專利名稱：一種檢測過氧化氫的電化學生物傳感器電極及其制備方法
技術領域：
本發明屬于過氧化氫檢測領域，尤其涉及一種檢測過氧化氫的傳感器及其制備方法。
背景技術：
隨著過氧化氫在電子、輕工、食品、環保、醫藥等領域的應用的不斷推廣，例如應用于消菌殺毒、紡織品漂白、工業廢水處理、化妝品、食品及奶制品生產設備與生產管線的清洗等，但與此同時，過氧化氫也可能會引發各種疾病，給人們的生命健康帶來隱患，因此，對于過氧化氫的快速檢測顯得尤為重要。有關過氧化氫的檢測技術有很多，其中，用電化學方法檢測過氧化氫的優點在于簡單、快捷、靈敏度高。近幾年來，酶生物傳感器引起許多研究人員的重視。由于大多數酶的催化活性中心深埋在酶蛋白內部，且在電極表面不能獲取合適的取向或蛋白質本身的吸附變性等原因使得酶蛋白大分子直接修飾的電極表面很難實現直接電子傳遞。因此，目前發展的重心是尋找合適的載體與酶的固定方法，既而提高酶生物傳感器的檢測性能。研究人員已經嘗試了各類修飾電極的載體和酶的固定方法。比如用表面活性劑、炭黑、聚合電解質、生物高聚合物、量子點作為載體。[參考:(a)Dong, S.J.；Che, G.L.；Xie, Y.ff.Chemical modifiedelectrodes.Beijing:Science Press,2003,456-570.(b)X.Y.He, L.Zhu, Electrochem.Commun.2006, 8, 615-620.(c) G.X.Ma, T.H.Lu, Y.Y.Xia, bioelectrochemistry.2007,71, 80.(d) H.Sun, N.F.Hu, J.Electroanal.Chem.2006, 588, 207-217.(e) Q.Lu, T.Zhou,
S.S.Hu, Biosens.Bioelectron.2007, 22, 899-904.(f) D.Shan, G.Cheng, D.Zhu, H.Xue,
S.Cosnier, S.Ding, Sensors Actuators B:Chem.2009，137，259-265.(g) Q.Lu, S.S.Hu,D.ff.Pang, Z.K.He, Chem.Commun.2005，20，2584-2585.]。金納米粒子因具有一種良好的介導能力，被廣泛用于蛋白質固定基質，以提高蛋白質或酶與電極間的電子傳遞速率。它不僅可以提供較大的比表面積，而且還可以與蛋白質或酶保持良好的生物相容性。[參見:(h) C.X.Lei, S.Q.Hu, G.L.Shen, R.Q.Yu, Talanta, 2003, 59, 981.(i) Dequarie, M.；Degrand, C.；Limoges, B.Anal.Chem.2000，72，5521-5528.(j)石文韜，邸靜，馬占芳，[J].化學進展，2012, 24, 569.(k) Yu, A.；Liang, Z.；Cho, J.；Caruso, F.Nano Lett, 2003, 3，1203，(I) Zhang, S.-X.；ffang, N.；Niu, Y.-M.Sens.Actuators B，2005，109，367]。除此之夕卜，將物理、化學性能優良的碳納米材料石墨烯、碳納米管等新型納米材料與金納米材料的復合材料，應用于酶生物傳感器中，使電流響應靈敏度有很大提高。[參考:(m)C.Y.Li，D.S, D.B.Tian, J.R Zhang, J.J.Zhu.J.Mater, Chem, 2011, 21, 7604.(n) Y.C.Gao, K.Xi,ff.N.Wang, X.D.Jia, J.J.Zhu, Anal.Methods, 2011, 3, 2387.]。螺旋碳納米纖維作為一種新型納米材料，由于特殊的螺旋結構，使其具有較大的的比表面積，并且水溶性較好，導電性優良。但螺旋碳納米纖維在電化學生物傳感器方面的應用還尚未報道。本發明將螺旋碳納米纖維和金膠復合材料應用于酶生物傳感器，此復合材料一方面具有了螺旋碳管優良的導電性能又具有了金膠的生物相容性，使得制備的傳感器檢測性能有了很大提高，對過氧化 氫檢測線性范圍為1.0O μ M 3157 μ Μ，檢測限為0.46 μ Μ。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測過氧化氫的生物電化學傳感器及其制備方法。該傳感器是將螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子復合材料作載體，極大地促進酶與電極間的電子傳遞，從而達到提高傳感器靈敏度的目的。