用于檢測多特異性結合物的游離結合搭檔的方法

用于檢測多特異性結合物的游離結合搭檔的方法
【專利摘要】本文報道了用于檢測樣品中的多特異性抗體的游離抗原的方法，從而待檢測的抗原能夠被多特異性抗體的第一結合位點特異性結合，包括孵育包含游離抗原和多特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體的步驟，所述抗獨特型抗體特異性結合多特異性抗體的不同于第一結合位點的第二結合位點，從而從樣品中耗盡了多特異性抗體。
【專利說明】用于檢測多特異性結合物的游離結合搭檔的方法
[0001]本發明涉及用于檢測樣品中的游離的(即，未復合的)結合搭檔的方法，所述結合搭檔(binding partner)可以被樣品中的多特異性結合物(multispecific binder)特異性結合，其中在檢測游離的結合搭檔之前，從樣品中耗盡了與多特異性結合物結合的結合搭檔。
_2] 發明背景
[0003]含有抗體的標準固相免疫測定涉及在固相上吸附/固定的抗體(捕獲抗體)、抗原和針對與酶或可檢測的標記(示蹤抗體)綴合的抗原的另一表位的抗體之間形成復合物。在測定中，形成夾心物(sandwich):固相/捕獲抗體/抗原/示蹤抗體。在夾心物等催化的反應中，抗體-綴合酶的活性與孵育基質中的抗原濃度成比例。抗獨特型抗體測定提及在例如 US5, 219，730 ；W0 87/002778 ；EP O 139 389 和 EP O 170 302 中。ffadhwa,M.等人(J.1mmunol.Methods278 (2003) 1-17)報道了用于檢測、測量和表征由生物治療劑誘導的不理想抗體的對策。EP I 917 854中報道了用于生產抗獨特型抗體的方法。
[0004]Chen, Y.-P.等人(Clin.Vac.1mmunol.14(2007)720-725)報道了通過同時針對人紅細胞和乙肝病毒表面抗原的雙特異性雙抗體介導的凝集測定快速檢測乙肝病毒表面抗原。Bruynck，A.等人(J.Cancer67 (1993) 436-440)報道了用于癌癥治療的人源化雙特異性單克隆抗體的特征。在WO 2006/096697中，報道了用于確定蛋白質二價和抗體治療劑的方法。
[0005]發明概沭
[0006]本文報道了用于檢測游離的(即，未復合的)結合搭檔的存在，和/或用于確定游離的(即，未復合的)結合搭檔的量的方法，所述結合搭檔可以特異性通過多特異性結合物的至少一個結合特異性結合。已發現，在確定游離結合搭檔的存在或量之前，從樣品中耗盡被多特異性結合物特異性結合的結合搭檔，即，結合搭檔-多特異性結合物-復合物，是有利的。根據本文報道的方法，多特異性結合物的耗盡是通過孵育樣品與單特異性結合物實現的，所述單特異性結合物特異性結合多特異性結合物的一個結合特異性，從而單特異性結合物特異性結合多特異性結合物的結合特異性，所述多特異性結合物不結合待確定的結合搭檔(參見圖2)。
[0007]本文報道的一個方面是用于體外確定結合搭檔(抗原、靶和被分析物)的存在和/或量的方法，所述結合搭檔可以被多特異性結合物的第一結合特異性特異性結合，其中在檢測結合搭檔之前，通過孵育樣品和單特異性結合物，耗盡了與多特異性結合物結合的結合搭檔，其中單特異性結合物特異性結合多特異性結合物的第二結合特異性。
[0008]在一個實施方案中，待檢測的結合搭檔是未復合的結合搭檔或游離結合搭檔。
[0009]因此，本文報道的一個方面是用于確定多特異性結合物的結合搭檔的存在和/或量的體外方法，使得多特異性結合物的第一結合特異性可以特異性結合結合搭檔，包括步驟:
[0010]-孵育包含結合搭檔和多特異性結合物的樣品與單特異性結合物，所述單特異性結合物特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性結合物的第二結合特異性。[0011]在一個實施方案中，方法包括步驟:
[0012]-孵育包含結合搭檔和多特異性結合物的樣品與單特異性結合物，所述單特異性結合物特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性結合物的第二結合特異性，和
[0013]-確定耗盡多特異性結合物的樣品中的結合搭檔的量。
[0014]在一個實施方案中，方法包括步驟:
[0015]-孵育包含結合搭檔和多特異性結合物的樣品與單特異性結合物，所述單特異性結合物特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性結合物的第二結合特異性，
[0016]-在確定游離的結合搭檔的存在或量之前，從樣品中耗盡單特異性結合物-多特異性結合物-復合物，
[0017]-確定耗盡多特異性結合物的樣品中的結合搭檔的量。
[0018]隨著與特異性結合多特異性結合物的第二結合特異性的單特異性結合物孵育，從樣品中去除了多特異性結合物。同時，還從樣品中去除了結合搭檔-多特異性結合物-復合物。
[0019]在一個實施方案中，多特異性結合物選自抗體、包含抗體或抗體片段和非抗體多肽的融合多肽、包含抗體或抗體片段和可溶性受體的融合多肽，或包含抗體或抗體片段和肽類結合分子的融合多肽。
[0020]在一個實施方案中，多特異性結合物是抗體。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體、或三特異性抗體、或四特異性抗體、或五特異性抗體、或六特異性抗體。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體。
[0021]在一個實施方案中，單特異性結合物是抗獨特型抗體。
[0022]在一個實施方案中，結合特異性是結合位點或一對抗體重鏈可變結構域和抗體輕鏈可變結構域。
[0023]在一個實施方案中，抗獨特型抗體與固相結合。
[0024]在一個實施方案中，抗獨特型抗體是生物素化的，且固相包被了鏈霉抗生物素。在一個實施方案中，固相是是包被了鏈霉抗生物素的順磁珠或包被了鏈霉抗生物素的瓊脂糖珠。
[0025]本文報道的一個方面是使用免疫測定，免疫學確定樣品中的多特異性結合物的結合搭檔的存在和/或量的方法，其中在確定結合搭檔之前，從樣品中耗盡多特異性結合物。
[0026]在本文報道的所有方面的一個實施方案中，結合搭檔是游離的結合搭檔，即，沒有與多特異性結合物結合或復合的結合搭檔。
[0027]在一個實施方案中，抗獨特型抗體是針對多特異性結合物的生物素化的抗獨特型抗體，并通過鏈霉抗生物素與固相綴合。
[0028]在本文報道的方法的一個實施方案中，抗獨特型抗體是包含至少兩種抗獨特型抗體的混合物，所述抗獨特型抗體在它們與固相綴合的抗體位點中不同。
[0029]在一個實施方案中，抗體與其綴合搭檔的綴合是通過化學結合來實施的，所述化學結合經由N-末端和/或ε -氨基(賴氨酸)，不同賴氨酸的ε -氨基，藥物抗體的氨基酸骨架的羧基_、巰基_、羥基-和/或酚-官能團，和/或藥物抗體的碳水化合物結構的糖醇基。
[0030]在一個實施方案中，抗獨特型抗體混合物包含通過至少兩種不同的氨基與固相綴合的抗獨特型抗體。這類通過不同氨基的偶聯可以通過如下實施:第一步，ε-氨基的一部分與化學保護劑酰基化，例如通過朽1康酰化(citraconylat1n)。在第二步,通過剩余氨基實施綴合。之后，去除檸康酰化作用，抗體通過剩余的游離氨基與固相綴合，即，獲得的抗體通過未被檸康酰化保護的氨基與固相綴合。合適的化學保護劑在未保護的側鏈胺上形成鍵，與N-末端的鍵不同且較不穩定。許多這類化學保護劑是已知的(參見例如EP O 651761)。在一個實施方案中，化學保護劑包括環狀二羧酸酸酐，例如馬來酸酐或檸康酸酐。
[0031]在一個實施方案中，抗獨特型抗體通過被動吸附與固相綴合。被動吸附是例如Butler, J.E.在 “Solid Phases in Immunoassay，，(1996) 205-225 和 Diamandis, Ε.P.和Christopoulos, Τ.K.(編者)在 “ Immunoassays” (1996) Academic Press (San Diego)中描述的。
[0032]在一個實施方案中，抗獨特型抗體通過特定的結合對綴合(固定)。在一個實施方案中，這類結合對(第一組分/第二組分)選自鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、抗體 / 抗原(參見例如，Hermanson, G.T.等人，B1conjugate Techniques, AcademicPress (1996))、凝集素/多糖、類固醇/類固醇結合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。在一個實施方案中，抗獨特型抗體與生物素綴合，且通過固定的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素實施固定。
[0033]本文報道的一個方面是用于確定樣品中的多特異性抗體的抗原的存在和/或量的體外方法，其中待檢測的抗原可以被多特異性抗體的第一結合特異性可以特異性結合，包括步驟:
[0034]-孵育包含多特異性抗體、結合多特異性抗體的抗原和游離抗原的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性。
[0035]在一個實施方案中，方法包括步驟:
[0036]-孵育包含抗原和多特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性，和
[0037]-確定耗盡多特異性抗體的樣品中的抗原的量。
[0038]在一個實施方案中，方法包括步驟:
[0039]-孵育包含抗原和多特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性，
