淋球菌ng檢測試劑盒的制作方法

            文檔序號:6177169閱讀:849來源:國知局
            專利名稱:淋球菌ng檢測試劑盒的制作方法
            技術領域
            本發明提供一種淋球菌(NG)檢測試劑盒,具體是一種基于熒光PCR的NG-DNA檢測試劑盒。
            背景技術
            奈瑟淋球菌(Neisseria gonorrheae, NG) 1879年由Neisser發現,俗稱淋病雙球菌或淋球菌,是引起人類淋病的致病病原體,屬奈瑟菌屬。淋球菌(NG)有嚴格的人類寄生性,對人體有較強的適應和侵襲能力,其主要致病物質包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖等,是發展中國家發病率較高的性傳播疾病之一。NG主要通過性接觸直接感染,也可以通過接觸患者的衣物或馬桶等間接感染,還可以通過產道感染分娩時的胎兒。淋病是世界上發病人數較多的性病之一,估計每年世界的患病人數大約有I億;在美國,據保守的估計,每年至少發生100萬例患者。我國在解放后不久淋病基本消滅,但是從1977年起淋病死灰復燃,并迅速蔓延到全國各地,在短短的幾年時間里報告病例數迅速攀升,至九十年代中期達到高峰,此后其發病水平開始緩慢回落,但仍然維持在較高水平。近年來,淋病的發病水平又呈上升的勢頭,在性傳播疾病中位居前列。由NG感染引起的疾病是性傳播疾病中的一種重要疾病,由于NG感染者臨床癥狀不典型,如何快速、準確的進行檢測,對疾病的診斷、治療和控制等有著十分重要的意義。目前淋球菌的實驗室診斷方法主要有分離培養法、涂片鏡檢法、免疫學方法、基于PCR技術的檢測方法等。分離培養法的操作簡單,特異性較高,被認為是診斷淋球菌的“金標準”,但是培養耗時比較長,同時敏感性較低,可能因病原微生物的量過少,或接種后病原微生物不成活而延誤病情。涂片鏡檢法簡便易行,價格低廉,但其特異性受取材、涂片、染色等各種因素的影響,且鏡下淋病雙球菌極易與其他的革蘭氏陰性雙球菌混淆,易發生誤診和漏診。免疫學方法主要包括酶聯吸附試驗和免疫膠體金技術,操作簡單且靈敏性優于培養法。近年來,聚核酶鏈式反應(`PCR)法漸漸顯現了其在檢測上的優勢,熒光PCR技術是基于傳統PCR技術并結合光譜技術而發展起來的一種更靈敏,更特異,更精確的核酸檢測技術。檢測結果準確,重復性高,能動態反應患者治療前、后病原體動態變化及與臨床的關系,且整個過程中避免了傳統PCR需后處理的問題,減少了污染。定量PCR的出現,打破PCR只能定性的局面,其中熒光定量PCR以其高靈敏度、高特異性、低污染率、實時監測等特點,可為臨床提供更加準確、客觀的檢測結果,并及時地了解病情及預后。運用PCR技術進行檢測主要涉及到兩個方面,核酸的提取和核酸的擴增檢測。目前國內臨床上主要采用煮沸法對淋球菌的核酸進行提取,具體是先將分泌物樣本濃縮、洗滌,再加裂解液,煮沸,高速離心,取上清為模板;該方法核酸提取過程較復雜,樣本處理耗時長,且在處理樣本時,經過煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個步驟,樣本中的DNA存在損耗,尤其對于高濃度的樣本,裂解不充分、富集不完全,會造成DNA的大量丟失導致樣本定量偏低,同時由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟,容易造成氣溶膠污;另外,對于濃縮這一步,不同廠家的濃縮效果不一樣,有的可以看到沉淀,有的無法看到,能看到沉淀是因為該步驟將核酸與蛋白都濃縮了,這樣會導致后面加入裂解液時很難充分混勻;無法看到沉淀的則使操作者無法確定吸棄上清時會不會吹打到核酸。臨床上檢測NG-DNA的方法目前主要是基于實時熒光定量PCR的技術及其改進,實時熒光定量PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術,使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴增儀,熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光,收集檢測熒光信號,通過檢測熒光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平,試驗結束后可通過軟件自動分析獲得擴增曲線,根據擴增曲線與熒光閾值線的交點(即Ct值)以及擴增曲線的形狀,可以判斷陰陽性結果;如果同一反應中有已知濃度的定量參考品或標準品,則可以通過軟件自動分析獲得標準曲線,由此實現對未知樣本的定值(即定量檢測)。與傳統的PCR相對比,其在反應體系中增加了一條兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時,熒光報告基團發出的熒光能量被淬滅基團吸收,呈現淬滅效應;如果擴增過程中有靶序列的存在,隨著目標片段的延伸,探針分子逐漸被Taq酶水解切斷,熒光報告基團與淬滅基團相互解離,阻斷了二者間熒光能量轉移效應,熒光報告基團發出的熒光信號被熒光檢測裝置收集。隨著擴增的進行,熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。試驗結束后,可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動分析數據,可以獲得陰陽性結果和樣本濃度的定值結果,因此,該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中,已逐漸取代傳統的PCR方法,得到十分廣泛的應用。目前國內外已有基于實時熒光定量PCR技術檢測NG-DNA的試劑盒應用于臨床檢測中,但這些試劑盒多半以煮沸法提取核酸,且其檢測靈敏度不高,約在50(Tl000COpies/ml左右;另外,這些試劑盒大多缺乏完善的質控體系,還需要進一步完善和提高技術水平,使此類產品更加滿足臨床準確診斷的需要。

            發明內容
