鑒定調節苦味的化合物的測定的制作方法

鑒定調節苦味的化合物的測定的制作方法
【專利摘要】本發明TAS2R受體TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的激動劑。將激動劑分配給這些受體使得鑒定調節苦味的化合物的測定成為可能。例如，本發明提供鑒定抑制由這些激動劑引起的苦味的化合物的方法。本發明還提供鑒定選擇性抑制由這些激動劑引起的苦味的化合物的方法。本發明進一步提供鑒定模擬由這些激動劑引起的苦味的化合物的方法。本發明還提供鑒定增強由這些激動劑引起的苦味的化合物的方法。
【專利說明】鑒定調節苦味的化合物的測定
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年10月20日提交的美國臨時申請61/549，693的優先權，所述申請通過引用整體并入本文。
發明領域
[0003]本發明涉及鑒定苦味調節劑的測定。
[0004]發明背景
[0005]味覺(如人的味覺)可以鑒別至少五種傳統的味道:甜味、酸味、咸味、苦味和鮮味(美味)。包括植物、食物、食物成分和營養劑的許多營養物質包含促苦味劑和/或具有苦味。此外，對保持或改善健康重要的許多藥物物質包含促苦味劑和/或具有苦味。雖然某些食品和消費品具有合乎需要的苦味，包括咖啡、啤酒和黑巧克力，但在許多情況下，消費者不喜歡這些苦味。例如，許多消費者不喜歡某些促苦味劑和/或苦味的感覺并且回避具有不希望的促苦味劑或苦味的食物或藥物產品而偏好具有較低含量的不希望的促苦味劑或苦味減小或完全沒有苦味的食物和藥物產品。對含有不希望的促苦味劑和/或具有不希望的苦味的產品的這種排斥可能由存在于口腔和/或胃腸道中的苦味受體活化介導的促苦味劑和/或苦味的感覺所引起。在很多情況下，消費者不喜歡促苦味劑和/或苦味妨礙或抑制了食物的營養質量和安全的改善，因為不能使用希望的水平的包含促苦味劑和/或具有苦味的營養劑或防腐劑。此外，對某些藥劑的促苦味劑或苦味的厭惡或排斥使使用這些藥劑的處方方案的順應性受到負面影響。
[0006]例如，在食品的制備中使用的一些添加劑、防腐劑、乳化劑和食材包含促苦味劑和/或具有苦味。雖然這些添加劑、防腐劑、乳化劑和食材可能影響食品的味道，但是它們可能對于改善食品的保存期限、營養質量或質地也是重要的。例如，高血壓和心血管疾病的日益增加的趨勢部分是由于西方飲食的高鈉攝入。因此，用另一種咸味化合物代替氯化鈉是合乎需要的。最常用的氯化鈉替代物是氯化鉀，氯化鉀對一部分人來說除了具有咸味之外還具有苦味。氯化鉀的苦味限制了它可以用于代替食物中的氯化鈉而不給對它敏感的人群產生不希望的苦味的范圍。
[0007]另一種常用的食品添加劑乳酸鈉具有廣泛的抗微生物作用，對抑制酸敗和致病細菌的生長有效，并且通常在食品(例如肉和禽產品)中使用來延長保存期限并增加食物安全性。然而，由于其鈉含量，乳酸鈉作為防腐劑是不合要求的。乳酸鉀具有類似的抗微生物性質，已經用于代替乳酸鈉。然而，乳酸鉀也與苦味相關，這種苦味限制了它可以用于代替食物中的乳酸鈉而不引起不希望的苦味的范圍。
[0008]此外，肥胖和糖尿病的日益增加的發病率部分是由于許多飲食的高糖攝入。因此，用另一種甜味化合物代替糖是合乎需要的。可以用于減少食物中的糖的人造和天然糖替代物往往與苦味相關，這也限制了其用于代替食物中的糖而不引起不利的苦味的范圍。例如，常用的糖替代物是乙酰磺胺酸鉀，其除了具有甜味之外也具有苦味。
[0009]不受理論限制，促苦味劑、促甜味劑和促鮮味劑和化合物通常通過G-蛋白偶聯受體引發味覺反應，而促咸味劑和促酸味劑和化合物通常被假設是通過離子通道引發味覺反應。苦味受體屬于誘導響應于促苦味劑的胞內鈣濃度變化的G-蛋白偶聯受體的TAS2R(也稱為T2R)家族。TAS2R受體通過味蛋白(一種味道特異性的G-蛋白)起作用。有至少二十五種不同的TAS2R家族成員，顯示苦味的感覺是復雜的，其涉及一些不同促味劑-受體相互作用。一些TAS2R成員，如TAS2R60，是不具有鑒定的配體的孤兒受體。能夠調節口腔和/或胃腸道中的苦味受體的活化和/或信號傳導的化合物可以有效地在食物和藥物產品中獲得促苦味劑或苦味物質的希望的使用水平，而不引起消費者由于感覺增加的水平的促苦味劑或苦味厭惡這些產品。在一些情況下，苦味受體和苦味的阻滯劑或調節劑可以通過存在于口腔和/或胃腸道中的苦味受體和/或味道轉導信號傳導機制減小促苦味劑和/或苦味的感覺。
[0010]傳統上，在食物制備和藥物中，使用甜味劑和其它促味劑(包括鹽)來掩蔽苦味。然而，在一些情況下，這是不希望的或不足夠的，因為它可能改變、掩蔽或影響食品中的其它味道/氣味/感覺(例如，非苦味或希望的苦味)。此外，該途徑很少能夠完全地掩蔽存在于這些食品或藥物中的苦味。因此，優選減小苦味的化合物而不是掩蔽劑，或除了掩蔽劑之外減小苦味的化合物是優選的。
[0011]因此，提供鑒定可以加入包含促苦味劑或具有苦味的食品、消費品和藥物中的化合物的測定是合乎需要的，所述化合物用于消除、調節或減小所述促苦味劑或苦味的感覺或減小口腔和/或胃腸道中的苦味受體的相應活化。類似地，鑒定不活化其它苦味受體的化合物(即，具有脫靶影響的化合物)是合乎需要的。
[0012]發明概述
[0013]本發明基于 申請人:在本文公開的發現，即TAS2R受體TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的激動劑。將激動劑分配給這些受體使得鑒定調節苦味的化合物的測定成為可能。例如，本發明提供鑒定抑制由這些激動劑引起的苦味的化合物的方法。本發明還提供鑒定選擇性抑制由這些激動劑引起的苦味的化合物的方法。本發明進一步提供鑒定模擬由這些激動劑引起的苦味的化合物的方法。本發明還提供鑒定增強由這些激動劑引起的苦味的化合物的方法。
[0014]鑒定抑制苦味的化合物的方法
[0015]本發明的一個方面提供鑒定抑制由KCl引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一細胞和第二細胞，其中第一和第二細胞各自表達選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的一者或多者的苦味受體，其中第一和第二細胞表達相同的一種或多種苦味受體；使第一細胞與活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的一者或多者的促味劑接觸；使第二細胞與測試化合物和促味劑接觸；測定第一和第二細胞的苦味受體活化；和比較第一細胞的苦味受體活化與第二細胞的苦味受體活化，其中如果第二細胞的苦味受體活性低于第一細胞的苦味受體活性，則測試化合物是由KCl引起的苦味的抑制劑。
[0016]在一些實施方案中，所述方法包括提供表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的一者或多者的苦味受體的細胞；使細胞與活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的一者或多者的促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第一測定；洗滌細胞；使細胞與測試化合物和促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第二測定；和比較第一測定的苦味受體活化與第二測定的苦味受體活化，其中如果第二測定的苦味受體活性低于第一測定的苦味受體活性，則測試化合物是由KCl引起的苦味的抑制劑。
[0017]本發明的另一方面提供鑒定抑制由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一細胞和第二細胞，其中第一和第二細胞各自表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的一者或多者的苦味受體，其中第一和第二細胞表達相同的一種或多種苦味受體；使第一細胞與活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的一者或多者的促味劑接觸；使第二細胞與測試化合物和促味劑接觸；測定第一和第二細胞的苦味受體活化；和比較第一細胞的苦味受體活化與第二細胞的苦味受體活化，其中如果第二細胞的苦味受體活性低于第一細胞的苦味受體活性，則測試化合物是由乳酸鉀引起的苦味的抑制劑。
[0018]在一些實施方案中，所述方法包括提供表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的一者或多者的苦味受體的細胞；使細胞與活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的一者或多者的促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第一測定；洗滌細胞；使細胞與測試化合物和促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第二測定；和比較第一測定的苦味受體活化與第二測定的苦味受體活化，其中如果第二測定的苦味受體活性低于第一測定的苦味受體活性，則測試化合物是由乳酸鉀引起的苦味的抑制劑。
[0019]本發明的另一方面提供鑒定抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一細胞和第二細胞，其中第一和第二細胞各自表達選自:了八521?1、了4521?4 、了4521?9、了4521?13、了4521?14、了4521?16和了4521?44 的一者或多者的苦味受體，其中第一和第二細胞表達相同的一種或多種苦味受體；使第一細胞與活化TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的一者或多者的促味劑接觸；使第二細胞與測試化合物和促味劑接觸；測定第一和第二細胞的苦味受體活化；和比較第一細胞的苦味受體活化與第二細胞的苦味受體活化，其中如果第二細胞的苦味受體活性低于第一細胞的苦味受體活性，則測試化合物是由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的抑制劑。
[0020]在一些實施方案中，所述方法包括提供表達選自:TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的一者或多者的苦味受體的細胞；使細胞與活化TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的一者或多者的促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第一測定；洗滌細胞；使細胞與測試化合物和促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第二測定；和比較第一測定的苦味受體活化與第二測定的苦味受體活化，其中如果第二測定的苦味受體活性低于第一測定的苦味受體活性，則測試化合物是由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的抑制劑。
[0021 ] 在一些實施方案中，所述促味劑是KCl、乳酸鉀、乙酰磺胺酸鉀或普通苦味化合物。在一些實施方案中，所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。
[0022]在一些實施方案中，所述苦味受體與G蛋白復合。在一些實施方案中，所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。在一些實施方案中，所述Gq蛋白是Gal5蛋白。
[0023]在一些實施方案中，所述苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。在一些實施方案中，所述胞內鈣濃度是使用諸如Fluo-4或鈣-3染料的鈣敏感性熒光染料測定的。[0024]在一些實施方案中，本方法的細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，所述細胞存在于體外細胞系的小組中。
[0025]鑒定選擇性抑制苦味的化合物的方法
[0026]本發明的一方面提供鑒定選擇性抑制由KCl引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一和第二小組的細胞系，其中每個小組包括表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的一者或多者的苦味受體的細胞系，并且每種受體在至少一種細胞系中表達，且每個小組含有相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少兩者的促味劑接觸；使第二小組中的細胞系與測試化合物和促味劑接觸；測定第一和第二小組中的每種細胞系的苦味受體活化；和比較第一小組中的每種細胞系的苦味受體活化與第二小組中相應細胞的苦味受體活化，其中如果與第一小組相比，第二小組中的選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少兩者的苦味受體活性較低，則測試化合物是由KCl引起的苦味的選擇性抑制劑。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少三種細胞系中較低，其中所述細胞系選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60，則測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少四種細胞系中較低，其中所述細胞系選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60，則測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少五種細胞系中較低，其中所述細胞系選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60，則測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在針對TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60細胞系的每一者的第二小組中較低，則測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60，其中每種受體在每個小組的至少一種細胞系中表達。在一些實施方案中，與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50和TAS2R55苦味受體活性。在一些實施方案中，將第一小組的每種細胞系在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。
[0027]本發明的另一方面提供鑒定選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一和第二小組的細胞系，其中小組包括表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的一者或多者的苦味受體的細胞系，并且每種受體在至少一種細胞系中表達，且每個小組含有相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與活化 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60的至少兩者的促味劑接觸；使第二小組中的細胞系與測試化合物和促味劑接觸；測定第一和第二小組中的每種細胞系的苦味受體活化；和比較第一小組中的每種細胞系的苦味受體活化與第二小組中相應細胞的苦味受體活化，其中如果與第一小組相比，第二小組中的選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少兩者的苦味受體活性較低，則測試化合物是由乳酸鉀引起的苦味的選擇性抑制劑。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少三種細胞系中較低，其中所述細胞系選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60，則測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少四種細胞系中較低，其中所述細胞系選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60，則測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少五種細胞系中較低，其中所述細胞系選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60，則測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少六種細胞系中較低，其中所述細胞系選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60，則測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 細胞系的每一者中較低，則測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和TAS2R60，其中每種受體在每個小組的至少一種細胞系中表達。在一些實施方案中，與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50和TAS2R55苦味受體活性。在一些實施方案中，將第一小組的每種細胞系在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。
[0028]本發明的另一方面提供鑒定選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一和第二小組的細胞系，其中所述小組包括表達選自:TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的一者或多者的苦味受體的細胞系，且每種受體在至少一種細胞系中表達并且每種受體在至少一種細胞系中表達且每個小組含有相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與活化TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少兩者的促味劑接觸；使第二小組中的細胞系與測試化合物和促味劑接觸；測定第一和第二小組中的每種細胞系的苦味受體活化；和比較第一小組中的每種細胞系的苦味受體活化與第二小組中相應細胞的苦味受體活化，其中如果與第一小組相比，在第二小組中選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少兩者的苦味受體活性較低，則測試化合物是由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的選擇性抑制劑。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少三種細胞系中較低，其中所述細胞系選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44，則測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少四種細胞系中較低，其中所述細胞系選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44，則測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少五種細胞系中較低，其中所述細胞系選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44，則測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的至少六種細胞系中較低，其中所述細胞系選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44，則測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在第二小組的TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 細胞系的每一者中較低，則測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和TAS2R60，其中每種受體在每個小組的至少一種細胞系中表達。在一些實施方案中，與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55和TAS2R60苦味受體活性。在一些實施方案中，將第一小組的每種細胞系在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。
[0029]在一些實施方案中，所述促味劑是KCl、乳酸鉀、乙酰磺胺酸鉀或普通苦味化合物。在一些實施方案中，所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。
[0030]在一些實施方案中，所述苦味受體與G蛋白復合。在一些實施方案中，所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。在一些實施方案中，所述Gq蛋白是Gal5蛋白。
[0031 ] 在一些實施方案中，所述苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。在一些實施方案中，所述胞內鈣濃度是使用諸如Fluo-4或鈣-3染料的鈣敏感性熒光染料測定的。
[0032]在一些實施方案中，本方法的細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，所述細胞存在于體外細胞系的小組中。
[0033]鑒定模擬苦味的化合物的方法
[0034]本發明的一方面提供鑒定模擬由KCl引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一和第二小組的細胞系，其中小組包括表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的一種或多種苦味受體的細胞系，并且每種受體在至少一種細胞系中表達且每個小組含有相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與陰性對照接觸；使第二小組中的每種細胞系與測試化合物接觸；測定第一和第二小組中的每種細胞系的苦味受體活化；和比較第一小組中的每種細胞系的苦味受體活化與第二小組中相應細胞的苦味受體活化，其中與第一小組相比，如果在第二小組中所述測試化合物誘導 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 苦味受體活性，則測試化合物模擬由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60，其中每種受體在每個小組的至少一種細胞系中表達。在一些實施方案中，與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50和TAS2R55苦味受體活性。在一些實施方案中，將第一小組的每種細胞系在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加測試化合物之前的測定緩沖液。
