專利名稱：一種檢測甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法
技術領域：
本發明屬于電化學免疫傳感器技術領域，具體涉及一種檢測甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法，尤其是基于ZnSe量子點及PEDOT導電化合物薄膜修飾電極用于甲胎蛋白免疫生物傳感器的構建。
背景技術：
甲胎蛋白(a -fet0pix)tein，AFP)是胚胎發育早期的一種主要血清蛋白，在健康的成人體內，其值通常低于25 ng/ml，血清中甲胎蛋白的升高對原發性肝癌診斷具有重要的意義。目前甲胎蛋白的檢測方法主要有酶聯免疫分析法、放射免疫測定法、間接血酶法和瓊脂雙擴散法等。雖然這些方法靈敏、可靠，但存在酶不穩定，放射物質設備要求高，危害較大等缺點。
發明內容
本發明目的在于提供一種檢測AFP的電化學免疫傳感器的制備方法，該方法基于PEDOT及ZnSe量子點作為生物蛋白分子的固定載體，具有較寬的線性范圍及較高的靈敏度。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種檢測AFP的電化學免疫傳感器的制備方法，其包括下述步驟:
1)制備水溶性ZnSe量子點；
2)制備PEDOT/Azure I /ZnSe 修飾電極;
3)構建電化學免疫傳感器。所述步驟I)具體可參照文獻[Enustun.B.V, Turkevich.J.J.Am.Chem.Soc.1963，85，3317-3328]進行 ZnSe 量子點的制備，并參照[Alexey Shavel, NikolaiGaponik, Alexander Eychmller.J.Phys.Chem.B.2004, 108, 5905-5908]對 ZnSe量子點進行純化。所述步驟2)具體為:將處理清潔的直徑為3mm的鉬盤電極浸入含有0.5 mol/L3，4-乙烯二氧噻吩(EDOT)單體的1- 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體中，在45°C溫度條件下，以鉬盤電極為工作電極，鉬片電極為對電極，銀絲作參比的+1.25 V的工作電位恒電位電聚合得到藍色的PEDOT薄膜修飾電極，聚合電量為1.0 mC ;然后將PEDOT薄膜修飾電極用去離子水洗凈，晾干，取5μ I質量百分比為5%的天青I (Azure I )溶液滴涂于PEDOT薄膜修飾電極表面，晾干成膜，用去離子水反復沖洗用以去除非共價鍵合的天青I，晾干，然后浸入ZnSe量子點溶液中浸泡12h，取出后用去離子水清洗干凈，晾干備用，SP為 PEDOT/Azure I /ZnSe 修飾電極。所述步驟3)具體為:將步驟2)所得修飾電極浸入到30 μ I含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗體(ant1- AFP)的磷酸緩沖溶液中4°C孵育12h，然后用PBST溶液清洗電極用以去除與修飾電極結合不夠穩定的抗體；再將修飾電極浸入到含1.0mg/L辣根過氧化物酶(HRP)的磷酸緩沖溶液中放置4小時，取出，用PBST溶液清洗干凈，由此即得到電化學免疫傳感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀配置的磷酸緩沖溶液和濃度0.05%的Tween-20組成的混合溶液。量子點(quantum Dots,簡稱QDs)是一種半導體晶體材料的納米顆粒,直徑在10nm以內，較普通細胞的體積小數千倍。這種納米尺寸的化合物具有水溶性、生物相容性等特點，在免疫生物學和臨床檢驗學等研究中有廣闊的應用前景。眾所周知，納米材料的催化性能取決于粒子的大小。