            本發明提供一種核酸釋放劑在淋球菌NG檢測中的應用,所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) O. OI O. 5mM/L,氯化鉀20^300mM/L,十二烷基磺酸鈉O. OI 2%和乙醇
            O.05 1%。在本發明所述核酸釋放劑中,其溶劑可以為本領域常用的,例如為無菌水或TE緩沖液。本發明首次披露在淋球菌NG檢測中使用含強蛋白變性劑的核酸釋放劑,在很大程度上簡化了該核酸檢測的步驟,而且檢測靈敏度有了很大的提高。本發明提供一種淋球菌NG檢測試劑盒,所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液,所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L,十二烷基磺酸鈉O. 0Γ2%和乙醇O. 05^1% ;所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游弓I物和用于靶多核苷酸檢測的探針。使用本發明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測結果沒有明顯差異,而本發明中提取核酸時采用強烈的蛋白變性劑,快速破壞病原體外殼蛋白結構,釋放出病原體核酸,無需加熱即可完成DNA的釋放和提取;本發明試劑盒檢測淋球菌NG的靈敏度可達400copies/ml,檢測線性范圍為400 4. 00E+10copies/ml。具體地,用于靶多核苷酸的探針序列為5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’;優選用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分別為5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’和5’ -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3’。本發明的試劑盒因采用用于檢測靶多核苷酸的上述引物和/或探針序列,具有很好的特異性。本發明中,優選所述試劑盒中還包括內標,所述內標的序列為5’_GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。本發明中所述內標為插入PUC18T載體的一段長為97堿基對的人工合成DNA序列的重組體,即質粒,它作為PCR擴增體系中的陽性內對照,預防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質導致的假陰性。在所述試劑盒中包含內標的情況下,所述PCR反應液中還包括用于內標檢測的上游引物、下游引物和探針;且優選內標探針的序列為5’ -TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’ 。優選本發明所述試劑盒中還包括酶混合液,所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和O. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶),同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產物,利用UNG酶和PCR反應液中的dUTP可以起到預防PCR產物污染的作用,從而防止樣本檢測假陽性。在一個具體實施方式
            中,所述試劑盒中還包括NG陽性對照、NG陰性對照和NG定
            量參考品O本發明還提供一種淋球菌檢測試劑盒,所述試劑盒中包括PCR反應液,所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針,且用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分別為5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’和5, -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3,。本發明又提供一種淋球菌檢測試劑盒,所述試劑盒中包括PCR反應液,所述PCR反應液中包含用于靶多核苷 酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針,且用于靶多核苷酸的探針序列為5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’。本發明還具體提供一種淋球菌檢測試劑盒,所述試劑盒中包括核酸釋放劑、PCR反應液、內標、酶混合液、NG陽性對照、NG陰性對照和NG定量參考品;且所述核酸釋放劑中包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L,十二烷基磺酸鈉O. θΓ2%,乙醇
            O.05^1%和溶劑TE緩沖液;所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增和檢測的上游引物、下游引物和探針,用于內標擴增和檢測的上游引物、下游引物和探針,10XPCR反應緩沖液,脫氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸dNTP ;所述內標為插入PUC18T載體的一段長為97堿基對的人工合成DNA序列的重組體;所述酶混合液中包含DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。本發明提供的NG熒光PCR檢測試劑盒操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測范圍寬,應用該試劑盒可以對生殖道分泌物等未知樣本中的NG-DNA進行快速準確的檢測,為診斷淋球菌感染提供可靠的實驗依據。其檢測結果可用于NG感染的輔助診斷以及藥物療效的觀察,為性病的早期診斷以及性病高危人群的初篩提供分子診斷依據。