[0035]本發明的另一方面提供鑒定模擬由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一和第二小組的細胞系，其中小組包括表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的一種或多種苦味受體的細胞系，并且每種受體在至少一種細胞系中表達且每個小組含有相同的細胞系；使第一小組的每種細胞系與陰性對照接觸；使第二小組中的每種細胞系與測試化合物接觸；測定第一和第二小組中的每種細胞系的苦味受體活化；和比較第一小組中的每種細胞系的苦味受體活化與第二小組中相應細胞的苦味受體活化，其中如果與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物誘導 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 苦味受體活性，則測試化合物模擬由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和TAS2R60，其中每種受體在每個小組的至少一種細胞系中表達。在一些實施方案中，與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50和TAS2R55苦味受體活性。在一些實施方案中，將第一小組的每種細胞系在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加測試化合物之前的測定緩沖液。
[0036]本發明的另一方面提供鑒定模擬由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一和第二小組的細胞系，其中小組包括表達選自:TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的一種或多種苦味受體的細胞系，并且每種受體在至少一種細胞系中表達且每個小組含有相同的細胞系；使第一小組的每種細胞系與陰性對照接觸；使第二小組中的每種細胞系與測試化合物接觸；測定第一和第二小組中的每種細胞系的苦味受體活化；和比較第一小組中的每種細胞系的苦味受體活化與第二小組中相應細胞的苦味受體活化，其中如果與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物誘導 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44苦味受體活性，則測試化合物模擬由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55和TAS2R60，其中每種受體在每個小組的至少一種細胞系中表達。在一些實施方案中，與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體活性。在一些實施方案中，將第一小組的每種細胞系在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加測試化合物之前的測定緩沖液。
[0037]在一些實施方案中，所述苦味受體與G蛋白復合。在一些實施方案中，所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。在一些實施方案中，所述Gq蛋白是Gal5蛋白。[0038]在一些實施方案中，苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。在一些實施方案中，胞內鈣濃度是使用諸如Fluo-4或鈣-3染料的鈣敏感性熒光染料來測定的。
[0039]在一些實施方案中，本方法的細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，所述細胞存在于體外細胞系的小組中。
[0040]鑒定增強苦味的化合物的方法
[0041]本發明的一方面提供鑒定增強由KCl引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一細胞和第二細胞，所述細胞各自表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的一種或多種苦味受體；使第一細胞與活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的一者或多者的促味劑接觸；使第二細胞與測試化合物和促味劑接觸；測定第一和第二細胞的苦味受體活化；和比較所述第一細胞的苦味受體活化與所述第二細胞的苦味受體活化，其中如果第二細胞的苦味受體活性高于第一細胞的苦味受體活性，則測試化合物是由KCl引起的苦味促進劑。在一些實施方案中，所述方法包括提供表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的一者或多者的苦味受體的細胞；使細胞與活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的一者或多者的促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第一測定；洗滌細胞；使細胞與測試化合物和促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第二測定；和比較第一測定的苦味受體活化與第二測定的苦味受體活化，其中如果第二測定的苦味受體活性高于第一測定的苦味受體活性，則測試化合物是由KCl引起的苦味的促進劑。
[0042]本發明的另一方面提供鑒定增強由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一細胞和第二細胞，所述細胞各自表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的一者或多者的苦味受體；使第一細胞與活化 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的一者或多者的促味劑接觸；使第二細胞與測試化合物和促味劑接觸；測定第一和第二細胞的苦味受體活化；和比較所述第一細胞的苦味受體活化與所述第二細胞的苦味受體活化，其中如果第二細胞的苦味受體活性高于第一細胞的苦味受體活性，則測試化合物是由乳酸鉀引起的苦味的促進劑。在一些實施方案中，所述方法包括提供表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的一者或多者苦味受體；使細胞與活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的一者或多者的促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第一測定；洗滌細胞；使細胞與測試化合物和促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第二測定；和比較第一測定的苦味受體活化與第二測定的苦味受體活化，其中如果第二測定的苦味受體活性高于第一測定的苦味受體活性，則測試化合物是由乳酸鉀引起的苦味的促進劑。
[0043]本發明的另一方面提供鑒定增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一細胞和第二細胞，所述細胞各自表達選自:TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的一者或多者的苦味受體；使第一細胞與活化 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的一者或多者的促味劑接觸；使第二細胞與測試化合物和促味劑接觸；測定第一和第二細胞的苦味受體活化；和比較第一細胞的苦味受體活化與第二細胞的苦味受體活化，其中如果第二細胞的苦味受體活性高于第一細胞的苦味受體活性，則測試化合物是由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的促進劑。在一些實施方案中，所述方法包括提供表達選自:TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的一者或多者的苦味受體；使細胞與活化TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的一者或多者的促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第一測定；洗滌細胞；使細胞與測試化合物和促味劑接觸；進行對苦味受體活化的第二測定；和比較第一測定的苦味受體活化與第二測定的苦味受體活化，其中如果第二測定的苦味受體活性高于第一測定的苦味受體活性，則測試化合物是由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的促進劑。
[0044]在一些實施方案中，所述促味劑是KCl、乳酸鉀、乙酰磺胺酸鉀或普通苦味化合物。在一些實施方案中，所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。
[0045]在一些實施方案中，所述苦味受體與G蛋白復合。在一些實施方案中，所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。在一些實施方案中，所述Gq蛋白是Gal5蛋白。
[0046]在一些實施方案中，所述苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。在一些實施方案中，所述胞內鈣濃度是使用諸如Fluo-4或鈣-3染料的鈣敏感性熒光染料來測定的。
[0047]在一些實施方案中，本方法的細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，所述細胞存在于體外細胞系的小組中。
[0048]確定促苦味劑是否存在于組合物中的方法
[0049]本發明的一方面提供確定KCl是否存在于組合物中的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的一種或多種苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60，并且每種受體在至少一種細胞系中表達且每個小組含有相同的細胞系；使第一小組的每種細胞系與陰性對照接觸；使第二小組中的每種細胞系與組合物接觸；測定第一和第二小組中的每種細胞系的苦味受體活化；和比較第一小組中的每種細胞系的苦味受體活化與第二小組中相應細胞的苦味受體活化，其中如果與第一小組相比在第二小組中組合物誘導TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60苦味受體活性，并且與第一小組相比在第二小組中組合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和TAS2R55苦味受體活性，則KCl存在于組合物中。在一些實施方案中，將第一小組的每種細胞系在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加組合物之前的測定緩沖液。
[0050]本發明的另一方面提供確定乳酸鉀是否存在于組合物中的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的一種或多種苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60，并且每種受體在至少一種細胞系中表達且每個小組含有相同的細胞系；使第一小組的每種細胞系與陰性對照接觸；使第二小組中的每種細胞系與組合物接觸；測定第一和第二小組中的每種細胞系的苦味受體活化；和比較第一小組中的每種細胞系的苦味受體活化與第二小組中相應細胞的苦味受體活化，其中與第一小組相比在第二小組中組合物誘導TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60苦味受體活性，并且與第一小組相比在第二小組中組合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50和TAS2R55苦味受體活性，則乳酸鉀存在于組合物中。在一些實施方案中，將第一小組的每種細胞系在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加組合物之前的測定緩沖液。
[0051]本發明的另一方面提供確定乙酰磺胺酸鉀是否存在于組合物中的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的一種或多種苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60，并且每種受體在至少一種細胞系中表達且每個小組含有相同的細胞系；使第一小組的每種細胞系與陰性對照接觸；使第二小組中的每種細胞系與組合物接觸；測定第一和第二小組中的每種細胞系的苦味受體活化；和比較第一小組中的每種細胞系的苦味受體活化與第二小組中相應細胞的苦味受體活化，其中如果與第一小組相比在第二小組中組合物誘導TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44苦味受體活性，并且與第一小組相比在第二小組中組合物不誘導 TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55和TAS2R60苦味受體活性，則乙酰磺胺酸鉀存在于組合物中。在一些實施方案中，將第一小組的每種細胞系在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加組合物之前的測定緩沖液。
[0052]在一些實施方案中，所述組合物是食品提取物。在一些實施方案中，所述組合物包含藥物活性成分。
[0053]在一些實施方案中，所述苦味受體與G蛋白復合。在一些實施方案中，所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。在一些實施方案中，所述Gq蛋白是Gal5蛋白。
[0054]在一些實施方案中，苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。在一些實施方案中，胞內鈣濃度是使用諸如Fluo-4或鈣-3染料的鈣敏感性熒光染料來測定的。
[0055]在一些實施方案中，本方法的細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，所述細胞存在于體外細胞系的小組中。
[0056]本發明具體的實施方案在以下編號的段落中示出:
[0057]1.一種鑒定抑制由KCl引起的苦味的化合物的方法，其包括:
[0058]a)提供第一和第二細胞，
[0059]其中每種細胞表達獨立選自以下的一種或多種苦味受體:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 苦味受體，并且
[0060]其中每種細胞表達相同的一種或多種苦味受體；
[0061]b)使所述第一細胞與促味劑接觸，
[0062]其中所述促味劑活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 苦味受體的一者或多者；
[0063]c)使所述第二細胞與測試化合物和所述促味劑接觸；
[0064]d)測定所述第一和第二細胞的苦味受體活化；和
[0065]e)比較所述第一細胞的苦味受體活化與所述第二細胞的苦味受體活化，
[0066]其中如果所述第二細胞的苦味受體活性低于所述第一細胞的苦味受體活性，則測試化合物是由KCl引起的苦味的抑制劑。
[0067]2.一種鑒定抑制由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法，其包括:
[0068]a)提供第一和第二細胞，
[0069]其中每種細胞表達獨立選自以下的一種或多種苦味受體:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 苦味受體，并且
[0070]其中每種細胞表達相同的一種或多種苦味受體；
[0071]b)使所述第一細胞與促味劑接觸，
[0072]其中所述促味劑活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60苦味受體的一種或多種；
[0073]c)使所述第二細胞與測試化合物和所述促味劑接觸；
[0074]d)測定所述第一和第二細胞的苦味受體活化；和
[0075]e)比較所述第一細胞的苦味受體活化與所述第二細胞的苦味受體活化，
[0076]其中如果所述第二細胞的苦味受體活性低于所述第一細胞的苦味受體活性，則測試化合物是由乳酸鉀引起的苦味的抑制劑。
[0077]3.根據段落1-2中任一項所述的方法，其中所述促味劑是KC1、乳酸鉀或普通苦味化合物。
[0078]4.根據段落1-3中任一項所述的方法，其中所述苦味受體與G蛋白復合。
[0079]5.根據段落4所述的方法，其中所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。
[0080]6.根據段落5所述的方法，其中所述Gq蛋白是Gal5蛋白。
[0081]7.根據段落1-6中任一項所述的方法，其中所述苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。
[0082]8.根據段落7所述的方法，其中所述胞內鈣濃度是使用鈣敏感性熒光染料來測定的。
[0083]9.根據段落8所述的方法，其中所述鈣敏感性熒光染料是Fluo-4或鈣_3染料。
[0084]10.根據段落1-9中任一項所述的方法，其中所述第一和第二細胞存在于體外細胞系中。
[0085]11.根據段落1-9中任一項所述的方法，其中所述第一和第二細胞存在于體外細胞系小組中。
[0086]12.根據段落1-11中任一項所述的方法，其中所述普通苦味化合物是是苯甲地那銨或糖精地那銨(denatonium saccharide)。
[0087]13.一種鑒定選擇性抑制由KCl引起的苦味的化合物的方法，其包括:
[0088]a)提供第一和第二小組的細胞系，
[0089]其中每種細胞系包括表達選自以下的苦味受體的細胞:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 苦味受體，[0090]其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且
[0091]其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；
[0092]b)使所述第一小組中的每種細胞系與促味劑接觸，
[0093]其中所述促味劑活化選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60的至少兩者；
[0094]c)使所述第二小組中的每種細胞系與測試化合物和所述促味劑接觸；
[0095]d)測定每種細胞系的苦味受體活化；
[0096]其中，如果與第一小組相比，在第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少兩者的苦味受體活性較低，則測試化合物是由KCl引起的苦味的選擇性抑制劑。
[0097]14.根據段落13所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少三者的苦味受體活性較低。
[0098]15.根據段落13所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少四者的苦味受體活性較低。
[0099]16.根據段落13所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少五者的苦味受體活性較低。
[0100]17.根據段落13所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的苦味受體活性較低。
[0101]18.根據段落13-17中任一項所述的方法，其中每個小組包括表達選自以下的苦味受體的細胞系:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體，
[0102]其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且
[0103]其中第一和第二小組包括相同的細胞系。
[0104]19.根據段落18所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中測試化合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和TAS2R55苦味受體活性。
[0105]20.一種鑒定選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法，其包括:
[0106]a)提供第一和第二小組的細胞系，
[0107]其中每種細胞系包括表達選自以下的苦味受體的細胞:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 苦味受體，
[0108]其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且
[0109]其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；
[0110]b)使所述第一小組中的每種細胞系與促味劑接觸，
[0111]其中所述促味劑活化選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少兩者；
[0112]c)使所述第二小組中的每種細胞系與測試化合物和所述促味劑接觸；
[0113]d)測定每種細胞系的苦味受體活化；[0114]其中，如果與第一小組相比，在第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少兩者的苦味受體活性較低，則測試化合物是由乳酸鉀引起的苦味的選擇性抑制劑。
[0115]21.根據段落20所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少三者的苦味受體活性較低。
[0116]22.根據段落20所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少四者的苦味受體活性較低。
[0117]23.根據段落20所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少五者的苦味受體活性較低。
[0118]24.根據段落20所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少六者的苦味受體活性較低。
[0119]25.根據段落13所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的苦味受體活性較低。
[0120]26.根據段落20-25中任一項所述的方法，其中每個小組包括表達選自以下的苦味受體的細胞系:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體，
