)靈敏度高、特異性強。群勃龍殘留快速檢測試紙卡以膠體金標記高親和カ的抗群勃龍特異性單克隆抗體制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子通過異性電荷間范德華力相結合，膠體金對單克隆抗體的特異性和親和カ影響很小。因此，快速檢測試紙卡靈敏度高、特異性強，其檢測限可達2 ng/ml ；
(2)操作簡單、方便快捷。使用快速檢測試紙卡時無需特殊試劑，只要將處理后的樣品溶液用滴管滴入試紙卡加樣孔內3 4滴，3飛min即可觀察結果；
(3)檢測結果形象、直觀。試紙卡以紅色印跡線“I ”或“ Il ”作為檢測線的陽性和陰性標記，即在硝酸纖維素膜上質控線(C線)顯示一條紅色“ I ”印跡時，表示被檢測樣品溶液呈陽性；若硝酸纖維素膜上質控線(C線)和檢測線(T線)同時出現兩條紅色“ Il ”印跡吋，表示樣品溶液呈陰性。結果形象直觀，簡單準確，不容易出現誤判；
(4)膠膜的使用可以延長檢測結果觀察時間，試紙卡穩定性好。本試紙卡樣品吸收墊將檢測溶液完全吸收，使之與偶聯墊上金標抗體充分反應，可以有效減少誤差率；還可以防止外界雜質干擾，影響金標抗體與檢測抗原的結合；
(5)成本低、投資少。使用本發明試紙卡，不需要另配復雜的儀器設備和昂貴的試劑，現場檢測一歩到位，成本低廉，見效快；
(6)易于大范圍推廣應用。本試紙卡操作簡單，適合不同類別的人員使用，如實驗室檢測、海關檢疫、衛生監瞀、規模養殖及個體生產等，具有廣_的市場前景和較大的經濟效益和社會效益。
圖1為本發明群勃龍殘留快速檢測試紙卡的結構示意圖；圖2為本發明群勃龍殘留快速檢測試紙卡中試紙條的側視圖；圖3為本發明群勃龍殘留快速檢測試紙卡中試紙條的俯視圖。圖面說明:1、塑料盒體、2、試紙條、3、支撐層、4、樣品墊、5、金標抗體結合墊、6、硝酸纖維素膜(NC膜)、7、吸收墊、8、加樣孔、9、觀察窗、10、質控線(C線)、11、檢測線(T線)、12、膠膜、13、標記線。
具體實施例方式結合附圖詳細描述實施例。ー種群勃龍殘留快速檢測試紙卡，包括塑料盒體I和封裝于塑料盒體I內的試紙條2，所述的試紙條2的底層為支撐層3，該支撐層3上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊4、金標抗體結合墊5、硝酸纖維素膜6和吸收墊7，所述的塑料盒體I上開有加樣孔8和觀察窗9，該加樣孔8的位置與試紙條2上的樣品墊4位置相對應，觀察窗9與試紙條2上的硝酸纖維素膜6位置相對應，所述的硝酸纖維素膜6上有群勃龍ー雞卵清白蛋白(TRE — OVA)偶聯物溶液印制的檢測線(T線)11和羊抗鼠IgG溶液印制的質控線(C線)10，兩者間距5 mm，其中群勃龍ー雞卵清白蛋白偶聯物溶液印制的檢測線(T線)11位于靠近樣品墊4的ー側，所述的金標抗體結合墊5上灌注有膠體金標記的抗群勃龍特異性單克隆抗體。本發明所述的支撐層3是由聚氯こ烯樹脂與穩定劑及輔料配合制成的PVC板。本發明所述的吸收墊7是由吸水能力極強的植物長纖維為原材料制成的純白濾紙。本發明所述的樣品墊4和金標抗體結合墊5是由玻璃纖維棉制作而成的。本發明所述的樣品墊4和金標抗體結合墊5的疊壓寬度為2 mm,吸收墊7與硝酸纖維素膜6的疊壓寬度為2 _。本發明所述的樣品墊4、金標抗體結合墊5和吸收墊7上方覆蓋有膠膜保護層12。本發明所述的硝酸纖維素膜6兩端分界處有標記線13。一、本發明群勃龍殘留快速檢測試紙卡的制備方法:
1、所述的抗群勃龍特異性單克隆抗體由群勃龍ー牛血清白蛋白(TRE — BSA)偶聯物免疫Balb/C小鼠制備而來，由以下步驟實現:
(I)半抗原衍生化:準確稱取TRE 100 mg溶于10 ml無水吡啶，然后加入180 mg的琥珀酸酐，50で避光攪拌反應24 h。反應產物用氮吹儀濃縮，獲得淡黃色膏狀物，用5% NaHCO3溶解后，こ醚萃取，H2SO4酸化。離心后棄上清，殘余物用無水硫酸鈉干燥，重結晶得TRE琥珀酸酷。(2)免疫原的合成:采用碳化ニ亞胺法(EDC)法合成TRE免疫原:37.2 mg TRE琥珀酸酯用2 ml N，N- ニ甲基甲酰胺(DMF)攪拌溶解后，加入12 mg NHS和38 mg EDC, 37で條件下避光，搖床振蕩反應24 h。離心后取上清逐滴加入到3 ml含66 mg BSA的磷酸鹽緩沖溶液中(PBS，0.01 mol/L, pH 7.4),37で條件下避光振蕩反應4 h。反應完成后先用蒸餾水透析2 d，再用PBS透析3 d。紫外掃描透析液無小分子吸收峰時分裝于安瓿瓶中，-2 0で保存。(3)小鼠免疫:用TRE-BSA免疫8 10周齡雌性Balb/C小鼠5只，劑量為60 U g/只，體積為0.2 ml。首免用PBS稀釋的免疫原與等體積FCA完全乳化，以后每隔3 w加強免疫一次，換用FIA乳化。免疫5次后斷尾采血分離血清，用間接ELISA和間接競爭ELISA(ciELISA)篩選效價高,抑制效果好的小鼠作為融合備用鼠。融合前3 d超免小鼠,尾靜脈和腹腔各注射60 //g免疫原。(4)細胞融合:融合前4 5 d用含有8-氮鳥嘌呤的完全培養基(含15%FBS的RPM1-1640)傳代培養NSO細胞；前I d用HAT培養滋養細胞；融合時眶下竇采血，脫頸致死小鼠。無菌取脾臟制備脾細胞，在PEG-1500作用下與NSO細胞融合(細胞數量比約為10:1)，將融合后的細胞懸液加入到已鋪有滋養細胞的96孔細胞板中，HAT培養。(5)單克隆細胞株的篩選:融合后1(T14 d用間接ELISA和ciELISA篩選強陽性、抑制率高、生長狀態好的雜交瘤細胞株，用有限稀釋法進行3次亞克隆。然后用蛋白同化激素標準品溶液篩選靈敏度高、特異性強的單克隆源細胞株，共取得6株。其中，T3D6細胞株靈敏度最高，特異性最強，其抗體特異性結果見表一。
表一 T3D6細胞株抗體特異性
權利要求
1.ー種群勃龍殘留快速檢測試紙卡，其特征在于:所述的群勃龍殘留快速檢測試紙卡包括塑料盒體和封裝于塑料盒體內的試紙條，所述試紙條的底層為支撐層，該支撐層上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的塑料盒體上開有加樣孔和觀察窗，該加樣孔的位置與試紙條上的樣品墊位置相對應，觀察窗與試紙條上的硝酸纖維素膜位置相對應，所述的硝酸纖維素膜上有群勃龍ー雞卵清白蛋白偶聯物溶液印制的檢測線和羊抗鼠IgG溶液印制的質控線，所述的金標抗體結合墊上灌注有膠體金標記的抗群勃龍 特異性單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的群勃龍殘留快速檢測試紙卡，其特征在于:所述的支撐層是PVC 板。
3.根據權利要求1所述的群勃龍殘留快速檢測試紙卡，其特征在于:所述的膠體金標記的抗群勃龍特異性單克隆抗體是由群勃龍ー牛血清白蛋白偶聯物免疫Balb/C小鼠制備而來的。
4.一種權利要求1所述的群勃龍殘留快速檢測試紙卡，其特征在于:首先將樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊按照由左到右的順序附著干支撐層上，所述的硝酸纖維素膜上有群勃龍ー雞卵清白蛋白偶聯物溶液印制的檢測線和羊抗鼠IgG溶液印制的質控線，然后用切割機制成試紙條，再將試紙條封裝于帶有加樣孔和觀察窗的塑料盒體內，即制得群勃龍殘留快速檢測試紙卡。
5.根據權利要求4所述的群勃龍殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于所述的樣品墊的制備方法為:將玻璃纖維棉用含有質量濃度為2%的BSA、質量濃度為1%的蔗糖、質量濃度為0.5%的硼酸鈉和質量濃度為0.1%的NaN3的磷酸鹽緩沖溶液處理后，干燥備用，即為樣品墊。
