專利名稱：長柱金絲桃藥材hplc指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于中藥質量控制標準技術領域，涉及一種中藥材指紋圖譜的建立方法，尤其是長柱金絲桃高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜和應用。
背景技術：
中藥指紋圖譜特指中藥樣本經光譜或色譜等現代分析技術得到的中藥各組分群體特征的圖譜的圖象。目前指紋圖譜已成為國內外公認的鑒別中藥品種和評價中藥質量的最有效的手段之一。美國食品藥品管理局在1996年制定的中，要求對植物原料、植物藥中間品和植物藥產品提供相應的《FDA關于植物制品的指南》指紋圖譜。英國草藥典、印度草藥典以及加拿大藥用及芳香植物學會、德國藥用植物學會液接受色譜指紋圖譜。中國國家藥品監督管理部門于2000年發布了《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》，明確要求對新申報的中藥注射劑和已上市的中藥注射劑實行指紋圖譜標準。中藥指紋圖譜經過了數十年的研究，使用了包括紫外、紅外、氣相、高效液相、薄層、核磁共振、掃描電子顯微鏡、計算機圖像分析、電泳技術、同工酶分析法、分子生物學技術、聚類分析技術等許多現代分析測試手段，為中藥的物質鑒定和成分分析積累了大量的數據。但從中藥全面質量控制的角度看，還遠未達到有效地反應和控制中藥的整體質量的目的。高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜在國際上容易獲得認可，包括美國、英國、法國、加拿大、德國、日本和印度在內的許多國家更愿意接受HPLC指紋圖譜。因此，為中藥材建立相應的HPLC指紋圖譜，是現階段控制中藥內在質量的有效手段之一。長柱金絲桃(Hypericum ascyron L.)又名紅旱蓮,為藤黃科金絲桃屬植物黃海棠的干燥地上部分，以全草入藥，別名湖南連翹、黃海棠，收載于《全國中草藥匯編》，性寒，味微苦。具有涼血止血、清熱解毒。用于治療出血、跌打損傷、瘡癤腫毒、肝炎等癥。現代藥理研究表明長柱金絲桃具有平喘，止咳，祛痰的作用。目前，人們對長柱金絲桃的質量控制還只限于對其諸多組分中的某個有效成分或指標性成分進行定性、定量分析，缺乏全面反映長柱金絲桃質量標準的控制手段。通過檢索，尚未發現與本發明申請相關的專利公開文獻。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種方法簡單、易于操作、穩定性和重現性良好的長柱金絲桃高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜，該方法及標準指紋圖譜可應用于長柱金絲桃藥材的真偽的鑒別和質量控制中。本發明實現目的的技術方案是:一種長柱金絲桃藥材HPLC指紋圖譜的建立方法，步驟如下:⑴供試品溶液的制備:取長柱金絲桃陰干全草粉碎成粗粉，采用超聲萃取法提取長柱金絲桃中的總黃酮，在超生功率700W，乙醇濃度60%，料液比為1:30的條件下，超生30min，離心，取上清液作為供試品溶液；⑵指紋圖譜的制作:色譜分離柱填料為5 μ m Kromasil_C18, 250X4.6mm ;流動相為水-乙腈；采用梯度洗脫的方式:0min — 5min, 5min — IOmin, IOmin — 15min,15min — 30min，30min — 60min，60min — 90min,乙腈 5% — 10%, 10% — 15%, 15% — 17%,17%— 17%, 17% —25%，25% —45% ;流速0.8 1.0ml/min ;檢測波長 275nm ;柱溫 25 35°C，在此條件下分析供試品溶液，得到長柱金絲桃藥材的指紋圖譜；⑶標準指紋圖譜的確定:按照本發明提供的方法，對擴13批長柱金絲桃藥材建立了 HPLC指紋圖譜，通過分析比較，確定了 26個共有特征峰，其保留時間分別為:3.734min,10.577min,13.21Omiη，15.43Omiη，17.263min,18.197min,19.457min,20.81Omin，21.69Omin，22.378min，26.799min，27.84Imin，32.829min，38.435min，46.334min，48.764min,51.484min,52.485min，56.275min，59.479min，61.069min，64.092min，66.858min，67.513min，76.489min，78.637min，這些共有特征峰構成了長柱金絲桃藥材的指紋特征，可作為長柱金絲桃藥材的標準指紋圖譜。如上所述的建立方法在長柱金絲桃藥材的真偽的鑒別和質量控制中的應用。如上所述的建立方法所得到的柱金絲桃藥材HPLC標準指紋圖譜在長柱金絲桃藥材的真偽的鑒別和質量控制中的應用。本發明的優點和有益效果為:1、本發明長柱金絲桃藥材標準指紋圖譜將長柱金絲桃藥材作為一個整體對待，通過比較其共有特征峰可以找出不同藥材之間的細微差異，因此適于對長柱金絲桃藥材的真偽的鑒別和質量控制，保證了長柱金絲桃藥材質量的穩定、均一和可控。2、本發明制備方法所采用的供試品制備簡單，高效液相色譜條件易于實現，因此方法簡單、易于操作；而且，該方法的精密度、穩定性和重現性良好、特征峰多、準確可靠，所建立的指紋圖譜能夠有效的表征長柱金絲桃藥材的質量。