[0121]其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且
[0122]其中第一和第二小組包括相同的細胞系。
[0123]27.根據段落26所述的方法，其中與第一小組相比，在第二小組中測試化合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和 TAS2R55 苦味受體活性。
[0124]28.根據段落13-27中任一項所述的方法，其中所述促味劑是KC1、乳酸鉀或普通苦味化合物。
[0125]29.根據段落13-28中任一項所述的方法，其中所述苦味受體與G蛋白復合。
[0126]30.根據段落29所述的方法，其中所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。
[0127]31.根據段落30所述的方法，其中所述Gq蛋白是Gal5蛋白。
[0128]32.根據段落28-31中任一項所述的方法，其中苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。
[0129]33.根據段落32所述的方法，其中胞內鈣濃度是使用鈣敏感性熒光染料來測定的。
[0130]34.根據段落33所述的方法，其中所述鈣敏感性熒光染料是Fluo-4或鈣_3染料。
[0131]35.根據段落28-34中任一項所述的方法，其中所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。
[0132]36.根據段落13-34中任一項所述的方法，其中將來自第一小組的細胞系在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。
[0133]37.一種鑒定增強由KCl引起的苦味的化合物的方法，所述方法包括:
[0134]a)提供第一和第二細胞，[0135]其中每種細胞表達獨立選自以下的一種或多種苦味受體:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 苦味受體；
[0136]b)使所述第一細胞與促味劑接觸，
[0137]其中所述促味劑活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 苦味受體的一者或多者；
[0138]c)使所述第二細胞與測試化合物和所述促味劑接觸；
[0139]d)測定所述第一和第二細胞的苦味受體活化；和
[0140]e)比較所述第一細胞的苦味受體活化與所述第二細胞的苦味受體活化，
[0141]其中如果所述第二細胞的苦味受體活性高于所述第一細胞的苦味受體活性，則測試化合物增強由KCl引起的苦味。
[0142]38.一種鑒定增強由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法，其包括:
[0143]a)提供第一和第二細胞，
[0144]其中每種細胞表達獨立選自以下的一種或多種苦味受體:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 苦味受體；
[0145]b)使所述第一細胞與促味劑接觸，
[0146]其中所述促味劑活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60苦味受體的一種或多種；
[0147]c)使所述第二細胞與測試化合物和所述促味劑接觸；
[0148]d)測定所述第一和第二細胞的苦味受體活化；和
[0149]e)比較所述第一細胞的苦味受體活化與所述第二細胞的苦味受體活化，
[0150]其中如果所述第二細胞的苦味受體活性高于所述第一細胞的苦味受體活性，則測試化合物增強由乳酸鉀引起的苦味。
[0151]39.根據段落37-38中任一項所述的方法，其中所述促味劑是KC1、乳酸鉀或普通苦味化合物。
[0152]40.根據段落37-39中任一項所述的方法，其中所述苦味受體與G蛋白復合。
[0153]41.根據段落40所述的方法，其中所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。
[0154]42.根據段落41所述的方法，其中所述Gq蛋白是Gal5蛋白。
[0155]43.根據段落37-42中任一項所述的方法，其中所述苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。
[0156]44.根據段落43所述的方法，其中所述胞內鈣濃度是使用鈣敏感性熒光染料來測定的。
[0157]45.根據段落44所述的方法，其中所述鈣敏感性熒光染料是Fluo-4或鈣_3染料。
[0158]46.根據段落37-45中任一項所述的方法，其中所述細胞存在于體外細胞系中。
[0159]47.根據段落37-45中任一項所述的方法，其中所述細胞存在于一組體外細胞系中。
[0160]48.根據段落39-47中任一項所述的方法，其中所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。
[0161]49.根據段落37-48中任一項所述的方法，其中將所述第一細胞在苦味受體活化測定之后洗滌，以提供所述第二細胞。[0162]50.一種鑒定抑制由KCl引起的苦味的化合物的方法，其包括:
[0163]a)提供細胞，
[0164]其中所述細胞表達選自以下的一種或多種苦味受體:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 苦味受體；
[0165]b)使所述細胞與促味劑接觸，
[0166]其中所述促味劑活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 苦味受體的一者或多者；
[0167]c)測定所述細胞的苦味受體活化；
[0168]d)洗滌所述細胞；
[0169]e)使所述細胞與測試化合物和促味劑接觸；
[0170]f)測定所述細胞的苦味受體活化；和
[0171]g)比較步驟(C)中的所述細胞的苦味受體活化與步驟(f)中的所述細胞的苦味受體活化，
[0172]其中如果步驟(f)中的苦味受體活性低于步驟(C)中的苦味受體活性，則測試化合物是由KCl引起的苦味的抑制劑。
[0173]51.一種鑒定抑制由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法，其包括:
[0174]a)提供細胞，
[0175]其中所述細胞表達選自以下的一種或多種苦味受體:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 苦味受體；
[0176]b)使所述細胞與促味劑接觸，
[0177]其中所述促味劑活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60苦味受體的一種或多種；
[0178]c)測定所述細胞的苦味受體活化；
[0179]d)洗滌所述細胞；
[0180]e)使所述細胞與測試化合物和促味劑接觸；
[0181]f)測定所述細胞的苦味受體活化；和
[0182]g)比較步驟(C)中的所述細胞的苦味受體活化與步驟(f)中的所述細胞的苦味受體活化，
[0183]其中如果步驟(f)中的苦味受體活性低于步驟(C)中的苦味受體活性，則測試化合物是由乳酸鉀引起的苦味的抑制劑。
[0184]52.根據段落50-51中任一項所述的方法，其中所述促味劑是KC1、乳酸鉀或普通苦味化合物。
[0185]53.根據段落50-52中任一項所述的方法，其中所述苦味受體與G蛋白復合。
[0186]54.根據段落53所述的方法，其中所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。
[0187]55.根據段落54所述的方法，其中所述Gq蛋白是Gal5蛋白。
[0188]56.根據段落50-55中任一項所述的方法，其中苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。
[0189]57.根據段落56所述的方法，其中所述胞內鈣濃度是使用鈣敏感性熒光染料來測定的。[0190]58.根據段落57所述的方法，其中所述鈣敏感性熒光染料是Fluo-4或鈣_3染料。
[0191]59.根據段落50-58中任一項所述的方法，其中所述細胞存在于體外細胞系中。
[0192]60.根據段落50-58中任一項所述的方法，其中所述細胞存在于一組體外細胞系中。
[0193]61.根據段落52-60中任一項所述的方法，其中所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。
[0194]附圖簡述
[0195]圖1表明在所有線中，所有二十五種苦味細胞系對內源性受體激動劑異丙腎上腺素的響應是高度一致的。百分比響應(Y-軸)作為異丙腎上腺素濃度(X-軸)的函數來作圖，并且將結果擬合成曲線以計算EC5tl值(半數最大受體活化的濃度)。對于所有二十五種細胞系，EC50值大約為4.9±0.41nM。
[0196]圖2表明六種受體顯示對KCl (20mM)有穩健的功能響應，這顯示這些六種受體特別適于檢測KC1。其余的十九種受體無一提供超過閾值(40%)的功能響應。
[0197]圖3提供㈧響應于在表達KCl-特異性受體的細胞系中的KCl添加的KCl信號傳導的劑量-響應曲線，和(B)響應于在表達KCl-特異性受體的細胞系中緩沖液添加的KCl信號傳導的劑量-響應曲線。Y-軸代表熒光(RFU)。在㈧中，X-軸代表log KCl濃度(M)。在無KCl添加的⑶中的X-軸反映了 log㈧中的KCl濃度(M)。
[0198]圖4表明七種受體顯示對乳酸鉀(20mM)穩健的功能響應，這表明這些七種受體特別適于檢測乳酸鉀。其余的十八種受體無一提供超過閾值(40%)的功能響應。
[0199]圖5表明七種受體顯示對乙酰磺胺酸鉀(20mM)穩健的功能響應，這表明這些七種受體特別適于檢測乙酰磺胺酸鉀。其余的十八種受體無一提供超過閾值(40%)的功能響應。
[0200]圖6表明所有二十五種細胞系對KC1、乳酸鉀和乙酰磺胺酸鉀的功能反應性。
[0201]發明詳述
[0202]為了本文描述的發明可被完全理解，示出以下詳述。
[0203]除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與為本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的那些術語相同的含義。盡管與本文描述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料可于本發明的實踐或測試中，但以下描述適合的方法和材料。所述材料、方法和實施例僅為示例性的，并非意在限制。本文提及的所有出版物、專利和其它文件均為了所有目的以引用方式并入。
[0204]在該說明書通篇中，詞語“包括/包含(comprise) ”或變體諸如“包括/包含(comprises, comprising) ”將被理解為暗示包括所述的整數或整數組,但不排除任何其它整數或整數組。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括復數且復數術語應包括單數。術語“或更多”和“至少”可在本文中互換使用。例如“兩個/兩種或更多個/更多種”和“至少兩個/至少兩種”可互換使用。類似地，術語“小于/少于”或“大于/高于”可在本文中互換使用，例如，“A小于/少于B”和“B大于/高于A”可互換使用。
[0205]術語“激動劑”、“增效劑”或“活化劑”是指增加苦味受體活性從而導致胞內分子的數量或分布或者酶的活性變化的一種化合物或物質，這是苦味受體胞內信號傳導路徑的一部分。所述胞內分子的實例包括但不限于游離鈣、環腺苷酸(cAMP)、肌醇單磷酸、肌醇二磷酸或肌醇三磷酸。所述酶的實例包括但不限于腺苷酸環化酶、磷脂酶_C、G蛋白偶聯受體激酶。
[0206]術語“拮抗劑”、“抑制劑”或“阻滯劑”是指降低苦味受體活性從而導致胞內分子的數量或分布或者酶的活性變化的一種化合物或物質，這是苦味受體的胞內信號傳導路徑一部分。所述胞內分子的實例包括但不限于游離鈣、環腺苷酸(cAMP)、肌醇單磷酸、肌醇二磷酸或肌醇三磷酸。所述酶的實例包括但不限于腺苷酸環化酶、磷脂酶-C、G蛋白偶聯受體激酶。如本文所用，抑制劑、拮抗劑或阻滯劑可作用于所有或特定亞類的苦味受體。所述抑制劑、拮抗劑或阻滯劑可將TAS2R受體的活性降低至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或 100%。
[0207]術語“人造甜味劑”和“糖替代物”是指帶來甜味但具有比糖低的熱能的食品添加齊U。在一些情況下，“人造甜味劑”或“糖替代物”的熱能可忽略不計。
[0208]如本文所用的術語“苦”或“苦味”是指在檢測促苦味劑之后產生的感覺或味覺。以下屬性可導致苦味:澀味、苦澀味、金屬味、苦金屬味以及異味、余味和包括但不限于凍灼味和紙板味的不良味道、和/或這些味道的任何組合。需要注意的是，在本領域，術語“異味”常與“苦味”意義相同。不受理論的限制，苦味的多樣性可反映出大量苦味受體和這些受體對促苦味劑的差分檢測。如本文所用的苦味包括促苦味劑對苦味受體的活化。如本文所用的苦味還包括促苦味劑對苦味受體的活化及隨后的下游信號傳導。如本文所用的苦味還包括在促苦味劑刺激之后信號傳導路徑的活化。如本文所用的苦味進一步包括由苦味受體檢測促苦味劑之后的信號傳導引起的感覺。如本文所用的苦味進一步包括由使苦味受體與促苦味劑接觸之后的信號傳導引起的感覺。苦味可以在腦中感覺到。
[0209]術語“苦味受體”是指促苦味劑可結合其上的受體，通常為細胞表面受體。苦味受體可存在于口腔和/或口外組織中，如，于整個胃腸道(包括胃、腸和結腸)的味覺樣(taste-like)激素分泌細胞中。苦味受體還可存在于體外，諸如在包括但不限于基于細胞的測定或結合測定的測定中。
[0210]術語“促苦味劑”、“苦味配體”或“苦味化合物”是指活化苦味受體或可被苦味受體檢測的化合物和/或為受試者帶來苦味感覺的化合物。“促苦味劑”還指聯合以活化苦味受體或可被苦味受體檢測和/或為受試者帶來苦味感覺的多個化合物。“促苦味劑”進一步是指受試者攝入時經酶修飾活化苦味受體或被苦味受體檢測和/或為受試者帶來苦味感覺的化合物。因為苦味感覺可能隨個體不同而變化，所以與其它個體對相同化合物感覺到的那類苦味相比，某些個體可能把“促苦味劑”描述為帶來不同種類的苦味的化合物。術語促苦味劑還指帶來苦味的化合物。
[0211]術語“細胞系”或“克隆細胞系”是指一類細胞，其都是單一原細胞的后代。如本文所用，將細胞系體外維持在細胞培養物中，并且可以等份的形式冷凍以建立克隆細胞庫。
[0212]術語“消費品”是指用于個人使用和/或被受試者消耗的保健和美容產品。消費品可以以任何形式存在，包括但不限于液體、固體、半固體、片劑、膠囊、錠劑、條狀(strip)、粉劑、凝膠劑、膠、糊劑、漿液、糖漿、氣溶膠和噴霧劑。消費品的非限制性實例包括保健營養品、營養補充劑、口紅、唇膏、皂、洗發劑、膠、粘合劑(如牙科粘合劑)、牙膏、口服鎮痛藥、口氣清新劑(breath freshener)、漱口劑、牙齒增白劑和其它潔齒劑。
[0213]術語“接觸”是指拮抗劑、激動劑、調節劑、促味劑或測試化合物與多肽(如，TAS2R受體)或表達多肽的宿主細胞之間的任何相互作用，從而至少兩種組分中的任一個可以在液相中(例如在溶液中或在懸浮液中)獨立于彼此，或可結合至固相，例如以基本上平面的形式或以顆粒、微粒(pearl)等的形式。所述多肽可為TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 或 TAS2R60。類似地，所述宿主細胞可表達 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55、TAS2R60 或其組合。
[0214]術語“飲食”通指由受試者消耗的食品和/或飲料。受試者的“飲食”還包括受試者攝取的任何消費品或藥物組合物。
[0215]術語“可食用的組合物”是指適于消耗的組合物，通常經由口腔(盡管消耗可經由非口途徑諸如吸入來發生)。可食用的組合物可以任何形式存在，包括但不限于液體、固體、半固體、片劑、錠劑、粉劑、凝膠劑、膠、糊劑、漿液、糖漿、氣溶膠和噴霧劑。如本文所用，可食用的組合物包括食品、藥物組合物和消費品。術語食用的組合物還指例如膳食和營養補充劑。如本文所用，可食用組合物還包括可置口腔內但不被吞咽的組合物，包括專業的牙科產品，諸如牙科治療、填充物、包裝材料、模具和拋光劑。術語“可食用的(comestible)”是指類似的組合物，并且通常用作為術語“可食用的(edible) ”的同義詞。
[0216]術語“有效量”是指足夠產生期望的性質或結果的量。例如，本發明測定中使用的化合物的有效量是能夠降低與促苦味劑相關的苦味感覺的量。通常，本發明測定中使用的化合物的有效量是能夠抑制促苦味劑對苦味受體活化的量。可選地，本發明測定中使用的化合物的有效量是在另一種促苦味劑的存在下能夠活化苦味受體的量。
[0217]術語“氣味調節劑”是指當添加至可食用的組合物(諸如食品)時，修飾(如，掩蔽、消除、減小、降低或增加)存在于所述可食用組合物中的氣味(如，甜味、咸味、鮮味、酸味或苦味)的感覺的化合物或化合物的混合物。
[0218]短語“功能性苦味受體”是指以與在正常表達苦味受體而未工程化的細胞中的苦味受體大體上相同的方式，響應于已知的活化劑或已知的抑制劑的苦味受體。苦味受體行為可通過例如生理活動和藥理學響應來確定。生理活動包括但不限于苦味感覺。藥理學響應包括但不限于胞內分子的數量或分布或者酶活性的改變，當使苦味受體與調節劑接觸時，這是苦味受體的胞內信號傳導路徑的一部分。例如，藥理學響應可包括當苦味受體被活化時胞內游離鈣的增加，或者當苦味受體被阻斷時胞內游離鈣的降低。
[0219]術語“調節劑”是指主動或被動改變苦味受體的結構、構象、生物化學或生物物理性質或功能性的化合物或物質。所述調節劑可為苦味受體激動劑(增效劑或活化劑)或拮抗劑(抑制劑或阻滯劑)，包括部分激動劑或拮抗劑、選擇性激動劑或拮抗劑和反向激動齊U，并且可為別構調節劑。即使一種物質或化合物的調節活性在不同條件或濃度下或根據苦味受體的不同形式(如天然存在的形式VS.突變體形式)及苦味受體的不同的天然存在的等位基因變體(如由于多態性)而變化，所述物質或化合物仍是調節劑。如本文所用，調節劑可影響苦味受體的活性、苦味受體對另一種調節化合物的響應或者苦味受體的選擇性。調節劑還可改變另一種調節劑影響苦味受體功能的能力。調節劑可作用于所有苦味受體或特定亞類的苦味受體。所述調節劑包括但不限于增效劑、活化劑、抑制劑、激動劑、拮抗劑和阻滯劑。
[0220]如本文所用，術語“天然”蛋白(如苦味受體)是指不具有隨附或插入其中的異源氨基酸序列的蛋白質。例如，本文使用的“天然苦味受體”包括不具有在多肽水平表達的標簽序列的苦味受體。盡管將苦味受體稱之為天然， 申請人:并非意在排除包含氨基酸取代、突變或缺失的苦味受體變體，或者為天然存在或之前已知的受體蛋白的片段或剪接形式的變體。
[0221]術語“脫靶效應”是指非目標味道受體的不期望的調節、活化或抑制。例如，如果苦味調節劑意在調節苦味受體的具體亞類的活性，并且其還調節其它苦味受體或其它味道受體(諸如甜味受體和鮮味受體)的活性，則苦味調節劑顯示出脫靶效應。類似地，如果味道調節劑意在調節由于促苦味劑導致的苦味，且如果其調節由于另一種促味劑導致的味道或如果其本身帶有味道，則味道調節劑顯示出脫靶效應。苦味調節劑的脫靶效應可導致鮮味、甜味、酸味、鮮味和/或苦味的活化或抑制。
[0222]術語“百萬分之一”和“ppm”可用于指食物工業中溶液的低濃度。例如，在IOOOml溶劑中的一克溶質的濃度為lOOOppm，和在IOOOml溶劑中的千分之一克(0.0Olg)溶質的濃度為lppm。因此,每升一毫克的濃度(即lmg/L)等于lppm。
[0223]與氨基酸和/或核苷酸序列結合的短語“百分比同一性的”或“百分比同一性”是指在兩個不同序列之間的相似性。該百分比同一性可通過標準比對算法來測定，例如，Altshul 等描述的基本局部比對工具(Basic Local Alignment Tool) (BLAST) ((1990)J.Mol.Biol., 215:403410) ;Needleman 等的算法((1970) J.Mol.Biol., 48:444453);或Meyers 等的算法((1988)Comput.App1.Biosc1., 4:1117)。一組參數可為 Blosum62 評分矩陣，其空位罰分為12，空位延伸罰分為4，和移碼空位罰分為5。兩個氨基酸或核苷酸序列之間的百分比同一性也可使用E.Meyers和ff.Miller算法((1989)CAB10S, 4:11-17)來確定，所述算法已經并入到使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12且空位罰分為4的ALIGN程序(版本2.0)內。所述百分比同一性通常通過比較類似長度的序列來計算。蛋白質分析軟件使用測量分配給各種取代、缺失和其它修飾(包括保守氨基酸取代)的相似性匹配類似序列。例如，GCG Wisconsin軟件包(Accelrys, Inc.)含有諸如“Gap”和“Bestfit”的程序，其可與默認參數一同使用以確定密切相關的多肽(諸如來自不同生物體物種的同源多肽)之間或者野生型蛋白和其突變體之間的序列同一性。參見，如GCG版本6.1。多肽序列還可使用FASTA來比較，所述FASTA使用默認或推薦參數。GCG版本6.1.中的程序FASTA(如，FASTA2和FASTA3)提供查詢和搜索序列之間的最佳重疊區的比對和百分比序列同一性(Pearson, Methods Enzymo 1.183:63-98 (1990) ；Pearson, Methods Mol.Biol.132:185-219(2000))。用于同一性比較的多肽序列的長度通常將至少為約16個氨基酸殘基，通常為至少約20個殘基，更通常為至少約24個殘基，典型為至少約28個殘基，并且優選為超過約35個殘基。用于同一性比較的DNA序列的長度通常將為至少約48個核酸殘基，通常為至少約60個核酸殘基，更通常為至少約72個核酸殘基，典型為至少約84個核酸殘基，并且更優選為超過約105個核酸殘基。[0224]術語“苦味的感覺”、“咸味的感覺”、“味道的感覺”和相似術語是指受試者對具體味道或氣味的意識。
[0225]術語“選擇性苦味調節劑”是指調節由于特定促苦味劑引起的苦味而不調節任何其它促味劑或帶有其本身味道的化合物。例如，選擇性抑制由KCl引起的苦味的化合物降低由KCl引起的苦味而不增加或降低由另一種促味劑(包括其它促苦味劑)引起的味道。在一些實施方案中，選擇性苦味調節劑是具體苦味受體或具體亞類的苦味受體的激動劑或拮抗劑。例如，選擇性抑制由KCl引起的苦味的化合物拮抗TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的一者或多者的苦味受體活性，而不活化或抑制任何其它味道受體(包括其它苦味受體)。
[0226]由于術語“穩定表達”和“瞬時表達”將被本領域技術人員所理解，術語“穩定的”或“穩定表達”意在區分本發明的細胞和細胞系與瞬時表達的細胞。
[0227]術語“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”描述了用于將一種或多種核酸探針與核酸樣品雜交并洗滌去除未與樣品中目標核酸的特異性結合的探針的溫度和鹽條件。嚴格條件為本領域技術人員所已知，并可見于Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。水性和非水性方法描述于該文獻中，并且可采用任何一種。嚴格雜交條件的實例是在6X SSC中在約45°C下的雜交，隨后在0.2X SSC,0.1%SDS中在60°C下至少洗滌一次。嚴格雜交條件的另一個實例是在6X SSC中在約45°C下雜交，隨后在0.2X SSC, 0.1% SDS中在65°C下至少洗滌一次。嚴格條件包括在0.5M磷酸鈉，7% SDS中在65°C下雜交，隨后在0.2X SSC, I % SDS中在65°C下至少洗滌一次。
