專利名稱：一種基于光場傳播的非標記三維顯微方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明屬于光學超分辨顯微領域，尤其涉及一種基于光場傳播的非標記三維顯微方法和裝置。
背景技術：
隨著科學技術的發展，人們不斷追求越來越小的尺寸結構和越來越高的分辨能力，特別是在微電子、航空航天、納米加工、生命科學和材料工程等領域，對微小尺度結構的要求日益迫。透過式干涉相位顯微技術的發展，為非標記條件下的顯微成像提供了支持。由于樣品與周圍環境的折射率不同，光在透射樣品玻片過程中光的相位會受到樣品的調制，從而攜帶樣品的折射率和厚度信息，通過與參考光干涉的方法得到樣品折射率分布圖。2007年，Wonshik Choi首次提出層析相位顯微鏡，即通過改變透射光角度，得到一系列角度相關的折射率分布圖，通過適當的算法實現三維重構，實現更高精度的三維樣品圖。2011年他們對光路進行了修改，在犧牲一定程度分辨率的情況下，實現了。他們在2008年申請了相關專利，為實現生物樣品實時測量提供了保證，促進了光學干涉相位成像進入一個嶄新的發展階段。干涉相位顯微術具有較高的高分辨率，在橫向方向的分辨率約為0.8μπι，縱向方向約為I μ m。顯微鏡的高分辨率不僅僅是由于光的衍射極限限制，樣品的不均勻性也是影響分辨率的重要因素。通過改變照明角度的方法，重構三維圖像，能夠明顯的提高干涉相位顯微鏡的分辨能力，如果采用拍頻干涉法的話分辨率可以做到橫向0.5μπι，縱向0.75 μ m,采用直接干涉的方法可以得到橫向0.6 μ m，縱向0.8 μ m的分辨率。很大程度上提高了干涉相位顯微鏡的分辨能力。通過角度掃描的方法來實現三維重構，由于要實現大范圍角度遍歷，成像速度較慢，不適合生物活動樣品的觀察。而且在已有的層析相位顯微鏡的光路中參考光路和樣品光路的不重合，這樣會引入一定的環境誤差，不利于分辨率的繼續提高，同時，目前的層析相位顯微鏡僅僅局限于一維掃描，這對分辨率的提高也存在著一定限制。因此，必須提出一種新的層析相位方法，來實現較高的成像速度和共路測量，并且要實現二維掃描的便宜性。
發明內容
本發明提供了一種基于光場傳播的非標記三維顯微方法和裝置，通過對光場傳播技術來實現相位檢測，有效提高了系統的成像速率。本發明結構簡單，可以實現共路測量，很大程度上減少環境因素的影響，可用于非標記生物樣品的高精度檢測、測量等領域。一種基于光場傳播的非標記三維顯微方法，包括以下幾個步驟:I)將激光光束聚焦后投射到待測樣品上，并利用顯微物鏡收集帶有樣品信息的激光光束;2)將帶有樣品信息的激光光束分成第一光束和第二光束,并通過第一圖像傳感器和第二圖像傳感器分別采集第一光束和第二光束的光強信息圖像；3)改變激光光束入射到待測樣品上的角度，對待測樣品進行掃描，并利用顯微物鏡收集帶有樣品信息的激光光束，然后重復步驟2)；4)通過計算機對所述的光強信息圖像進行計算分析得到相應的相位遲滯分布圖，然后采用三維重構算法得到三維圖像。所述激光光束經濾波和準直后轉換為平面波投射到待測樣品上。激光光束經濾波和準直后得到高品質的平面波，能提供整個系統的成像分辨率。所述顯微物鏡為數值孔徑為1.4的浸油式顯微物鏡。待測樣品需要滴油浸沒以提高橫向分辨率，顯微物鏡同樣采用浸沒式高數值孔徑的型號，同時搭配與顯微物鏡配套的場鏡。