            圖1中①為實施例中淋球菌NG-DNA檢測結果為陽性的待測樣本的擴增曲線,圖1中②為實施例中NG-DNA檢測結果為陰性的待測樣本的擴增曲線。
            具體實施例方式以下僅為本發明的優選實施方式,本發明的保護范圍并不局限于此,任何本領域的技術人員在本發明公開的技術范圍內,可很容易進行的改變或變化都涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此,本發明的保護范圍應以權利要求書的保護范圍為準。實施例1本實施例提供一種具體的淋球菌熒光PCR檢測試劑盒,它包括如下組分①核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin) O.1mM/L,氯化鉀100mM/L,十二燒基磺酸鈉(SDS) O. 1%, O. 1% 的乙醇。②內標(陽性內對照)為插入PUC18T載體的一段長為97堿基對的人工合成DNA序列的重組體,即質粒,濃度為5. 00E+05copies/ml,97堿基對的序列為5’ -GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。③PCR反應液包括10XPCR反應緩沖液5 μ 1,O. 2mmol/L的dNTP,用于靶多核苷酸擴增的上、下游引物均為O. 3 μ mol/L,用于靶多核苷酸檢測的探針為O. 3 μ mol/L,用于內標片段擴增的上下游引物均為O. 3 μ mol/L,用于檢測內標的探針為O.1 μ mol/L。其中,所述10XPCR反應緩沖液為包括pH7. 5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0. 2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液;所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP ;所述用于靶多核苷酸擴增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測的探針是源于淋球菌核酸的保守區域的引物和探針,其堿基序列分別為上游引物5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’ ;下游引物5’ -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3’ ;探針5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATA GGGCTTG-3 ’ ;所述的用于檢測內標的引物探針序列分別為上游引物5’ -GTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’ ;下游引物5’ -ACAAACGGGCAACATACCTTG-3’ ;探針5’-TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’ 。④酶混合液包含5U/ μ I的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和IU/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。⑤NG定量參考品來源于使用NG企業定量線性參考品Lf L5定值后的NG強陽性質粒,該淋球菌定量參考品包括Α、B、C、D四個濃度組成的梯度參考品,其濃度分別為 4. 00E+07copies/ml (Α)、4· 00E+06copies/ml (Β)、4· 00E+05copies/ml (C)、4.00E+04copies/ml (D)0⑥NG陽性對照為臨床醫院收集的NG強陽性樣本,其濃度為4. 00E+05copies/ml ο⑦NG陰性對照不含有淋球菌、單純皰疹病毒、沙眼衣原體、解脲脲原體以及人乳頭瘤病毒等的滅活陰性臨床樣本。實施例2本實施例提供上述實施例1所述試劑盒用于檢測生殖道分泌物等未知樣本中NG-DNA的操作步驟一、試劑準備根據待測樣本、NG陰性對照、NG陽性對照以及NG定量參考品Al的數量,按比例取相應量的PCR反應液(38 μ I/人份)、酶混合液(2 μ I/人份)及內標1. O μ I/人份,充分混勻成PCR-mix,例如待測樣本為3人份時,一共需配制9人份(上述四者的人份數分別為3、1、I和4)的PCR-mix ;瞬時離心后備用。二、樣本處理1.方法A :樣本直接快速核酸釋放每個PCR反應管中加入核酸釋放劑2 5μ I (建議深吸淺打,避免出現氣泡),各管依次加入待測樣本、NG陰性對照、NG陽性對照及NG定量參考品A D各3飛μ 1,吸打3飛次混勻(輕輕吸打,避免出現氣泡);間隔10分鐘以上,每管加入ΡΟ -π Χ4(Γ45μ 1,吸打混勻2-3次,蓋上管蓋(去除氣泡后),2000rpm離心30秒。2.方法B :樣本經高速離心濃縮后核酸釋放取20(Γ500 μ I待測樣本,13,OOOrpm離心5分鐘后吸棄上清,加入20^50 μ I核酸釋放劑,靜置10分鐘后,備用;每個PCR反應管加入上述經預處理的待測樣本、NG陰性對照、NG陽性對照及NG定量參考品A D各5 10 μ I ;每個PCR反應管加入PCR_mix4(T45 μ 1,蓋上管蓋(去除氣泡后),2000rpm離心30秒。三、熒光PCR反應與結果分析(在熒光定量PCR擴增儀上進行)I)將PCR反應管放入擴增儀樣品槽,按對應順序設置待測樣本名稱及定量參考品濃度。2)突光檢測通道選擇選擇FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )檢測NG ;選擇 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher:None)檢測內標;參比突光(PassiveReference)設置為 none。

            3)熒光定量PCR反應條件見表1:表I