[0040]-在確定游離抗原的存在或量之前，從樣品中耗盡抗獨特型抗體-多特異性抗體-復合物，
[0041]-確定耗盡多特異性抗體的樣品中的抗原的量。
[0042]隨著與特異性結合多特異性抗體的第二結合特異性的抗獨特型抗體孵育，從樣品中去除多特異性抗體。同時還從樣品中去除抗原-多特異性抗體-復合物。
[0043]在一個實施方案中，樣品包含多特異性抗體、游離抗原和多特異性抗體-抗原復合物，且檢測多特異性抗體的游離抗原。
[0044]在一個實施方案中，抗獨特型抗體與順磁珠綴合。
[0045]在一個實施方案中，抗獨特型抗體與固相綴合。
[0046]在一個實施方案中，抗獨特型抗體是生物素化的，且固相包被了鏈霉抗生物素。在一個實施方案中，固相是包被了鏈霉抗生物素的順磁珠或包被了鏈霉抗生物素的瓊脂糖珠。
[0047]在一個實施方案中，抗獨特型抗體與多特異性抗體的第二結合特異性具有15I/mol*s或更高的解離常數ka。
[0048]在一個實施方案中，抗獨特型抗體對于與多特異性抗體的第二結合特異性的結合具有5*1-8Hi01/1或更低的Kd值。
[0049]在一個實施方案中，結合特異性是結合位點。在一個實施方案中，結合位點是一對抗體重鏈可變結構域和抗體輕鏈可變結構域。
[0050]在一個實施方案中，與抗獨特型抗體孵育約10分鐘至約36小時。
[0051]在一個實施方案中，調整樣品至多特異性抗體濃度為約2 μ g/ml至約15 μ g/ml。
[0052]在一個實施方案中，調整樣品至總抗原濃度為約lng/ml至約250ng/ml。
[0053]在一個實施方案中，方法包括下列步驟:
[0054]-孵育包含多特異性抗體、多特異性抗體結合的抗原和游離抗原的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性，以形成抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，和
[0055]-從樣品中去除抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物。
[0056]在一個實施方案中，抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物是抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物和抗獨特型抗體-多特異性抗體-抗原復合物的混合物。
[0057]在一個實施方案中，方法包括下列步驟:
[0058]-孵育包含抗原和多特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性，從而形成抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，
[0059]-從樣品中去除抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，和
[0060]-確定耗盡了多特異性抗體的樣品中的抗原的量。
[0061]在一個實施方案中，確定抗原的量包括下列步驟:
[0062]-孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，所述捕獲抗體特異性結合抗原，形成捕獲抗體-抗原復合物，和
[0063]-關聯所形成的捕獲抗體-抗原復合物與樣品中的抗原的量。
[0064]在一個實施方案中，確定抗原的量包括以下步驟:
[0065]-孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，所述捕獲抗體特異性結合抗原，形成捕獲抗體-抗原復合物，
[0066]-孵育捕獲抗體-抗原復合物與示蹤抗體，使捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上的不重疊表位，和
[0067]-關聯所形成的捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量。
[0068]在一個實施方案中，確定抗原的量包括以下步驟:
[0069]-孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，所述捕獲抗體特異性結合抗原，形成捕獲抗體-抗原復合物，
[0070]-孵育捕獲抗體-抗原復合物與示蹤抗體，使捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上的不重疊表位，[0071 ]-孵育捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與包含可檢測的標記的檢測抗體，使檢測抗體在示蹤抗體的可變結構域外的表位上特異性結合示蹤抗體，和
[0072]-關聯所形成的捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量。
[0073]在一個實施方案中，多特異性抗體是具有第一結合特異性和并且具有第二結合特異性的雙特異性抗體，所述第一結合特異性特異性結合第一抗原或抗原上的第一表位，所述第二結合特異性特異性結合第二抗原或抗原上的第二表位。
[0074]本文報道的一個方面是特異性結合多特異性抗體的第一結合特異性的抗獨特型抗體的用途，用于從樣品中耗盡與多特異性抗體的第二結合特異性結合的抗原。
[0075]發明詳沭
[0076]本文報道了用于預處理樣品，檢測臨床前和臨床樣品中的多特異性結合物的“游離結合搭檔”的體外方法，所述多特異性結合物例如雙特異性抗體/藥物。
[0077]已發現在檢測游離的結合搭檔之前，必須從樣品中耗盡多特異性結合物。
[0078]本文報道了特異性結合治療性多特異性抗體的結合特異性的抗獨特型抗體的用途，用于確定多特異性治療性抗體的抗原的水平，所述抗原能夠但是不被多特異性治療性抗體的不同的第二結合特異性結合。抗獨特型抗體用于從樣品中耗盡多特異性抗體和多特異性抗體-待檢測抗原-復合物。
[0079]因此，本文報道了用于確定多特異性結合物的游離結合搭檔(抗原、靶和被分析物)的體外方法，所述游離結合搭檔可以被多特異性結合物的第一結合特異性特異性地結合，其中在確定游離結合搭檔之前，通過孵育樣品和特異性結合多特異性結合物的第二結合特異性并且隨之從樣品中耗盡多特異性結合物和多特異性結合物-結合搭檔-復合物的單特異性結合物，從樣品中耗盡多特異性結合物，其中第二結合特異性不同于第一結合特異性。
[0080]確定總抗原、雙特異性抗體-結合的抗原和游離抗原有助于監控治療性抗體的療法。總抗原代表游離的和雙特異性抗體-結合的抗原的總和。
[0081]在下文中，用這樣的多特異性抗體和抗原示例本文報道的方法，作為多特異性結合物的實施方案，所述多特異性抗體特異性結合多種抗原或相同抗原上的多個表位，作為結合搭檔的實施方案，所述抗原被多特異性抗體的一個結合特異性特異性的結合。
[0082]本文中的術語“抗體”是廣義使用的，涵蓋了各種抗體結構，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要其表現出理想的抗原結合活性。
[0083]在某些實施方案中，抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同的位點具有結合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中，一個結合特異性是針對第一抗原的，另一個結合特異性是針對不同的第二抗原的。在某些實施方案中，雙特異性抗體可以結合相同抗原的2個不同的表位。雙特異性抗體可以被制備為全長抗體或抗體片段。在一個實施方案中，抗體是特異性結合第一和第二抗原的雙特異性抗體。在一個實施方案中，雙特異性抗體具有i)特異性結合第一抗原或抗原上的第一表位的第一結合特異性，和ii)特異性結合第二抗原或相同抗原上的第二表位的第二結合特異性。在一個實施方案中，相同抗原上的第二表位是不重疊的表位。
[0084]多特異性抗體描述在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792 或 WO2010/145793 中。
[0085]“抗體片段”指不同于完整抗體的分子，所述分子包括完整抗體的一部分，該部分結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’ -SH、F(ab' )2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv);和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0086]抗體的“類”指抗體重鏈具有的恒定結構域或恒定區的類型。有五大類抗體:1gA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中若干可進一步分為亞類(同種型)，例如IgG” IgG2' IgG3' IgG4'IgA1和18?。與不同類型的免疫球蛋白對應的重鏈恒定結構域分別被稱為α、δ、ε、Y和μ。
[0087]術語“游離抗原”表示這樣的抗原，其可以被抗體的結合特異性特異的結合，但目前還沒有結合該結合特異性。在一個實施方案中，游離抗原是未結合抗體的抗原或未與抗體復合的抗原。