所述第一光束和第二光束的光路相互垂直。本發明還提供了一種基于光場傳播的非標記三維顯微裝置，包括用于產生激光光束的光源，還包括:沿所述激光光束光路依次布置掃描器、樣品臺、顯微物鏡和分光鏡；用于采集所述分光鏡出射光束的光強信息圖像的第一圖像傳感器和第二圖像傳感器；以及與所述掃描器、第一圖像傳感器和第二圖像傳感器連接的計算機。本發明所采用的掃描器為二維掃描振鏡。所述光源和掃描器之間設有沿所述激光光束光路依次布置的小孔光闌和準直透鏡。小孔光闌用于對激光光束進行濾波，準直透鏡用于對激光光束進行準直，激光光束經濾波、準直后能提高激光質量，得到高品質的平面波，能提升整個系統的分辨率。所述掃描器和樣品臺之間設有沿所述激光光束光路依次布置的掃描透鏡和會聚透鏡。為了保證光線在角度變化時光線入射到待測樣品上的位置不變，必須保證二維掃描振鏡的反射中心在掃描透鏡的前焦點處，待測樣品放置在會聚透鏡的后焦點處，且掃描透鏡的后焦面與會聚透鏡的前焦面重合。所述的第一圖像傳感器和第二圖像傳感器分別為第一 CXD和第二 (XD，通過第一CXD和第二 CXD分別采集第一光束和第二光束的光強信息圖像。本發明的樣品臺為三維移動平臺，便于待測樣品的放置，以及在觀察前調整待測樣品的位置。本發明的工作原理如下:激光器產生的激光經過小孔光闌和準直透鏡最后得到面型平整的平面波，然后經過二維掃描振鏡，掃描透鏡，會聚透鏡，然后以不同角度入射到待測樣品上，透過樣品的平面波經過顯微物鏡和場鏡放大，照射到分光鏡上，經過分光鏡分光分別用兩個位置固定的CXD垂直拍攝。在角度α入射的情況下，假設Α、Β兩個CXD得到的兩個光強信息分別是Ia= I1U,y)，Ib = I2 (X，y)，其中X，y為圖像中點的橫豎坐標。對于光場傳播就光波平面整體來看，屬于一個低頻信息，在整個光場傳播中能夠平行傳遞，但由于經過待測樣品調制后的波面會有不同的相位延時，在波面上會包涵帶有待測樣品信息的高頻信息，在光電傳遞過程中會有發散或會聚，由于A、B兩個CCD的間距為Δ z, Ib = f (ΙΑ, Δ z),通過Ia = I1 (x, y), Ib=I2(x，y)，dl = Ib-1ajV1-V0 = -kdl/dz，其中IA、IB是兩個CCD上的光強圖信息，中其▽為梯度算子，I為波面光強分布，0為波面相位分布，k為比例系數，dl和dz分別為兩個CCD所成像的強度差和距離分光鏡分光面的距離差。最后通過f函數得到圖像的波前相位信息，由于照射到待測樣品上的光是經過平整處理的平面波，所以波前相位信息可以量化反應待測樣品的折射率分布，由于照明屬于寬場照明，通過整個面上的相對比較可以得到待測樣品折射率分布圖0x,y，該折射率分布圖與入射角α相匹配，在正負60度錐角范圍入
射，每一度采樣一次時，就可以得到的若干幅與角度相匹配的干涉圖，通過拉東反變換得到對橫向或者縱向分辨率有所側重的3D圖像。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:(I)實現了共路層析相位成像，能夠更好的避免環境對成像效果的影響。(2)橫向分辨率顯著提高，橫向分辨率可以達到I μ m以下；(3)裝置結構簡潔，方便快速高精度調整，且不會產生相互干擾；(4)降低了對CCD攝像速率的要求，能夠更隨意的根據樣品選擇成像速度。