            權利要求
            1.一種核酸釋放劑在淋球菌NG檢測中的應用,所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)O. θΓθ. 5mM/L,氯化鉀 2(T300mM/L,十二烷基磺酸鈉 O. 01 2% 和乙醇 O. 05 1%。
            2.一種淋球菌NG檢測試劑盒,所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液,所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L,十二烷基磺酸鈉0. Of 2%和乙醇0. 05^1% ;所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針。
            3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒,其特征在于,用于靶多核苷酸的探針序列為5’-CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’。
            4.根據權利要求2所述的檢測試劑盒,其特征在于,用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分別為5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’ 和 5’ -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3’。
            5.根據權利要求2 4中任意一項所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒中還包括內標,所述內標序列為 5,-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3,。
            6.根據權利要求5所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述PCR反應液中還包括用于內標檢測的上游引物、下游引物和探針;且內標探針的序列為5’ -TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3,。
            7.根據權利要求2 4中任意一項所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述試劑盒中還包括酶混合液,所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶),同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。
            8.根據權利要求廣4中任意一項所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述試劑盒中還包括NG陽性對照、NG陰性對照和NG定量參考品。
            9.一種淋球菌檢測試劑盒,所述試劑盒中包括PCR反應液,所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針,且用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分別為5 ’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3 ’和5, -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3,。
            10.一種淋球菌檢測試劑盒,所述試劑盒中包括PCR反應液,所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針,且用于靶多核苷酸的探針序列為 5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’。
            全文摘要
            本發明提供一種淋球菌(NG)檢測試劑盒,所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液,所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01~0.5mM/L,氯化鉀20~300mM/L,十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1%;所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針。使用本發明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法的檢測結果沒有明顯差異,而本發明中提取核酸時采用強烈的蛋白變性劑,快速破壞病原體外殼蛋白結構,釋放出病原體核酸,無需加熱即可完成DNA的釋放和提取;本發明試劑盒檢測NG的靈敏度可達400copies/ml,檢測線性范圍為400~4.00E+10copies/ml;應用該試劑盒可以對生殖道分泌物等未知樣本中的NG-DNA進行快速準確的檢測,為診斷淋球菌感染提供可靠的實驗依據。
            文檔編號G01N21/64GK103060453SQ20131000907
            公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月10日 優先權日2013年1月10日
            發明者戴立忠, 鄧中平, 李勃 申請人:湖南圣湘生物科技有限公司
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