專利名稱：一種檢測食品中殘留過氧化氫的酶-比色法的制作方法
技術領域：
本發明涉及食品安全檢測中過氧化氫的檢測，尤其是采用酶-比色法對食品中殘留過氧化氫的測定。
背景技術：
過氧化氫俗稱雙氧水，無色、無味，有氧化性、除臭、脫色和殺菌等作用。同時，雙氧水在無菌食品包裝殺菌エ序是常用的殺菌劑，如乳品生產中利樂包裝設備必須使用過氧化氫殺菌劑。然而由于雙氧水的特殊性質，不法人員將其加到食品中使賣相變得更好或保質期更長，過去在牛奶、豆腐干、水產品、水發產品、肉制品等食品中都有檢出。在牛奶生產過程中有人濫用エ業過氧化氫來抑制細菌的繁殖，降低亞硝酸鹽的含量。但高濃度的過氧化氫不僅會影響食品的品質，也會嚴重損害消費者的健康。在GB2760-2007《食品添加劑使用衛生標準》中，過氧化氫已從食品添加劑中刪除，被列入了“食品エ業用加工助劑使用名単”，在食品生產加工作為助劑可以使用。根據《食品安全法》規定，食品中的過氧化氫殘留不得檢出。因此研究一種有效、快速、特異性強、檢測限低的方法是十分必要的。食品中殘留過氧化氫的檢測方法主要有滴定分析(高錳酸鉀法或碘量法)、分光光度法、熒光法、高效液相色譜法。我國檢測食品中殘留過氧化氫的方法為國家標準GB/T23499-2009《食品中殘留過氧化氫的測定方法》，該標準中采用的是碘量法和鈦鹽比色法。而液相色譜法需要較昂貴的儀器，且樣品前處理也比較復雜，檢測時間長。市場上同時也有快速檢測過氧化氫的試紙和檢測儀，如雙氧水試紙條，基于傳感器和電分析的便攜式過氧化氫檢測儀等。根據過氧化氫的特性，研制出來的常見快速方法有試紙法，如柴春彥等利用光典型生物傳感器制成的過氧化物酶測試條(CN200710047154，檢測食品中過氧化氫快速測試條)；謝莉等研制的過氧化物酶催化四甲基聯苯胺顯色的試紙條(牛奶中過氧化氫快速檢測試紙條的研制，食品科技，2012，37 (3)，301-303);王煒軍等公開了ー種利用過氧化物酶和顯色劑反應來測定過氧化氫濃度的酶試紙(CN100516843C —種用于測定過氧化氫濃度的酶試紙)。本發明建立了一種檢測食品中殘留過氧化氫的酶-比色法，該方法簡單、快速、準確、有效、成本低，能實現大批樣品的快速定性定量檢測，檢出限低。
發明內容
本發明的目的是提供ー種測定食品中殘留過氧化氫的方法。為此，本發明采用的技術方案是:(I)將固體樣品粉碎均勻，取樣5-10g(精確至0.0Olg)，對液體樣品混勻后量取10-20mL于50mL容量瓶中。依次加5mL硫酸鋅溶液，5mL亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白和脂肪，混勻，加水定容至刻度。放置10-20min。用濾紙或0.45 y m濾膜過濾。如果沉淀蛋白和脂肪后的樣品溶液含有顔色，可加入Ig活性炭振搖lmin，濾紙過濾，或將樣品溶液通過活性炭固相萃取小柱，除色，收集凈化液，待用。如果經過活性炭吸附試樣液仍然有顏色干擾，測定時應扣除試樣液的本底色。(2)濾液用稀酸和稀堿調節溶液pH值在7.6,混勻后用濾紙或0.45 iim濾膜過濾。(3)取10-20mL濾液于25或50mL容量瓶中，加入過氧化物酶試劑溶液l-3mL，30-40°C水浴恒溫顯色10-20min，冷卻至室溫，定容至刻度。(4)采用分光光度法進行檢測，在470nm波長處測定吸光度。吸光度與過氧化氫的含量成正比，從而計算樣品中過氧化氫的含量。步驟(I)中所用的硫酸鋅溶液配制:稱取53.5g七水硫酸鋅溶于水中，并稀釋定容至 IOOmL。步驟(I)中所用的亞鐵氰化鉀溶液配制:稱取17.2g三水亞鐵氰化鉀溶于水中，并稀釋定容至100mL。步驟⑵中所用的稀酸，為稀鹽酸或稀硫酸溶液，質量濃度0.01-1.0%。步驟(2)中所用的稀堿，為稀氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，質量濃度為0.01-1.0%。步驟(3)所用的過氧化物酶試劑溶液由辣根過氧化物酶、鄰甲氧基苯酚的磷酸鹽緩沖液顯色劑組成。含鄰甲氧基苯酚0.0050mol/L的0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH= 7.6)。使用時將辣根過氧化物酶固體粉末加入到混合溶液中，輕輕混勻，配制成酶活力5U (活力単位)/mL，4°C下可以保存I個月。步驟⑶中所用的水浴溫度，優選37°C。如果樣品中含有過氧化氫，則溶液變粉紅色或紅褐色，顯色明顯。本方法的創新性在于經過氧化物酶的催化作用，過氧化氫與鄰甲氧基苯酚反應，反應產物與過氧化氫含量成正比，測定反應產物的吸光度，根據反應產物吸光度和過氧化氫濃度的標準曲線，計算得到過氧化氫的含量。
