一種免疫基底的制備方法及抗原或抗體的免疫檢測方法

專利名稱：一種免疫基底的制備方法及抗原或抗體的免疫檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種拉曼光譜檢測技術，尤其是涉及一種免疫基底的制備方法及抗原或抗體的免疫檢測方法。
背景技術：
拉曼散射是光子的非彈性散射，由分子振動或轉動能級躍遷產生。利用拉曼散射光譜技術可以在分子水平分析生物組織、細胞的物質組成及含量變化。由于拉曼散射光譜技術具有快速、無損、靈敏度高等特點，因此被廣泛地應用于生命科學、生化材料以及藥物的檢測和分析。然而，通常情況下拉曼信號較弱，不能滿足高靈敏度檢測分析的要求。1974年，Fleischmann等人首次從電化學池中銀電極表面單分子層批唳吸附物的拉曼散射實驗中發現了表面增強拉曼散射(Surface-Enhanced Raman scattering, SERS)現象，為拉曼散射光譜技術的應用開辟了新的途徑，特別適用于吸附在貴金屬納米粒子表面化合物分子的檢測和分析。另一方面，金屬(金或銀)納米粒子除了具有小尺寸效應、表面效應和宏觀量子隧道效應等特性，還具有良好的生物相溶性，適合作為載體使生物分子(如抗原或抗體)和熒光染料分子作為拉曼標記物吸附在金屬(金或銀)納米粒子表面制備成免疫探針，使得拉曼標記物的拉曼信號能夠被放大IO12 IO15倍，彌補了通常情況下拉曼信號較弱的缺點，滿足了生物醫學上免疫檢測和分析的高靈敏度要求。目前，抗原與抗體的檢測方法主要有:放射免疫檢測法、酶聯免疫檢測法、熒光免疫檢測法和表面增強拉曼散射(SERS)免疫檢測法等，這些方法各有特點，例如:放射免疫分析法和熒光免疫分析法的檢測靈敏度較高，但放射性物質的放射輻射和污染、傳統熒光團的發射譜線較寬(半峰全寬(FWHM)約為50 IOOnm)以及易于光降解等問題限制了放射免疫分析法與熒光免疫法的應用；酶聯免疫分析法具有高通量檢測的功能，但不適用于超靈敏檢測；表面增強拉曼散射(SERS)免疫檢測法，靈敏度高，光譜譜線窄，適用于高通量無損檢測分析，但是利用SERS效應進行免疫檢測，需要良好的SERS基底。盡管通過光刻、電子束刻蝕、反應離子刻蝕、納米壓印等微納加工技術可以制備出精度高、形貌復雜的SERS基底，但是所采用的微納加工設備構造復雜、費用昂貴，且制作過程耗時長、成本高、制備得到的基底面積小并不易大規模量產。而利用化學方法合成金屬(金和銀)納米粒子作為SERS基底，相對容易，但是金屬納米粒子處于溶液相，在檢測過程中，納米粒子很容易隨機聚集，且很難控制，得到的SERS信號的穩定性和可重復性較差。

發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種工藝過程簡單、成本低且耗時少的免疫基底的制備方法。本發明所要解決的另一個技術問題是利用第一個技術問題中的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底實現抗原或抗體免疫檢測的方法，該方法能夠有效地提高抗原或抗體檢測分析的靈敏度和穩定性，能夠實現高通量多抗原或多抗體檢測。
本發明解決上述第一個技術問題所采用的技術方案為:一種免疫基底的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
①-1、將單面拋光的硅片浸入有機溶劑中，并對硅片進行超聲波清洗20 40分鐘，然后用去離子水沖洗超聲波清洗后的硅片，再對沖洗干凈的硅片進行干燥處理；
①_2、在冰浴條件下，按體積比為1:3的比例，將質量百分比為20% 40%的過氧化氫溶液緩慢加入到質量百分比為80% 98%的濃硫酸溶液中，制備得到氧化劑溶液；
①-3、將經步驟①-1清洗并干燥過的硅片浸入由步驟①-2制備得到的氧化劑溶液中，在氧化劑溶液中反應0.5 I小時以去除硅片上的有機物，之后取出硅片，用去離子水沖洗硅片數次，然后對硅片進行干燥處理；
①_4、將經步驟①-3處理后的硅片浸入質量百分比為5% 20%的氫氟酸溶液中，在氫氟酸溶液中反應0.5 I小時后，立即取出硅片并浸入質量百分比為1% 3%的硝酸銀溶液或質量百分比為0.05% 2%的氯金酸溶液中，緩慢攪拌I 3分鐘，即得到銀納米粒子或金納米粒子修飾的硅片，取出硅片進行干燥處理；
①_5、將用于進行抗原檢測的抗體溶液或用于進行抗體檢測的抗原溶液滴加到經步驟
①_4處理后得到的銀納米粒子或金納米粒子修飾的硅片的拋光面上，并在溫度為2 8°C、濕度為40 80%的條件下靜置10 12小時，之后依次用三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水沖洗硅片，以去除未吸附到銀納米粒子或金納米粒子上的抗體或抗原，最后對吸附有抗體或抗原的銀納米粒子或金納米粒子修飾的硅片進行干燥處理；