6.根據權利要求4所述的群勃龍殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于所述的金標抗體結合墊的制備方法為:將玻璃纖維棉裁成4 mm寬的細條，放入含有質量濃度為5%的BSA、質量濃度為2%的蔗糖、質量濃度為0.8%的NaCl和質量濃度為0.05%的NaN3的磷酸鹽緩沖溶液中20 min，37で恒溫烘干，然后將金標抗體灌注于已處理好的玻璃纖維棉上，真空凍干4 h，即為金標抗體結合墊。
7.根據權利要求4所述的群勃龍殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于所述的硝酸纖維素膜的制備方法為:將硝酸纖維素膜置于X-only單向噴點儀平臺上，檢測抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平壓紫，開機后將抗原和ニ抗分別點射于硝酸纖維素膜上，形成檢測線和質控線，室溫自然干燥后，將其浸入BSA質量濃度為1%的磷酸鹽緩沖溶液，pH值為7.4的封閉液中30 min，37で烘干后，加入干燥劑，4で密封保存。
8.根據權利要求4所述的群勃龍殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于所述的群勃龍ー雞卵清白蛋白偶聯物的制備方法為:稱取群勃龍100 mg和琥珀酸酐180 mg，溶于10 ml無水吡啶，50で避光攪拌反應24 h，反應產物用氮吹儀濃縮，獲得淡黃色膏狀物；用質量濃度為5%的NaHCO3溶液溶解后，こ醚萃取，H2SO4酸化，離心后棄上清，殘余物用無水硫酸鈉干燥，重結晶得群勃龍琥珀酸酷；混合酸酐法將37.2 mg群勃龍琥珀酸酷溶解在2ml N，N-ニ甲基甲酰胺中，置4°C冰箱中預冷10 min，然后于冰浴磁力攪拌下，加入10 U I三乙胺，4で冰浴條件下反應I h，再加入30 氯甲酸異丁酯，繼續冰浴攪拌反應I h;將·40 mg的雞卵清白蛋白溶于2 ml、摩爾濃度為0.05 mol/L、pH=9.6的碳酸鹽緩沖溶液中，冰浴、攪拌條件下將上述反應產物逐滴加入雞卵清白蛋白溶液中，加完后在4で下振蕩反應6h，反應產物充分透析，即得群勃龍ー雞卵清白蛋白檢測抗原溶液，將其冷凍干燥保存備用。
9.根據權利要求4所述的群勃龍殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于所述的吸收墊的制備方法為:將以植物長纖維為原材料制作的純白濾紙用切割機切成4 _寬的細條，并用膠膜進行一側 封閉，干燥備用，即為吸收墊。
全文摘要
本發明公開了一種群勃龍殘留快速檢測試紙卡及其制備方法。本發明的技術方案要點為一種群勃龍殘留快速檢測試紙卡，包括塑料盒體和封裝于塑料盒體內的試紙條，所述試紙條的底層為支撐層，該支撐層上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的硝酸纖維素膜上有群勃龍－雞卵清白蛋白偶聯物溶液印制的檢測線和羊抗鼠IgG溶液印制的質控線，所述的金標抗體結合墊上灌注有膠體金標記的抗群勃龍特異性單克隆抗體。本發明還公開了該群勃龍殘留快速檢測試紙卡的制備方法。本發明操作簡單、快速準確、靈敏度高、特異性強、成本低、穩定性好，可進行批量檢測。
文檔編號G01N33/74GK103116031SQ20131005453
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月20日 優先權日2013年2月20日
發明者姜金慶, 王自良, 張慧輝, 常新耀, 劉俊偉, 王淑云, 齊永華, 趙坤, 胡建和, 劉興友 申請人:河南科技學院