[0228]術語“受試者”是指哺乳動物。在優選的實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，受試者是家養或實驗動物，包括但不限于居家寵物，諸如狗、貓、豬、兔、大鼠、小鼠、沙土鼠、倉鼠、豚鼠和雪貂。在一些實施方案中，受試者是家畜。家畜的非限制性實例包括:羊駝、野牛、駱駝、牛、鹿、豬、馬、美洲駝、騾、驢、綿羊、山羊、兔、馴鹿和牦牛。
[0229]術語“甜味”是指例如由糖引發的味道。引發甜味的組合物的非限制性實例包括葡萄糖、蔗糖、果糖、糖精、環氨酸鹽、阿司帕坦、乙酰氨基磺酸鉀、三氯蔗糖、阿力甜和紐甜。甜味的量或組合物的甜味可通過如味道測試來確定。
[0230]術語“普通苦味化合物”是指活化所有二十五種苦味受體的化合物。普通苦味化合物的非限制性實例包括苯甲地那銨和糖精地那銨。
[0231]本發明提供鑒定調節苦味的化合物的測定。例如，本發明提供鑒定抑制由KC1、乳酸鉀或乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法。本發明還提供鑒定選擇性抑制由KC1、乳酸鉀或乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法。本發明進一步提供鑒定模擬由KC1、乳酸鉀或乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法。本發明還提供鑒定增強由KC1、乳酸鉀或乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法。本發明另外提供確定KC1、乳酸鉀或乙酰磺胺酸鉀是否存在于組合物中的方法。
[0232]表達苦味受體的細胞和細胞系
[0233]本發明涉及使用表達或已經工程化以表達一種或多種苦味受體的細胞和細胞系的體外測定。在一些實施方案中，本發明的細胞或細胞系表達一種或多種功能性苦味受體。
[0234]根據本發明的一個實施方案，用編碼苦味受體的核酸轉染所述細胞和細胞系。在其它實施方案中，所述細胞和細胞系內源性表達苦味受體。在一些實施方案中，用編碼苦味受體或突變型苦味受體的等位基因變體(即，多態性)的核酸轉染所述細胞和細胞系。本發明的細胞系可穩定表達引入的苦味受體。在另一個實施方案中，所述細胞和細胞系具有活化的苦味受體以用于通過基因活化進行的表達。在一些實施方案中，所述苦味受體是天然苦味受體。
[0235]在具體的實施方案中，由于工程化的基因活化，所述細胞和細胞系表達內源性苦味受體，即內源性基因表達的活化，其中所述活化并非天然發生于未進行適當處理的細胞中。工程化基因的活化可開啟內源性苦味受體的表達，例如其中內源性苦味受體并不在未進行適當處理的細胞系中表達。可選地，工程化基因的活化可導致內源性苦味受體表達水平的提高，例如在不進行適當處理的情況下，內源性基因在所述細胞系中的表達水平不期望地低，例如對于細胞系中苦味受體的功能測定并不足夠。可選地，工程化基因的活化可用于過表達內源性苦味受體，例如以用于從細胞系分離內源性苦味受體。工程化基因的活化可通過本領域技術人員已知的多種方法來實現。例如，可通過如在組成型或誘導型啟動子的控制下將表達轉錄因子或反式激活因子的核酸引入至細胞內，來過表達或者誘導表達基因轉錄的一種或多種轉錄因子或者反式激活因子。如果已知內源性基因是在誘導型啟動子的控制下，則可通過將所述細胞暴露于已知的基因誘導劑而誘導表達。此外，編碼內源性基因本身的核酸可被導入細胞內，以獲得由于基因組中拷貝數增加而導致的基因表達水平提高。此外，內源性基因表達的某些已知的抑制劑(所述抑制劑由細胞表達)可在細胞中使用本領域已知的技術(如RNAi)敲低或甚至敲除，從而增加內源性基因的表達。
[0236]在一些實施方案中，細胞和細胞系穩定表達一種或多種苦味受體。在一些實施方案中，表達的苦味受體當被激動劑活化時增加胞內游離鈣。在一些實施方案中，增效劑、激動劑或活化劑可為小分子、化學部分、多肽、抗體或食物提取物。在其它實施方案中，表達的苦味受體當被拮抗劑抑制時降低胞內游離鈣。在一些實施方案中，抑制劑、拮抗劑或阻滯劑可為小分子、化學部分、多肽、抗體或食物提取物。增效劑、激動劑、活化劑、抑制劑、拮抗劑或阻滯劑可作用于所有或特定亞類的苦味受體。
[0237]根據本發明，由細胞或細胞系表達的苦味受體可來自任何哺乳動物，所述動物包括大鼠、小鼠、兔、山羊、狗、母牛、豬或靈長類動物。在優選的實施方案中，所述苦味受體是人苦味受體。
[0238]在一些實施方案中，本發明的細胞或細胞系可包含:編碼人TAS2R1的核苷酸序列(SEQ ID NO:2);編碼人TAS2R3的核苷酸序列(SEQ ID NO:3);編碼人TAS2R4的核苷酸序列(SEQ ID NO:4);編碼人TAS2R5的核苷酸序列(SEQ ID NO:5);編碼人TAS2R7的核苷酸序列(SEQ ID NO:6);編碼人TAS2R8的核苷酸序列(SEQ ID NO:7);編碼人TAS2R9的核苷酸序列(SEQ ID NO:8);編碼人TAS2R10的核苷酸序列(SEQ ID NO:9);編碼人TAS2R13的核苷酸序列(SEQ ID NO: 10);編碼人TAS2R14的核苷酸序列(SEQ ID NO: 11);編碼人TAS2R16的核苷酸序列(SEQ ID NO: 12);編碼人TAS2R38的核苷酸序列(SEQ ID NO: 13);編碼人TAS2R39的核苷酸序列(SEQ ID NO: 14);編碼人TAS2R40的核苷酸序列(SEQ ID NO: 15);編碼人TAS2R41的核苷酸序列(SEQ ID NO: 16);編碼人TAS2R43的核苷酸序列(SEQ ID NO: 17)；編碼人TAS2R44的核苷酸序列(SEQ ID NO: 18);編碼人TAS2R45的核苷酸序列(SEQ IDNO: 19);編碼人TAS2R46的核苷酸序列(SEQIDN0:20);編碼人TAS2R47的核苷酸序列(SEQID N0:21);編碼人TAS2R48的核苷酸序列(SEQ ID NO:22);編碼人TAS2R49的核苷酸序列(SEQ ID NO:23);編碼人TAS2R50的核苷酸序列(SEQ ID NO:24);編碼人TAS2R55的核苷酸序列(SEQ ID NO: 25);編碼人TAS2R60的核苷酸序列(SEQ ID NO: 26);或其任何組合。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:與SEQ ID NO:2-26的任一者有80^^85^^90^^95^^98%或99%序列同一性的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列--與SEQ ID NO:2-26的任一者具有95%序列同一'I"生的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:與SEQ ID NO:2-26的任一者具有80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有TAS2R活性的多肽。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:與SEQ ID NO:2-26的任一者具有95%序列同一'丨生的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有TAS2R活性的多肽。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:在嚴格條件下與SEQ ID NO:2-26的任一者雜交的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:包括SEQID NO:2-26的任一者的成熟形式的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:為SEQ ID NO:2-26的任一者的變體的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:為SEQ ID NO:2-26的任一者的片段的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列=SEQID NO:2-26的任一者的核苷酸序列溶蛋白性裂解產物的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含核苷酸序列選自以下:為SEQ ID NO:2-26的任一者的直向同源物(ortholog)的核苷酸序列。此類直向同源物為本領域所熟知。在一些實施方案中，與SEQID NO:2-26的任一者相比，核苷酸序列具有五個或更少、四個或更少、三個或更少、兩個或更少，或者一個或更少的保守取代。 [0239] 在一些實施方案中，本發明的細胞或細胞系可包含編碼人TAS2R1(SEQ IDNO: 28)；人 TAS2R3(SEQ ID NO: 29)；人 TAS2R4(SE Q ID NO: 30)；人 TAS2R5 (SEQ IDNO: 31) ;ATAS2R7(SEQ ID NO: 32);人 TAS2R8 (SEQ ID NO: 33);人 TAS2R9 (SEQ ID NO: 34)；人 TAS2R10(SEQ ID NO:35)；人 TAS2R13(SEQ ID NO:36)；人 TAS2R14(SEQ ID NO:37)；人 TAS2R16(SEQ ID NO:38)；人 TAS2R38(SEQ ID NO:39)；人 TAS2R39(SEQ ID NO:40)；人 TAS2R40(SEQ ID NO:41)；人 TAS2R41(SEQ ID NO:42)；人 TAS2R43(SEQ ID NO:43)；人 TAS2R44(SEQ ID NO:44)；人 TAS2R45(SEQ ID NO:45)；人 TAS2R46(SEQ ID NO:46)；人 TAS2R47 (SEQ ID NO: 47)；人 TAS2R48 (SEQ ID NO: 48)；人 TAS2R49 (SEQ ID NO: 49)；人TAS2R50 (SEQ ID NO:50);人 TAS2R55 (SEQ ID N0:51);人 TAS2R60 (SEQ ID NO:52);或其組合的多核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:與編碼SEQ ID NO:28-52的任一者的核苷酸序列具有80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一'I"生的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:與編碼SEQ ID NO:28-52的任一者的核苷酸序列具有95%序列同一'丨生的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:與編碼SEQ ID NO:28-52的任一者的核苷酸序列具有80 %、85 %、90 %、95 %、98 %或99 %序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有TAS2R活性的多肽。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:與編碼SEQ ID NO:28-52的任一者的核苷酸序列具有95%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有TAS2R活性的多肽。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:在嚴格雜交條件下與編碼SEQID NO:28-52的任一者的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:編碼SEQ ID NO:28-52的任一者的成熟形式的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:為編碼SEQ IDNO:28-52的任一者的核苷酸序列的變體的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:為編碼SEQ ID NO:28-52的任一者的核苷酸序列的片段的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:編碼SEQ ID NO:28-52的任一者的核苷酸序列的核苷酸序列溶蛋白性裂解產物。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的核苷酸序列:為編碼SEQ ID NO:28-52的任一者的核苷酸序列的直向同源物的核苷酸序列。此類直向同源物為本領域所熟知。在一些實施方案中，與SEQ ID NO:28-52的任一者相比,所述核苷酸序列編碼具有五個或更少、四個或更少、三個或更少、兩個或更少，或者一個或更少的保守氨基酸取代的TAS2R受體。
[0240]在一些實施方案中，本發明的細胞或細胞系可包含人TAS2R1 (SEQ ID NO:28);人TAS2R3(SEQ ID NO: 29) ;、TAS2R4 (SEQ ID NO: 30) ;、TAS2R5 (SEQ ID NO: 31) ;ATAS2R7(SEQID NO:32)；人 TAS2R8 (SEQ ID NO:33)；人 TAS2R9 (SEQ ID NO:34)；人 TAS2R10 (SEQ IDNO:35) ;、TAS2R13(SEQ ID N0:36) ;、TAS2R14 (SEQ ID NO: 37) ;、TAS2R16 (SEQ ID NO: 38)；人 TAS2R38(SEQ ID NO:39)；人 TAS2R39(SEQ ID NO:40)；人 TAS2R40(SEQ ID NO:41)；人 TAS2R41(SEQ ID NO:42)；人 TAS2R43(SEQ ID NO:43)；人 TAS2R44(SEQ ID NO:44)；人 TAS2R45(SEQ ID NO:45)；人 TAS2R46(SEQ ID NO:46)；人 TAS2R47(SEQ ID NO:47)；人 TAS2R48 (SEQ ID NO:48)；人 TAS2R49 (SEQ ID NO:49)；人 TAS2R50 (SEQ ID NO:50)；人TAS2R55 (SEQ ID NO: 51);人 TAS2R60 (SEQ ID NO:52);或其組合。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自以下的TAS2R受體:與SEQ ID NO:28-52的任一者具有80%、85%、90 %、95 %、98 %或99 %序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自與SEQ ID NO:28-52的任一者具有95%序列同一性的氨基酸序列的TAS2R受體。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自與SEQ ID NO: 28-52的任一者具有80%、85 %、90 %、95 %、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的TAS2R受體，其中所述TAS2R受體具有TAS2R受體活性。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自與SEQ ID NO: 28-52的任一者具有95 %序列同一性的氨基酸序列的TAS2R受體，其中所述TAS2R受體具有TAS2R受體活性。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自SEQ ID NO:28-52的任一者的成熟形式的TAS2R受體。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自SEQ IDNO:28-52的任一者的變體的TAS2R受體。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自SEQ ID NO:28-52中任一者的片段的TAS2R受體。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自SEQ ID NO:28-52中任一者的溶蛋白性裂解產物的TAS2R受體。在一些實施方案中，所述細胞或細胞系包含選自SEQ ID NO:28-52中任一者的直向同源物的TAS2R受體。此類直向同源物為本領域所述熟知。在一些實施方案中，與SEQ ID NO:28-52的任一者相比，所述TAS2R受體具有五個或更少、四個或更少、三個或更少、兩個或更少，或者一個或更少的保守氨基酸取代。
[0241]編碼苦味受體的核酸可為DNA、合成DNA、基因組DNA cDNA、RNA、雙鏈DNA或單鏈DNA。在一些實施方案中，與編碼野生型苦味受體的核酸序列相比，所述核酸包含可能或不可能產生氨基酸取代的一個或多個突變。在一些其它實施方案中，與在給定群體中編碼某些苦味受體的最常存在的核酸序列相比，所述核酸包含一個或多個天然存在的等位基因變體。天然存在的等位基因變體包括天然存在的相同苦味受體的不同氨基酸序列，如由于等位變異或多態性在給定群體中觀察到的那些。在一些實施方案中，編碼苦味受體的核酸是片段。在一些實施方案中，所述片段編碼具有TAS2R活性的多肽。在一些實施方案中，所述片段包含SEQ ID NO:2-26的至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少80個、至少100個、至少125個、至少150個、至少175個、至少200個、至少250個、至少300個、至少400個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少850個或至少900個核苷酸。
[0242]多態性在人類基因組中是常見的現象。發生于苦味受體基因內或附近的多態性可通過如上調或下調它們的表達水平或通過改變它們的氨基酸序列來影響它們的表達或改變它們的功能。附錄表I顯示獨特多態性的參考數目，包括與人TAS2R基因相關的單核苷酸多態性(“SNP”)、在每個參考序列中SNP的位置和SNP的描述。參考數目可在美國生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information) ( “NCBI” ；Bethesda, MD)的單核苷酸多態性數據庫(“dbSNP”)中搜索。
[0243]已研究和記錄了導致編碼序列多態性的人苦味受體基因的等位變異。參見， 如 Ueda 等,“Identification of coding single-nucleotide polymorphisms inhuman taste receptor genes involving bitter tasting”，Biochem Biophys ResCommun285:147-151, 2001 ；ffooding 等,“Natural selection and molecular evolutionin PTC, a bitter-taste receptor gene, ” Am.J.Hum, Genet.74:637-646, 2004 ；和 Kim等,“Worldwide haplotype diversity and coding sequence variation at human bittertaste receptor loci ”，Human Mutat ion26:199-204，2005。附錄表 2 是在不同的人苦味受體的編碼序列中的天然變異的列表。人苦味受體、它們編碼序列的SEQ ID NO，和蛋白序列于前三列中列出。核苷酸變化和它們在每個編碼序列內的位置(如通過其SEQ ID NO鑒定)分別顯示于“核苷酸變化”和“核苷酸變化的位置”列中。在每個苦味受體內的氨基酸改變(如通過其SEQ ID NO鑒定)使用單字母縮寫顯示于“描述”列中。它們的位置參考每個相應的SEQ ID NO，顯示于“氨基酸改變的位置”列中。此外，“描述”列還含有那些變異的標識符，其可在NCBI的dbSNP中搜索。“特征標識符”是由UniProt蛋白知識庫(UniProtProtein Knowledgebase)分配給一些變異的獨特且穩定的特征標識符,所述UniProt蛋白知識庫由歐洲生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute) (Cambridge,UnitedKingdom)托管。它們可在UniProt中搜索。“NA”表示到目前為止UniProt還沒有分配的特征標識符。
[0244]人味覺的變異是熟知的現象。不希望被理論所束縛，苦味的變異可涉及苦味受體的多態性。例如，苯硫脲(PTC)的一種受體hTAS2R38的多態性已與檢測丙硫氧嘧啶(PROP)的能力相關(Kim 等,“Positional cloning of the human quantitative trait locusunderlying taste sensitivity to phenylthiocarbamide，，，Science299:1221-1225，2003 ；Wooding等，2004)。有三種常見的多態性存在于TAS2R38基因-A49P、V262A和I296V-其組合以形成兩種常見的單倍型和幾種其它非常罕見的單倍型。所述兩種常見單倍型是AVI (常稱為“味盲”)和PAV(常稱為“嘗味者(taster) ” )。改變這些單倍型的組合將產生純合子-PAV/PAV和AVI/AV1-及雜合子PAV/AVI。這些基因型可占據PTC嘗味能力變異的高達85%:具有兩份拷貝的PAV多態性的人報道PTC比TAS2R38雜合子更苦，并且具有兩份拷貝的AVI/AVI多態性的人通常報道PTC大體上是無味的。猜測這些多態性通過改變G-蛋白-結合結構域影響味道。在一些實施方案中，本發明的細胞或細胞系可包含編碼人PAV TAS2R38的多核苷酸序列(SEQ ID NO:54)。在一些實施方案中，本發明的細胞或細胞系可包含人 PAV TAS2R38 (SEQ ID NO: 54)。
[0245]此外，群體中一個對天然植物化合物蘆薈素和馬兜鈴酸的苦味非常敏感的亞類已遺傳了 hTAS2R43基因中的某些多態性。不具有該等位基因的人不能嘗到低濃度的這些化合物。所述hTAS2R43敏感性等位基因還使得人們對糖精的苦味更加敏感。此外，與hTAS2R43敏感性等位基因密切相關的某些hTAS2R44等位基因還使得人們對糖精的苦味更加敏感。群體的一些亞類不具有某些hTAS2R基因，這促進了不同個體之間的味覺差異。苦味基因的多態性也已與疾病如糖尿病(TAS2R9)和酒精中毒(TAS2R16)風險增加相關。使用穩定表達異源性天然存在的苦味受體、或者其等位基因變體或多晶型物(polymorph)、或者具有并非天然存在的一個或多個突變(如，隨機突變或定點突變)的其突變體形式的細胞和細胞系的測定，都在本發明的范圍內。
