煙草中核黃素的定量檢測方法

專利名稱：煙草中核黃素的定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及卷煙檢測分析技術領域，更具體地，涉及一種煙草中的核黃素的分析測定，尤其涉及采用液相色譜-電噴霧線性離子阱質譜分析方法分析測定煙草中的核黃素。
背景技術：
核黃素，即維生素B2,是一種水溶性化合物。核黃素具有多種生物學和生理學功能，是維持人體健康不可缺少的微量營養素，例如，缺乏核黃素會引起口腔發炎、舌炎、角膜發炎等。煙草中的核黃素早在50年代末被發現，核黃素在煙草相關領域的研究引起不少學者和研究機構的關注，它可作為體內抗氧化劑，有利于阻止煙氣中的硝酸鹽的轉化，也可作為體內感光劑進行抗體催化氧化降解尼古丁。近期劉菲等用核黃素處理煙草懸浮細胞研究發現，核黃素處理后提高了煙草懸浮細胞PAL、POD活性，積累了更多與抗病有關的次生代謝產物。因為煙草中核黃素含量較低，對于煙草樣品中本身存在的核黃素的儀器分析鑒定方法一直以來卻沒有報道，更未見煙草樣品中核黃素的定量檢測報道。液相色譜是分析核黃素的常用方法，但將液相色譜法其應用于煙草樣品時，因為煙草中核黃素含量低，且煙草樣品基質復雜，需要進行繁雜的樣品前處理，且可能存在共流出現象。近些年來，隨著液相色譜與質譜聯用技術(LC-MS)的不斷成熟與普及，LC-MS在定性定量分析中都得到了相當廣泛的應用。Leporati等用三重四極桿串聯質譜分析了多種水溶性維生素，但三重四極桿串聯質譜只能在二級質譜水平上獲取離子碎片信息，定性分析能力有限，無法實現定量檢測。隨著煙草質量和消費要求的不斷提高，滿足煙草制品的質量、產品研究需要，建立靈敏、準確、快速鑒定煙草中核黃素的方法已經成為本技術領域亟待解決的技術難題，并需要對煙草樣品中核黃素含量進行準確和快速的測定。

發明內容
本發明的目的是克服現有核黃素分析檢測技術的不足，尤其是煙草樣品中核黃素分析檢測技術的不足，提供一種煙草中核黃素的定量檢測方法，本發明采用液相色譜-電噴霧線性離子阱質譜分析檢測煙草中的核黃素的含量。本發明的目的通過以下技術方案予以實現:
提供一種煙草中核黃素的定量檢測方法，是采用液相色譜-電噴霧線性離子阱質譜法，包括以下步驟:
S1.樣品液準備；
稱取0.25 g煙末，加入25 mL 0.1 mol/L鹽酸后在95°C水浴中搖蕩I小時，冷卻后加Λ 20 mL 2 mol/L醋酸銨，用水定容至50 mL即得待測煙草樣品溶液，以待測煙草樣品溶液制備不同濃度梯度的進樣液； 配制核黃素的甲醇溶液作為儲備液，避光保存在2°C下；配制核黃素的水溶液作為工作標準溶液，核黃素的濃度為4 μ g核黃素/mL水。S2.將進樣液經0.2 μ m濾膜過濾后直接進樣，采用液相色譜-電噴霧線性離子阱質譜法進行分析檢測。SI所述儲備液，避光保存在2°C下。SI所述工作標準溶液用完立即避光保存于2°C下，可以每兩天配制一次；
S2所述直接進樣優選采用注射泵直接進樣。S2所述液相色譜的條件為:
安捷倫Eclipse XDB-C18 (150 mm X 2.1 mm, 5 μ m)色譜柱,流動相為含0.1% (體積百分比濃度)甲酸的甲醇溶液:0.05% (體積百分比濃度)醋酸=70%: 30%(體積比)；使用安捷倫Zorbax C18保護柱(12.5 mm X 2.1 mm, 5 μ m),等梯度淋洗,流速200 μ L/min,柱溫30 V，進樣環5 μ L，全環進樣。S2所述噴霧線性離子阱質譜的條件:
毛細管溫度:350°C ;噴霧電壓:5 kV ;鞘氣:31 LTQ單位；輔助氣:5 LTQ單位；最大離子注射時間300 ms ;分離寬度2 m/z ； SRM模式，其中歸一化碰撞能量:22%，激活Q:0.30。所述以待測煙草樣品溶液制備不同濃度梯度的進樣液的不同濃度梯度可以根據具體實際需要進行確定，例如進樣液濃度可設置梯度為80ng/mL、320ng/mL、960ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL。本發明的有益效果是:
煙草樣品的樣品基質與其他樣品基質顯著不同，而且煙草中的核黃素含量是極低的，現有技術中沒有關于其檢測分析的技術報道，也得不到相關的技術啟示。本發明成功地建立了采用液相色譜-線形離子阱多級質譜實現了煙草中核黃素的快速準確地定量分析檢測技術方案，這是本技術領域首次應用LC-1TMS2從多級質譜角度對煙草中的核黃素進行檢測分析，填補了本技術領域的空白。本發明針對性優化了樣品處理以及檢測條件參數，簡化了冗長復雜的樣品前處理，避免了共流出問題，具有靈敏度高、選擇性優異的有益效果，有效縮短了分析時間，大大提聞了分析檢測效率。


圖1核黃素在正電離模式下的多級質譜圖以及主要碎片的可能結構，用注射泵直接進樣，進樣濃度為25.6 μ g/mL。圖2實際煙草樣品核黃素的重建離子色譜圖。圖中的粗體數字表示用于重建色譜圖的特征子離子(MS 377 —MS2 243)。圖3實際煙草樣品核黃素的重建離子色譜圖。圖中的粗體數字表示用于重建色譜圖的特征子離子(MS 377 —MS2 243 —MS3172)。圖4實際煙草樣品核黃素的重建離子色譜圖。圖中的粗體數字表示用于重建色譜圖的特征子離子(MS 377 —MS2 243 —MS3 172 —MS4145)。圖5實際煙草樣品核黃素的重建離子色譜圖。圖中的粗體數字表示用于重建色譜圖的特征子離子(MS 377 —MS2 243 —MS3 172 — MS4 145 —MS5118)。
圖6實際煙草樣品核黃素的重建離子色譜圖。圖中的粗體數字表示用于重建色譜圖的特征子離子(MS 399 —MS2382)。圖7實際煙草樣品核黃素的重建離子色譜圖。圖中的粗體數字表示用于重建色譜圖的特征子離子(MS 399 —MS2 382 —MS3266)。圖8實際煙草樣品核黃素的重建離子色譜圖。圖中的粗體數字表示用于重建色譜圖的特征子離子(MS -375 — MS2-255)。圖9實際煙草樣品核黃素的重建離子色譜圖。圖中的粗體數字表示用于重建色譜圖的特征子離子(MS -375 —MS2 -255 — MS3-212)。圖10定量檢測核黃素時，加標后煙草樣品的核黃素MS2離子流圖，SRM掃描模式。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。除非特別說明，本發明實施例采用的試劑和儀器設備參照本技術領域常規。實施例1煙草樣品中核黃素的分析鑒定
(一)儀器、材料與試劑
液質聯用儀由美國Thermo公司的Finnigan Surveyor液相色譜系統以及FinninganLTQ線性離子阱質譜構成，其中液相系統包括自動進樣器、四元質譜泵，質譜帶電噴霧離子化探針，由裝有Xcalibur 1.4版的戴爾計算機進行儀器控制、數據采集和處理；意大利Claind LC-MS氮氣發生器；美國Mi ll1-Q超純水儀；德國Memmert水浴振蕩器；電子天平Sartorius BS 423S (感量 0.0Olg) ;Whatman 0.2 μ m 尼龍濾膜針式濾器。核黃素(純度≥98.0%)購自Fluka公司，色譜純甲醇和甲酸分別購自Merck公司和Teadia公司，Mill1-Q級水，其他試劑均為分析純。(二)實驗方法
S1.待測樣品準備稱取0.25 g煙末，用25 mL 0.1 mol/L鹽酸在95°C水浴中搖蕩I小時，冷卻后加入20 mL 2 mol/L醋酸銨，用水定容至50 mL。S2.工作標準溶液制備核黃素儲備液用甲醇配制并避光保存在2°C下。用水配制4 μ g/mL的核黃素工作標準溶液，用完立即避光保存于2°C下，每兩天配制一次。用標準加入法測定樣品中的核黃素，用SI處理好的待測樣品溶液制備5個濃度梯度，經0.2 μ m濾膜過濾后直接進樣。本實施例米用的濃度梯度為:80ng/mL、320ng/mL、960ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL。分析鑒定