圖1為本發明的長柱金絲桃藥材的HPLC標準指紋圖譜，其中，從左到右分別為其26個共有的特征峰。圖2為本發明的10批長柱金絲桃藥材的HPLC指紋圖譜。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。如無特殊說明，本發明中所使用的試劑為常規試劑；如無特殊說明，所使用的方法為常規方法。長柱金絲桃藥材HPLC指紋圖譜的建立方法，步驟如下:1、供試品溶液的制備:取長柱金絲桃藥材陰干，全草粉碎成粗粉，過60目分析篩，采用超聲萃取法提取長柱金絲桃藥材中的總黃酮，在超生功率700W，乙醇濃度60%，料液比(g: ml)為1:30的條件下,超生30min, 5000rpm離心IOmin,取上清液作為供試品溶液；2、高效液相色譜分析:色譜分離柱填料為5 μ m Kromasil-C18, 250X4.6mm ;流動相為水-乙腈；采用梯度洗脫的方式:Omin — 5min, 5min — IOmin, IOmin — 15min,15min — 30min，30min — 60min，60min — 90min,乙腈 5% — 10%, 10% — 15%, 15% — 17%,17%— 17%, 17% — 25%，25% — 45% ;流速 0.8 1.0ml/min ;檢測波長 275nm ;柱溫 25 35°C。
在此條件下分析供試品溶液，得到長柱金絲桃藥材的指紋圖譜。3、按照本發明提供的方法，對10批長柱金絲桃藥材(10批長柱金絲桃采樣地點為內蒙古海拉爾，采樣時間為2008年7月，8月；2009年7月，8月；2010年7月，8月；2011年7月，8月；2012年7月，8月)建立了 HPLC指紋圖譜，該10批長柱金絲桃藥材的10項指紋圖譜見附圖2，通過分析比較，確定了 26個共有特征峰，其保留時間分別為:3.734min,10.577min,13.21Omin，15.43Omin，17.263min，18.197min，19.457min,20.81Omin，21.69Omin，22.378min，26.799min，27.84Imin，32.829min，38.435min，46.334min，48.764min,51.484min,52.485min,56.275min,59.479min,61.069min,64.092min,66.858min，67.513min，76.489min，78.637min，這些共有特征峰構成了長柱金絲桃藥材的指紋特征，可作為長柱金絲桃藥材的標準指紋圖譜。通過檢測，該長柱金絲桃藥材HPLC指紋圖譜的建立方法的精密度的相對保留時間的RSD < 0.73%，相對保留峰面積的RSD < 4.96% ;穩定性的相對保留時間的RSD <
4.29%，相對保留峰面積的RSD < 4.83%;重現性的相對保留時間的RSD < 4.16%，相對保留峰面積的RSD < 4.98%。由此可見，該方法的精密度、穩定性和重現性良好。本發明長柱金絲桃高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜可以應用于長柱金絲桃藥材的真偽的鑒別和質量控制中。
權利要求
1.一種長柱金絲桃藥材HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于:步驟如下: ⑴供試品溶液的制備:取長柱金絲桃陰干全草粉碎成粗粉，采用超聲萃取法提取長柱金絲桃中的總黃酮，在超生功率700W，乙醇濃度60%，料液比為1:30的條件下，超生30min，離心，取上清液作為供試品溶液； ⑵指紋圖譜的制作:色譜分離柱填料為5 μ m Kromasil-C18, 250 X 4.6mm；流動相為水-乙腈；采用梯度洗脫的方式:0min — 5min, 5min — IOmin, IOmin — 15min,15min — 30min，30min — 60min，60min — 90min,乙腈 5% — 10%, 10% — 15%, 15% — 17%,17%— 17%, 17%—25%，25% —45% ;流速0.8 1.0ml/min ;檢測波長 275nm ;柱溫25 35°C，在此條件下分析供試品溶液，得到長柱金絲桃藥材的指紋圖譜； ⑶標準指紋圖譜的確定:按照本發明提供的方法，對擴13批長柱金絲桃藥材建立了HPLC指紋圖譜，通過分析比較，確定了 26個共有特征峰，其保留時間分別為:3.734min,10.577min,13.21Omiη，15.43Omin，17.263min，18.197min,19.457min,20.81Omin，21.690min，22.378min，26.799min，27.84Imin，32.829min，38.435min，46.334min，48.764min,51.484min,52.485min,56.275min,59.479min,61.069min,64.092min,66.858min，67.513min，76.489min，78.637min，這些共有特征峰構成了長柱金絲桃藥材的指紋特征，可作為長柱金絲桃藥材的標準指紋圖譜。
2.按權利要求1所述的建立方法在長柱金絲桃藥材的真偽的鑒別和質量控制中的應用。
3.按權利要求1所述的建立方法所得到的柱金絲桃藥材HPLC標準指紋圖譜在長柱金絲桃藥材的真偽的鑒別和質量控制中的應用。
全文摘要
本發明涉及長柱金絲桃藥材HPLC指紋圖譜的建立方法，包括供試品溶液的制備、色譜條件的選擇，通過對10批次長柱金絲桃藥材HPLC指紋圖譜的對比，確定其共有指紋特征峰，得到長柱金絲桃藥材的標準指紋圖譜。本發明長柱金絲桃藥材標準指紋圖譜將長柱金絲桃藥材作為一個整體對待，通過比較其共有特征峰可以找出不同藥材之間的細微差異，因此適于對長柱金絲桃藥材的真偽的鑒別和質量控制，保證了長柱金絲桃藥材質量的穩定、均一和可控。
文檔編號G01N30/88GK103091439SQ20131000443
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月7日 優先權日2013年1月7日
發明者張同存, 李秀梅, 羅學剛, 王楠, 周采菊, 馬寧, 李琨, 廖興華 申請人:天津科技大學