圖1為本發明基于光場傳播的非標記三維顯微裝置的結構示意圖。圖2為本發明的水平方向掃描和垂直方向掃描時隨著振鏡從-α轉動到+ α過程中會聚透鏡前焦面的光線入射點圖。圖3為本發明的螺旋掃描時隨著掃描振鏡角度變化聚透鏡前焦面上的光線入射點圖。
具體實施例方式如圖1所示，一種基于光場傳播的非標記三維顯微裝置，包括光源1，聚焦鏡2，小孔光闌3,準直透鏡4,反射鏡5, 二維掃描振鏡6,掃描透鏡7,會聚透鏡8,樣品臺9,顯微物鏡 10，場鏡 11，分光鏡 12，CCD-A13，CCD-B14，計算機 15。其中，光源I發出激光光束，本實施例中的光源為氦氖激光器，聚焦鏡2、小孔光闌
3、準直透鏡4、反射鏡5，二維掃描振鏡6，掃描透鏡7，會聚透鏡8，樣品臺9，顯微物鏡10，場鏡11，分光鏡12，依次設置在激光光束光路的光軸上。CCD-Al3、CCD-B14 分別對應第一 CCD 和第二 CCD，且 CCD_A13、CCD_B14 分別放在分光鏡分出的兩束激光的光軸上。小孔光闌3位于聚焦鏡2的后焦點處，小孔光闌3位于準直透鏡4的前焦點處，反射鏡5調節俯仰角，使激光恰好打到二維掃描振鏡6的反射中心，調整反射鏡5角度，保證激光經反射后恰好能入射到二維掃描振鏡7的反射中心。二維掃描振鏡6的反射中心位于掃描透鏡7的前焦點處，會聚透鏡8的前焦面與掃描透鏡7的后焦面重合，為了保證激光光束在角度變化時入射到樣品上的位置不變，必須保證二維掃描振鏡6的反射中心在掃描透鏡7的前焦點處，待測樣品在會聚透鏡8的后焦點處，掃描透鏡7的后焦面與會聚透鏡8的前焦面重合。同時為了實現角度的放大作用，掃描透鏡7的焦距應該適當長一點，會聚透鏡8應采用1.4數值孔徑的會聚透鏡。會聚透鏡8后焦點就是待測樣品觀察的中心，由于會聚透鏡8的工作距離非常短，待測樣品會夾在會聚透鏡8和顯微物鏡10之間進行觀察，同時需要滴油浸沒以提高橫向分辨率，顯微物鏡10同樣采用浸沒式高數值孔徑的型號，同時搭配與顯微物鏡配套的場鏡。樣品臺9距離會聚透鏡的距離為工距離，顯微物鏡10通過浸油的方式直接與樣品臺9接觸，場鏡11放置在顯微物鏡10的適當距離。(XD-A13距離分光鏡12分光面的距離固定，(XD-B14可通過滑動導軌調節，使(XD-B14與(XD-A13的距離接近，并精確可調。二維掃描振鏡6和(XD-A13和(XD-B14分別與主控計算機相連，計算機15根據圖像的獲取情況決定二維掃描振鏡6的掃描速度，并逐步完成待測樣品掃描。由于待測樣品浸沒在一種與待測樣品折射率非常接近的介質內，所以待測樣品對波前的調制，不會太劇烈。我們采用光場傳播的方式測量波前相位，通過分光鏡將光束分成兩束分別用兩個CCD對其 進行成像，兩個CCD必須正對光線入射方向，同時距離分光鏡分光點的距離盡量近同時其差值必須恒定準確。在光路搭建完成之后，通過計算機控制二維掃描振鏡在水平方向上進行掃描，根據觀察的精度和速度要求選擇掃描范圍和掃描頻率，兩個CCD同步拍攝，計算機獲取圖像后根據兩個CCD上圖像的強度變化，計算出波前信息，繼而得出相位信息。對上述得到的相位信息進行相位展開，進而得出在該角度照明情況下相對應的折射率分布圖，將一個掃描周期里所有的折射率分布圖綜合起來，通過三維重構算法得到三維圖像。