液相色譜條件:
安捷倫 Eclipse XDB-C18 column (50 mm X 2.I mm, 1.8 μ m)色譜柱,流動相為甲醇:0.1% (體積百分比濃度)甲酸=40%: 60% (體積比);使用安捷倫Zorbax C18保護柱(12.5 mm X 2.1 mm, 5 μ m),等梯度淋洗,流速200 μ L/min,柱溫30°C,進樣環5 μ L,全環進樣。質譜條件:
毛細管溫度:350°C ;噴霧電壓:5 kV ;鞘氣:31 LTQ單位；輔助氣:5 LTQ單位；最大離子注射時間300 ms ;分離寬度2 m/z ;全掃描模式定性； 質譜的大氣壓電離方式主要有電噴霧離子化(ESI)和大氣壓化學離子化(APCI)。ESI適于分析極性較強的分子，APCI適于分析弱極性分子。本發明結合核黃素的極性特征分析，比較了大量實驗結果，確定采用ESI方式進行分析，獲得準確的分析結果。為了進一步準確鑒定煙草中的核黃素，用多級質譜在正負電離模式下用注射泵直接進樣獲取其質譜圖，同時，為了便于比較離子碎片的豐度，所有質譜均使用同一濃度(25.6μ g/mL)的標準溶液進行采集。附圖1給出了核黃素的正電離模式多級質譜圖以及主要碎片的可能結構。正電離模式下的一級質譜MS的離子m/z 377，399 and 415分別對應于[M+H]+，[M+Na]+和[M+K]+。核黃素的1，2，3，4-正戊醇基團具有多羥基，加鈉峰的形成應與這些羥基有關。核黃素在負電離模式的一級質譜產生較強的掉氫峰m/z -375,m/z -375在施加適當的碰撞能量后極易丟失1，2，3，4-正丁醇基團，產生離子m/z -255, m/z -255在丟失一個1，2，3，4-正戊醇基團殘余的亞甲基后，在三級質譜(MS3)上產生碎片m/z -240。用LC-1TMSn在全掃描模式下獲取烤煙樣品核黃素的色譜圖。選用較短的1.8 μ m高效液相色譜柱以縮短分析時間。用正負電離模式下多級質譜的特征子離子重建的離子色譜圖(請見附圖2 附圖9，圖中的粗體數字表示用于重建色譜圖的特征子離子，附圖中縱坐標為絕對強度(intensity))，保留時間均為1.1 min，與標樣保留時間完全一致。對照相應的各級標樣質譜圖，均吻合。分析其他烤煙煙葉樣品，結果均相同。經過液相色譜保留時間和多級質譜碎片結構分析，表明核黃素是煙草本身具有的一種化學成分。實施例2煙草樣品中核黃素的定量分析 (一)儀器、材料與試劑同實施例1
(二)實驗方法
S1.待測樣品準備稱取0.25 g煙末，用25 mL 0.1 mol/L鹽酸在95°C水浴中搖蕩I小時，冷卻后加入20 mL 2 mol/L醋酸銨，用水定容至50 mL。S2.工作標準溶液制備儲備液用甲醇配制并避光保存在2°C下。用水配制4μ g/mL的工作標準溶液，用完立即避光保存于2°C下，每兩天配制一次。用標準加入法測定樣品中的核黃素，用SI處理好的待測樣品溶液制備5個濃度梯度，經0.2 μ m濾膜過濾后直接進樣。本實施例米用的濃度梯度為:80ng/mL、320ng/mL、960ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL。檢測分析:
液相色譜條件:
安捷倫Eclipse XDB-C18 (150 mm X 2.1 mm, 5 μ m)色譜柱；流動相:含0.1%甲酸的甲醇溶液:0.05%醋酸=70%: 30% (體積比)，所述甲酸和醋酸的濃度皆為體積百分比濃度；安捷倫Zorbax C18保護柱(12.5 mm X 2.1 mm, 5 μ m),等梯度淋洗,流速200 μ L/min,柱溫30°C,進樣環5 μ L,全環進樣。質譜條件:
毛細管溫度:350°C ;噴霧電壓:5 kV ;鞘氣:31 LTQ單位；輔助氣:5 LTQ單位；最大離子注射時間300 ms;分離寬度2 m/z ； SRM模式定量，其中歸一化碰撞能量:22%，激活Q:
0.30。用二級質譜(LC-1TMS2)進行定量分析。核黃素在煙草中的含量低，而煙草樣品的基質相當復雜，本發明經過創造性地分析總結，為了保證測定結果的準確，使用具有相同或類似基質環境的空白樣品。但目前常規是沒有辦法找到不含核黃素的空白樣品的，因此本實施例選用標準加入法，把樣品基質的影響進行綜合考慮，以外推工作標準曲線與X軸的截距計算待測物的濃度。實驗結果表明，工作標準曲線使用等權重，線性良好，線性范圍為
8 10000 ng/mL，相關系數R2均大于0.99。色譜保留時間為4.67 min，請見附圖10所示，檢測限為0.5ng/mL (S/N = 3)，精密度小于3%。本發明測定了大量隨機抽取的實際煙草樣品的核黃素含量，測定要求R2 > 0.99，否則重新測定。實驗結果不能在此一一贅述，表I為隨機抽取的部分樣品的核黃素含量(計算公式參照:儀器測得濃度(ng/mL) X 50 mL /1000 X煙末重量(g))。表I LC-1TMS2測定實際煙草樣品中的核黃素含量
權利要求
1.一種煙草中核黃素的定量檢測方法，其特征在于，是采用液相色譜-電噴霧線性離子阱多級質譜法，包括以下步驟:品液準備； 稱取0.25 g煙末，加入25 mL 0.1 mo I/L鹽酸后在95°C水浴中搖蕩I小時，冷卻后加Λ 20 mL 2 mol/L醋酸銨，用水定容至50 mL即得待測煙草樣品溶液，以待測煙草樣品溶液制備不同濃度梯度的進樣液； 配制核黃素的甲醇溶液作為儲備液；配制核黃素的水溶液作為工作標準溶液，核黃素的濃度為4 μ g核黃素/mL水；進樣液經0.2 μ m濾膜過濾后直接進樣，采用液相色譜-電噴霧線性離子阱質譜法進行分析檢測； 所述液相色譜的條件為: 安捷倫Eclipse XDB-C18色譜柱,所述色譜柱的規格為150 mm X 2.1 mm、5 μ m ;流動相為含0.1%甲酸的甲醇溶液與0.05%醋酸的混合液，所述甲醇溶液和醋酸的體積比為70%:30% ;使用安捷倫Zorbax C18保護柱,所述保護柱的規格為12.5 mm X 2.1 mm、5 μ m,等梯度淋洗，流速200 μ L/min,柱溫30°C,進樣環5 μ L,全環進樣； 所述電噴霧線性離子阱質譜的條件為: 毛細管溫度:350°C ;噴霧電壓:5 kV ;鞘氣:31 LTQ單位；輔助氣:5 LTQ單位；最大離子注射時間300 ms ;分離寬度2 m/z ;SRM模式，其中歸一化碰撞能量:22%，激活Q:0.30。
2.根據權利要求1所述煙草中核黃素的分析鑒定方法，其特征在于，SI所述儲備液避光保存在2 C下。
3.根據權利要求1所述煙草中核黃素的分析鑒定方法，其特征在于，SI所述工作標準溶液用完立即避光保存于2°C下，每兩天配制一次。
4.根據權利要求1所述煙草中核黃素的液相色譜-電噴霧線性離子阱多級質譜法定量檢測方法，其特征在于，SI所述以待測煙草樣品溶液制備不同濃度梯度的進樣液濃度為80ng/mL、320ng/mL、960ng/mL>2000ng/mL>4000ng/mL。
全文摘要
本發明涉及卷煙檢測技術領域，提供了一種煙草中核黃素的定量檢測方法。本發明針對煙草樣品中核黃素，建立了靈敏、準確、快速測定煙草中核黃素的液相色譜-電噴霧線性離子阱質譜法(LC-ITMS2方法)，成功實現煙草樣品中核黃素的含量測定。本發明檢測方法線性范圍為8～10000ng/mL，相關系數R2均大于0.99，檢測限為0.5ng/mL(S/N=3)，精密度小于3%。本發明方法避免了共流出問題，靈敏度高、選擇性優異、簡化了冗長復雜的樣品前處理，有效縮短了分析時間，大大提高了分析檢測效率。
文檔編號G01N30/02GK103115981SQ20131003353
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者黃翼飛, 胡靜 申請人:廣東中煙工業有限責任公司