本發明的技術方案如下:一種檢測過氧化氫的電化學生物傳感器，包括工作電極、鉬電極、飽和甘汞電極，其特征在于將自組裝的螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的復合材料及血紅蛋白或肌紅蛋白或辣根過氧化物酶，且用nafion固定的修飾玻碳電極作工作電極。所述自組裝的螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的復合材料、血紅蛋白或肌紅蛋白或過氧化物酶nafion間的質量比為1.5: 2.25: 0.7 ；所述自組裝的螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的復合材料中自組裝的螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的質量比為50: 7。所述電化學生物傳感器的制備方法采用的技術方案如下:它由下列步驟組成:步驟I螺旋碳納米纖維的制備:稱取51mg的NiO粉末放入瓷盅后，置入石英玻璃管中，然后在3751:通氫氣的環境下，反應1小時，最后在4151:乙炔氛圍中反應0.5小時，即可獲得0.364g螺旋碳納米纖維，產物冷卻到室溫即可使用。步驟2金/螺旋碳納米纖維復合材料的制備:首先將得到的螺旋碳納米纖維用聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(roDA)功能化，具體做法是將20mg螺旋碳納米纖維分散到IOmL質量百分比濃度為0.25%的的TODA (含0.5M的NaCl)水溶液中，超聲IOmin后得到均勻的黑色懸浮液，經過離心分離，用蒸餾水清洗至PH為中性。接著，取ImL由以上得到的螺旋碳納米纖維溶液，將IOmL的粒徑約10 30nm的金膠分散于其中，超聲30min,之后,依次加入ImL的金膠，每加一次金膠超聲lOmin，至加入的金膠共15mL為止，最后，去除上層清夜，得到質量百分比濃度為0.5%的金膠/螺旋碳納米纖維復合材料的溶液。步驟3配置質量百分比濃度為0.5% Nafion的溶液:將20 μ L的質量百分比濃度為5%的Nafion溶液與180 μ L無水乙醇混合，超聲混勻即可得到質量百分比濃度為0.5%的Nafion溶液。步驟4玻碳電極(直徑為3mm)首先分別用1.0,0.3,0.05 μ m的氧化鋁粉末在麂皮上打磨光滑，然后用二次蒸餾水沖洗，超聲清洗，置于ImM鐵氰化鉀溶液(含0.1M的KCl)中做循環伏安掃描，電位范圍為-0.2 0.6V，掃速設為100mV/s，得到氧化還原電位之差在60 SOmV內，說明電極表面已經處理干凈，超聲清洗，室溫晾干。步驟5取3 μ L由步驟2獲得的溶液滴到步驟4得到的玻碳電極上，在室溫下待溶劑揮發后，滴上4.5μ L質量百分比濃度為0.5%的血紅蛋白水溶液，然后在室溫下待溶劑揮發后，滴涂2 μ L質量百分比濃度為0.5%的nafion溶液固定，室溫晾干，得到的修飾電極，放在4 C冰箱中保存備用。步驟6步驟5得到的修飾電極與鉬電極及飽和甘汞電極組成三電極體系的生物電化學傳感器。
對螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的復合材料進行掃描電子顯微鏡(SEM)表征。采用循環伏安法和時間電流法兩種電化學方法對以上制備的酶生物傳感器進行測試。具體步驟為:室溫下，在電解液溶液中通入氮氣15min除掉溶液中的氧氣后，上方保持通入氮氣，將三個電極浸入lOOmM、pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，采用循環伏安法或時間電流法進行電化學測試，采用循環伏安法時的掃速為100mV/S，掃描電位范圍為-0.8V -0.2V ;采用時間電流法時的選取的工作電位為-0.5V。SEM表征:對螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子復合材料進行SEM表征。結果表明金納米粒子均勻的吸附在螺旋碳納米纖維上(見圖1)。循環伏安法測定結果:螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的復合材料及血紅蛋白修飾的玻碳電極在含200 μ M過氧化氫的磷酸鹽緩沖溶液中的循環伏安圖(見圖2)的還原峰明顯比在不含過氧化氫溶液的大，氧化峰減小，表明由于血紅蛋白的催化活性，本體系可對溶液中的過氧化氫產生靈敏的電流響應。時間電流法測定結果:圖3是在-0.5V的工作電位下，向IOOmM pH為7磷酸鹽緩沖溶液中，連續加入過氧化氫(濃度為Ι.ΟΟμΜ 3157μΜ)，得到的的時間電流曲線。從圖中可見，隨過氧化氫濃度的增加，電流響應也在不斷增大，且響應時間在10秒內，表明在電極表面實現了快速的電子轉移。圖4所示的是該傳感器對不同濃度過氧化氫的響應電流的標準曲線。在過氧化氫濃度在1.00μM 3157μM內，響應電流與過氧化氫濃度成線性關系。線性回歸方程式為:y = 0.4718+0.0193x, R2 = 0.9987，檢出限為0.46 μ M(信噪比為3)。因此，本發明可用于過氧化氫的定量檢測。本發明是選用螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子復合材料作為血紅蛋白的載體，使血紅蛋白獲取合適的取向，加快酶與電極間的電子傳遞，極大地提高了檢測過氧化氫的靈敏性，加寬了檢測范圍，可用于過氧化氫的定量檢測，方法簡單，檢測迅速。