如果進行連續掃描可以通過局部替換的方式，即不需要每次成像的圖都是當次掃描的圖像，可以在上一輪掃描過程中取部分圖像，與本次掃描的部分圖像共同組成重構算法需要的所有角度圖像，在計算機計算速度允許的情況下，克服振鏡掃描速率限制，實現視頻圖像顯示。采用圖1所示的裝置實現在一維掃描條件下實現基于光場傳播的非標記三維顯微方法，其工作過程如下:(I)光源I發射出光束，經過聚焦鏡2聚焦到小孔光闌3上進行濾波，調節準直透鏡4的位置，使小孔光闌3恰好在準直透鏡4的前焦點處，透過小孔光闌3的光經過準直透鏡4準直成為平面波照射到反射鏡5上，調節反射鏡5的俯仰角使激光光束照射到二維掃描振鏡6的反射中心，調整二維掃描振鏡6的位置角度，在掃描振鏡處于初始狀態時恰好能夠將入射光線在水平方向偏折90°出射。出射的激光光束正入射到掃描透鏡7上，調整掃描透鏡7與二維掃描振鏡6之間的距離，使二維掃描振鏡6的反射中心恰好在掃描透鏡7的前焦點處，且在掃描振鏡6處于初始狀態時，入射到掃描透鏡7上的光束是沿光軸垂直入射。經過掃描透鏡7的激光正入射到會聚透鏡8上，調整會聚透鏡8的位置，使會聚透鏡8的前焦面和掃描透鏡7的后焦面重合I經過會聚透鏡8的激光照射到待測樣品上。(2)待測樣品放置在三維控制的樣品臺9上，通過顯微物鏡10觀察透過待測樣品的激光光束，透過顯微物鏡10的激光透過場鏡11上，然后再經分光鏡12分成相互垂直的兩束光A、B,然后分別用(XD-A13和(XD-B14垂直接收，調整兩個CXD的位置，保證其距離分光鏡分光點的距離差恒定。(3)計算機15控制二維掃描振鏡6，水平方向調整角度到-α我們優選_60°，此時入射到會聚透鏡后焦面的位置，如圖2中最左邊的點。然后通過(XD-A13和(XD-B14采集該角度下的光強信息圖像，計算機讀入(XD-A13和(XD-B14的光強信息圖像，計算機15發出信息控制二維掃描振鏡6水平轉動Γ或者其他采樣角度。然后再進行采集圖像，不斷重復，遍歷到水平方向+α，優選+60°，此時會聚透鏡后焦面的入射點如圖2中最右邊點。得到240幅或者其他要求數量的與角度相關的圖像，通過光場傳播計算得到120幅或者其他要求數量的相位遲滯分布圖。通過三維重構算法得到水平掃描高精度三維圖像。在上述的步驟(3)中，還可以用計算機15控制二維掃描振鏡6，使垂直方向調整角度到-α我們優選-60°，此時入射到會聚透鏡后焦面的位置，如圖2中最下邊的點。用(XD-A13和(XD-B14采集該角度下的光強信息圖像，計算機讀入(XD-A13和(XD-B14的光強信息圖像，計算機15發出信息控制二維掃描振鏡6垂直轉動Γ或者其他采樣角度。然后再進行采集圖像，不斷重復，遍歷到垂直方向+ α，優選+60°，此時會聚透鏡后焦面光線入射點如圖2中最上邊的點。得到240幅或者其他要求數量的與角度相關的圖像，通過光場傳播計算得到120幅或者其他要求數量的相位遲滯分布圖。通過三維重構算法得到垂直掃描高精度三維圖像。在步驟(3)中，還可以用計算機15控制二維掃描振鏡6，調整掃描振鏡角度，進行螺旋掃描，此操作過程中會聚透鏡前焦面的光線入射點如圖3所示。具體實施方法是，首先通過計算機15調整二維掃描振鏡7使光線恰好0°入射，然后(XD-A13與(XD-B14分別拍攝圖像，計算機15讀入圖像后發出命令使二維掃描振鏡7在水平和垂直兩個方向同時轉動，使會聚透鏡8的入射光線按照預設的曲率軌跡和空間間隔入射，當整個螺旋掃描結束后會得到整個三維錐角角度遍歷的相位遲滯圖，根據需要觀察的部位和圖像分布，進行角度篩選和三維重構得到分辨 率局部側重的高分辨三維重構圖。