①_6、在經步驟①-5處理后的硅片的拋光面上，滴加與步驟①_5中滴加的抗體溶液或抗原溶液相同體積的牛血清白蛋白溶液，在室溫下反應2 4小時，之后依次用含有0.05%Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液沖液和去離子水對硅片進行沖洗，以去除未吸附到銀納米粒子或金納米粒子上的牛血清白蛋白，再對硅片進行干燥處理，制備得到具有特異性選擇功能的免疫基底。所述的步驟①-1中的有機溶劑為丙酮或酒精或甲苯。所述的步驟①_5中所滴加的抗體溶液為一種抗體的溶液或為多種抗體的混合溶液，所滴加的抗體溶液的濃度為I 3mg/ml ;或所滴加的抗原溶液為一種抗原的溶液或為多種抗原的混合溶液，所滴加的抗原溶液的濃度為I 3mg/ml。所述的步驟①_5中所滴加的抗體溶液的種類由待檢測的抗原決定；或所滴加的抗原溶液的種類由待檢測的抗體決定。所述的步驟①-5中所滴加的抗體溶液的體積由所選用的硅片的拋光面的大小決定；或所滴加的抗原溶液的體積由所選用的硅片的拋光面的大小決定。所述的步驟①-6中所滴加的牛血清白蛋白溶液的質量百分比為2 4%。本發明解決上述另一個技術問題所采用的技術方案為:一種利用上述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底實現抗原或抗體的免疫檢測方法，其特征在于包括以下步驟:
②-1、制備免疫探針溶液，其中免疫探針溶液中的免疫探針的表面吸附的抗體或抗原的種類與上述第一個技術問題中所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上所吸附的抗體或抗原的種類相同；
②-2、將待測抗原溶液或待測抗體溶液滴加到利用上述第一個技術問題中所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底的吸附有抗體或抗原的表面上，在溫度為30 38°C的條件下反應2小時；之后依次用含有0.05% Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水對免疫基底進行沖洗，以去除未與免疫基底上的抗體或抗原發生免疫復合反應的抗原或抗體，再對免疫基底進行干燥處理；
②_3、在經步驟②-2處理后得到的免疫基底的吸附有待測抗原或待測抗體的表面上，滴加與步驟②_2中所滴加的待測抗原溶液或待測抗體溶液相同體積的免疫探針溶液，在溫度為4°C的恒溫條件下反應1.5 3小時；之后依次用含有0.05% Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水對免疫基底進行沖洗，以去除未與免疫基底上所固定的待測抗原或待測抗體發生免疫復合反應的免疫探針，再對免疫基底進行干燥處理；
②_4、利用拉曼光譜儀對經步驟②-3處理后得到的免疫基底進行光譜測量，如果步驟
②-2中所滴加的待測抗原溶液中的抗原與上述第一個技術問題中所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上的抗體以及免疫探針中的抗體發生免疫復合反應，則能夠檢測到免疫探針中的拉曼標記物的特征指紋譜；或如果步驟②_2中所滴加的待測抗體溶液中的抗體與上述第一個技術問題中所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上的抗原以及免疫探針中的抗原發生免疫復合反應，則能夠檢測到免疫探針中的拉曼標記物的特征指紋譜。所述的步驟②-1中免疫探針溶液的制備過程為:
a、制備粒徑大小為15 70nm的銀納米粒子溶液或金納米粒子溶液；
b、取I 3ml的銀納米粒子溶液或金納米粒子溶液，并滴入到離心管中，然后將裝有銀納米粒子溶液或金納米粒子溶液的離心管置放于高速離心機中，以8000 12000 rpm的轉速離心10 30分鐘；之后去除離心管中的上層清液，再將沉積物溶于相同體積的去離子水中；
C、向步驟b處理后得到的溶液中加入2 10 μ I且濃度為I 5mM的拉曼標記物溶液，在室溫條件下放置I 12小時后，以8000 12000rpm的轉速離心30分鐘，之后去除離心管中的上層清液，再將沉積物溶于I 3ml的磷酸鹽緩沖溶液或硼酸鹽緩沖溶液中；
d、在緩慢攪拌的情況下，向經步驟c處理后得到的溶液中，加入15 30μI且濃度為I 3mg/ml的抗體溶液或抗原溶液，在4°C恒溫下反應I 1.5小時后，以8000 12000rpm的轉速離心10 30分鐘，以去除未吸附在銀納米粒子或金納米粒子上的抗體或抗原，之后去除離心管中的上層清液，再在超聲波振蕩環境下，將離心管中的沉積物溶于I 3ml的磷酸鹽緩沖溶液或硼酸鹽緩沖溶液中；在此，要求加入的抗體溶液中的抗體的種類與上述第一個技術問題中所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上所吸附的抗體的種類相同，或要求加入的抗原溶液中的抗原與上述第一個技術問題中所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上所吸附的抗原的種類相同；
e、在緩慢攪拌的情況下，向步驟d處理后得到的溶液中，加入10 20μ I的牛血清白蛋白溶液，在室溫條件下靜置I 1.5小時后，以8000 12000 rpm的轉速離心10 30分鐘，之后去除離心管中的上層清液，再在超聲波振蕩環境下，將離心管中的沉積物溶于0.5 3ml的磷酸鹽緩沖溶液或硼酸鹽緩沖溶液中，制備得到具有特異性選擇功能的免疫探針溶液。
所述的步驟②-2中所滴加的待測抗原溶液的體積由上述第一個技術問題中所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底的吸附有抗體或抗原的表面的大小決定；或所滴加的待測抗體溶液的體積由上述第一個技術問題中所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底的吸附有抗體或抗原的表面的大小決定。所述的步驟c中拉曼標記物溶液中的拉曼標記物為四巰基苯甲酸、或為異硫氰酸羅丹明B、或為對巰基苯胺、或為對巰基吡啶；所述的步驟e中所加入的牛血清白蛋白溶液的質量百分比為2 4%。與現有技術相比，本發明的優點在于:
I)本發明提出的免疫基底的制備方法，工藝過程簡單、成本低、耗時少，易于高通量檢測多種待測抗原或抗體；且可根據所需待檢測的抗原或抗體的種類來制備相應的用于檢測該種抗原或抗體的免疫基底。2)在免疫基底的制備過程中，利用貴金屬(金或銀)納米粒子修飾硅片，由于金屬(金或銀)納米粒子具有良好的生物相容性，因此可使得免疫基底能很好地保持抗原或抗體的生物活性，同時硅片上修飾的貴金屬(金或銀)納米粒子也具有極好的表面增強拉曼散射效應。3)本發明提出的抗原或抗體的免疫檢測方法，其利用貴金屬(金或銀)納米粒子的表面增強拉曼散射效應來進行拉曼信號檢測，不僅能夠大大提高抗原或抗體檢測分析的靈敏度，而且拉曼光譜帶寬很窄，可用于高通量多抗原或抗體檢測；另一方面，拉曼信號檢測過程是在固態的免疫基底上進行的，因此避免了在溶液相情況下可能產生的信號不穩定和不可重復等問題。4)在抗原或抗體的免疫檢測過程中，所用免疫探針的制備過程簡單、成本低、耗時少，與免疫基底相結合用來檢測抗原或抗體，不僅靈敏度高，而且特異性好。5)在免疫探針的制備過程中所用的金或銀納米粒子溶液是通過水相法制備得到的，因此金或銀納米粒子表面只有一層保護劑檸檬酸根離子，易被拉曼標記物以及牛血清白蛋白所取代，也不會對檢測信號產生影響。


圖1為利用銀納米粒子修飾的免疫基底與金納米粒子免疫探針檢測載脂蛋白B抗原時，四巰基苯甲酸(拉曼標記物)的拉曼光譜 圖2為利用金納米粒子修飾的免疫基底與金納米粒子免疫探針檢測載脂蛋白B抗原時，四巰基苯甲酸(拉曼標記物)的拉曼光譜 圖3為利用銀納米粒子修飾的免疫基底與銀納米粒子免疫探針檢測載脂蛋白B抗原時，四巰基苯甲酸(拉曼標記物)的拉曼光譜 圖4為利用金納米粒子修飾的免疫基底與銀納米粒子免疫探針檢測載脂蛋白B抗原時，四巰基苯甲酸(拉曼標記物)的拉曼光譜圖。
具體實施例方式以下結合實施例及其附圖對本發明作進一步詳細描述。實施例一: 本實施例提出的一種銀納米粒子修飾的免疫基底的制備方法，其包括以下步驟:
①-1、取邊長為5_的正方形的單面拋光的硅片，將其浸入有機溶劑中，并對硅片進行超聲波清洗30分鐘，然后用去離子水沖洗超聲波清洗后的硅片，再對沖洗干凈的硅片進行干燥處理。在此，單面拋光的硅片也可以選用其他形狀和大小的硅片；有機溶劑可采用丙酮、酒精或甲苯等。①_2、配制氧化劑溶液:在冰浴條件下，按體積比為1:3的比例，將質量百分比為30%的過氧化氫溶液緩慢加入到質量百分比為98%的濃硫酸溶液中，制備得到氧化劑溶液。例如，取12ml的質量百分比為98%的濃硫酸溶液注入玻璃燒杯中，然后將玻璃燒杯置于裝有冰塊與水的混合物的容器中，再取4ml的質量百分比為30%的過氧化氫溶液，緩慢滴加到濃硫酸溶液中，之后靜置10分鐘，即制備得到氧化劑溶液。①-3、將經步驟①-1清洗并干燥過的硅片浸入由步驟①_2制備得到的氧化劑溶液中，在氧化劑溶液中反應0.8小時以去除硅片上的有機物，之后取出硅片，用去離子水沖洗硅片數次，然后對硅片進行干燥處理。①-4、將經步驟①-3處理后的硅片浸入質量百分比為10%的氫氟酸溶液中，在氫氟酸溶液中反應0.8小時后，立即取出硅片并浸入質量百分比為2%的硝酸銀溶液中，緩慢攪拌I分鐘后，即得到銀納米粒子修飾的硅片，取出硅片進行干燥處理。在此步驟中，硅片在氫氟酸溶液中反應后，在硅片的拋光面上形成一層S1-H鍵，然后在硝酸銀溶液中，硅片的拋光面上的S1-H鍵還原銀離子，在硅片的拋光面上形成一層銀納米粒子。①-5、將用于進行抗原檢測的13 μ I的濃度為2mg/ml的抗載脂蛋白B抗體溶液滴加到經步驟①_4處理后得到的銀納米粒子修飾的硅片的拋光面上，并在溫度為4°C、濕度為65%的條件下靜置12小時，之后依次用三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBS)和去離子水沖洗硅片，以去除未吸附到銀納米粒子上的抗體，最后對吸附有抗體的銀納米粒子修飾的硅片進行干燥處理。在此，所滴加的抗體溶液可以是其他種類的抗體溶液；或者滴加的抗體溶液是多種抗體的混合溶液，可以用于對多種抗原進行特異性選擇。在此，在銀納米粒子修飾的硅片上也可以滴加抗原溶液，用于進行抗體檢測。在此，所滴加的抗體溶液的種類由待檢測的抗原決定；或所滴加的抗原溶液的種類由待檢測的抗體決定。在此，所滴加的抗體溶液或抗原溶液的體積由所用硅片的拋光面的大小決定，一般要求可涂滿覆蓋整個拋光面。①_6、在經步驟①-5處理后的硅片的拋光面上，滴加與步驟①-5中滴加的抗載脂蛋白B抗體溶液相同體積的牛血清白蛋白(BSA)溶液，在室溫下反應3小時，之后依次用含有0.05% Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水對硅片進行沖洗，以去除未吸附到銀納米粒子上的牛血清白蛋白，再對硅片進行干燥處理，制備得到對載脂蛋白B具有特異性選擇功能的免疫基底。在本實施例中，三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBS)的PH值為7.6 ;含有0.05% Tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液的PH值為8.0 ;牛血清白蛋白溶液的質量百分比為3%，在具體實施過程中，也可以用人血清白蛋白或脫脂奶粉制成的溶液替代牛血清白蛋白溶液；干燥處理在氬氣或氮氣的環境中進行。實施例二:
本實施例提出了一種銀納米粒子修飾的免疫基底的制備方法，本實施例的銀納米粒子修飾的免疫基底的制備方法制備與實施例一給出的銀納米粒子修飾的免疫基底的制備方法的過程基本相同，不同之處僅在于本實施例所采用的氫氟酸的質量百分比為5%，硝酸銀溶液的質量百分比為3%，硅片浸入到硝酸銀溶液中的時間為2分鐘。實施例三:
本實施例提出了一種銀納米粒子修飾的免疫基底的制備方法，本實施例的銀納米粒子修飾的免疫基底的制備方法與實施例一給出的銀納米粒子修飾的免疫基底的制備方法的過程基本相同，不同之處僅在于本實施例所采用的氫氟酸的質量百分比為15%，硝酸銀溶液的質量百分比為1%，硅片浸入到硝酸銀溶液中的時間為3分鐘。實施例四:
本實施例提出了一種金納米粒子修飾的免疫基底的制備方法，本實施例的金納米粒子修飾的免疫基底的制備方法與實施例一給出的銀納米粒子修飾的免疫基底的制備方法的過程基本相同，不同之處僅在于本實施例是將實施例一步驟①-4中質量百分比為2%的硝酸銀溶液換成質量百分比為0.5%的氯金酸溶液，硅片浸入到氯金酸溶液中的時間為3分鐘。實施例五:
本實施例提出的一種金納米粒子修飾的免疫基底的制備方法，其包括以下步驟:
①-1、取邊長為IOmm的正方形的單面拋光的硅片，將其浸入有機溶劑中，并對硅片進行超聲波清洗40分鐘，然后用去離子水沖洗超聲波清洗后的硅片，再對沖洗干凈的硅片進行干燥處理。①-2、配制氧化劑溶液:在冰浴條件下，按體積比為1:3的比例，將質量百分比為38%的過氧化氫溶液緩慢加入到質量百分比為90%的濃硫酸溶液中，制備得到氧化劑溶液。①-3、將經步驟①-1清洗并干燥過的硅片浸入由步驟①-2制備得到的氧化劑溶液中，在氧化劑溶液中反應I小時以去除硅片上的有機物，之后取出硅片，用去離子水沖洗硅片數次，然后對硅片進行干燥處理。①-4、將經步驟①-3處理后的硅片浸入質量百分比為15%的氫氟酸溶液中，在氫氟酸溶液中反應0.5小時后，立即取出硅片并浸入質量百分比為1%的氯金酸溶液中，緩慢攪拌2分鐘后，即得到金納米粒子修飾的硅片，取出硅片進行干燥處理。在此步驟中，硅片在氫氟酸溶液中反應后，在硅片的拋光面上形成一層S1-H鍵，然后在氯金酸溶液中，硅片的拋光面上的S1-H鍵還原金離子，在硅片的拋光面形成一層金納米粒子。①-5、將用于進行抗原檢測的60 μ I的濃度為lmg/ml的抗載脂蛋白B抗體溶液滴加到經步驟①-4處理后得到的金納米粒子修飾的硅片的拋光面上，并在溫度為8°C、濕度為80%的條件下靜置11小時，之后依次用三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBS)和去離子水沖洗硅片，以去除未吸附到金納米粒子上的抗體，最后對吸附有抗體的金納米粒子修飾的硅片進行干燥處理。
在此，所滴加的抗體溶液可以是其他種類的抗體溶液；或者滴加的抗體溶液是多種抗體的混合溶液，可以用于對多種抗原進行特異性選擇。在此，在金納米粒子修飾的硅片上也可以滴加抗原溶液，用于進行抗體檢測。在此，所滴加的抗體溶液或抗原溶液的種類由待檢測的抗原或抗體決定。在此，所滴加的抗體溶液或抗原溶液的體積由所用硅片的拋光表面大小決定，要求可涂滿覆蓋整個拋光表面。①-6、在經步驟①-5處理后的硅片上，滴加與步驟①-5中滴加的載脂蛋白B抗體溶液相同體積的牛血清白蛋白(BSA)溶液，在室溫下反應2.5小時，之后依次用含有0.05%Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液)和去離子水對硅片進行沖洗，以去除未吸附到金納米粒子上的牛血清白蛋白，再對硅片進行干燥處理，制備得到對載脂蛋白B具有特異性選擇功能的免疫基底。在本實施例中，三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBS)的PH值為7.6 ;含有0.05% Tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液的PH值為8.0 ;牛血清白蛋白溶液的質量百分比為3%，在具體實施過程中，也可以用人血清白蛋白或脫脂奶粉制成的溶液替代牛血清白蛋白溶液；干燥處理在氬氣或氮氣的環境中進行。實施例六:
本實施例提出的一種金納米粒子修飾的免疫基底的制備方法，其包括以下步驟:
①-1、取邊長為IOmm的正方形的單面拋光的娃片,將其浸入有機溶劑中，燕對娃片進行超聲波清洗30分鐘，然后用去離子水沖洗超聲波清洗后的硅片，再對沖洗干凈的硅片進行干燥處理。①-2、配制氧化劑溶液:在冰浴條件下，按體積比為1:3的比例，將質量百分比為20%的過氧化氫溶液緩慢加入到質量百分比為80%的濃硫酸溶液中，制備得到氧化劑溶液。在此，氧化劑溶液的作用是去除基片表面的有機物。①-3、將經步驟①-1清洗并干燥過的硅片浸入由步驟①-2制備得到的氧化劑溶液中，在氧化劑溶液中反應I小時，之后取出硅片，用去離子水沖洗硅片數次，然后對硅片進行干燥處理。①-4、將經步驟①-3處理后的硅片浸入質量百分比為20%的氫氟酸溶液中，在氫氟酸溶液中反應I小時后，立即取出硅片并浸入質量百分比為2%的氯金酸溶液中，緩慢攪拌I分鐘后，即得到金納米粒子修飾的硅片，取出硅片進行干燥處理。在此步驟中，硅片在氫氟酸溶液中反應后，在硅片的拋光面上形成一層S1-H鍵，然后在氯金酸溶液中，硅片的拋光面上的S1-H鍵還原金離子，在硅片表面形成一層金納米粒子。①-5、將用于進行抗原檢測的60 μ I的濃度為3mg/ml的抗載脂蛋白B抗體溶液滴加到經步驟①-4處理后得到的金納米粒子修飾的硅片的拋光面上，并在溫度為6°C、濕度為45%的條件下靜置10小時，之后依次用三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBS)和去離子水沖洗硅片，以去除未吸附到金納米粒子上的抗體，最后對吸附有抗體的金納米粒子修飾的硅片進行干燥處理。在此，所滴加的抗體溶液可以是其他種類的抗體溶液；或者滴加的抗體溶液是多種抗體的混合溶液，可以用于對多種抗原進行特異性選擇。
在此，在金納米粒子修飾的硅片上也可以滴加抗原溶液，用于進行抗體檢測。在此，所滴加的抗體溶液或抗原溶液的種類由待檢測的抗原或抗體決定。在此，所滴加的抗體溶液或抗原溶液的體積由所用硅片的拋光表面大小決定，要求可涂滿覆蓋整個拋光表面。①-6、在經步驟①-5處理后的硅片上，滴加與步驟①-5中滴加的抗載脂蛋白B抗體溶液相同體積的牛血清白蛋白(BSA)溶液，在室溫下反應3小時，之后依次用含有0.05%Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液)和去離子水對硅片進行沖洗，以去除未吸附到金納米粒子上的牛血清白蛋白，再對硅片進行干燥處理，制備得到對載脂蛋白B具有特異性選擇功能的免疫基底。在此，三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBS)的PH值可以為7.6 ;含有0.05% Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液的PH值可以為8.0 ;牛血清白蛋白溶液的質量百分比可以為2%，牛血清白蛋白可以由人血清白蛋白或脫脂奶粉等替代；干燥處理在氬氣或氮氣的環境中進行。實施例七:
本實施例為利用一種免疫基底的制備方法所制備得到的免疫基底實現抗原或抗體免疫檢測的方法，其基本原理是:對于抗原檢測，利用待測抗原與免疫基底表面抗體之間的免疫復合反應，將待測抗原吸附在免疫基底表面，再利用待測抗原與免疫探針表面的抗體之間的免疫復合反應，使免疫探針被吸附在免疫基底表面，形成免疫基底-抗原-免疫探針三層夾心結構，然后通過檢測免疫探針表面吸附的拉曼標記物四巰基苯甲酸的特征指紋譜來檢測待測抗原；在進行抗體檢測時，先利用待測抗體與免疫基底表面抗原之間的免疫復合反應，將待測抗體吸附在免疫基底表面，再利用待測抗體與免疫探針表面的抗原之間發生免疫復合反應，使免疫探針被吸附在免疫基底表面，形成免疫基底-抗體-免疫探針三層夾心結構，通過檢測免疫探針表面吸附的拉曼標記物四巰基苯甲酸的特征指紋譜來檢測待測抗體。其具體包括以下步驟:
②-1、制備含有與實施例一和實施例四給出的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上所吸附的抗體(抗載脂蛋白B抗體)相同種類的抗體的免疫探針溶液；免疫探針溶液的具體制備過程如下:
a、制備金納米粒子溶液，其具體制備過程如下:I)取0.0lg的氯金酸粉末溶于2ml的去離子水中，然后稀釋到200ml，得到200ml的質量百分比為0.01%的氯金酸溶液；2)然后利用水浴法對氯金酸溶液進行加熱直至氯金酸溶液的溫度達到100°C;3)取0.1g的檸檬酸鈉粉末，溶于9.9ml的去離子水中，超聲波振蕩10分鐘，配置成質量百分比為1%的檸檬酸鈉溶液；4)在劇烈攪拌的條件下，向溫度為100°C的氯金酸溶液中加入4ml的質量百分比為1%的檸檬酸鈉溶液，持續攪拌并加熱20分鐘直至溶液變成酒紅色后停止攪拌與加熱，再將溶液置于室溫下使其自然冷卻，即得到金納米粒子溶液。b、取3ml的金納米粒子溶液，滴入到離心管中，然后將裝有金納米粒子溶液的離心管置放于高速離心機中，以IlOOOrpm的轉速離心30分鐘；之后去除離心管中的上層清液，再將離心管中的沉積物溶于相同體積的去離子水中。在此，所取的金納米粒子溶液的量可為Iml或2ml等不同體積。C、向步驟b處理后得到的溶液中加入8 μ I且濃度為ImM的拉曼標記物(四巰基苯甲酸(4MBA))溶液，在室溫條件下放置12小時后，進行離心處理，以IlOOOrpm的轉速離心30分鐘，之后去除離心管中的上層清液，再將沉積物溶于Iml的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中。d、在緩慢攪拌的情況下，向經步驟c處理后得到的溶液中，加入20 μ I且濃度為2mg/ml的抗載脂蛋白B抗體溶液,在4°C恒溫下反應1.5小時,再離心處理，以IlOOOrpm的轉速離心30分鐘，以去除未吸附在金屬納米粒子表面的載脂蛋白B抗體，之后去除離心管中的上層清液，再在超聲波振蕩環境下，將離心管中的沉積物溶于Iml的磷酸鹽緩沖溶液中。在此，加入的抗體溶液的量可以控制在15 30 μ I范圍內，濃度可控制在I 3mg/ml范圍內；磷酸鹽緩沖溶液的PH值可以為7.0 ;磷酸鹽緩沖溶液的量可控制在I 3ml范圍內；磷酸鹽緩沖溶液可由硼酸鹽緩沖溶液替代，硼酸鹽緩沖溶液的PH值可以為9.2。在此，值得注意的是要求加入的抗體溶液中的抗體與實施例一和實施例四給出的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上所吸附的抗體的種類相同，如果免疫基底上所吸附的是抗原，則要求加入的抗原溶液中的抗原與免疫基底上所吸附的抗原的種類相同。e、在緩慢攪拌的情況下，向步驟d處理后得到的溶液中，加入10 μ I的牛血清白蛋白(BSA)溶液，在室溫條件下靜置I小時，再進行離心處理，以IlOOOrpm的轉速離心30分鐘；之后去除離心管中的上層清液，再在超聲波振蕩環境下，將離心管中的沉積物溶于