圖1為螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子復合材料的掃描電子顯微鏡的形貌圖。圖2為金/螺旋碳納米纖維復合材料及血紅蛋白修飾電極在不含和含有200 μ MH2O2的IOOmM pH = 7的磷酸鹽緩沖溶液中的循環伏安圖。圖3為金/螺旋碳納米纖維復合材料酶生物傳感器在電位為-0.5V時，對H2O2的計時安培響應圖。圖4為IOOmM pH = 7的磷酸鹽緩沖溶液中H2O2的濃度與響應電流的線性關系。
具體實施例方式實施例一:酶生物傳感器的制備稱取51mg的NiO粉末放入瓷盅后，置入石英玻璃管中，然后在375°C通氫氣的環境下，反應I小時，最后在415°C乙炔氛圍中反應0.5小時，即可獲得0.364g螺旋碳納米纖維，產物冷卻到室溫即可使用。稱取20mg螺旋碳納米纖維分散到IOmL質量百分比濃度為0.25 %的TODA (含0.5M的NaCl)水溶液中，超聲IOmin后得到均勻的黑色懸浮液，經過離心分離，用蒸餾水清洗至pH為中性。接著，取ImL由以上得到的螺旋碳納米纖維溶液，將IOmL的粒徑約10 30nm的金膠分散于其中，超聲，之后，依次加入ImL的金膠,每加一次金膠超聲IOmin,至加入的金膠共15mL為止，最后，去除上層清夜，得到質量百分比濃度為0.5%的金/螺旋碳納米纖維復合材料的溶液。取20 μ L的質量百分比濃度為5 %的Nafion溶液加入180 μ L無水乙醇，超聲混勻即可得到質量百分比濃度為0.5%的Nafion溶液。玻碳電極首先分別用1.0,0.3,0.05 μ m的氧化鋁粉末在麂皮上打磨光滑，然后用二次蒸餾水沖洗，超聲清洗，置于ImM鐵氰化鉀溶液(含0.1M的KCl)中做循環伏安掃描，電位范圍為-0.2 0.6V，掃速設為100mV/s，得到氧化還原電位之差在60 80mV內，超聲清洗，室溫晾干。取3 μ L金/螺旋碳納米纖維復合材料溶液滴到玻碳電極上，在室溫下待溶劑揮發后，滴上4.5μ L質量百分比濃度為0.5%的的血紅蛋白水溶液，然后在室溫下待溶劑揮發后，滴涂2 μ L質量百分比濃度為0.5%的nafion溶液固定，室溫晾干后，即可得到酶生物傳感器，放在4°C冰箱中保存備用。實施例二:酶生物傳感器的制備將實施例一中的“20mg螺旋碳納米纖維分散到IOmL質量百分比濃度為0.25 %的TODA”改為“20 30mg螺旋碳納米纖維分散到5 30mL質量百分比濃度為0.25 %的TODA”，制備的其他條件同實施例一，得到的傳感器的性能類似于實施例一，可以用于過氧化氫的定量檢測。實施例三:酶生物傳感器的制備將實施例一中的“質量百分比濃度為0.25%的的TODA”改為質量百分比濃度為
0.05 0.5%的的TODA”，制備的其他條件同實施例一，得到的傳感器的性能類似于實施例一，可以用于過氧化氫的定量檢測。實施例四:酶生物傳感器的制備將實施例一中“質量百分比濃度為0.5%的金/螺旋碳納米纖維復合材料的溶液”改為“質量百分比濃度為0.5% 2.0 %的金/螺旋碳納米纖維復合材料的溶液”，制備的其他條件同實施例一，得到的傳感器的性能類似于實施例一，可以用于過氧化氫的定量檢測。實施例五:酶生物傳感器的制備將實施例一中“超聲lOmin”改為“超聲10 30min”，制備的其他條件同實施例一，得到的傳感器的性能類似于實施例一，可以用于過氧化氫的定量檢測。實施例六:酶生物傳感器的制備將實施例一中“ IOmL的粒徑約20nm的金膠”改為“ IOmL的粒徑約10 30nm的金膠”，制備的其他條件同實施例一，得到的傳感器的性能類似于實施例一，可以用于過氧化氫的定量檢測。實施例七:酶生物傳感器的制備將實施例一中“至加入的金膠共15mL為止”改為“至加入的金膠共15 20mL為止”，制備的其他條件同實施例一，得到的傳感器的性能類似于實施例一，可以用于過氧化氫的定量檢測。實施例八:酶生物傳感器的制備將實施例一中“4.5μ L質量百分比濃度為0.5%的血紅蛋白水溶液”改為“3 8μ L的質量百分比濃度為0.5% 1.0 %的血紅蛋白水溶液”，制備的其他條件同實施例一，得到的傳感器的性能類似于實施例一，可以用于過氧化氫的定量檢測。