一種在白術生長期檢測抗性標志物的方法
【專利摘要】本發明公開了一種在白術生長期檢測其抗性標志物的方法。該方法是在白術土傳病高發期，采集自然狀態下感病植株與抗病植株；同時，采用傷根法接種白絹菌菌絲，待感染發病后分別采健康和發病植株，采用HPLC法測定樣品植株中主要代謝物白術內酯類水平，進行組間差異比較，確定顯著性差異組分，篩選與白術抗性有關的標志性代謝物，并以羅氏白絹小菌核菌(Sclerotium?rolfsii?Sacc.)為受試菌，進行該組分的毒力測試，證明白術內酯II的抑菌功效，以此獲得抗性標志物，用于白術抗性評價、抗性品種選育等方面。
【專利說明】一種在白術生長期檢測抗性標志物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種在白術生長期檢測抗性標志物的方法，具體涉及一種白術次生代謝物白術內酯II做為與白術土傳病害抗病性有關的標志物檢測方法。
【背景技術】
[0002]白術(Atractylodis macrocephala Koidz.)為我國大宗中藥材之一，全國先后約有20個省(市區)引種栽培，目前種植面積約1.3萬公頃。然而，在土壤條件、栽培條件及氣候條件適宜條件下，白術的土傳病害發病的損失率嚴重時可達50%，甚至引起絕收。白術土傳病害是白術種植生產的限制性因子，其主要有由羅氏白絹小菌核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)等致病菌引起。針對這種情況,研究白術抗病機理,尋找強抗逆性品種、篩選防病藥劑，抵御白術病害的研究越來越受到重視。
[0003]盡管，國內有學者在白術的種質資源調查分析的基礎上利用分子標記方法對國內不同產地白術藥材的種質資源進行遺傳變異分析，闡明了栽培白術保持較高的遺傳多樣性是保持藥材優良品質和品種選育的基礎，白術的良種選育有良好的種源條件。然而白術與其它藥用植物一樣缺乏大量序列數據信息，使得基因表達的系統分析、微陣列等轉錄輪廓分析方法及cDNA-ALFP技術難以應用于其各種生物學功能相關基因的表達分析研究，這些生物學功能包括白術的遺傳、生育、抗病等方面，嚴重阻礙了白術大規模的基因發掘。在白術等藥用植物抗病研究中更是如此。
[0004]植物代謝物具有抗病基因的放大表達作用，是細胞或組織的生物化學表現型，代謝物分析所提供的信息比轉錄組和蛋白質組分析所提供的的信息更有用，更能夠揭示基因和表現型之間的關系，找到植物抗病的分子標志物，在植物的抗病育種、抗病機理研究中必然起到重大的作用。本發明提供一種方法，采用代謝物分析法明確了與白術土傳病害抗性有關的特征標志代謝物，該標志物可用于白術抗性評價、抗性品種選育等方面。
【發明內容】
[0005]本發明公開了一種在白術生長期檢測其抗性標志物的方法。該方法是在白術土傳病高發期，采集自然狀態下感病植株與抗病植株；同時，采用傷根法接種白絹菌菌絲，待感染發病后分別采健康和發病植株，采用HPLC法測定樣品植株中主要代謝物白術內酯類水平，進行組間差異比較，確定顯著性差異組分，篩選與白術抗性有關的標志性代謝物，并以羅氏白絹小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)為受試菌,進行該組分的毒力測試,證明白術內酯II的抑菌功效，以此獲得抗性標志物，用于白術抗性評價、抗性品種選育等方面。
[0006]本發明的目的是通過以下步驟實現的:
[0007]A種植白術，按常規進行田間管理，于5-7月白術土傳病害高峰期采集自然狀態下感病植株(Al)與抗病植株(A2)各30株以上，去除泥土，低溫干燥，作為測試樣品，備用；
[0008]B采用傷根法接種羅氏白絹小菌核菌，1-3周后分別采健康(BI)和發病植株(B2)各30株以上，去除泥土，低溫干燥，作為測試樣品，備用；[0009]C采用HPLC法測定A步驟和B步驟的樣品中白術內酯類的含量值，并采用單因素T檢驗分析Al與A2、BI與B2組間水平的差異，確定在白術抗病植株與健康植株中明顯高表達的代謝物為白術內酯II，并進一步采用對照品追加法鑒定此代謝物為白術內酯II ;
[0010]D采用體外抑菌實驗驗證候選標志物對白術致病菌的抑制活性，以羅氏白絹小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)為受試菌種,分別測試對該致病菌的毒力，與白術內酯
1、白術內酯III比較，明確白術內酯II有明顯的抑制作用，實驗證實代謝物白術內酯II為與白術抗病性有關的標志物。
[0011]上述檢測在白術中與抗性相關的標志物的方法，采集白術感病植株和健康植株樣品優選為6月份白術土傳病害高發期。