0.5ml的磷酸鹽緩沖溶液中，制備得到表面吸附有抗載脂蛋白B抗體和拉曼標記物四巰基苯甲酸的金納米粒子免疫探針溶液。在此，牛血清白蛋白溶液的質量百分比可以為3% ;牛血清白蛋白溶液也可替換為人血清白蛋白溶液或脫水牛奶。在此，高速離心機的轉速可設置為8000 12000 rpm，時間可設置為10 30分
鐘。高轉速情況下，時間設置可相應縮短。在此，拉曼標記物四巰基苯甲酸可以用異硫氰酸羅丹明B、對巰基苯胺、對巰基吡啶等物質代替。②-2、分別將濃度為2 μ g/ml的載脂蛋白B (待測抗原)溶液，滴加涂滿覆蓋到上述實施例一和實施例四制備得到的免疫基底上，在溫度為37°C的條件下反應2小時；之后依次用含有0.05% Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、Tris緩沖液和去離子水對免疫基底進行沖洗，與免疫基底表面的抗載脂蛋白B抗體發生免疫復合反應的載脂蛋白B被保留在基底表面，而未與免疫基底表面的抗載脂蛋白B抗體發生免疫復合反應的載脂蛋白B被清洗掉，然后再對免疫基底進行干燥處理。在此，待測抗原載脂蛋白B溶液的濃度可以為任意濃度。②_3、取經步驟②-1制備得到的免疫探針溶液，滴加涂滿覆蓋經步驟②-2處理后得到的免疫基底上，在溫度為4°C的恒溫條件下反應2小時；之后依次用含有0.05% Tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、Tris緩沖液和去離子水對免疫基底進行沖洗，與免疫基底表面的載脂蛋白B發生免疫復合反應的免疫探針被保留在基底表面，未與保留在免疫基底表面的抗原發生免疫復合反應的免疫探針被清洗掉，再對免疫基底進行干燥處理。②-4、利用現有的拉曼光譜儀(拉曼光譜儀的激光波長為785nm、激光功率為49.5mff)對步驟②-3處理后得到的免疫基底進行拉曼光譜測量(測量時間為10s)，檢測免疫探針中的拉曼標記物的特征指紋譜拉曼。
在此，拉曼光譜儀的激光波長可以為633 nm或者532nm等，激光功率可以為30mW或60mW等，測量時間可以設為5s或20s等。在此，干燥處理在氬氣或氮氣的環境中進行。圖1給出了利用實施例一制備得到的銀納米粒子修飾的免疫基底與本實施例制備得到的金納米粒子免疫探針檢測待測抗原(載脂蛋白B)時，四巰基苯甲酸的拉曼光譜圖。圖1中，實線對應待測溶液中載脂蛋白B的濃度為2 μ g/ml ;虛線對應不含載脂蛋白B的待測溶液。當待測溶液中含有抗原(載脂蛋白B)時，載脂蛋白B與免疫基底表面的抗載脂蛋白B抗體以及免疫探針表面的抗載脂蛋白B抗體之間發生免疫復合反應，形成免疫基底-抗原(載脂蛋白B)-免疫探針三層夾心結構，從而可以檢測到強的拉曼標記物四巰基苯甲酸的特征指紋峰；當待測溶液中不含有抗原(載脂蛋白B)時，不形成免疫基底-抗原(載脂蛋白B)-免疫探針三層夾心結構，但由于免疫探針與免疫基底發生非特異性吸附，在免疫基底表面殘留極少量的免疫探針，僅得到很弱的拉曼光譜。圖2給出了利用實施例四制備得到的金納米粒子修飾的免疫基底與本實施例制備得到的金納米粒子免疫探針檢測待測抗原(載脂蛋白B)時，四巰基苯甲酸的拉曼光譜圖。圖2中，實線對應待測溶液中載脂蛋白B的濃度為2 μ g/ml ;虛線對應不含載脂蛋白B的待測溶液。當待測溶液中含有抗原(載脂蛋白B)時，載脂蛋白B與免疫基底表面的抗載脂蛋白B抗體以及免疫探針表面的抗載脂蛋白B抗體之間發生免疫復合反應，形成免疫基底-抗原(載脂蛋白B)-免疫探針三層夾心結構，從而可以檢測到強的拉曼標記物四巰基苯甲酸的特征指紋峰；當待測溶液中不含有抗原(載脂蛋白B)時，不形成免疫基底-抗原(載脂蛋白B)-免疫探針三層夾心結構，但由于免疫探針與免疫基底發生非特異性吸附，在免疫基底表面殘留極少量的免疫探針，僅得到很弱的拉曼光譜。實施例八:
本實施例為利用一種免疫基底的制備方法所制備得到的免疫基底實現免疫檢測抗原或抗體的方法，其過程與實施例七的過程基本相同，不同之處在于制備免疫探針時用銀納米粒子代替金納米粒子。在本實施例中，免疫探針所用的銀納米粒子溶液的制備過程為:1)取0.018g的硝酸銀粉末溶于IOOml的去離子水中得到硝酸銀溶液，然后利用水浴法對硝酸銀溶液加熱至IOO0C ；2)取0.1g的檸檬酸鈉粉末，溶于9.9ml的去離子水中，超聲波振蕩3分鐘，配置成質量百分比為1%的檸檬酸鈉溶液；3)待硝酸銀溶液達到100°C時，在劇烈攪拌的條件下，力口入2ml的質量百分比為1%的檸檬酸鈉溶液，持續攪拌并加熱20分鐘直至溶液變成青黃色，然后停止攪拌與加熱，再將溶液置于室溫下使其自然冷卻，冷卻后得到銀納米粒子溶液。圖3給出了利用實施例二制備得到的銀納米粒子修飾的免疫基底與本實施例制備得到的銀納米粒子免疫探針檢測待測抗原(載脂蛋白B)時，四巰基苯甲酸的拉曼光譜圖。