小的粒徑不僅有助于提高生物蛋白分子的固定能力，而且可以提供較多的活性比表面積，增加蛋白分子固定的個數。本申請合成了水溶性的ZnSe量子點，電鏡結果顯示其平均粒徑為4.4 nm，相對于金膠納米顆粒(16 nm)的粒徑要小的多。因此，其可以代替金膠納米顆粒作為生物蛋白分子的固定載體，從而改善生物蛋白分子的吸附能力，增加固定量。同時，在離子液體中電聚合得到的PEDOT聚合物薄膜具有疏松多孔的三維結構，便于吸附更多的量子點。因此，基于ZnSe量子點和導電聚合物PEDOT的雙納米粒子的協同作用，可以有效的增加電子傳遞。本申請采用PEDOT納米導電材料來作為生物傳感器的基體，通過共價鍵合的方法在復合材料的表面組裝導電功能材料-天青I來共同作為電子傳輸體，這樣既保證了抗原-抗體反應中電子的快速傳遞，又使得生物分子保持了有效的生物活性。更重要的是，硒化鋅量子點的組裝，使得標記的生物分子數目得到了增加，從而使得利用水溶性的硒化鋅量子點作為信號擴增的甲胎蛋白免疫傳感器，實現了對AFP的高靈敏度測定。此外，天青I作為一種生物染料，是一種比較活潑的電子轉移媒介體，在導電基質上具有良好的電化學行為。本發明方法利用染料分子天青I作為電子媒介體，與聚(3，4_乙烯二氧噻吩)共同構建了抗體分子的固定載體，用ZnSe量子點來吸附在復合物薄膜表面，用于結合抗體分子與辣根過氧化物酶，將ZnSe量子點的化學放大作用與免疫傳感器的特異性相結合，融合兩者的優點，增強了電化學檢測AFP的靈敏度和檢測限。
圖1是實施例1制備的電化學免疫傳感器的構建示意 圖2是實施例1制備的PEDOT及PEDOT /Azure I/ ZnSe薄膜的FESEM圖；由PEDOT的電鏡圖片(a)可以看出制備的PEDOT為疏松多孔的三維結構，每層的厚度約10 nm，如此多孔的網狀結構便于吸附更多的量子點，從而使得標記的生物分子數目增加，增強了免疫傳感器的靈敏度；而由PEDOT /Azure I/ ZnSe的電鏡圖(b)可觀察到網狀結構表面覆蓋大量的小顆粒，標識著在PEDOT的表面成功地修飾了大量的ZnSe量子點；
圖3為按照實施例1制備的電化學免疫傳感器的線形曲線。
具體實施例方式以下通過具體實施例來說明本發明的技術方案，但本發明的保護范圍并不局限于此。實施例1
一種檢測AFP的電化學免疫傳感器的制備方法，其包括下述步驟: I)制備水溶性ZnSe量子點:
制備:參照文獻[Enustun.B.V, Turkevich.J.J.Am.Chem.Soc.1963, 85,3317-3328]進行，具體為:量取125ml的二次蒸餾水充氮除氧lh，然后在攪拌條件下向水中加入 0.875g(2.35 mmol) ZnClO4.6H20 與 5.7 mmol 的 3-巰基丙酸(MPA，用作穩定劑)，用 Imol/L的NaOH溶液將反應溶液的pH值調節為6.5，繼續向溶液中通氮氣除氧。攪拌下，力口Λ 0.134g(0.46mmol)Al2Se3及過量硫酸進行反應(用以產生新鮮的H2Se3),在此狀態下，產生了 ZnSe的前驅體。然后加熱回流2h，經過成核以及生長階段，得到熒光發射波長為390nm的ZnSe量子點。純化:參照文獻[AlexeyShavel, Nikolai Gaponik, Alexander Eychmller.J.Phys.Chem.B.2004, 108, 5905-5908]純化，具體為:將 ZnSe 量子點用 3000 MW 的超濾離心管于4°C離心15 min用以消除未反應完的MPA。然后用50 mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液洗滌三遍，取離心管的上部溶液再溶于PBS緩沖液中，用50 000 MW的超濾離心管進行第二次超濾離心，離心后將離心管下部的溶液在3000 MW的超濾離心管中經過離心濃縮，使得量子點的濃度達到0.1 μ mol/L,高分辨透射電鏡結果表明制得的ZnSe量子點平均粒徑為 4.4 nm。)制備PEDOT/Azure I /ZnSe 修飾電極:
將直徑3 mm的鉬盤電極依次用直徑1.0,0.3和0.05 μ m的Al2O3粉在麂皮上拋光至鏡面，每次拋光后用清水洗去表面污物，再分別用超純水、乙醇各超聲清洗3 min,氮氣吹干、待用。以BMMBF4為電解液與支持電解質，于5ml的BMMBF4中加入作為反應單體的EDOT
2.5mmol，攪拌均勻。先通氮氣保護30min用以使溶液處于氮氣氛圍下。在45°C溫度條件下采用三電極體系，以清洗干凈的直徑為3mm鉬盤電極為工作電極，鉬片為對比電極，銀絲作參比電極，攪拌狀態下，在上述電解液中于+1.25 V (vs.Ag)的工作電位恒電位電聚合，聚合電量為1.0 mC，得到表面包覆有藍色PEDOT聚合物薄膜的修飾電極(即PEDOT修飾電極)。將PEDOT修飾電極用去離子水沖洗干凈，晾干。取5 μ I質量百分比為5%的天青I水溶液滴涂于PEDOT修飾電極表面，晾干成膜，用去離子水反復沖洗，用以去除非共價鍵合的天青I，晾干，然后浸入Iml的ZnSe量子點溶液(量子點濃度0.1 μ mol/L)中浸泡12h，取出后用去尚子水清洗干凈，晾干備用，即為PEDOT/Azure I /ZnSe修飾電極。)構建電化學免疫傳感器:
將PEDOT/Azure I /ZnSe修飾電極浸入到30 μ I含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗體的磷酸緩沖溶液中4°C孵育12h以使抗體分子結合在修飾電極表面，然后用PBST溶液清洗修飾電極用以移走電極表面物理吸附的抗體；再將修飾電極浸入到30μ I含1.0mg/L HRP的磷酸緩沖溶液中放置4小時，取出，用PBST溶液清洗干凈，由此即得到電化學免疫傳感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀配置的磷酸緩沖溶液和濃度0.05%的Tween-20組成的混合溶液。一)電化學免疫傳感器檢測AFP:
將制備好的電化學免疫傳感器浸入到30 μ L含有不同濃度AFP的樣品溶液中于37°C孵育20 min，用PBST溶液清洗電極表面后，與鉬片對電極、甘汞參比電極組成三電極系統，在5ml含有2.0 mmol/L H2O2的pH 7.4磷酸緩沖液中進行循環伏安電化學檢測。整個檢測過程保持在氮氣氛圍中，掃描電位區間為-ο.6 0.3V (vs.SCE，Saturated CalomelElectrode)。根據響應電流與AFP濃度的對數之間的線性關系，繪制工作曲線。得到“響應電流一 AFP濃度”的線性曲線為1=2.52861ogC-0.2386，線性相關系數為0.9868 (結果見圖
3)。AFP在5X 10_5 ng/ml 250 ng/ml范圍內，響應電流與AFP濃度的對數保持良好的線性關系，檢測限為10_6 ng/ml。二)電化學免疫傳感器的穩定性與重現性:
將電化學免疫傳感器浸入到30 μ L含有5 ng/ml AFP的標準溶液中于37 1:免疫反應20 min，然后用PBST溶液清洗電極表面后，與鉬片對電極，甘汞參比電極，組成三電極系統，在5ml含有2.0 mmol/L H2O2的pH 7.4磷酸緩沖溶液中進行循環伏安電化學檢測。整個檢測過程保持在氮氣氛圍中，掃描電位區間為-0.6 0.3V (vs.SCE)。每隔三天對相同濃度的標準樣品進打測試，60天后，傳感器的電流響應保持在96.2%。 同時制備6個電化學免疫傳感器，浸入到同一份含有5ng/ml AFP的標準品中于37°〇免疫反應20 min,測試響應電流，其相對標準偏差(RSD)在4.7%以內。將電化學免疫 傳感器浸泡在piranha溶液(由濃硫酸與30%過氧化氫按體積比3:I混和而得)中5min即可除去電極表面的生物分子和有機物質，實現對免疫修飾電極的再生。重復上述的電極修飾過程即可得到全新的AFP傳感器。對于連續再生5次的傳感器，其相對標準偏差(RSD)為 5.6%。三)電化學免疫傳感器在檢測實際血清樣品中AFP濃度的應用:
將電化學免疫傳感器置于6份實際血清樣品中免疫反應20 min后，按上述實驗方法測量其電流值。然后通過線性方程求出樣品中的AFP濃度，并和醫院臨床診斷中所使用的化學發光酶聯免疫法得到的結果進行比較，結果見表I。由表I可看出，采用本發明方法制備的免疫傳感器所得的檢測結果和傳統臨床檢測結果基本相一致。因此，表明該免疫傳感器可滿足臨床對AFP檢測的需求。
表1:電化學免疫法與化學發光酶免疫祛的AfP檢測結果對比
權利要求
1.一種檢測甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括下述步驟: 1)制備水溶性ZnSe量子點； 2)制備PEDOT/Azure I /ZnSe 修飾電極; 3)構建電化學免疫傳感器。
2.如權利要求1所述檢測甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟2)具體為:將處理清潔的鉬盤電極浸入含有0.5 mol/L 3，4-乙烯二氧噻吩單體的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體中，在45°C溫度條件下，以鉬盤電極為工作電極，銀絲為參比的+1.25 V的工作電位恒電位電聚合得到PEDOT薄膜修飾電極，聚合電量為1.0 mC ;然后將PEDOT薄膜修飾電極用去離子水洗凈，晾干，取5 μ I濃度5%的天青I溶液滴涂于PEDOT薄膜修飾電極表面，晾干成膜，用去離子水反復沖洗用以去除非共價鍵合的天青I，晾干，然后浸入ZnSe量子點溶液中浸泡12h，取出后用去離子水清洗干凈，晾干備用，即為PEDOT/Azure I /ZnSe修飾電極。
3.如權利要求1所述檢測甲胎蛋白的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟3)具體為:將步驟2)所得修飾電極浸入到30 μ I含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗體的磷酸緩沖溶液中4°C孵育12h，然后用PBST溶液清洗電極用以去除與修飾電極結合不夠穩定的抗體；再將修飾電極浸入到含1.0mg/L辣根過氧化物酶的磷酸緩沖溶液中放置4小時，取出，用PBST溶液清洗干凈，由此即得到電化學免疫傳感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀配置的磷酸緩沖溶液和濃度0.05%的Tween-20組成的混合溶液。
全文摘要
本發明公開了一種檢測甲胎蛋白的免疫生物傳感器的制備方法，其通過將聚(3，4-乙烯二氧噻吩)、天青Ⅰ、ZnSe量子點及甲胎蛋白抗體自組裝修飾到鉑盤電極上得到。它利用染料分子天青Ⅰ作為電子媒介體，與聚(3，4-乙烯二氧噻吩)共同構建了抗體分子的固定載體，用ZnSe量子點來吸附在復合物薄膜表面，用于結合抗體分子與辣根過氧化物酶，將ZnSe量子點的化學放大作用與免疫傳感器的特異性相結合，融合兩者的優點，增強了電化學檢測甲胎蛋白靈敏度和檢測限。
文檔編號G01N33/68GK103105497SQ20131004737
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月6日 優先權日2013年2月6日
發明者劉珂珂, 褚艷紅, 劉清, 劉沖 申請人:河南省科學院高新技術研究中心