[0012]通過以上方法獲得白術抗性標志物，與農業領域里常用的轉錄組學和蛋白組學尋找分子標記物的方法比較，因為基因和蛋白表達的微小變化會在代謝物上得到放大，使得檢測更容易，費用低，研究中采用的技術更通用，篩選出的抗性標志代謝物對白術抗病機理及育種有關的研究領域將會具有很大的利用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1白術樣品以及白術內酯I㈧、白術內酯II⑶和白術內酯III(C)的HPLC色譜圖(1-白術內酯1、2-白術內酯I1、3-白術內酯II1、C-白術樣品220nm檢測、D-白術樣品276nm檢測)
[0014]圖2白術內酯II的抑菌作用(第5天抑制率77% )
[0015]具體實施方法
[0016]下面結合實施例來具體說明本方法
實施例
[0017]本實施例中的具體步驟是:
[0018]A田間自然樣本采集試驗分別在浙江昌化和浙江天目山藥材種植基地進行。2010年3月中旬種植白術，2011年6月中旬白絹病發病高峰期，采集自然條件下的感病(A1)和抗病植株(A2)各30株去除泥土，低溫干燥，作為測試樣品，備用。
[0019]B田間接種試驗
[0020]分別在昌化和天目山藥材種植基地進行。2010年3月中旬種植白術，2011年6月中旬白絹病發病高峰期采用傷根法接種白絹菌菌絲，待感染發病后分別采健康(B1)和發病植株(B2)各30株，去除泥土，低溫干燥，作為測試樣品，備用。
[0021]C白術內酯類成分測定
[0022]色譜條件色譜柱:SunFire C18(250mmX4.6mm, 5 μ m);流動相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫程序為 O ?16min，60 % ?76 % A ; 16 ?18min，76 % ?100 % A ; 18 ?30min，100 %A。體積流量lmL/min，柱溫25。。，白術內酯1、III檢測波長為220nm、白術內酯II檢測波長為276nm，進樣量20yL。色譜圖見圖1。
[0023]對照品溶液的制備精密稱取白術內酯1、I1、III對照品適量，用甲醇配制成含有白術內酯1、I1、In分別為0.266,0.100,0.341mg/mL的混合對照品溶液。
[0024]供試品溶液的制備精密稱取白術樣品粉末0.5g，加入8mL甲醇，超聲30min，靜置后用甲醇定容至IOmL,搖勻,得50mg/mL的供試品溶液。
[0025]樣品測定并采用對照品追加法鑒定白術內酯II。
[0026]結果與分析:采用單因素T檢驗分析Al與A2、B1與B2組間水平的差異，由表1可知，白術生長期其抗病植株中白術內酯II表達水平顯著高于感病植株，而白術中內酯I和白術內酯III的表達水平在抗病植株與感病植株組間無顯著差異。可以認為抗病植株中白術內酯II的高水平是白術抗病基因表達的放大表觀，是白術抗土傳病害的關鍵代謝物。由表2可知，白術接種白絹菌后，健康植株白術內酯II，III的表達呈現顯著升高的趨勢，其中白術內酯II水平在健康植株與發病植株中的表達呈現顯著差異，而白術內酯I基本無變化。
[0027]表2.白術感病樣品(Al)和抗病樣品(A2)內酯的含量
[0028]
【權利要求】
1.一種在白術生長期檢測抗性標志物的方法，其特征在于: A種植白術，按常規進行田間管理，于5-7月白術土傳病害高峰期采集自然狀態下感病植株(Al)與抗病植株(A2)各30株以上，去除泥土，低溫干燥，作為測試樣品，備用； B采用傷根法接種羅氏白絹小菌核菌，1-3周后分別采健康(BI)和發病植株(B2)各30株以上，去除泥土，低溫干燥，作為測試樣品，備用； C采用HPLC法測定A步驟和B步驟的樣品中白術內酯類的含量值，并采用單因素T檢驗分析Al與A2、BI與B2組間水平的差異，確定在白術抗病植株與健康植株中明顯高表達的代謝物為白術內酯II，并進一步采用對照品追加法鑒定此代謝物為白術內酯II ; D采用體外抑菌實驗驗證候選標志物對白術致病菌的抑制活性，以羅氏白絹小菌核菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)為受試菌種,分別測試對該致病菌的毒力，與白術內酯1、白術內酯III比較，明確白術內酯II有明顯的抑制作用，實驗證實代謝物白術內酯II為與白術抗病性有關的標志物。
2.根據權利要求1所述的檢測在白術中與抗性相關的標志物的方法，其特征在于:白術內酯II在具有抗病能力的白術中明顯高表達，并與白術抗土傳病害相關。
3.根據權利要求1所述的檢測在白術中與抗性相關的標志物的方法，其特征在于:采集白術感病植株和健康植株樣品優選為6月份白術土傳病害高發期。
【文檔編號】G01N30/02GK103940919SQ201310054049
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月19日 優先權日:2013年1月19日
【發明者】田薇, 王春榮, 李倩, 蔣鵬 申請人:浙江農林大學