[0088]術語“Fe-區”在本文中用于定義免疫球蛋白重鏈的C-末端區域，其含有恒定區的至少一部分。術語包括天然序列Fe-區和變體Fe-區。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fe-區從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基末端。然而,Fe-區的C-末端賴氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外說明，否則Fe-區或恒定區的氨基酸殘基編號是根據EU編號系統的，也被稱為 EU 指數，如 Kabat, Ε.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版，Public Health Service, Nat1nal Institutes of Health, Bethesda,MD(1991)，NIHPublicat1n91-3242。
[0089]“框架”或“FR”指除超變區(HVR)殘基以外的可變結構域殘基。可變結構域的FR一般由4個FR結構域組成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般出現在VH(或VL)的下列序列中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
[0090]“人抗體”是具有這樣的氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列對應于由人或人細胞生產的抗體的氨基酸序列，或源自利用人抗體儲庫或其他人抗體編碼序列的來自非人來源的抗體的氨基酸序列。人抗體的這一定義具體排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
[0091]“人源化”抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個，通常2個可變結構域，其中所有的或基本上所有的HVR(例如CDR)對應于非人抗體的HVR，而所有的或基本上所有的FR對應于人抗體的FR。人源化抗體任選的可包括至少一部分源自人抗體的抗體恒定區。抗體的“人源化形態”，例如非人抗體，指經過了人源化作用的抗體。
[0092]如本文中使用的，術語“超變區”或“HVR”指抗體可變結構域中序列高度變化和/或形成結構定義的環(“超變環”)的每個區域。一般而言，天然的四鏈抗體包括6個HVR;3個在VH中(H1、H2、H3)，3個在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包括來自超變環和/或來自“互補決定區”(CDR)的氨基酸殘基，后者具有最高的序列可變性和/或參與抗原識別。示例性的超變環出現在第26-32位(LI)、第50-52位(L2)、第91-96位(L3)、第26-32位(Hl)、第 53-55 位(H2)和第 96-101 位(H3)氨基酸殘基(Chothia，C.和 Lesk，A.M.，J.Mol.B1l.196(1987)901-917)。示例性 CDR (CDR_L1、CDR_L2、CDR-L3、CDR-Hl、CDR_H2 和 CDR-H3)出現在LI的第24-34位、L2的第50-56位、L3的第89-97位、Hl的第31-35B位、H2的第 50-65 位和 H3 的第 95-102 位氛基酸殘基(Kabat, Ε.A.等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, Nat1nal Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991) ,NIH Publicat1n91-3242)。除了 VH 中的 CDRl 外，CDR—般包括形成超變環的氨基酸殘基。CDR還包括“特異性決定殘基”或“SDR”，是接觸抗原的殘基。包含在CDR區域中的SDR被稱為縮寫-CDR或a_CDR。示例性a_CDR(a_CDR-Ll、a_CDR_L2、a-CDR-L3、a-CDR-Hl、a_CDR-H2 和 a_CDR_H3)出現在 LI 的第 31-34 位、L2 的第 50-55 位、L3的第89-96位、Hl的第31-35B位、H2的第50-58位和H3的第95-102位氨基酸殘基(Almagro, J.C.和 Fransson, J.，Front.B1sc1.13(2008) 1619-1633)。除非另外指出，否則可變結構域中的HVR殘基和其他殘基(例如，FR殘基)在本文中是根據Kabat等人，見上文編號的。
[0093]如本文中使用的，術語“單克隆抗體”指從基本上均質的抗體群體中獲得的抗體，即，除可能的變體抗體外，包含在群體中的單個抗體是相同的和/或結合相同表位，例如含有天然存在的突變或在生產單克隆抗體制品的過程中產生的突變，這類變體一般只以微量存在。與通常包括針對不同決定子(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品相反，單克隆抗體制品的每個單克隆抗體都針對抗原上的單個決定子。因此，修飾詞“單克隆”表示從基本均質的抗體群體中獲得的抗體的特征，而不被視為要求通過任何特定的方法生產抗體。例如，本發明使用的單克隆抗體可以通過多種技術制備，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，本文中描述了這類方法和其他用于制備單克隆抗體的示例性方法。
[0094]術語“可變區”或“可變結構域”指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域(分別是VH和VL) —般具有相似的結構，每個結構域包含4個保守的框架區(FR)和3個超變區(HVR)(參見例如Kindt，T.J.等人，Kuby Immunology,第 6 版，W.H.Freeman 和 C0.，N.Y.(2007),第 91 頁)。單個 VH 或 VL 結構域足以產生抗原-結合特異性。此外，可以使用結合抗原的抗體的VH或VL結構域，分別篩選互補VL或VH結構域文庫,分離結合特定抗原的抗體(參見例如Portolano, S.等人，J.1mmunol.150(1993)880-887 ；Clackson, T.等人，Nature352 (1991) 624-628)。
[0095]術語“抗獨特型抗體”表示特異性結合親本抗體的結合特異性(如結合位點)的抗體，即，針對例如親本抗體的抗原結合位點。在一個實施方案中，抗獨特型抗體特異性結合親本抗體的一個或多個CDR。在一個實施方案中，親本抗體是治療性抗體。在一個實施方案中，親本抗體是多特異性抗體。在一個實施方案中，親本抗體是雙特異性抗體。
[0096]如果通過表面等離振子共振(SPR)測定檢測到信號降低50%或更多，在一個實施方案中，降低75%或更多，則兩個表位是重疊的，所述SPR使用固定的抗體和可溶性抗原，或反之亦然，其中研究的表位的濃度是20-50nM，需要檢測表位重疊的抗體的濃度是ΙΟΟηΜ。可選的，可以使用這樣的方法，其中結合相同抗原的兩個抗體的表位重疊是在競爭性測試系統的幫助下確定的。出于該目的，例如在基于細胞的酶免疫測定(ELISA)的幫助下，應用表達重組抗原表位的細胞，測試需要檢測表位重疊的抗體是否與其它抗體競爭結合固定抗原。出于該目的，孵育固定抗原與標記形態的抗體和需要確定表位重疊的過量抗體。通過檢測結合的標記，可以簡單地驗證表位重疊。如果關于已知抗體，確定了在相同濃度下，信號降低大于70 %，在一個實施方案中，降低大于80 %，或在更高濃度下(在一種情形中，15-倍過量的需要被測定表位重疊的抗體)，替換大于80%，在一個實施方案中，替換大于90%,則存在表位一致性或重疊,且兩種抗體結合相同抗原上相同的或重疊的表位。
[0097]不同的免疫測定的原則描述在例如Hage，D.S.(Anal.Chem.71 (1999) 294R-304R)中。Lu，B.等人(Analystl21 (1996)29R-32R)報道了定向固定抗體，用于免疫測定。例如ffilchek, M.,和 Bayer, Ε.A.,在 Methods Enzymo1.184(1990)467-469 報道了抗生物素蛋白-生物素-介導的免疫測定。
[0098]單克隆抗體及其恒定結構域作為蛋白質含有多個反應性側鏈，用于偶聯結合搭檔，如表面、蛋白質、聚合物(例如，PEG、纖維素或聚苯乙烯)、酶或結合對的成員。抗體的化學反應基是例如氨基(賴氨酸、^1-氨基)、巰基(胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)、羧酸基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。這類方法描述在例如Aslam M.和Dent，A.的“B1conjugat1n”，MacMillan Ref.Ltd.1999,第 50-100 頁中。
[0099]最常見的蛋白質反應基團之一是氨基酸賴氨酸的脂肪族ε-胺。一般而言，幾乎所有的抗體都含有豐富的賴氨酸。在高于ΡΗ8.0時(pKa = 9.18)，賴氨酸胺是相當好的親核基團，因此簡單完全的與多種試劑反應，形成穩定的鍵。胺-反應試劑主要與賴氨酸和蛋白質的α-氨基反應。反應性酯，特別是N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)酯，是最常應用的修飾胺基的試劑。用于在含水環境中反應的最佳pH是ρΗ8.0至9.0。異硫氰酸鹽/酯是胺修飾試劑，與蛋白質形成硫脲鍵。它們在含水溶液中與蛋白質胺反應(最佳是在ΡΗ9.0至
9.5)。醛類在溫和的含水條件下與脂肪族或芳香族胺類、肼類和酰肼類反應，形成亞胺中間物(希夫氏堿)。希夫氏堿可以用溫和的或強的還原劑(如硼氫化鈉或氰硼氫化鈉)選擇性還原，衍生出穩定的烷基胺鍵。用于修飾胺類的其他試劑是酸酐。例如，二乙烯三胺五乙酸酸酐(DTPA)是含有2個胺-反應性酸酐基的雙功能螯合劑。它可以與蛋白質的N-末端和ε-氨基反應，形成酰胺鍵。打開酸酐環，生成多價的金屬螯合臂，其能夠與配位復合物中的金屬緊密結合。