圖3中，實線對應待測溶液中載脂蛋白B的濃度為2 μ g/ml ;虛線對應不含載脂蛋白B的待測溶液。當待測溶液中含有抗原(載脂蛋白B)時，載脂蛋白B與免疫基底表面的抗載脂蛋白B抗體以及免疫探針表面的抗載脂蛋白B抗體之間發生免疫復合反應，形成免疫基底-抗原(載脂蛋白B)-免疫探針三層夾心結構，從而可以檢測到強的拉曼標記物四巰基苯甲酸的特征指紋峰；當待測溶液中不含有抗原(載脂蛋白B)時，不形成免疫基底-抗原(載脂蛋白B)-免疫探針三層夾心結構，但由于免疫探針與免疫基底發生非特異性吸附，在免疫基底表面殘留極少量的免疫探針，僅得到很弱的拉曼光譜。圖4給出了利用實施例五制備得到的金納米粒子修飾的免疫基底與本實施例制備得到的銀納米粒子免疫探針檢測待測抗原(載脂蛋白B)時，四巰基苯甲酸的拉曼光譜圖。圖4中，實線對應待測溶液中載脂蛋白B的濃度為2 μ g/ml ;虛線對應不含載脂蛋白B的待測溶液。當待測溶液中含有抗原(載脂蛋白B)時，載脂蛋白B與免疫基底表面的抗載脂蛋白B抗體以及免疫探針表面的抗載脂蛋白B抗體之間發生免疫復合反應，形成免疫基底-抗原(載脂蛋白B)-免疫探針三層夾心結構，從而可以檢測到強的拉曼標記物四巰基苯甲酸的特征指紋峰；當待測溶液中不含有抗原(載脂蛋白B)時，不形成免疫基底-抗原(載脂蛋白B)-免疫探針三層夾心結構，但由于免疫探針與免疫基底發生非特異性吸附，在免疫基底表面殘留極少量的免疫探針，僅得到很弱的拉曼光譜。
權利要求
1.一種免疫基底的制備方法，其特征在于包括以下步驟: ①-1、將單面拋光的硅片浸入有機溶劑中，并對硅片進行超聲波清洗20 40分鐘，然后用去離子水沖洗超聲波清洗后的硅片，再對沖洗干凈的硅片進行干燥處理； ①_2、在冰浴條件下，按體積比為1:3的比例，將質量百分比為20% 40%的過氧化氫溶液緩慢加入到質量百分比為80% 98%的濃硫酸溶液中，制備得到氧化劑溶液； ①-3、將經步驟①-1清洗并干燥過的硅片浸入由步驟①-2制備得到的氧化劑溶液中，在氧化劑溶液中反應0.5 I小時以去除硅片上的有機物，之后取出硅片，用去離子水沖洗硅片數次，然后對硅片進行干燥處理； ①_4、將經步驟①-3處理后的硅片浸入質量百分比為5% 20%的氫氟酸溶液中，在氫氟酸溶液中反應0.5 I小時后，立即取出硅片并浸入質量百分比為1% 3%的硝酸銀溶液或質量百分比為0.05% 2%的氯金酸溶液中，緩慢攪拌I 3分鐘，即得到銀納米粒子或金納米粒子修飾的硅片，取出硅片進行干燥處理； ①_5、將用于進行抗原檢測的抗體溶液或用于進行抗體檢測的抗原溶液滴加到經步驟①-4處理后得到的銀納米粒子或金納米粒子修飾的硅片的拋光面上，并在溫度為2 8°C、濕度為40 80%的條件下靜置10 12小時，之后依次用三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水沖洗硅片，以去除未吸附到銀納米粒子或金納米粒子上的抗體或抗原，最后對吸附有抗體或抗原的銀納米粒子或金納米粒子修飾的硅片進行干燥處理； ①_6、在經步驟①-5處理后的硅片的拋光面上，滴加與步驟①_5中滴加的抗體溶液或抗原溶液相同體積的牛血清白蛋白溶液，在室溫下反應2 4小時，之后依次用含有0.05%Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水對硅片進行沖洗，以去除未吸附到銀納米粒子或金納米粒子上的牛血清白蛋白，再對硅片進行干燥處理，制備得到具有特異性選擇功能的免疫基底。
2.根據權利要求1所述的一種免疫基底的制備方法，其特征在于所述的步驟①-1中的有機溶劑為丙酮或酒精或甲苯。
3.根據權利要求1或2所述的一種免疫基底的制備方法，其特征在于所述的步驟①-5中所滴加的抗體溶液為一種抗體的溶液或為多種抗體的混合溶液，所滴加的抗體溶液的濃度為I 3mg/ml ;或所滴加的抗原溶液為一種抗原的溶液或為多種抗原的混合溶液,所滴加的抗原溶液的濃度為I 3mg/ml。
4.根據權利要求3所述的一種免疫基底的制備方法，其特征在于所述的步驟①-5中所滴加的抗體溶液的種類由待檢測的抗原決定；或所滴加的抗原溶液的種類由待檢測的抗體決定。
5.根據權利要求4所述的一種免疫基底的制備方法，其特征在于所述的步驟①-5中所滴加的抗體溶液的體積由所選用的硅片的拋光面的大小決定；或所滴加的抗原溶液的體積由所選用的硅片的拋光面的大小決定。
6.根據權利要求5所述的一種免疫基底的制備方法，其特征在于所述的步驟①-6中所滴加的牛血清白蛋白溶液的質量百分比為2 4%。
7.一種利用權利要求1所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底實現抗原或抗體的免疫檢測方法，其特征在于包括以下步驟: ②-1、制備免疫探針溶液，其中免疫探針溶液中的免疫探針的表面所吸附的抗體或抗原的種類與權利要求1所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上所吸附的抗體或抗原的種類相同； ②-2、將待測抗原溶液或待測抗體溶液滴加到利用權利要求1所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底的吸附有抗體或抗原的表面上，在溫度為30 