[0246]包含苦味受體、其突變體形式、或其天然存在的等位基因變體的細胞和細胞系可用于鑒定苦味受體功能的調節劑，所述調節劑包括對具體苦味受體突變體形式或者天然存在的等位基因變體特異的調節劑。因此，所述細胞和細胞系可用于獲得關于苦味受體的單獨天然形式或突變體形式或天然存在的等位基因變體的性質、活性和作用的信息，并用于鑒定對具體天然或突變體形式或天然存在的等位基因變體，或者對天然或突變體形式或天然存在的等位基因變體的亞類具有活性的苦味受體調節劑。這些調節劑可用作為治療劑，所述治療劑差異性靶向處于疾病狀態或組織中的修飾的苦味受體形式。因為苦味受體體內的多態性例如可促進不期望的活性或疾病狀態，所以本發明的細胞和細胞系還可用于篩選調節劑的治療用途，其中突變體形式或天然存在的等位基因變體的響應變化可為期望的。所述細胞和細胞系還可用于鑒定僅對苦味受體的天然或突變體形式或天然存在的等位基因變體的亞類具有活性的調節劑。
[0247]用于產生細胞和細胞系的宿主細胞可以其天然狀態表達一種或多種內源性苦味受體或者缺乏對任何苦味受體的表達。在所述細胞或細胞系表達一種或多種其本身的苦味受體(也稱為“內源性”苦味受體)的情況下，異源性苦味受體可與細胞或細胞系的一種或多種內源性苦味受體之一相同。例如，編碼細胞或細胞系內源性苦味受體的核酸可被引入至所述細胞或細胞系內，以增加在細胞或細胞系中的編碼苦味受體的基因拷貝數，使得與未引入核酸的細胞或細胞系相比，在所述細胞或細胞系中以較高的水平表達所述苦味受體。所述宿主細胞可為原代細胞、生殖細胞或干細胞，包括胚胎干細胞。所述宿主細胞還可為永生化細胞。原代或永生化宿主細胞可源自真核生物的中胚層、外胚層或內胚層。所述宿主細胞可為內皮細胞、表皮細胞、間充質細胞、神經細胞、腎細胞、肝細胞、造血細胞或免疫細胞。例如，所述宿主細胞可為腸隱窩或絨毛細胞、克拉拉細胞、結腸細胞、腸細胞、杯狀細胞、腸嗜鉻細胞、腸內分泌細胞。所述宿主細胞可為真核細胞、原核細胞、哺乳動物細胞、人細胞、靈長類動物細胞、牛科動物細胞、豬科動物細胞、貓科動物細胞、嚙齒類動物細胞、有袋類動物細胞、鼠科動物細胞或其它細胞。所述宿主細胞還可為非哺乳動物，諸如酵母、昆蟲、真菌、植物、低等真核生物和原核生物。由于缺乏由可與目標相互作用的細胞提供的表達產物，此類宿主細胞可以較高的可能性提供針對測試苦味受體調節劑的更有差異的背景。在優選的實施方案中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞。可用于產生本發明的細胞或細胞系的宿主細胞的實例包括但不限于:人胚胎腎293T細胞、建立的神經元細胞系、嗜鉻細胞、成神經細胞瘤成纖維細胞、橫紋肌肉瘤、背根神經節細胞、NSO細胞、CV-UATCCCCL70)、COS-1 (ATCC CRL1650)、C0S-7 (ATCC CRL1651)、CHO-Kl (ATCC CCL61)、3T3 (ATCCCCL92)、ΝΙΗ/3Τ3 (ATCC CRL1658)、HeLa (ATCC CCL2)、C127I (ATCC CRL1616)、BS-C-1 (ATCCCCL26)、MRC-5 (ATCC CCL171)、L-細胞、HEK-293 (ATCC CRL1573)和 PC12 (ATCC CRL-1721)、HEK293T (ATCC CRL-11268)、RBL (ATCC CRL-1378)、SH-SY5Y (ATCC CRL-2266)、MDCK (ATCCCCL-34)、SJ-RH30 (ATCC CRL-2061)、HepG2 (ATCC HB-8065)、ND7/23 (ECACC92090903)、CHO (ECACC85050302)、Vero (ATCC CCL81)、Caco-2 (ATCC HTB37)、K562 (ATCC CCL243)、Jurkat (ATCC TIB-152)、Per.C6 (Cruce 11, Leiden, The Netherlands)、Huvec (ATCC 人原代 PCS100-010,小鼠 CRL2514, CRL2515, CRL2516)、HuH_7D12 (ECACC01042712)、293 (ATCCCRL10852)、A549 (ATCC CCL185)、MR-90 (ATCC CCL186)、MCF-7 (ATC HTB-22)、U-20S (ATCCHTB-96)、T84(ATCC CCL248)，或任何建立的細胞系(極化或非極化的)或可從諸如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection) (ATCC, 10801University Blvd.Manassas, Va.20110-2209USA)或歐洲細胞培養物收集中心(European Collection of CellCultures) (ECACC, Sali sbury Wiltshire SP40JG England)的資源庫獲取的任何細胞系。
[0248]如將被本領域技術人員所理解的那樣，任何適合與宿主細胞一起使用的載體可用于將編碼TAS2R受體的核酸引入至宿主細胞內。包括各種TAS2R受體的載體可為相同類型或不同類型。可用于引入編碼核酸的TAS2R受體至宿主細胞內的載體的實例包括但不限于質粒、包括逆轉錄病毒和慢病毒的病毒、粘粒、人工染色體，并可包括例如 Pcmv-Script、pcDNA3.1Hygro> pcDNA3.lneo、pcDNA3.1puro> pSV2neo、
pIRES pur。、pSV2ze。、pFNllA(BIND) Flexi?、pGL4.31、pFC14A( HaloTag? 7)CMV Flexi(R)、 pFC14K( HaloTag? 7)cmv Flexi?、pFN24A(Halo Tag? 7)CMVd3 Flexi?、pFN24K(Halo Tag? 7)CMVd3 Flexi?, HaloTag?pHT2、pACT、pAdVAntage?、pALTER?-MAX、pBIND、pCAT? 3-Basic、pCAT? 3-Control, pCAT? 3-增強子、pCAT? 3_啟動子、pC1、pCMVTNT?、pG51uc、pS1、pTARGET?、pTNT?、pF12A RM Flexi?, pF12K RM Flexi?、pReg neo、pYES2/GS、pAd/CMV/V5-DEST Gateway?載體、pAd/PL-DEST? Gate曹ay?載體、
Gateway?, pdest?, 27 載體、Gateway?, pef-dest51 載體、Gateway?, pcDNA?-DEST47
載體、pCMV/Bsd 載體、pEF6/His A, B, &c、pcDNA?6.2-DEST、pLenti6/TR、pLP-AcGFPl-C、pLPS-AcGFPl-N、 pLP-1RESneo、 pLP_TRE2、 pLP-RevTRE、 pLP-LNCX、 pLP-CMV-HA、pLP-CMV-Myc > pLP-RetroQ、pLP-CMVneo。在一些實施方案中，所述載體包括表達控制序列，諸如組成型或條件型啟動子。本領域的普通技術人員將能夠選擇合適的序列。例如，適合的啟動子包括但不限于CMV、TK、SV40和EF-1 α。在一些實施方案中，所述啟動子是可誘導的、溫度調節的、組織特異性的、可抑制的、熱激、發育的、細胞譜系特異性的、真核、原核或時空的啟動子，或者以上任何一者或多者的未修飾的或誘變的、隨機化的、攪亂順序的組合或重組。在其它實施方案中，TAS2R受體通過基因活化表達，其中通過同源重組將外源性啟動子插入宿主細胞基因組中，以驅動TAS2R受體基因的表達，所述TAS2R受體基因正常來講并不在宿主細胞中表達。在一些實施方案中，編碼TAS2R受體的基因是游離基因。編碼TAS2R受體的核酸優選地被組成性表達。
[0249]可通過熟知的方法，將包括編碼TAS2受體的序列或TAS2R信號傳導路徑的組分序列和任選編碼可選擇標記的核酸的核酸引入至所選宿主細胞內。所述方法包括但不限于轉染、病毒遞送、蛋白或多肽介導的插入、共沉淀法、基于脂質的遞送試劑(脂轉染)、細胞轉染(cytofection)、脂多胺遞送、枝狀聚合體遞送試劑(dendrimer delivery reagent) >電穿孔或機械遞送。轉染試劑的實例為GENEPORTER、GENEP0RTER2、LIPOFECTAMINE、LIP0FECTAMINE2000, FUGENE6、FUGENE HD、TFX-10, TFX-20、TFX-50、0LIG0FECTAMINE、TRANSFAST、TRANSFECTAM、GENESHUTTLE、TROJENE、GENESILENCER、X-TREMEGENE、PERFECTIN、CYTOFECTIN、SIPORT、UNIFECTOR、SIFECTOR、TRANSIT-LTK TRANSIT-LT2、TRANSIT-EXPRESS、IFECT、RNAI SHUTTLE、METAFECTENE、LYOVEC,LIPOTAX1、GENEERASER、GENEJUICE、CYTOPURE、JETS1、JETPE1、MEGAFECTIN、POLYFECT、TRANSMESSANGER、RNAiFECT、SUPERFECT、EFFECTENE、TF-PE1-KIT、CLONFECTIN 和 METAFECTINE。
[0250]在另一方面，細胞和細胞系表達G蛋白。G蛋白有兩個家族，異源三聚體G蛋白和單體G蛋白。異源三聚體G蛋白被G蛋白偶聯受體(“GPCR”)活化，并包括三個亞基:Ga、G0和GY。如本文所用，術語G蛋白包括這些亞基的任何一個，例如Ga或其組合，以及具有所有三個亞基的異源三聚體G蛋白。在失活狀態中，Ga、Ge和(^形成三聚體。β和Y亞基彼此緊密結合，并且被稱為β-Υ復合物。Ga在配體結合至GPCR之后從G0y上分離下來。所述G0y復合物在其⑶P-GTP交換之后從Ga亞基上釋放出來。G0y復合物可活化其它第二信使或門離子通道。Ga的四個家族包括:通過活化腺苷酸環化酶來增加cAMP合成的& (刺激性)；抑制腺苷酸環化酶的Gi (抑制性)；G12/13家族調節各種細胞運動過程(即細胞骨架，細胞連接)；和刺激鈣信號傳導和磷脂酶C的G,。單體G蛋白與異源三聚體G蛋白的a亞基是同源的。任何G蛋白可在本發明的細胞或細胞系中表達，所述G蛋白包括但不限于轉導素(如，GNATl、GNAT2和鳥嘌呤核苷酸-結合蛋白G(t))、味蛋白(如，GNAT3鳥嘌呤核苷酸結合蛋白和a轉導素3)、人GNA15(鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)a 15 (Gq類；同義詞GNA16)和小鼠Ga 15，及它們的嵌合體蛋白如G a 15-GNA15 (也稱為G a 15-Ga 16)。在優選的實施方案中，所述G蛋白是小鼠Ga 15 (SEQ IDN0:53)。在另一個優選的實施方案中，所述G蛋白是人GNA15 (SEQ ID NO:1)或是由包含SEQ ID NO: 27的核酸編碼的人G蛋白。所述G蛋白還可為任何哺乳動物G蛋白，諸如但不限于附錄表3中列出的任何哺乳動物G蛋白。由所述細胞穩定表達的G蛋白對于所述細胞可為內源性的。可選地，所述G蛋白的穩定表達可為將編碼G蛋白的核酸穩定轉染至細胞內的結果。穩定表達異源性G蛋白的細胞為本領域已知，如 HEK293/Ga 15 細胞(Chandrashekar 等，“T2Rs function as bitter tastereceptors”，CelllOO: 703-711，2000 ；Bufe 等，“The human TAS2R16 receptor mediatesbitter taste in response to β-glucopyranosides，，，Na Genet32:397-401)。在其它實施方案中，編碼G蛋白的核酸和編碼苦味受體的核酸可被連續地轉染至宿主細胞內，編碼G蛋白的核酸首先被轉染或者編碼苦味受體的核酸首先被轉染。在其它實施方案中，編碼G蛋白的核酸和編碼苦味受體的核酸可被在相同或不同載體上共轉染至宿主細胞內。因此，對穩定表達G蛋白和苦味受體的細胞的選擇同樣可連續或同時進行。可用于穩定表達G蛋白的細胞或細胞系與可用于如上所解釋的穩定表達苦味受體的那些細胞或細胞系相同。
[0251]在本發明的一些實施方案中，本發明的細胞或細胞系共表達一種或多種苦味受體和其它蛋白。在優選的實施方案中，所述其它蛋白為至少一種其它味道受體，諸如甜味(TAS1R2/TAS1R3)受體或鮮味(TAS1R1/TAS1R3)受體。在一些實施方案中，本發明的細胞系小組包括表達苦味受體的細胞系和表達其它味道受體的細胞系(諸如甜味(TAS1R2/TAS1R3)受體或鮮味(TAS1R1/TAS1R3)受體)。與苦味受體共表達的蛋白質可通過任何機制表達，諸如但不限于在宿主細胞中內源性表達或由載體異源性表達。此外，在本發明的其它實施方案中，多于一種類型的苦味受體可在細胞或細胞系中穩定表達。
[0252]此外根據本發明，表達苦味受體的天然存在形式或其天然存在的等位基因變體的細胞和細胞系，以及表達苦味受體的突變體形式的細胞和細胞系，可對胞內游離鈣水平進行表征。在一些實施方案中，本發明的細胞和細胞系表達具有“生理相關”活性的苦味受體。如本文所用，生理相關性是指表達苦味受體的細胞或細胞系的一種性質，借此所述苦味受體當被活化時以與相同類型的天然存在的苦味受體那樣方式引起胞內游離鈣增加，并且當用相同的化合物調節時以與相同類型的天然存在的苦味受體將響應方式相同的方式對調節劑響應。本發明的苦味受體-表達細胞和細胞系，包括苦味受體的一些突變體形式和苦味受體的一些天然存在的等位基因變體，優選在適合的測定(諸如測量胞內游離鈣的測定)中顯示與正常表達天然苦味受體的細胞可比較的功能。此類測定為本領域技術人員所已知(Nahorski, “Pharmacology of intracellular signaling pathways,，’Brit.J.Pharm.147:S38-S45，2000))。此類比較用于確定細胞或細胞系的生理相關性。使用一組訓練有素的味道測試人員進行的“囁飲和吐出(Sip and spit) ”味道測試還可用于進一步驗證在本發明的細胞和細胞系中的苦味受體的生理相關性。使用經由篩選苦味受體的天然或突變體形式或其天然存在的等位基因變體鑒定的調節劑的囁飲和吐出的味道測試的結果可用于驗證這些不同形式的生理相關性。
[0253]在一些實施方案中，細胞和細胞系響應于調節劑并增加胞內游離鈣，苦味受體的生理范圍是EC5tl或IC5tl值。如本文所用，EC5tl是指在所述細胞或細胞系中誘導半數最大活化響應(half-maximal activating response)所需的化合物或物質的濃度。如本文所用，IC5q是指在所述細胞或細胞系中誘導半數最大抑制響應(half-maximal inhibitory response)所需的化合物或物質的濃度。EC5tl和IC5tl值可使用本領域熟知的技術來測定，例如化合物或物質濃度與苦味受體-表達細胞系的響應相關的劑量-響應曲線。
[0254]為了使得苦味受體表達細胞和細胞系，人們可使用例如美國專利6，692，965和國際專利公布W0/2005/079462中描述的技術。這些文件都為了所有目的通過引用整體并入本文。該技術提供對百萬個細胞的實時評估，使得可選擇任何期望數目的克隆(數百至數千個克隆)。使用諸如流式細胞分選(如，用FACS機器)或磁性細胞分選(如，用MACS機器)的細胞分選技術，每孔一個細胞可自動以高的統計置信度沉積于培養容器(諸如96孔培養板)中。所述技術的速率和自動化使得多基因細胞系能夠容易分離。為了使得苦味受體表達細胞和細胞系，人們還可使用例如國際專利公布W02009/102569和W02010/088633中描述的技術。這些文件都為了所有目的通過引用整體并入本文。該技術提供產生與生理性質匹配的細胞和細胞系的自動化方法。此類方法可用于產生適用于高通量篩選潛在苦味受體調節劑的細胞系小組。
[0255]使用所述技術，每種苦味受體的RNA序列可使用信號傳導探針(還稱為分子信標或熒光探針)檢測。在一些實施方案中，所述分子信標識別如上所述的目標標簽序列。在另一個實施方案中，所述分子信標識別在苦味受體編碼序列本身內的序列。信號傳導探針可通過設計包含分別與標簽的RNA序列或苦味受體編碼序列互補的一部分的探針，來針對RNA標簽或苦味受體編碼序列。如果使用，則這些相同的技術可用于檢測G蛋白的RNA序列。
[0256]鑒定調節苦味的化合物的方法
[0257]—方面，本發明提供鑒定調節苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法是基于體外細胞的測定，以如篩選苦味受體調節劑；評估物質的苦味；產生用于結晶學和結合研究的蛋白；和研究化合物選擇性和劑量、受體/化合物結合動力學和穩定性及受體表達對細胞生理機能(如，電生理機能、蛋白質運輸、蛋白質折疊和蛋白質調節)的作用。
[0258]在一些實施方案中，基于體外細胞的測定使用表達以上討論的苦味受體細胞和細胞系。表達苦味受體各種組合的細胞和細胞系可單獨或一起使用以鑒定苦味受體調節劑(包括對特定苦味受體或者苦味受體的突變體形式或天然存在的等位基因變體特異的那些)，并獲得關于獨立形式的活性的信息。
[0259]調節劑包括改變苦味受體或其突變體形式或天然存在的等位基因變體的活性的任何物質或化合物。所述調節劑可為苦味受體激動劑(增效劑或活化劑)或拮抗劑(抑制劑或阻滯劑)，包括部分激動劑或拮抗劑、選擇性激動劑或拮抗劑及反向激動劑，并且可為別構調節劑。即使一種物質或化合物的調節活性在不同條件或濃度下或根據苦味受體的不同形式(如，突變體形式和天然存在的等位基因變體)改變，這種物質或化合物仍是調節齊U。在其它方面，調節劑可改變另一種調節劑影響苦味受體作用的能力。例如，一種不被拮抗劑抑制的苦味受體形式的調節劑可產生易被拮抗劑抑制的此種形式的苦味受體。
[0260]通過基于苦味受體對各種調節劑的響應使體內形式的苦味受體的身份與已知形式的苦味受體的身份相關聯，細胞和細胞系可用于鑒定不同形式的苦味受體在不同苦味受體病狀中的作用。這使得能夠選擇對此類苦味受體-相關的病狀或其它生理條件有較強針對性治療的疾病-或組織-特異性的苦味受體調節劑。例如，因為許多天然存在的苦味化合物是有毒性的，所以苦味受體可作為避免攝取有毒的食物化合物的警告傳感器。在胃腸粘膜中表達的苦味受體可能參與在內腔中的營養劑和有害物質的功能檢查，并使得腸道準備吸收它們或引發保護性響應。它們還可通過活化腸-腦神經通路參與食物攝取的控制。因此，使用本發明的細胞系和方法鑒定的苦味受體調節劑可在多種背景下用于調節營養吸收，如以控制肥胖者的食欲和/或減少腸道內的營養吸收，或以控制營養不良患者的饑餓感和/或以增加營養吸收和/或食物能量。苦味受體調節劑還可用于鑒定苦味化合物、進一步表征苦味受體的特定化學或結構基元或重要殘基(影響它們結合性質)、鑒定廣泛、溫和或選擇性適合與配體結合的苦味受體、基于它們的結合特性定義苦味受體的組合和亞類、使孤兒苦味受體脫孤、使用此類數據用于苦味受體的分子建模或藥物設計，和確定各種苦味受體在何種組織中有活性。
[0261 ] 為了鑒定苦味受體調節劑，表達細胞或細胞系的苦味受體可在以下條件下暴露于測試化合物，其中與適合的對照(如，不暴露于測試化合物的細胞)相比，苦味受體將期望起作用并然后檢測到苦味受體活性在統計學上有顯著變化(如，P〈0.05)。使用已知激動劑或拮抗劑的陽性和/或陰性對照和/或表達不同苦味受體或其突變體形式或天然存在的等位基因變體的細胞還可使用。在一些實施方案中，待檢測和/或測量的苦味受體活性是胞內游離鈣水平的變化。本領域的普通技術人員將理解各種測定參數可被優化，如信噪比。
[0262]在又一方面，本發明提供鑒定針對孤兒苦味受體的配體的方法，即本發明提供使苦味受體脫孤的方法。在沒有已知調節劑的情況下，表達苦味受體的細胞或細胞系可使用化合物或提取文庫來篩選，以產生針對受體的表達特征。任選地，可將具有類似特征的受體(如果有的話)分在一組，并用已知的苦味化合物篩選結合一種或多種受體的一種或多種配體。一旦配體被鑒定，則所述結果可進一步被味道測試所證實。任選地，所述細胞和細胞系穩定表達天然(即無標簽)苦味受體，因此使用該方法鑒定的配體是準確和相關的。
[0263]在一些實施方案中，包括細胞系集合的一種或多種細胞或細胞系暴露于測試化合物。在一些實施方案中，包括細胞系集合的一種或多種細胞或細胞系暴露于多種測試化合物(例如，測試化合物文庫)。測試化合物文庫可使用本發明的細胞系來篩選以鑒定一種或多種調節劑。所述測試化合物可為包括小分子、多肽、肽、肽模擬物、抗體或其抗原結合部分的化學部分。在抗體的情況下，它們可為非人抗體、嵌合抗體、人源化抗體或完全人抗體。抗體可為包含任何抗體的重鏈和輕鏈或抗原結合部分的完全互補物的完整抗體，包括抗體片段(諸如Fab, Fab，, F(ab，)2, Fd, Fv, dAb等)、單鏈抗體(scFv)、單結構域抗體、重鏈或輕鏈可變區的所有或抗原結合部分)。
[0264]在一些實施方案中，一種或多種細胞或細胞系，包括細胞系的集合，在促苦味劑的存在下暴露于測試化合物或多種測試化合物。在一些實施方案中，所述促苦味劑是活化苦味受體亞類的“特異性促苦味劑”。在一些實施方案中，所述促苦味劑是活化每種苦味受體的“普通苦味化合物”。普通苦味化合物的非限制性實例包括苯甲地那銨或糖精地那銨。降低促苦味劑對苦味受體活性誘導的測試化合物是促苦味劑的抑制劑。增加促苦味劑對苦味受體活性誘導的測試化合物是促苦味劑的促進劑。
[0265]一些苦味調節劑和測試化合物可顯示出脫靶效應。優選地，所述苦味調節劑或測試化合物是選擇性苦味調節劑，并且不顯示出脫靶效應。
[0266]本發明的體外測定可使用細胞或細胞系的集合進行。在優選的實施方案中，細胞或細胞系的集合包括表達25種苦味受體和/或其變體的每一者的細胞或細胞系。此類小組可用于確定化合物的標靶對比脫靶活性，或者受體在純苦味對比相關味道(即，澀味或金屬味)中的作用。
[0267]在一些實施方案中，在基于細胞、功能性、高通量的篩選(HTS)中，如使用96孔、384孔、1536孔或較高的板規格(plate format),測試大化合物集合的苦味受體調節活性。在一些實施方案中，測試化合物或多種測試化合物(包括測試化合物文庫)可使用本發明的多于一種的細胞或細胞系(包括細胞系的集合)來篩選。如果使用各自表達不同的天然存在的或突變體苦味受體分子的多種細胞或細胞系，則人們可鑒定對多種苦味受體或其突變體形式或天然存在的等位基因變體有效的調節劑，或者可選地對具體苦味受體或其突變體形式或天然存在的等位基因變體特異的并且不調節其它苦味受體或其它形式的苦味受體的調節劑。在表達人苦味受體的細胞或細胞系的情況下，所述細胞可暴露于測試化合物來鑒定調節(增加或降低)苦味受體活性的化合物以用于治療特征為不期望的苦味受體活性的疾病或疾患，或者降低或消失期望的苦味受體活性。
[0268]在一些實施方案中，在暴露至測試化合物之前，本發明的細胞或細胞系可通過例如酶的預處理來修飾，所述酶包括哺乳動物或其它動物的酶、植物酶、細菌酶、來自裂解細胞的酶、蛋白修飾酶、脂質修飾酶和口腔、胃腸道、胃或唾液中的酶。此類酶可包括例如激酶、蛋白酶、磷酸酶、糖苷酶、氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、連接酶等。可選地，所述細胞和細胞系可先暴露于所述測試化合物，隨后進行處理以鑒定化合物，所述化合物改變了處理對苦味受體的修飾。