[0100]抗體中另一種常見的反應基是來自含硫氨基酸一胱氨酸及其還原產物半胱氨酸(或二分之一胱氨酸)的巰基殘基。半胱氨酸含有游離的巰基，比胺更親核，一般是蛋白質中的最反應性官能團。巰基一般在中性PH下是反應性的，因此可以在存在胺的條件下與其他分子選擇性偶聯。由于游離的巰基是相對反應性的，具有這些基團的蛋白質的基團通常以二硫基或二硫鍵的氧化形態存在。在這類蛋白質中，用試劑如二硫蘇糖醇(DTT)還原二硫鍵是生成反應性游離巰基必需的。巰基反應試劑是蛋白質上將偶聯巰基以形成硫醚偶聯產物的試劑。這些試劑在弱酸性至中性PH下快速的反應，因此可以在存在胺基的條件下選擇性反應。文獻報道了若干種硫醇化交聯劑的用途，如Traut試劑(2-亞氨基硫雜環戊烷)、琥珀酰亞氨基(乙酰硫基)乙酸酯(SATA)和磺基琥珀酰亞氨基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)，用于提供通過反應性氨基導入多個巰基的有效方式。鹵乙酰基衍生物(例如碘乙酰胺)形成硫醚鍵，并且也是用于巰基修飾的試劑。其他有效的試劑是馬來酰亞胺。馬來酰亞胺與巰基反應性試劑的反應基本上和與碘乙酰胺的反應相同。馬來酰亞胺在弱酸性至中性PH下快速的反應。
[0101]抗體中的另一類常見反應基是羧酸。蛋白質在C-末端位置上、在天冬氨酸和谷氨酸的側鏈中含有羧酸基。羧酸在水中相對較低的反應性通常導致難以利用這類基團選擇性的修飾蛋白質和其他生物分子。當進行修飾時，通常利用水溶性碳二亞胺將羧酸基轉化為反應性酯，并且所述羧酸基與親核試劑如胺、酰肼或肼反應。含胺的試劑應該是弱堿性的，從而在存在賴氨酸的更強堿性的ε -氨基的條件下，與活化的羧酸選擇性反應，形成穩定的酰胺鍵。當PH升高到高于8.0時，可以發生蛋白質交聯。
[0102]高碘酸鈉可用于將與抗體相連的碳水化合物部分中的糖的醇部分氧化為醛。每個醛基可以與針對羧酸所述的胺、酰肼或肼反應。由于碳水化合物部分主要出現在抗體的可結晶片段(Fe)區中，可以通過定點修飾遠離抗原結合位點的碳水化合物來實現綴合。形成希夫氏堿中間物，可以通過用氰硼氫化鈉(溫和的和選擇性的)或硼氫化鈉(強)水溶性還原劑還原中間物，將其還原成烷基胺。
[0103]術語“樣品”包括但不限于來自活物或之前的活物的任意量的物質。這類活物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他動物。在一個實施方案中，樣品獲得自猴子尤其食蟹猴、或兔、或小鼠、或大鼠。在一個實施方案中，這類物質包括但不限于來自個體的全血、血清或血漿，這是臨床常規中最普遍使用的樣品源。
[0104]術語“固相”表示非液體的物質，包括由例如聚合物、金屬(順磁、鐵磁顆粒)、玻璃和陶瓷的材料制成的顆粒(包括微粒和珠子)；凝膠物質，如硅石、礬土和聚合物凝膠；毛細管，可由聚合物、金屬、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物質；電極；微滴定板；固體條(stripe);和比色杯、試管或其他分光光度計的樣品容器。固相組分與惰性固體表面的區別在于“固相”在其表面上含有至少一個部分預期與樣品中的物質相互作用。固相可以是固定組分，如試管、條、比色杯或微滴定板，或者可以是不固定的組分，如珠子和微粒。可以使用多種允許蛋白質和其他物質非共價或共價連接的微粒。這類顆粒包括聚合物顆粒，如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸酯)；金粒，如金納米顆粒和金膠體；以及陶瓷顆粒，如硅石、玻璃和金屬氧化物顆粒。參見例如，Martin, C.R.等，Analytical Chemistry-News &Features, 70 (1998) 322A-327A,或 Butler, J.Ε.，Methods22 (2000) 4-23?
[0105]在一個實施方案中，從色素原(熒光或發光的基團和染料)、酶、NMR-活性基、金屬顆粒或半抗原(如地高辛配基)中選擇可檢測的標記。可檢測的標記還可以是可以光可激活的交聯基團，例如，疊氮基或IH-氮雜環丙烯基。還在一個實施方案中，可以通過電化學發光檢測的金屬螯合物是發出信號的基團，特別優選的是釕螯合物，例如，釕(雙吡啶)32+螯合物。合適的釕標記基團描述在例如EP O 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511和WO 92/14138 中。
[0106]本文中報道了用于確定樣品中的多特異性抗體的(游離)抗原的存在和/或量的方法，包括特異性結合多特異性抗體的一個結合特異性的固相固定的抗獨特型抗體，該結合特異性不是多特異性抗體中特異性結合待確定的(游離)抗原的結合特異性，用于在確定(游離)抗原的量之前，從樣品中耗盡復合形態的或非復合形態的多特異性抗體。
[0107]在一個實施方案中，通過抗原橋接免疫測定法，確定耗盡了多特異性抗體的樣品中的抗原的存在和/或量。在一個實施方案中，免疫測定法包括捕獲抗體和示蹤抗體，其中捕獲抗體與固相綴合，而示蹤抗體與可檢測的標記綴合。
[0108]在一個實施方案中，方法包括在確定游離的結合搭檔的存在或量之前，從樣品中耗盡單特異性結合物-多特異性結合物-復合物。
[0109] 本文報道的一個方面是用于確定樣品中的多特異性抗體的抗原的存在和/或量的體外方法，其中待檢測的抗原可以被多特異性抗體的第一結合特異性特異的結合，包括步驟:
[0110]-孵育包含抗原和多特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異的結合多特異性抗體中不同于第一結合特異性的第二結合特異性，從而從樣品中去除多特異性抗體。
[0111]本領域技術人員已知，由于平衡熱力學，包含抗原和可以特異性結合抗原的抗體的樣品包括游離抗原、結合抗體的抗原和游離抗體的混合物。
[0112]在一個實施方案中，方法包括下列步驟:
[0113]-孵育包含抗原和多特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異的結合多特異性抗體中不同于第一結合特異性的第二結合特異性，從而形成抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，和
[0114]-從樣品中去除抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物。
[0115]在一個實施方案中，方法包括下列步驟:
[0116]-孵育包含抗原和多特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異的結合多特異性抗體中不同于第一結合特異性的第二結合特異性，從而形成抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，
[0117]-從樣品中去除抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，和
[0118]-確定耗盡了多特異性抗體的樣品中的抗原的量。
[0119]在一個實施方案中，方法包括步驟:
[0120]-在確定游離的結合搭檔的的存在或量之前，從樣品中耗盡單特異性結合物-多特異性結合物-復合物。
[0121]在一個實施方案中，方法包括步驟:
[0122]-孵育包含結合搭檔和多特異性結合物的樣品與單特異性結合物，所述單特異性結合物特異的結合多特異性抗體中不同于第一結合特異性的第二結合特異性，
[0123]-在確定游離的結合搭檔的存在或量之前，從樣品中耗盡單特異性結合物-多特異性結合物-復合物，和
[0124]-確定耗盡了多特異性結合物的樣品中的結合搭檔的量。
[0125]在一個實施方案中，通過抗原橋接免疫測定法，確定抗原的存在和/或量。
[0126]在一個實施方案中，確定抗原的存在和/或量是確定游離抗原的量。
[0127]在一個實施方案中，確定抗原的存在和/或量包括下列步驟:
[0128]-孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與特異性結合抗原的捕獲抗體，形成捕獲抗體-抗原復合物，和
[0129]-關聯所形成的捕獲抗體-抗原復合物的量與樣品中的抗原的量。
[0130]在一個實施方案中，確定抗原的存在和/或量包括下列步驟:
[0131]-孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與特異性結合抗原的捕獲抗體，形成捕獲抗體-抗原復合物，
[0132]-孵育捕獲抗體-抗原復合物與示蹤抗體，其中捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上的不重疊的表位,和
[0133]-關聯所形成的捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量。[0134]在一個實施方案中，示蹤抗體包括可檢測的標記。
[0135]在一個實施方案中，確定抗原的存在和/或量包括下列步驟:
[0136]-孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與特異性結合抗原的捕獲抗體，形成捕獲抗體-抗原復合物，
[0137]-孵育捕獲抗體-抗原復合物與示蹤抗體，其中捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上的不重疊的表位，
[0138]-孵育捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與包含可檢測的標記的檢測抗體，其中檢測抗體在示蹤抗體的可變結構域之外的表位上特異性結合示蹤抗體，和