實施例九:酶生物傳感器的制備將實施例一中“血紅蛋白”改為“肌紅蛋白”或“辣根過氧化物酶”，制備的其他條件同實施例一，得到的傳感器的性能類似于實施例一，可以用于過氧化氫的定量檢測。實施例十:酶生物傳感器的制備將實施例一中“2.0 μ L質量百分比濃度為0.5%的nafion溶液固定”改為“ 1.0 3.0yL的質量百分比濃度為0.1 0.5%的naf ion溶液固定”，制備的其他條件同實施例一，得到的傳感器的性能類似于實施例一，可以用于過氧化氫的定量檢測。用以上制備的酶生物傳感器采用循環伏安法和時間電流法兩種電化學方法進行測試。具體步驟為:室溫下，除去溶液中的氧氣后，在電解液上方保持惰性氣體氛圍，將三個電極浸入100mM、pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，采用循環伏安法或時間電流法進行電化學測試，采用循環伏安法時的掃速為100mV/S，掃描電位范圍為-0.8V -0.2V ;采用時間電流法時的選取的工作電位為-0.5V。
權利要求
1.一種檢測過氧化氫的電化學生物傳感器，包括工作電極、鉬電極、飽和甘汞電極，其特征在于將自組裝的螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的復合材料及血紅蛋白或肌紅蛋白或辣根過氧化物酶，且用nafion固定的修飾玻碳電極作工作電極。
2.根據權利要求1所述的檢測過氧化氫的電化學生物傳感器，其特征在于自組裝的螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的復合材料、血紅蛋白或肌紅蛋白或過氧化物酶nafion間的質量比為1.5: 2.25: 0.7。
3.根據權利要求1或2所述的檢測過氧化氫的電化學生物傳感器，其特征在于自組裝的螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的復合材料中自組裝的螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的質量比為50: 7。
4.一種制備如權利要求1-3中任一項權利要求所述的檢測過氧化氫的電化學生物傳感器的方法，包括: 步驟I螺旋碳納米纖維的制備:稱取51mg的NiO粉末放入瓷盅后，置入石英玻璃管中，然后在375°C通氫氣的環境下，反應I小時，最后在415°C乙炔氛圍中反應0.5小時，產物冷卻到室溫即可使用； 步驟2金/螺旋碳納米纖維復合材料的制備:首先將得到的螺旋碳納米纖維用聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(TODA)功能化，具體做法是稱取20 30mg的螺旋碳納米纖維分散到5 30mL質量百分比濃度為0.05 % 0.5 %的的TODA (含0.5M的NaCl)水溶液中，超聲10 30min后得到均勻的黑色懸浮液，經過離心分離，用蒸餾水清洗至pH為中性:接著，取ImL由以上得到的螺旋碳納米纖維溶液，將IOmL的粒徑約10 30nm的金膠分散于其中，超聲，之后，依次加入ImL的金膠,每加一次金膠超聲10 30min,至加入金膠總體積為15 20mL,最后，去除上層清夜，得到質量百分比濃度為0.5% 2.0%的金/螺旋碳納米纖維復合材料的溶液； 步驟3配置質量百分比濃度為0.1 % 0.5%的Nafion溶液； 步驟4玻碳電極清洗； 步驟5取2 5 μ L由步驟2獲得的溶液滴到步驟4得到的玻碳電極上，在室溫下待溶劑揮發后，滴上3 8μ L質量百分比濃度為0.5% 1.0 %的血紅蛋白溶液，然后在室溫下待溶劑揮發后，滴涂I 3μ L質量百分比濃度為0.1% 0.5%的nafion溶液固定，室溫晾干后，得到的修飾電極，放在4°C冰箱中保存備用； 步驟6步驟5得到的修飾電極與鉬電極及飽和甘汞電極組成三電極體系的生物電化學傳感器。
全文摘要
本發明是一種檢測過氧化氫的酶生物傳感器及其制備方法，該生物傳感器采用經典的三電極體系，其中參比電極是飽和甘汞電極，對電極是鉑電極，工作電極是玻碳電極。本發明主要是基于螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的復合材料作為血紅蛋白的載體，促進血紅蛋白與電極間的電子傳遞，從而有效提高了過氧化氫檢測的靈敏度，取得了比較令人滿意的結果。
文檔編號G01N27/327GK103207224SQ20131003462
公開日2013年7月17日 申請日期2013年1月19日 優先權日2013年1月19日
發明者崔榮靜, 韓志達, 張根華, 翟牧牧 申請人:常熟理工學院