具體實施方式
:下面對本發明做進ー步詳細說明。實施例1:準確稱量已經標定的過氧化氫溶液，配制1000mg/L的標準使用液。配制100mg/L的標準中間液。分別配制含0、l、2、5、10、20mg/L的過氧化氫標準使用液20mL，轉移到25mL比色管中，加入2mL過氧化物酶試劑溶液，在37°C水浴中恒溫20min，冷卻至室溫。用二次水定容至25mL，井分別于470nm波長處，測試所得溶液的吸光度。以吸光度為Y軸，過氧化氫濃度為X軸作標準曲線，得標準曲線回歸方程。實施例2:分析步驟:移取某品牌袋裝鮮牛奶20mL于50mL容量瓶中，依次加入5mL硫酸鋅溶液和5mL亞鐵氰化鉀溶液,混勻，加水定容至50mL,靜置20min,用濾紙過濾得到濾液,然后用0.01 %氫氧化鈉溶液調節pH值至7.6，濾紙過濾，濾液即為試液，移取20mL試液于25mL容量瓶中，加入2mL過氧化物酶試劑溶液，搖勻，在37°C水浴中恒溫20min，溶液顯淺紅色，冷卻至室溫，定容到25mL，在470nm處測定吸光度，根據實施例1過氧化氫的標準曲線方程，計算該樣品中含過氧化氫5.78mg/L。該方法定量限為2.0mg/L。實施例3:
分析步驟:取某集貿市場牛百葉，切成小塊兒后，食品粉碎機粉碎，稱取10.0g(精確至0.0Olg)到50mL容量瓶中，依次加入5mL硫酸鋅溶液和5mL亞鐵氰化鉀溶液，混勻，加水定容至50mL，靜置20min，濾紙過濾得到濾液，然后0.01%氫氧化鈉溶液調節pH值到
7.6，濾紙過濾，濾液即為試液，移取20mL試液到25mL容量瓶中，加入2mL過氧化物酶試劑溶液，搖勻，在37°C水浴中恒溫20min，溶液顯粉紅色，冷卻至室溫，定容到25mL，在470nm處測定吸光度，根據實施例1過氧化氫的標準曲線方程，計算該樣品中含過氧化氫9.54mg/kgo該方法定量限為5.0mg/kg。上述實施例僅供說明本發明之用，而并非是對本發明專利的限制；應當指出的是，對于本領域的普通技術人員，在不脫離本發明構思范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，這些都屬于本發明的保護范圍；因此，凡跟本發明權利要求范圍所做的均等變化與修飾，均應屬于本發明權利要求的覆蓋范圍。
權利要求
1.一種檢測食品中殘留過氧化氫的酶-比色法，其特征包括如下步驟: (1)樣品中分別加入硫酸鋅溶液、亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白和脂肪，混合均勻，定容，靜置，過濾，收集濾液； (2)用稀酸或稀堿調節濾液pH值到7.6，過濾； (3)取濾液，加入過氧化物酶試劑溶液，水浴恒溫，顯色，定容； (4)分光光度法測定吸光度，吸光度與過氧化氫的含量成正比，從而計算樣品中過氧化氫的含量。
根據權利要求書I所述的方法，其特征在于，所述的過氧化物酶試劑溶液由辣根過氧化物酶、鄰甲氧基苯酚的磷酸鹽緩沖液顯色劑組成。
全文摘要
本方法公開了一種檢測食品中殘留過氧化氫的酶-比色法，包括以下步驟稱取樣品加入硫酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀脂肪和蛋白質，過濾，調節濾液pH值為7.6，再次過濾，濾液加入過氧化物酶試劑溶液，定容，于470nm處測定吸光度，計算樣品中過氧化氫的含量。本發明的方法簡單、快捷、準確、干擾小。
文檔編號G01N21/78GK103091312SQ20131001185
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月14日 優先權日2013年1月14日
發明者宋薇 申請人:廈門譜尼測試有限公司