[0139]-關聯所形成的捕獲抗體-游離抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量。
[0140]在一個實施方案中，捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上的不重疊的表位。
[0141]在一個實施方案中，抗獨特型抗體和/或捕獲抗體與固相綴合。
[0142]用于本文報道的方法中的抗獨特型抗體和/或捕獲抗體可以與固相綴合。在一個實施方案中，綴合是通過化學結合來實施的，所述化學結合經由N-末端和/或ε -氨基(賴氨酸)、不同賴氨酸的ε -氨基、抗體的氨基酸骨架的羧基_、巰基_、羥基-和/或酚-官能團，和/或抗體的碳水化合物結構的糖醇基。在一個實施方案中，抗獨特型抗體和/或捕獲抗體是至少兩種與固相綴合的抗體的混合物，其中至少兩種與固相綴合的抗體與固相綴合的位點不同。例如，至少兩種與固相綴合的抗體的混合物可包括通過抗體的氨基酸骨架的氨基酸與固相綴合的抗體，和通過抗體的碳水化合物結構的糖醇基與固相綴合的抗體。此外，例如，至少兩種與固相綴合的抗體的混合物可包括通過其氨基酸骨架的不同氨基酸殘基與固相綴合的抗體。表述方式“不同的氨基酸殘基”表示兩種不同類型的氨基酸，如賴氨酸和天冬氨酸，或酪氨酸和谷氨酸，或氨基酸骨架中在抗體氨基酸序列中不同位置上的兩個氨基酸殘基。在后一種情況下，氨基酸可以是相同種類或不同種類的。表述方式“抗體位點不同”表示位點類型的不同，例如氨基酸或糖醇基，或(例如抗體與固相綴合的位置上)氨基酸骨架的氨基酸數不同。相同的應用也可以用于本文報道的方法中使用的示蹤抗體。
[0143]在方法的一個實施方案中，免疫測定包括捕獲抗體、示蹤抗體和檢測抗體，其中捕獲抗體是針對通過鏈霉抗生物素與固相綴合的抗原的生物素化抗體，示蹤抗體是針對與地高辛配基綴合的抗原的抗體，和檢測抗體是針對與辣根過氧化物酶綴合的地高辛配基的抗體。
[0144]用于從包含抗原X和/或抗原Y的樣品中耗盡由特異結合抗原X和抗原Y的雙特異性抗體組成的復合物的一般方法(分別用于確定抗原X或抗原Y)，包括下列步驟:
[0145]-裝配特異性結合抗原X和抗原Y的雙特異性抗體(抗Χ/Υ抗體)的復合物:
[0146]室溫孵育恒定濃度的抗原X與遞增量的雙特異性單克隆抗體I小時，所述抗體的第一結合特異性特異的結合抗原X，第二結合特異性特異的結合抗原Y(抗Χ/Υ抗體)。之后，使用該樣品作為耗盡步驟中的陽性對照。
[0147]-耗盡步驟:
[0148]為了耗盡與抗Χ/Υ抗體結合的抗原X，將針對特異性結合抗原Y(抗-1d Y抗體-BI)的結合特異性的生物素化抗-獨特型抗體與約?ο μ g/ml包被了磁性鏈霉抗生物素的珠子(SA-beads)結合。每個樣品洗滌600 μ ISA-Beads，并用磁性分離器從上清液中分離。將600 μ I含有生物素化的抗-1d Y抗體的溶液與SA-Beads混合，室溫孵育約I小時。通過用磁性分離器洗滌3次，去除過多的未結合的抗獨特型抗體。然后，孵育包被了抗獨特型抗體的珠子和約250 μ I含有抗Χ/Υ抗體與抗原X的復合物的樣品。混合物在室溫下孵育振蕩約I小時。在孵育后，用磁性分離器分離樣品與珠子。采集上清液用于在ELISA中分析“游離”抗原X(參見例如實施例2)。將剩余的珠子轉移到ELECSYS容器中，根據標準的用戶指導性操作規程(參見例如實施例3)，用ELECSYS2010分析儀分析與珠子結合的抗原X (結合雙特異性抗體的抗原X)。
[0149]為了耗盡與抗Χ/Υ抗體結合的抗原Y，將針對特異性結合抗原Χ(抗-1d X抗體-BI)的結合特異性的生物素化抗-獨特型抗體與約?ο μ g/ml包被了磁性鏈霉抗生物素的珠子(SA-beads)結合。每個樣品洗滌600 μ ISA-Beads，并用磁性分離器從上清液中分離。將600 μ I含有生物素化的抗-1d X抗體的溶液與SA-Beads混合，室溫孵育約I小時。通過用磁性分離器洗滌珠子3次，去除過多的未結合的抗獨特型抗體。然后，孵育包被了抗獨特型抗體的珠子和約250 μ I含有抗Χ/Υ抗體與抗原Y的復合物的樣品。混合物在室溫下孵育振蕩約I小時。在孵育后，用磁性分離器分離樣品與珠子。采集上清液用于在ELISA中分析“游離”抗原Y(參見例如實施例2)。將剩余的珠子轉移到ELECSYS容器中，根據標準的用戶指導性操作規程(參見例如實施例3)，用ELECSYS 2010分析儀分析與珠子結合的抗原Y(結合雙特異性抗體的抗原Y)。
[0150]在一個實施方案中，抗獨特型抗體具有105l/mol*s或更高的解離常數ka。在一個實施方案中，抗獨特型抗體具有l*105l/mol*s或更高的解離常數。在一個實施方案中，抗獨特型抗體還具有5*10_8mol/l或更低的Kd值。在一個實施方案中，抗獨特型抗體還具有l*10_9mOl/l或更低的Kd值。
[0151]在一個實施方案中，在耗盡步驟中孵育約5分鐘至約36小時。在一個實施方案中，在耗盡步驟中孵育約約15分鐘至約30小時。 [0152]在一個實施方案中,將樣品調節至多特異性抗體的濃度為約2 μ g/ml至約15 μ g/ml ο在一個實施方案中，將樣品調節至多特異性抗體的濃度為約3 μ g/ml至約12 μ g/ml。
[0153]在一個實施方案中,將樣品調節至總抗原濃度為約lpg/ml至約I μ g/ml。在一個實施方案中，將樣品調節至總抗原濃度為約10pg/ml至約500ng/ml。在一個實施方案中，將樣品調節至總抗原濃度為約100pg/ml至約250ng/ml。在一個實施方案中，將樣品調節至總抗原濃度為約lng/ml至約100ng/ml。
[0154]在雙特異性抗體針對ANG2和VEGF的情況下，作用機制是同時阻斷用于與其相應受體結合的兩種抗原。在缺少游離抗原(能夠結合受體)的條件下，抑制信號通路。在游離抗原和抗體結合的抗原之間的差異是有利的。
[0155]提供下列實施例和附圖以幫助理解本發明，但所附權利要求陳述了本發明的實際范圍。應理解，在不脫離本發明精神的條件下，可以對所述方法進行修飾。
具體實施方案
[0156]1、用于體外確定結合搭檔的存在和/或量的方法，所述結合搭檔能夠被多特異性結合物的第一結合特異性特異性地結合，其中在檢測結合搭檔之前，通過孵育樣品和單特異性結合物，耗盡了與多特異性結合物結合的結合搭檔，其中單特異性結合物特異性結合多特異性結合物的第二結合特異性。[0157]2、使用免疫測定，免疫學確定樣品中的多特異性結合物的結合搭檔的存在和/或量的方法，其中在確定結合搭檔之前，從樣品中耗盡多特異性結合物。
[0158]3、用于確定多特異性結合物的結合搭檔的存在和/或量的體外方法，其中結合搭檔能夠被多特異性結合物的第一結合特異性特異性結合，包括步驟:
[0159]-孵育包含結合搭檔和多特異性結合物的樣品與單特異性結合物，所述單特異性結合物特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性結合物的第二結合特異性。
[0160]4、用于確定樣品中的多特異性抗體的抗原的存在和/或量的體外方法，其中待檢測的抗原能夠被多特異性抗體的第一結合特異性特異性結合，包括步驟:
[0161]-孵育包含多特異性抗體、結合多特異性抗體的抗原和游離抗原的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性。
[0162]5、根據條目3至4的任一項的方法，其特征是還包括以下步驟作為第二步:
[0163]-在確定游離的結合搭檔的存在和/或量之前，從樣品中耗盡單特異性結合物-多特異性結合物-復合物。
[0164]6、根據條目3至5的任一項的方法，其特征是包括以下步驟作為最終步驟:
[0165]-確定耗盡多特異性結合物的樣品中的結合搭檔的量。
[0166]7、根據條目2至6的任一項的方法，其特征是包括以下步驟:
[0167]-孵育包含結合搭檔和多特異性結合物的樣品與單特異性結合物，所述單特異性結合物特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性結合物的第二結合特異性，
[0168]-在確定游離的結合搭檔的存在或量之前，從樣品中耗盡單特異性結合物-多特異性結合物-復合物，和
[0169]-確定耗盡多特異性結合物的樣品中的結合搭檔的量。
[0170]8、根據條目I至7的任一項的方法，其特征是結合搭檔選自抗原、靶和被分析物。
[0171]9、根據條目I至8的任一項的方法，其特征是結合搭檔是未復合的結合搭檔或游離的結合搭檔。
[0172]10、根據條目I至9的任一項的方法，其特征是結合特異性是結合位點或一對抗體重鏈可變結構域和抗體輕鏈可變結構域。
[0173]11、根據條目I至10的任一項的方法，其特征是多特異性結合物選自抗體、包含抗體或抗體片段和非抗體多肽的融合多肽、包含抗體或抗體片段和可溶性受體的融合多肽，或包含抗體或抗體片段和肽類結合分子的融合多肽。
[0174]12、根據條目I至11的任一項的方法，其特征是多特異性結合物是抗體。
[0175]13、根據條目8至12的任一項的方法，其特征是確定抗原的存在和/或量，包括以下步驟:
[0176]-孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，從而形成捕獲抗體-抗原復合物，所述捕獲抗體特異性結合抗原，和
[0177]-關聯所形成的捕獲抗體-抗原復合物與樣品中的抗原的量。
[0178]14、根據條目8至13的任一項的方法，其特征是確定抗原的量，包括以下步驟:
[0179]-孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，從而形成捕獲抗體-抗原復合物，所述捕獲抗體特異性結合抗原，[0180]-孵育捕獲抗體-抗原復合物與示蹤抗體，其中捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上的不重疊表位，和