[0269]鑒定和測量GPCR活化的測定為本領域所熟知。參見，如，“G-protein coupledreceptors (Signal Transduction Series), ” CRC Pressl999 ；第 I 版；編者 Haga 和Berstein0任何適用于檢測GPCR活化的測定可用于本發明的方法中，以評估潛在苦味受體調節劑對苦味受體活化的作用。此類測定的實例包括離子敏感型或膜電壓熒光指示劑。在靜息狀態下，這些染料可滲透膜，從而暴露于細胞，使得它們能夠基于濃度梯度進入細胞。一旦進入，細胞酶將染料轉化為膜-不可滲透形式，將所述染料俘獲(trapping)。膜不可滲透形式的染料通常還對例如游離胞內鈣高度敏感，從而當用特定強度或波長的光刺激時，鈣結合使得染料變為熒光的。因此，響應于GPCR活化的胞內鈣釋放可使用與結合鈣的膜-可滲透染料來測量。此類染料包括Indo-1、Fura-2、Fluo_3、Fluo-4、Rhod_2、Rhod_5N、I丐黃綠素、I丐黃綠素藍、cytoCalcein 紫羅蘭(cytoCalcein Violet)、Quin-2、Quest Fluo-8H?> Quest Fluo-8L?> Quest Fluo8?> Quest Rhod-4?、腔腸素和|丐-3。在具體實施方案中，GPCR活化使用Fluo-4或鈣-3螢光來測量。在一些實施方案中，測定緩沖液(即負載溶液)不包括丙磺舒。胞內鈣水平可使用例如熒光顯微鏡檢術、流式細胞術、熒光光譜法和熒光微板讀取器，通過測量來自響應于鈣結合的此類染料的熒光來測量。大多數熒光指示劑來源于BAPTA螯合劑，其摻入了響應于鈣的光-誘導的-電子轉移體系。例如，Molecular Devices Corp.的FLIPR ;i.和 FlexStation? 儀器、Hamamatsu Corp.的 FDSS 和BMG Technologies的NOVOstar?持續監測胞內鈣水平的變化，從而以時間依賴性熒光信號的方式提供受體活性的動態讀出。因此，這些儀器實現鈣的高通量測量用于GPCR研究。
[0270]GPCR活性還可通過測量以下來評估:腺苷酸環化酶活性、IP3/Ca2+信號傳導、磷脂酶C/胞內Ca2+信號傳導、GTP酶活性、GTP結合、微生理計/生物傳感器測定(參見，如,Hafner, 2000, Biosens.Bioelectron.15:149-158)、花生四烯酸水平(參見，如,Gijon等，2000，J.Biol.Chem.，275:20146-20156)、cAMP/cGMP 水平(通過放射免疫測定或用結合蛋白，參見，如,Horton和Baxendale, 1995, Methods Mol.Biol.41:91-105)、二酸甘油(DAG)水平、肌醇三磷酸(IP3)水平、蛋白激酶C活性和/或MAP激酶活性。
[0271]鑒定調節由KCl引起的苦味的化合物的方法
[0272]根據另一方面，本發明提供鑒定調節由KCl引起的苦味的化合物方法。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強KCl對苦味受體的活化的化合物。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強KCl及隨后的下游信號傳導對苦味受體的活化的化合物。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強在由KCl刺激之后信號傳導路徑活化的化合物。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強由KCl引起的苦味感覺的化合物。如下實施例2所示，KCl活化苦味受體TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60。因此，調節 KCl 對 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和TAS2R60苦味受體的一者或多者活化的化合物應為由KCl引起的苦味的調節劑。在一些實施方案中，所述化合物抑制 KCl 對 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60苦味受體的一者或多者的活化。在此類實施方案中，所述化合物是由KCl引起的苦味的抑制劑。在一些實施方案中，所述化合物增強KCl對TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60苦味受體的一者或多者的活化。在此類實施方案中，所述化合物是由KCl引起的苦味的促進劑。在一些實施方案中，所述化合物活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60苦味受體的一者或多者。在此類實施方案中，所述化合物模擬由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，使用活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60苦味受體的一者或多者的促味劑，進行以上公開的鑒定調節苦味的化合物的任何方法。在一些實施方案中，所述促味劑選自KC1、乳酸鉀、乙酰磺胺酸鉀和普通苦味化合物。在一些實施方案中，所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為5mM、IOmM, 15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為約5mM、約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM或約50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少5mM、至少10mM、至少15mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少35mM、至少40mM、至少45mM或至少50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少約5mM、至少約10mM、至少約15mM、至少約20mM、至少約25mM、至少約30mM、至少約35mM、至少約40mM、至少約45mM或至少約50mM。
[0273]在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的兩者或更多者的KCl-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的三者或更多者的KCl誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的四者或更多者的 KCl-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的五者或更多者的KCl-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的每一者的KCl-誘導的活化。
[0274]如上所述，在該部分中描述的鑒定調節由KCl引起的苦味的化合物的任何方法中，所述方法使用的苦味受體可與G-蛋白復合。可使用上述的任何G-蛋白。在一些實施方案中，所述G-蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。在一些實施方案中，所述Gq蛋白是Gal5蛋白。
[0275]在該部分中描述的鑒定調節由KCl引起的苦味的化合物的任何方法中，上述任何測定可用于測量苦味受體活性。在一些實施方案中，所述苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。在一些實施方案中，胞內鈣濃度是使用鈣敏感性熒光染料測量的。在一些實施方案中，所述鈣敏感性熒光染料選自Indo-1、Fura-2、Fluo-3、Fluo-4、Rhod-2、Rhod_5N、隹丐黃綠素、|丐黃綠素藍、cytoCalcein 紫羅蘭、Quin-2、Quest Fluo_8H?、Quest Fluo-8L?>Quest Fluo8?,Quest Rhod-4?、腔腸素和鈣_3。在具體的實施方案中，所述鈣敏感性熒光染料是Fluo-4或鈣-3。
[0276]在一些實施方案中，所述方法包括提供選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的一種或多種苦味受體；使一種或多種苦味受體與活化所述一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量一種或多種苦味受體的活性；洗漆一種或多種苦味受體；使一種或多種苦味受體與促味劑和測試化合物接觸；和測量一種或多種苦味受體的活性。如果一種或多種苦味受體由促味劑引起的活性不同于一種或多種苦味受體由促味劑和測試化合物引起的活性，則所述測試化合物調節由KCl引起的苦味。如果一種或多種苦味受體由促味劑引起的活性高于一種或多種苦味受體由促味劑和測試化合物引起的活性，則所述測試化合物抑制由KCl引起的苦味。如果一種或多種苦味受體由促味劑引起的活性低于一種或多種苦味受體由促味劑和測試化合物引起的活性，則所述測試化合物增強由KCl引起的苦味。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使所述受體在洗滌之前或之后與所述測試化合物接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使一種或多種苦味受體與促味劑接觸之前、同時或之后，使一種或多種苦味受體與測試化合物接觸。
[0277]在一些實施方案中，所述方法包括提供第 種或多種苦味受體和第二一種或多種苦味受體，所述苦味受體各自選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60 ;使第 種或多種苦味受體與活化所述一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量第 種或多種苦味受體的活性；使第二一種或多種苦味受體與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二一種或多種苦味受體活性。如果第 種或多種苦味受體的活性不同于第二一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物調節由KCl引起的苦味。如果第一一種或多種苦味受體的活性高于第二一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物抑制由KCl引起的苦味。如果第 種或多種苦味受體的活性低于第二一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，將第一一種或多種苦味受體在測量活性之后洗滌，以提供第二一種或多種苦味受體。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二一種或多種苦味受體與促味劑接觸之前、同時或之后，使第二一種或多種苦味受體與測試化合物接觸。
[0278]在一些實施方案中，所述方法包括提供表達一種或多種苦味受體的細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 ;使細胞與活化一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量一種或多種苦味受體的活性；洗滌細胞；使細胞與促味劑和測試化合物接觸；和測量一種或多種苦味受體的活性。如果一種或多種苦味受體由促味劑引起的活性不同于一種或多種苦味受體由促味劑和測試化合物引起的活性，則所述測試化合物調節由KCl引起的苦味。如果一種或多種苦味受體由促味劑引起的活性高于一種或多種苦味受體由促味劑和測試化合物引起的活性，則所述測試化合物抑制由KCl引起的苦味。如果一種或多種苦味受體由促味劑引起的活性低于一種或多種苦味受體由促味劑和測試化合物引起的活性，則所述測試化合物增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，所述細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，所述細胞存在于一組體外細胞系中。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使所述細胞在洗滌之前或之后與所述測試化合物接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使細胞與促味劑接觸之前、同時或之后，使細胞與測試化合物接觸。
[0279]在一些實施方案中，所述方法包括提供表達一種或多種苦味受體的第一細胞和表達一種或多種苦味受體的第二細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60 ;使第一細胞與活化所述一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量第一細胞的苦味受體活性；使第二細胞與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二細胞的苦味受體活性。如果第一細胞的苦味受體活性不同于第二細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物調節由KCl引起的苦味。如果第一細胞的苦味受體活性高于第二細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物抑制由KCl引起的苦味。如果第一細胞的苦味受體活性低于第二細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，第一和第二細胞存在于體外細胞系的一個或多個小組中。在一些實施方案中，將第一細胞在測量苦味受體活性之后洗滌以提供第二細胞。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二細胞與促味劑接觸之前、同時或之后使第二細胞與測試化合物接觸。
[0280]在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第三細胞和表達一種或多種苦味受體的第四細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60 ;其中第三和第四細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第三和第四細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一和第二細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第五細胞和表達一種或多種苦味受體的第六細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 ;其中第五和第六細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第五和第六細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一、第二、第三和第四細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第七細胞和表達一種或多種苦味受體的第八細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60 ;其中第七和第八細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第七和第八細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一、第二、第三、第四、第五和第六細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供 表達一種或多種苦味受體的第九細胞和表達一種或多種苦味受體的第十細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60 ;其中第九和第十細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第九和第十細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第i 細胞和表達一種或多種苦味受體的第十二細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 ;其中第十一和第十二細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第i 和第十二細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十細胞中的苦味受體。在此類實施方案中，所述方法包括使第三、第五、第七、第九和/或第十一細胞與活化一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量第三、第五、第七、第九和/或第十一細胞的的苦味受體活性；使第四、第六、第八、第十和/或第十二細胞與促味劑和測試化合物接觸；和測量第四、第六、第八、第十和/或第十二細胞的苦味受體活性。如果第三、第五、第七、第九和/或第十一細胞的苦味受體活性分別不同于第四、第六、第八、第十和/或第十二細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物調節由KCl引起的苦味。如果第四、第六、第八、第十和/或第十二細胞的苦味受體活性分別低于第三、第五、第七、第九和/或第十一細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物抑制由KCl引起的苦味。如果第四、第六、第八、第十和/或第十二細胞的苦味受體活性分別高于第三、第五、第七、第九和/或第十一細胞中的苦味受體活性，則所述測試化合物增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一和/或第十二細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一和/或第十二細胞存在于體外細胞系的一個或多個小組中。在一些實施方案中，將第三、第五、第七、第九和/或第十一細胞在測量苦味受體活性之后洗滌，以分別提供第四、第六、第八、第十和/或第十二細胞。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第四、第六、第八、第十和/或第十二細胞與促味劑接觸之前、同時或之后，使第四、第六、第八、第十和/或第十二細胞與所述測試化合物接觸。
[0281]在一些實施方案中，所述方法包括提供一組細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60,其中每種受體在至少一種細胞系中表達；使每種細胞系與活化選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的四者或更多者的促味劑接觸；測量每種細胞系的苦味受體活性；洗滌每種細胞系；使每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量每種細胞系的苦味受體活性。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時，選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的四種或更多種細胞系的的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的五種或更多種細胞系中不同。在一些實施方案中，苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60細胞系中不同。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時，選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的五種或更多種細胞系中較高。在一些實施方案中，苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60細胞系中較高。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相t匕，當與促味劑接觸時，選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的五種或更多種細胞系中較低。在一些實施方案中，苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60細胞系中較低。在一些實施方案中，如果化合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和TAS2R55苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，所述小組是體外細胞系的匹配小組。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使每種細胞系與測試化合物接觸。[0282]在一些實施方案中，所述方法包括提供一組細胞系，其中所述小組包括表達選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的苦味受體的細胞系，其中每種受體在至少一種細胞系中表達；使每種細胞系與活化選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少兩者的促味劑接觸；測量每種細胞系的苦味受體活性；洗滌每種細胞系；使每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量每種細胞系的苦味受體活性。在一些實施方案中，在每個小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60，其中每種受體在至少一種細胞系中表達。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時，選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少兩種細胞系的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少三種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少四種中不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少五種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 細胞系的每一者中不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時，選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的至少兩種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少三種中較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少四種中較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少五種中較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60細胞系的每一者中較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時，選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少兩種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少三種中較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少四種中較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少五種中較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60細胞系的每一者中較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果化合物不誘導TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和 TAS2R55 苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，所述小組是體外細胞系的匹配小組。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使每種細胞系與測試化合物接觸。