權利要求
1.一種基于光場傳播的非標記三維顯微方法，其特征在于，包括以下幾個步驟: 1)將激光光束聚焦后投射到待測樣品上，并利用顯微物鏡收集帶有樣品信息的激光光束； 2)將帶有樣品信息的激光光束分成第一光束和第二光束，并通過第一圖像傳感器和第二圖像傳感器分別采集第一光束和第二光束的光強信息圖像； 3)改變激光光束入射到待測樣品上的角度，對待測樣品進行掃描，并利用顯微物鏡接收帶有樣品信息的激光光束，然后重復步驟2)； 4)通過計算機對所述的光強信息圖像進行計算分析得到相應的相位遲滯分布圖，然后采用三維重構算法得到三維圖像。
2.如權利要求1所述的基于光場傳播的非標記三維顯微方法，其特征在于，所述激光光束經濾波和準直后轉換為平面波投射到待測樣品上。
3.如權利要求2所述的基于光場傳播的非標記三維顯微方法,其特征在于,所述顯微物鏡為數值孔徑為1.4的浸油式顯微物鏡。
4.如權利要求3所述的基于光場傳播的非標記三維顯微方法,其特征在于,所述第一光束和第二光束的光路相互垂直。
5.一種基于光場傳播的非標記三維顯微裝置，包括用于產生激光光束的光源，其特征在于，還包括: 沿所述激光光束光路依次布置掃描器、樣品臺、顯微物鏡和分光鏡； 用于采集所述分光鏡出射光束的光強信息圖像的第一圖像傳感器和第二圖像傳感器； 以及與所述掃描器、第一圖像傳感器和第二圖像傳感器連接的計算機。
6.如權利要求5所述的基于光場傳播的非標記三維顯微裝置,其特征在于，所述掃描器為二維掃描振鏡。
7.如權利要求6所述的基于光場傳播的非標記三維顯微裝置，其特征在于，所述光源和掃描器之間設有沿所述激光光束光路依次布置的小孔光闌和準直透鏡。
8.如權利要求7所述的基于光場傳播的非標記三維顯微裝置，其特征在于，所述掃描器和樣品臺之間設有沿所述激光光束光路依次布置的掃描透鏡和會聚透鏡。
9.如權利要求8所述的基于光場傳播的非標記三維顯微裝置，其特征在于，所述的第一圖像傳感器和第二圖像傳感器分別為第一 CXD和第二 (XD。
10.如權利要求9所述的基于光場傳播的非標記三維顯微裝置，其特征在于，所述樣品臺為三維移動平臺。
全文摘要
本發明公開了一種基于光場傳播的非標記三維顯微方法，包括以下幾個步驟1)將激光光束聚焦后投射到待測樣品上，并利用顯微物鏡收集帶有樣品信息的激光光束；2)將帶有樣品信息的激光光束分成第一光束和第二光束，并通過第一圖像傳感器和第二圖像傳感器分別采集第一光束和第二光束的光強信息圖像；3)改變激光光束入射到待測樣品上的角度，對待測樣品進行掃描，并利用顯微鏡收集帶有樣品信息的激光光束，然后重復步驟2)；4)通過計算機對所述的光強信息圖像進行計算分析得到相應的相位遲滯分布圖，然后采用三維重構算法得到三維圖像。本發明還公開了一種基于光場傳播的非標記三維顯微裝置。
文檔編號G01B11/24GK103148800SQ20131003361
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者匡翠方, 修鵬, 劉旭, 葛劍虹 申請人:浙江大學