[0181]-關聯所形成的捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量。
[0182]15、根據條目8至14的任一項的方法，其特征是確定抗原的量，包括以下步驟:
[0183]-孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，從而形成捕獲抗體-抗原復合物，所述捕獲抗體特異性結合抗原，
[0184]-孵育捕獲抗體-抗原復合物與示蹤抗體，其中捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上的不重疊表位，
[0185]-孵育捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與包含可檢測的標記的檢測抗體，其中檢測抗體在示蹤抗體的可變結構域外的表位上特異性地結合示蹤抗體，和
[0186]-關聯所形成的捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量。
[0187]16、根據條目11至15的任一項的方法，其特征是抗體是雙特異性抗體、或三特異性抗體、或四特異性抗體、或五特異性抗體、或六特異性抗體。
[0188]17、根據條目11至16的任一項的方法，其特征是抗體是雙特異性抗體。
[0189]18、根據條目11至17的任一項的方法，其特征是抗體是具有第一結合特異性和具有第二結合特異性的雙特異性抗體，所述第一結合特異性特異性結合第一抗原或抗原上的第一表位，所述第二結合特異性特異性結合第二抗原或抗原上的第二表位。
[0190]19、根據條目I至18的任一項的方法，其特征是單特異性結合物是抗獨特型抗體。
[0191]20、根據條目19的方法，其特征是方法包括以下步驟:
[0192]-孵育包含多特異性抗體、結合多特異性抗體的抗原和游離抗原的樣品與抗獨特型抗體，從而形成抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性，和
[0193]-從樣品中去除抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物。
[0194]21、根據條目19至20的任一項的方法，其特征是方法包括以下步驟:
[0195]-孵育包含抗原和多特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，從而形成抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性，
[0196]-從樣品中去除抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，和
[0197]-確定耗盡了多特異性抗體的樣品中的抗原的量。
[0198]22、根據條目20至21的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物是抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物和抗獨特型抗體-多特異性抗體-抗原復合物的混合物。
[0199]23、根據條目19至22的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體對于多特異性抗體的第二結合特異性具有105l/mol*s或更高的解離常數ka。
[0200]24、根據條目19至23的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體對于與多特異性抗體的第二結合特異性的結合具有5*10_8mol/l或更低的Kd值。
[0201]25、根據條目19至24的任一項的方法，其特征是與抗獨特型抗體孵育約10分鐘至約36小時。
[0202]26、根據條目I至25的任一項的方法，其特征是調整樣品至多特異性抗體濃度為約 2 μ g/ml 至約 15 μ g/ml。
[0203]27、根據條目I至26的任一項的方法，其特征是調整樣品至總抗原濃度為約Ing/ml 至約 250ng/ml。
[0204]28、根據條目19至27的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體與固相結合或綴
口 O
[0205]29、根據條目19至28的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體通過特定的結合對綴合(固定)。
[0206]30、根據條目29的方法，其特征是結合對(第一組分/第二組分)選自鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原、凝集素/多糖、類固醇/類固醇結合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G。
[0207]31、根據條目29至30的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體與生物素綴合，且通過固定的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素實施固定。
[0208]32、根據條目19至31的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體是生物素化的，且固相包被了鏈霉抗生物素。
[0209]33、根據條目19至31的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體是針對多特異性結合物的生物素化的抗獨特型抗體，且通過鏈霉抗生物素與固相綴合。
[0210]34、根據條目28至33的任一項的方法，其特征是固相是包被了鏈霉抗生物素的順磁珠或包被了鏈霉抗生物素的瓊脂糖珠。
[0211]35、根據條目19至34的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體是包含至少兩種抗獨特型抗體的混合物，所述抗獨特型抗體在它們與固相綴合的抗體位點上不同。
[0212]36、根據條目19至35的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體混合物包含通過至少兩種不同的氨基與固相綴合的抗獨特型抗體。
[0213]37、根據條目28至36的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體與其綴合搭檔的綴合是通過化學結合實施的，所述化學結合經由N-末端和/或ε-氨基(賴氨酸)和/或不同賴氨酸的ε -氨基、藥物抗體的氨基酸骨架的羧基_、巰基_、羥基-和/或酚-官能團，和/或藥物抗體的碳水化合物結構的糖醇基。
[0214]38、根據條目28至37的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體通過被動吸附與固
相綴合。
[0215]39、根據條目I至38的任一項的方法，其特征是樣品包含多特異性抗體、游離抗原和多特異性抗體-抗原復合物，且檢測是檢測多特異性抗體的游離抗原。
[0216]40、特異性結合多特異性抗體的第一結合特異性的抗獨特型抗體的用途，用于從樣品中耗盡與多特異性抗體的第二結合特異性結合的抗原。
[0217]附圖描沭
[0218]圖1結合藥物的靶(與雙特異性抗體結合的抗原)與游離靶(游離抗原)之間的平衡。
[0219]圖2使用針對雙特異性抗體的ANG2結合特異性的抗獨特型抗體，耗盡與雙特異性抗ANG2/VEGF抗體結合的VEGF ;將針對雙特異性抗體的ANG2結合特異性的生物素化抗獨特型抗體固定在包被了鏈霉抗生物素的磁珠上；在孵育這些磁珠和樣品(例如血清樣品)后，雙特異性抗ANG2/VEGF抗體被固定的抗獨特型抗體結合和耗盡；共-耗盡與雙特異性抗體結合的VEGF ;游離VEGF (未與雙特異性抗體結合)仍然保留在血清樣品的上清液中。
[0220]圖3用于檢測VEGF的夾心ELISA:固定的抗VEGF抗體結合VEGF，另一種標記的抗VEGF抗體允許檢測結合的VEGF ;測定用于檢測耗盡后的樣品上清液中的“游離"VEGF ;為了檢測c-MET，應用使用了兩種抗c-MET抗體的相同測定模式。
[0221]圖4在免疫耗盡之前和之后的C-MET水平:用特異性結合雙特異性抗體的HER3結合特異性的抗獨特型抗體，耗盡含有50ng/ml c-MET和遞增量的雙特異性抗HER3/c_MET抗體的樣品中的雙特異性抗體；示意圖顯示了 ELISA確定的耗盡前后的c-MET濃度；c_MET的水平在耗盡前相似，不依賴于雙特異性抗體的量；通過耗盡，去除了與雙特異性抗體結合的c-MET (結合藥物的靶)；耗盡后檢測到的c-MET (游離c-MET)濃度在存在2微克/ml雙特異性抗體時是約lng/ml，。
[0222]圖5比較若干用于免疫耗盡的抗獨特型抗體:使用4種特異性結合雙特異性抗體的HER3結合特異性的抗獨特型抗體，耗盡“結合”雙特異性抗體的c-MET ;如圖4所述進行實驗；用抗體M2.11.125的耗盡比其他3種抗獨特型抗體效率低。
[0223]圖6耗盡后的緩沖液和血清樣品的上清液中的VEGF的量:用特異性結合雙特異性抗體的ANG2結合特異性的抗獨特型抗體，耗盡含有50ng/ml VEGF和遞增量的雙特異性抗ANG2/VEGF抗體的緩沖液和血清樣品；通過ELISA測量免疫耗盡前后的VEGF濃度(圖3);對血清/血漿中的結合藥物的靶的耗盡與對測定緩沖液中的效率類似；在耗盡前的雙特異性抗體濃度依賴性信號過程是由于測定模式，以及測定使用的多特異性結合物和抗VEGF抗體之一特異性結合的VEGF上的表位重疊造成的。