[0283]在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55和TAS2R60苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與活化選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的四種或更多種的促味劑接觸；測量第一小組中的每種細胞系的苦味受體活性；使第二小組中的每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的四種或更多種的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的五種或更多種細胞系中不同。在一些實施方案中，苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60細胞系中不同。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的五種或更多種細胞系中較高。在一些實施方案中，苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60細胞系中較高。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的五種或更多種細胞系中較低。在一些實施方案中，苦味受體活性在 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60細胞系中較低。在一些實施方案中，如果與第一小組相比，在第二小組中測試化合物不誘導TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和 TAS2R55 苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配的小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二小組中的每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使第二小組中的每種細胞系與測試化合物接觸。
[0284]在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每個小組包括表達選自以下的苦味受體的細胞系:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與活化選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少兩種的促味劑接觸；測量第一小組中的每種細胞系的苦味受體活性；使第二小組中的每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。在一些實施方案中，第一和第二小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和TAS2R60，其中每種受體在每個小組的至少一種細胞系中表達。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少兩種的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少三種中不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少四種中不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的細胞系的至少五種中不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60細胞系的每一者中不同，則所述測試化合物選擇性調節由KCl引起的苦味。如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的至少兩種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少三種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少四種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的至少五種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60細胞系的每一者中較高，則所述測試化合物選擇性抑制由KCl引起的苦味。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少兩種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少三種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少四種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少五種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60細胞系的每一者中較低，則所述測試化合物選擇性增強由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第一小組相比，在第二小組中測試化合物不誘導TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50和TAS2R55苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配的小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二小組中的每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使第二小組中的每種細胞系與測試化合物接觸。
[0285]在一些實施方案中，鑒定由KCl引起的苦味的調節劑的以上任何方法所用的促味劑選自KCl、乳酸鉀、乙酰磺胺酸鉀和普通苦味化合物。在一些實施方案中，所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為約 5mM、約 10mM、約 15mM、約 20mM、約 25mM、約 30mM、約 35mM、約 40mM、約 45mM 或約 50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少5mM、至少10mM、至少15mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少35mM、至少40mM、至少45mM或至少50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少約5mM、至少約10mM、至少約15mM、至少約20mM、至少約25mM、至少約30mM、至少約35mM、至少約40mM、至少約45mM或至少約50mM。
[0286]在另一方面，本發明提供鑒定模擬由KCl引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與陰性對照接觸；測量第一小組中的每種細胞系的苦味受體活性；使第一小組的每種細胞系與陰性對照接觸；使第二小組中的每種細胞系與測試化合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。如果所述測試化合物誘導TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的苦味受體活性，則所述測試化合物模擬由KCl引起的苦味。在一些實施方案中，與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50和TAS2R55苦味受體活性。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配的小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加測試化合物之前的測定緩沖液。
[0287]在另一方面，本發明提供確定KCl是否存在于組合物中的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與陰性對照接觸；測量第一小組中的每種細胞系的苦味受體活性；使第二小組中的每種細胞系與所述組合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。如果與第一小組相比在第二小組中組合物誘導TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60苦味受體活性，并且與第一小組相比在第二小組中組合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和TAS2R55苦味受體活性，則KCl存在于所述組合物中。在一些實施方案中，所述組合物是食品提取物。在一些實施方案中，所述組合物包含藥物活性成分。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配的小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加組合物之前的測定緩沖液。
[0288]在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的兩種或更多種不同的苦味受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的不同苦味受體的兩種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的三種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的不同苦味受體的三種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的四種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的不同苦味受體的四種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的五種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的不同苦味受體的五種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的六種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的不同苦味受體的六種或更多種細胞接觸。
[0289]在一些實施方案中，其中鑒定調節、抑制、增強或模擬由KCl引起的苦味的化合物的方法包括使TAS2R44或表達TAS2R44的細胞與促味劑或測試化合物接觸，所述方法還包括使至少一種另外的苦味受體或表達至少一種另外的苦味受體的細胞與促味劑或測試化合物接觸，其中所述至少一種另外的苦味受體選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14和TAS2R60。
[0290]在一些實施方案中，所述方法進一步包括將調節、抑制、增強或模擬由KCl引起的苦味的測試化合物與食材、食材生產中使用的任何食材前體材料或任何添加物混合。在一些實施方案中，所述食材是供人消耗的。在一些實施方案中，所述食材是供動物消耗的，諸如供寵物或家畜消耗。在一些實施方案中，所述方法進一步包括將調節、抑制、增強或模擬由KCl引起的苦味的測試化合物與活性劑以藥學上可接受的形式混合。
[0291]鑒定調節由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法
[0292]根據另一方面，本發明提供鑒定調節由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強乳酸鉀對苦味受體的活化的化合物。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強由乳酸鉀及之后的下游信號傳導引起的苦味受體活化的化合物。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強在乳酸鉀刺激之后的信號傳導路徑的活化的化合物。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強由乳酸鉀引起的苦味的感覺的化合物。如以下實施例3所示，乳酸鉀活化苦味受體TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60。因此，調節 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60苦味受體的一者或多者的乳酸鉀活化的化合物應為由乳酸鉀引起的苦味的調節劑。在一些實施方案中，所述化合物抑制TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 苦味受體的一者或多者的乳酸鉀活化。在此類實施方案中，所述化合物是由乳酸鉀引起的苦味的抑制劑。在一些實施方案中，所述化合物增強 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60苦味受體的一者或多者的乳酸鉀活化。在此類實施方案中，所述化合物是由乳酸鉀引起的苦味的促進劑。在一些實施方案中，所述化合物活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60苦味受體的一者或多者。在此類實施方案中，所述化合物模擬由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，使用活化TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60苦味受體的一者或多者的促味劑，進行以上公開的鑒定調節苦味的化合物的任何方法。在一些實施方案中，所述促味劑選自KC1、乳酸鉀、乙酰磺胺酸鉀和普通苦味化合物。在一些實施方案中，所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為5mM、IOmM, 15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為約5mM、約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM或約50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少5mM、至少10mM、至少15mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少35mM、至少40mM、至少45mM或至少50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少約5mM、至少約10mM、至少約15mM、至少約20mM、至少約25mM、至少約30mM、至少約35mM、至少約40mM、至少約45mM或至少約50mM。
[0293]在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的兩者或更多者的乳酸鉀-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的三者或更多者的乳酸鉀-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60的四者或更多者的乳酸鉀-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的五者或更多者的乳酸鉀-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的六者或更多者的乳酸鉀-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的每一者的乳酸鉀-誘導的活化。
[0294]如上所述，在該段中描述的鑒定調節由乳酸鉀引起的苦味的化合物的任何方法中，所述方法使用的苦味受體可與G-蛋白復合。可使用上述的任何G-蛋白。在一些實施方案中，所述G-蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。在一些實施方案中，所述Gq蛋白是Gal5蛋白。
[0295]在該段中描述的鑒定調節由乳酸鉀引起的苦味的化合物的任何方法中，上述任何測定可用于測量苦味受體活性。在一些實施方案中，所述苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。在一些實施方案中，胞內鈣濃度是使用鈣敏感性熒光染料測量的。在一些實施方案中，所述鈣敏感性熒光染料選自Indo-1、Fura-2、Fluo-3、Fluo-4、Rhod-2, Rhod_5N、隹丐黃綠素、|丐黃綠素藍、cytoCalcein 紫羅蘭、Quin-2、Quest Fluo_8H?、Quest Fluo-8L?>Quest Fluo8?,Quest Rhod-4?、腔腸素和鈣_3。在具體的實施方案中，所述鈣敏感性熒光染料是Fluo-4或鈣-3。
[0296]在一些實施方案中，所述方法包括提供選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的一種或多種苦味受體；使一種或多種苦味受體與活化所述一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量一種或多種苦味受體的活性；洗漆一種或多種苦味受體；使一種或多種苦味受體與促味劑和測試化合物接觸；和測量一種或多種苦味受體的活性。如果由促味劑引起的一種或多種苦味受體的活性不同于由促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物調節由乳酸鉀引起的苦味。如果由促味劑引起的一種或多種苦味受體的活性高于由促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物抑制由乳酸鉀引起的苦味。如果由促味劑引起的一種或多種苦味受體的活性低于由促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物增強由乳酸鉀引起的苦味。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使所述受體在洗滌之前或之后與所述測試化合物接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使一種或多種苦味受體與促味劑接觸之前、同時或之后，使一種或多種苦味受體與測試化合物接觸。[0297]在一些實施方案中，所述方法包括提供第 種或多種苦味受體和第二一種或多種苦味受體，所述苦味受體各自選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60 ;使第 種或多種苦味受體與活化所述一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量第 種或多種苦味受體的活性；使第二一種或多種苦味受體與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二一種或多種苦味受體活性。如果第 種或多種苦味受體的活性不同于第二一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物調節由乳酸鉀引起的苦味。如果第一一種或多種苦味受體的活性高于第二一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物抑制由乳酸鉀引起的苦味。如果第 種或多種苦味受體的活性低于第二一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，將第一一種或多種苦味受體在測量活性之后洗滌，以提供第二一種或多種苦味受體。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二一種或多種苦味受體與促味劑接觸之前、同時或之后，使第二一種或多種苦味受體與測試化合物接觸。
[0298]在一些實施方案中，所述方法包括提供表達一種或多種苦味受體的細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60 ;使細胞與活化一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量一種或多種苦味受體的活性；洗滌細胞；使細胞與促味劑和測試化合物接觸；和測量一種或多種苦味受體的活性。如果由促味劑引起的一種或多種苦味受體的活性不同于由促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物調節由乳酸鉀引起的苦味。如果由促味劑引起的一種或多種苦味受體的活性高于由促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物抑制由乳酸鉀引起的苦味。如果由促味劑引起的一種或多種苦味受體的活性低于由促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，所述細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，所述細胞存在于一組體外細胞系中。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使所述細胞在洗滌之前或之后與所述測試化合物接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使細胞與促味劑接觸之前、同時或之后，使細胞與測試化合物接觸。