38°C的條件下反應2小時；之后依次用含有0.05% Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水對免疫基底進行沖洗，以去除未與免疫基底上的抗體或抗原發生免疫復合反應的抗原或抗體，再對免疫基底進行干燥處理； ②_3、在經步驟②-2處理后得到的免疫基底的吸附有待測抗原或待測抗體的表面上，滴加與步驟②_2中所滴加的待測抗原溶液或待測抗體溶液相同體積的免疫探針溶液，在溫度為4°C的恒溫條件下反應1.5 3小時；之后依次用含有0.05% Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水對免疫基底進行沖洗，以去除未與免疫基底上所固定的待測抗原或待測抗體發生免疫復合反應的免疫探針，再對免疫基底進行干燥處理； ②_4、利用拉曼光譜儀對經步驟②-3處理后得到的免疫基底進行光譜測量，如果步驟②-2中所滴加的待測抗原溶液中的抗原與權利要求1所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上的抗體以及免疫探針中的抗體發生免疫復合反應，則能夠檢測到免疫探針中的拉曼標記物的特征指紋譜；或如果步驟②_2中所滴加的待測抗體溶液中的抗體與權利要求I所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上的抗原以及免疫探針中的抗原發生免疫復合反應，則能夠檢測到免疫探針中的拉曼標記物的特征指紋譜。
8.根據權利要求7所述的一種抗原或抗體的免疫檢測方法，其特征在于所述的步驟②-1中免疫探針溶液的制備過程為: a、制備粒徑大小為15 70nm 的銀納米粒子溶液或金納米粒子溶液； b、取I 3ml的銀納米粒子溶液或金納米粒子溶液，并滴入到離心管中，然后將裝有銀納米粒子溶液或金納米粒子溶液的離心管置放于高速離心機中，以8000 12000 rpm的轉速離心10 30分鐘；之后去除離心管中的上層清液，再將沉積物溶于相同體積的去離子水中； C、向步驟b處理后得到的溶液中加入2 10 μ I且濃度為I 5mM的拉曼標記物溶液，在室溫條件下放置I 12小時后，以8000 12000rpm的轉速離心30分鐘，之后去除離心管中的上層清液，再將沉積物溶于I 3ml的磷酸鹽緩沖溶液或硼酸鹽緩沖溶液中； d、在緩慢攪拌的情況下，向經步驟c處理后得到的溶液中，加入15 30μI且濃度為I 3mg/ml的抗體溶液或抗原溶液，在4°C恒溫下反應I 1.5小時后，以8000 12000rpm的轉速離心10 30分鐘，以去除未吸附在銀納米粒子或金納米粒子上的抗體或抗原，之后去除離心管中的上層清液，再在超聲波振蕩環境下，將離心管中的沉積物溶于I 3ml的磷酸鹽緩沖溶液或硼酸鹽緩沖溶液中；在此，要求加入的抗體溶液中的抗體與權利要求1所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上所吸附的抗體的種類相同，或要求加入的抗原溶液中的抗原與權利要求1所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底上所吸附的抗原的種類相同； e、在緩慢攪拌的情況下，向步驟d處理后得到的溶液中，加入10 20μ I的牛血清白蛋白溶液，在室溫條件下靜置I 1.5小時后，以8000 12000 rpm的轉速離心10 30分鐘，之后去除離心管中的上層清液，再在超聲波振蕩環境下，將離心管中的沉積物溶于，0.5 3ml的磷酸鹽緩沖溶液或硼酸鹽緩沖溶液中，制備得到具有特異性選擇功能的免疫探針溶液。
9.根據權利要求7或8所述的一種抗原或抗體的免疫檢測方法，其特征在于所述的步驟②-2中所滴加的待測抗原溶液的體積由權利要求1所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底的吸附有抗體或抗原的表面的大小決定；或所滴加的待測抗體溶液的體積由權利要求1所述的免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底的吸附有抗體或抗原的表面的大小決定。
10.根據權利要求8所述的一種抗原或抗體的免疫檢測方法，其特征在于所述的步驟C中拉曼標記物溶液中的拉曼標記物為四巰基苯甲酸、或為異硫氰酸羅丹明B、或為對巰基苯胺、或 為對巰基吡啶 ；所述 的步驟e中所加入的牛血清白蛋白溶液的質量百分比為2 4%。
全文摘要
本發明公開了一種免疫基底的制備方法及抗原或抗體的免疫檢測方法，該免疫基底制備方法利用金或銀納米粒子修飾硅片，再在金或銀納米粒子表面修飾抗體/抗原，用于捕獲待測抗原/抗體；該抗原或抗體的免疫檢測方法應用上述免疫基底的制備方法制備得到的免疫基底以及金或銀納米粒子免疫探針，通過抗原-抗體的免疫復合反應，形成免疫基底-抗原/抗體-免疫探針三層夾心結構，利用金或銀納米粒子的表面增強拉曼散射效應，檢測免疫探針表面拉曼標記物的特征指紋譜實現待測抗原/抗體檢測，該方法能夠大大提高免疫檢測的靈敏度，而且可進行高通量的多抗原或多抗體檢測。
文檔編號G01N33/531GK103116019SQ201310015549
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月16日 優先權日2013年1月16日
發明者周駿, 束磊, 馬亞楠, 王彬彬, 賴魏, 張琪, 顏承恩 申請人:寧波大學