[0224]圖7在免疫耗盡后，用固定在鏈霉抗生物素珠子上的抗獨特型抗體檢測結合藥物的靶:將分離的磁珠轉移到ELECSYS2010分析儀中；用釕標記的抗VEGF抗體檢測珠子結合的抗獨特型抗體/雙特異性抗體/VEGF-復合物中的VEGF。
[0225]實施例
[0226]實施例1
[0227]耗盡結合藥物的靶(結合抗體的抗原)-在雙特異性藥物分子的情況下
[0228]從樣品中耗盡杭ANG2/VEGF杭體-VEGF復合物
[0229]A)裝配杭ANG2/VEGF杭體和VEGF的復合物
[0230]將恒定濃度的VEGF與遞增量的雙特異性抗體在室溫孵育I小時，所述雙特異性抗體以第一結合特異性特異性結合ANG2，且以第二結合特異性特異性結合VEGF (抗ANG2/VEGF抗體)。然后，使用這些樣品作為陽性對照用于耗盡步驟或用在耗盡步驟中。
[0231]B)耗盡步驟
[0232]為了耗盡與抗ANG2/VEGF抗體結合的VEGF，將針對這樣的結合特異性的生物素化抗獨特型抗體與10 μ g/ml包被了磁性鏈霉抗生物素的珠子(SAbeads)結合,所述結合特異性特異的結合ANG2 (抗-1d ANG2抗體-BI)。每個樣品洗滌600 μ ISA-Beads,并用磁性分離器從上清液中分離。將約600 μ I含有抗id ANG2抗體的溶液與SA-Beads混合，室溫孵育I小時。通過用磁性分離器洗滌珠子3次，去除過多的未結合的抗體。然后，孵育包被了抗體的珠子和250 μ I含有抗ANG2/VEGF抗體和VEGF的復合物的樣品。樣品在室溫下孵育振蕩I小時。在孵育后，用磁性分離器分離樣品與珠子。采集上清液，用于使用ELISA分析“游離"VEGF(參見實施例2)。將剩余的珠子轉移到ELECSYS容器中，根據生產商的說明，用ELECSYS2010分析儀分析與珠子結合的VEGF (結合了抗-ANG2/VEGF抗體的VEGF)(參見實施例3)。
[0233]使用兩種不同的針對ANG2結合特異性的抗獨特型抗體耗盡VEGF(也參見實施例5):
[0234]i)多克隆抗 id ANG2 抗體 Rb-1gG-BI，
[0235]ii)單克隆抗 id ANG2 抗體 M-2.3.55-BI。
[0236]從樣品中耗盡杭HER3/c-MET杭體_c_MET復合物
[0237]A)裝配抗HER3/C-MET抗體和c_MET的復合物
[0238]將恒定濃度的c-MET與遞增量的雙特異性抗體在室溫孵育I小時，所述雙特異性抗體以第一結合特異性特異性結合HER3，并且以第二結合特異性特異性結合c-MET (抗-HER3/C-MET抗體)。然后，用珠子處理該樣品，用于耗盡抗HER3/C_Met抗體-c-MET復合物。
[0239]B)耗盡步驟
[0240]為了耗盡與抗HER3/C-MET抗體結合的c_MET，將針對這樣的結合特異性的生物素化抗獨特型抗體與約10 μ g/ml包被了磁性鏈霉抗生物素的珠子(SAbeads)結合,所述結合特異性特異的結合HER3 (抗-1d HER3抗體-BI)。每個樣品洗滌600 μ ISA-Beads,并用磁性分離器從上清液中分離。將約600 μ I含有抗id HER3抗體Ml.1.10-BI的溶液與SA-Beads混合，室溫孵育I小時。通過用磁性分離器洗滌珠子3次，去除過多的未結合的抗體。然后，孵育包被了抗體的珠子和250 μ I含有抗HER3/C-MET抗體和c-MET的復合物的樣品。樣品在室溫下孵育振蕩I小時。在孵育后，用磁性分離器分離樣品與珠子。采集上清液，用于在ELISA中分析“游離” c-MET。
[0241]評估了 4種針對HER3結合特異性的抗獨特型抗體耗盡結合了抗HER3/c_MET抗體的c-MET (還參見實施例4):
[0242]i)單克隆抗 id HER3 抗體 M-1.1.1O-1gG,
[0243]ii)單克隆抗 id HER3 抗體 M-2.11.123-1gG，
[0244]iii)單克隆抗 id HER3 抗體 M-2.5.45-1gG，
[0245]iv)單克隆抗 id HER3 抗體 M-2.9.55-1gG。
[0246]實施例2
[0247]酶聯免疫吸附測定
[0248]用于檢測VEGF的ELISA
[0249]根據生產商的說明(R+D Systems Cat#DVE00)使用可商購的夾心免疫測定法。
[0250]將耗盡步驟(參見實施例1)的上清液樣品稀釋10倍，并添加到預包被的顯微平板(R+D Systems)的孔中。包含在樣品中的游離VEGF被包被在顯微平板的孔上的抗VEGF抗體結合。在室溫孵育2小時后，洗滌平板3次，去除未結合的樣品。然后，向孔中加入多克隆連接了 HRP的抗VEGF抗體(連接辣根過氧化物酶的抗VEGF抗體)，并在室溫再孵育2小時。再次洗滌步驟后，向孔中加入TMB底物溶液。在測量前，通過添加硫酸終止顯色反應(參見圖3)。
[0251]用于檢測c-MET 的 ELISA
[0252]使用可商購的夾心免疫測定(R+D Systems Cat#DY358)。[0253]在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，將小鼠單克隆抗c-MET抗體稀釋至約180 μ g/ml的工作濃度。將約100 μ I的該溶液移液到Nunc Maxisorb平板的每個孔中，室溫孵育I小時。在用捕獲抗體包被平板的孔之后，用補充了 0.05% (w/v) Tween的PBS洗滌平板3次，并用包含1% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS室溫封閉I小時。在添加樣品前，用PBS洗滌平板3次。
[0254]將來自c-MET耗盡步驟的上清液(參見實施例1)稀釋10倍。將約100 μ I每個樣品的稀釋液和一系列稀釋的校正標準移液到已包被和封閉的顯微平板的2個孔的每個中，室溫孵育I小時。
[0255]在孵育后，洗滌平板3次，去除未結合的樣品。然后，向孔中加入多克隆的連接了生物素的抗c-MET抗體，并在室溫再孵育2小時。再次洗滌步驟后，將鏈霉抗生物素-HRP綴合物(R+D systems)稀釋200倍，將100 μ I該溶液移液到顯微平板的每個孔中，室溫孵育I小時。在另一個洗滌步驟后，向孔中加入TMB底物溶液，在測量前，通過添加硫酸終止顯色反應(參見圖4)。
[0256]實施例3
[0257]用于檢測抗原X和抗Χ/Υ抗體的結合復合物的ELECSYS
[0258]洗滌用于耗盡步驟中的珠子(參見實施例1)，并用磁性分離器在ELECSYS測定緩沖液中分離3次，去除未結合的物質。將來自每個樣品的珠子溶解在600 μ I ELECSYS測定緩沖液中，采集用于分析。
[0259]簡而言之,用10 μ I緩沖液和20 μ I釕標記的針對抗原X的抗體(15 μ g/ml)孵育170 μ I珠子15分鐘。檢測與固定在SA-Beads上的抗原X-抗Χ/Υ抗體-抗獨特型抗體復合物結合的釕標記的抗體(參見例如Stockmann,W.等,Wien.Klin.Wochenschr.110(1998)Supp1.3:10-21 ；Forest, J.C.等，Clin.B1chem.31(1998)81-88)。
[0260]實施例4
[0261]評估抗獨特型抗體作為耗盡工具
[0262]根據實施例1描述的方法，使用具有不同動力學常數的不同抗獨特型抗體用于耗盡抗HER3/C-MET抗體及其復合物。
[0263]通過表面等離振子共振，評估抗獨特型抗體與抗HER3/C-MET抗體的HER3結合特異性特異性結合的動力學常數
[0264]用使用CM5芯片的BIAcore? τιοο儀器實施所有的測量。通過標準的胺偶聯實現芯片包被。除非另外指出，在25°C下，在HBS緩沖液(HEPES，NaCl，pH7.4)中實施所有的孵育。在CM5芯片的一個流動室中，通過胺偶聯固定飽和量的多克隆山羊抗小鼠Fc-Y抗體。之后，以30 μ 1/min的流速，注射不同的針對抗HER3/c_MET抗體結合特異性的單克隆小鼠抗體(特異的結合HER3)60秒，所述單克隆小鼠抗體被抗小鼠Fe抗體結合。在HBS緩沖液中稀釋所有的動物血清。通過以30 μ 1/min的流速，注射抗HER3/c_MET抗體60秒，分
析結合(聯結)。通過用HBS緩沖液洗滌芯片表面180秒，測量解離。使用BIAcore?的BIAevaluat1n軟件,用1:1Langmuir擬合模型計算解離常數值(=ka ；kd ；KD)。
[0265]表:通過SPR-分析確定的針對抗HER3/C-MET抗體的HER3結合特異性的各抗獨特
型抗體結合的動力學參數。
[0266]
【權利要求】
1.用于體外確定結合搭檔的存在和/或量的方法，所述結合搭檔能夠被多特異性結合物的第一結合特異性特異性地結合，其中在檢測結合搭檔之前，通過孵育樣品和單特異性結合物，耗盡了與多特異性結合物結合的結合搭檔，其中單特異性結合物特異性結合多特異性結合物的第二結合特異性。
2.使用免疫測定，免疫學確定樣品中的多特異性結合物的結合搭檔的存在和/或量的方法，其中在確定結合搭檔之前，從樣品中耗盡多特異性結合物。
3.用于確定多特異性結合物的結合搭檔的存在和/或量的體外方法，其中結合搭檔能夠被多特異性結合物的第一結合特異性特異性結合，包括步驟: -孵育包含結合搭檔和多特異性結合物的樣品與單特異性結合物，所述單特異性結合物特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性結合物的第二結合特異性。
4.用于確定樣品中的多特異性抗體的抗原的存在和/或量的體外方法，其中待檢測的抗原能夠被多特異性抗體的第一結合特異性特異性結合，包括步驟: -孵育包含多特異性抗體、結合多特異性抗體的抗原和游離抗原的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性。
5.根據權利要求3至4的任一項的方法，其特征是還包括以下步驟作為第二步: -在確定游離的結合搭檔的存在和/或量之前，從樣品中耗盡單特異性結合物-多特異性結合物-復合物。
6.根據權利要求3至5的任一項的方法，其特征是包括以下步驟作為最終步驟: -確定耗盡多特異性結合物的樣品中的結合搭檔的量。
7.根據權利要求2至6的任一項的方法，其特征是包括以下步驟: -孵育包含結合搭檔和多特異性結合物的樣品與單特異性結合物，所述單特異性結合物特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性結合物的第二結合特異性， -在確定游離的結合搭檔的存在或量之前，從樣品中耗盡單特異性結合物-多特異性結合物-復合物，和 -確定耗盡多特異性結合物的樣品中的結合搭檔的量。
8.根據權利要求1至7的任一項的方法，其特征是結合搭檔選自抗原、靶和被分析物。
9.根據權利要求1至8的任一項的方法，其特征是結合搭檔是未復合的結合搭檔或游離的結合搭檔。
10.根據權利要求1至9的任一項的方法，其特征是結合特異性是結合位點或一對抗體重鏈可變結構域和抗體輕鏈可變結構域。
11.根據權利要求1至10的任一項的方法，其特征是多特異性結合物選自抗體、包含抗體或抗體片段和非抗體多肽的融合多肽、包含抗體或抗體片段和可溶性受體的融合多肽，或包含抗體或抗體片段和肽類結合分子的融合多肽。
12.根據權利要求1至11的任一項的方法，其特征是多特異性結合物是抗體。
13.根據權利要求8至12的任一項的方法，其特征是確定抗原的存在和/或量，包括以下步驟: -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，從而形成捕獲抗體-抗原復合物，所述捕獲抗體特異性結合抗原，和-關聯所形成的捕獲抗體-抗原復合物與樣品中的抗原的量。
14.根據權利要求8至13的任一項的方法，其特征是確定抗原的量，包括以下步驟: -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，從而形成捕獲抗體-抗原復合物，所述捕獲抗體特異性結合抗原， -孵育捕獲抗體-抗原復合物與示蹤抗體，其中捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上的不重疊表位，和 -關聯所形成的捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量。
15.根據權利要求8至14的任一項的方法，其特征是確定抗原的量，包括以下步驟: -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，從而形成捕獲抗體-抗原復合物，所述捕獲抗體特異性結合抗原， -孵育捕獲抗體-抗原復合物與示蹤 抗體，其中捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上的不重疊表位， -孵育捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與包含可檢測的標記的檢測抗體，其中檢測抗體在示蹤抗體的可變結構域外的表位上特異性地結合示蹤抗體，和 -關聯所形成的捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量。
16.根據權利要求11至15的任一項的方法，其特征是抗體是雙特異性抗體、或三特異性抗體、或四特異性抗體、或五特異性抗體、或六特異性抗體。
17.根據權利要求11至16的任一項的方法，其特征是抗體是雙特異性抗體。
18.根據權利要求11至17的任一項的方法，其特征是抗體是具有第一結合特異性和具有第二結合特異性的雙特異性抗體，所述第一結合特異性特異性結合第一抗原或抗原上的第一表位，所述第二結合特異性特異性結合第二抗原或抗原上的第二表位。
19.根據權利要求1至18的任一項的方法，其特征是單特異性結合物是抗獨特型抗體。
20.根據權利要求19的方法，其特征是方法包括以下步驟: -孵育包含多特異性抗體、結合多特異性抗體的抗原和游離抗原的樣品與抗獨特型抗體，從而形成抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性，和-從樣品中去除抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物。
21.根據權利要求19至20的任一項的方法，其特征是方法包括以下步驟: -孵育包含抗原和多特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，從而形成抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，所述抗獨特型抗體特異性結合不同于第一結合特異性的多特異性抗體的第二結合特異性， -從樣品中去除抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物，和 -確定耗盡了多特異性抗體的樣品中的抗原的量。
22.根據權利要求20至21的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物是抗獨特型抗體-多特異性抗體復合物和抗獨特型抗體-多特異性抗體-抗原復合物的混合物。
23.根據權利要求19至22的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體對于多特異性抗體的第二結合特異性具有105l/mol*s或更高的解離常數ka。
24.根據權利要求19至23的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體對于與多特異性抗體的第二結合特異性的結合具有5*10_8mol/l或更低的Kd值。
25.根據權利要求19至24的任一項的方法，其特征是與抗獨特型抗體孵育約10分鐘至約36小時。
26.根據權利要求1至25的任一項的方法，其特征是調整樣品至多特異性抗體濃度為約 2 μ g/ml 至約 15 μ g/ml。
27.根據權利要求1至26的任一項的方法，其特征是調整樣品至總抗原濃度為約Ing/ml 至約 250ng/ml。
28.根據權利要求19至27的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體與固相結合或綴合。
29.根據權利要求19至28的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體通過特定的結合對綴合(固定)。
30.根據權利要求29的方法，其特征是結合對(第一組分/第二組分)選自鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原、凝集素/多糖、類固醇/類固醇結合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G。
31.根據權利要求29至30的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體與生物素綴合，且通過固定的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素實施固定。
32.根據權利要求19至31的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體是生物素化的，且固相包被了鏈霉抗生物素。
33.根據權利要求19至31的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體是針對多特異性結合物的生物素化的抗獨特型抗體，且通過鏈霉抗生物素與固相綴合。
34.根據權利要求28至33的任一項的方法，其特征是固相是包被了鏈霉抗生物素的順磁珠或包被了鏈霉抗生物素的瓊脂糖珠。
35.根據權利要求19至34的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體是包含至少兩種抗獨特型抗體的混合物，所述抗獨特型抗體在它們與固相綴合的抗體位點上不同。
36.根據權利要求19至35的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體混合物包含通過至少兩種不同的氨基與固相綴合的抗獨特型抗體。
37.根據權利要求28至36的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體與其綴合搭檔的綴合是通過化學結合實施的，所述化學結合經由N-末端和/或ε-氨基(賴氨酸)和/或不同賴氨酸的ε -氨基、藥物抗體的氨基酸骨架的羧基_、巰基_、羥基-和/或酚-官能團，和/或藥物抗體的碳水化合物結構的糖醇基。
38.根據權利要求28至37的任一項的方法，其特征是抗獨特型抗體通過被動吸附與固相綴合。
39.根據權利要求1至38的任一項的方法，其特征是樣品包含多特異性抗體、游離抗原和多特異性抗體-抗原復合物，且檢測是檢測多特異性抗體的游離抗原。
40.特異性結合多特異性抗體的第一結合特異性的抗獨特型抗體的用途，用于從樣品中耗盡與多特異性抗體的第二結合特異性結合的抗原。
【文檔編號】G01N33/543GK104040350SQ201280063032
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年12月18日 優先權日:2011年12月19日
【發明者】K-G·施圖本拉赫, U·韋塞爾斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司