[0299]在一些實施方案中，所述方法包括提供表達一種或多種苦味受體的第一細胞和表達一種或多種苦味受體的第二細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60 ;使第一細胞與活化一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量第一細胞的苦味受體活性；使第二細胞與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二細胞的苦味受體活性。如果第一細胞的苦味受體活性不同于第二細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物調節由乳酸鉀引起的苦味。如果第一細胞的苦味受體活性高于第二細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物抑制由乳酸鉀引起的苦味。如果第一細胞的苦味受體活性低于第二細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，第一和第二細胞存在于體外細胞系的一個或多個小組中。在一些實施方案中，將第一細胞在測量苦味受體活性之后洗滌以提供第二細胞。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二細胞與促味劑接觸之前、同時或之后使第二細胞與測試化合物接觸。
[0300]在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第三細胞和表達一種或多種苦味受體的第四細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 ;其中第三和第四細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第三和第四細胞中的苦味受體不同于第一和第二細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第五細胞和表達一種或多種苦味受體的第六細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 ;其中第五和第六細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第五和第六細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一、第二、第三和第四細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第七細胞和表達一種或多種苦味受體的第八細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60 ;其中第七和第八細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第七和第八細胞中的苦味受體不同于第一、第二、第三、第四、第五和第六細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第九細胞和表達一種或多種苦味受體的第十細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60 ;其中第九和第十細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第九和第十細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第i 細胞和表達一種或多種苦味受體的第十二細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60 ;其中第^ 和第十二細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第i和第十二細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第十三細胞和表達一種或多種苦味受體的第十四細胞，其中一種或多種苦味受體選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 ;其中第十三和第十四細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；其中第十三和第十四細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第十三和第十四細胞中的苦味受體不同于第一、第
二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一和第十二細胞中的苦味受體。在此類實施方案中，所述方法包括使第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞與活化一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞的苦味受體活性；使第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞與促味劑和測試化合物接觸；并且測量第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞的苦味受體活性。如果第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞的苦味受體活性分別不同于第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物調節由乳酸鉀引起的苦味。如果第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞的苦味受體活性分別低于第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物抑制由乳酸鉀引起的苦味。如果第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞的苦味受體活性分別高于第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第 十、第十一、第十二、第十三和/或第十四細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三和/或第十四存在于體外細胞系的一個或多個小組中。在一些實施方案中，將第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞在測量苦味受體活性之后洗滌，以分別提供第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞與促味劑接觸之前、同時或之后，使第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞與測試化合物接觸。
[0301]在一些實施方案中，所述方法包括提供一組細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60,其中每種受體在至少一種細胞系中表達；使每種細胞系與活化選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的四者或更多者的促味劑接觸；測量每種細胞系的苦味受體活性；洗滌每種細胞系；使每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量每種細胞系的苦味受體活性。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時，選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的四種或更多種細胞系的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60的五種或更多種細胞系中不同。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的六種或更多種細胞系中不同。在一些實施方案中，苦味受體活性在 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60細胞系中不同。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時，選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60的五種或更多種細胞系中較高。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的六種或更多種細胞系中較高。在一些實施方案中，苦味受體活性在 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60細胞系中較高。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時，選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的五種或更多種細胞系中較低。在一些實施方案中，苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 細胞系中較低。在一些實施方案中，如果化合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50和TAS2R55苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，所述小組是體外細胞系的匹配小組。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使每種細胞系與測試化合物接觸。
[0302]在一些實施方案中，所述方法包括提供一組細胞系，其中所述小組包括表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的苦味受體的細胞系，其中每種受體在至少一種細胞系中表達；使每種細胞系與活化選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少兩種的促味劑接觸；測量每種細胞系的苦味受體活性；洗滌每種細胞系；使每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量每種細胞系的苦味受體活性。在一些實施方案中，在每個小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60，其中每種受體在至少一種細胞系中表達。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少兩種細胞系的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少三種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少四種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少五種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少六種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 細胞系的每一者中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少兩種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60的至少三種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少四種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少五種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少六種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60細胞系的每一者中較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少兩種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時，選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少三種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少四種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60的至少五種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少六種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 細胞系的每一者中較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果化合物不誘導TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和 TAS2R55 苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，所述小組是體外細胞系的匹配小組。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使每種細胞系與測試化合物接觸。
[0303]在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55和TAS2R60苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與活化選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的四者或更多者的促味劑接觸；測量第一小組的每種細胞系的苦味受體活性；使第二小組中的每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的四種或更多種細胞系的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60的五種或更多種細胞系中不同。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的六種或更多種細胞系中不同。在一些實施方案中，苦味受體活性在 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60細胞系中不同。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的五種或更多種細胞系中較高。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的六種或更多種細胞系中較高。在一些實施方案中，苦味受體活性在 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 細胞系中較高。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的五種或更多種細胞系中較低。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的六種或更多種細胞系中較低。在一些實施方案中，苦味受體活性在 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 細胞系中較低。在一些實施方案中，如果與第一小組相比，在第二小組中測試化合物不誘導TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和 TAS2R55 苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配的小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二小組的每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使第二小組的每種細胞系與測試化合物接觸。
[0304]在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每個小組包括表達選自以下的苦味受體的細胞系:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與活化選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少兩者的促味劑接觸；測量第一小組的每種細胞系的苦味受體活性；使第二小組中的每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。在一些實施方案中，第一和第二小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55和TAS2R60，其中每種受體在每個小組的至少一種細胞系中表達。如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60的細胞系的至少兩種苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少三種細胞系的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少四種細胞系中的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少五種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少六種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60細胞系的每一者中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乳酸鉀引起的苦味。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少兩種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60的至少三種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少四種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60的至少五種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少六種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中苦味受體活性在 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60細胞系的每一者中較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乳酸鉀引起的苦味。如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60的至少兩種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少三種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60的至少四種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的至少五種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的至少六種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中苦味受體活性在TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60細胞系的每一者中較低，則所述測試化合物選擇性增強由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第一小組相比，在第二小組中測試化合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和TAS2R55苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二小組的每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使第二小組的每種細胞系與測試化合物接觸。
[0305]在一些實施方案中，鑒定由乳酸鉀引起的苦味的調節劑的以上任何方法所用的促味劑選自KCl、乳酸鉀、乙酰磺胺酸鉀和普通苦味化合物。在一些實施方案中，所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為約 5mM、約 10mM、約 15mM、約 20mM、約 25mM、約 30mM、約 35mM、約 40mM、約 45mM 或約 50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少5mM、至少10mM、至少15mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少35mM、至少40mM、至少45mM或至少50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少約5mM、至少約10mM、至少約15mM、至少約20mM、至少約25mM、至少約30mM、至少約35mM、至少約40mM、至少約45mM或至少約50mM。
[0306]在另一方面，本發明提供鑒定模擬由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與陰性對照接觸；測量第一小組中的每種細胞系的苦味受體活性；使第一小組的每種細胞系與陰性對照接觸；使第二小組中的每種細胞系與測試化合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。如果所述測試化合物誘導 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的苦味受體活性，則所述測試化合物模擬由乳酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50和TAS2R55苦味受體活性。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配的小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加測試化合物之前的測定緩沖液。
[0307]在另一方面，本發明提供確定乳酸鉀是否存在于組合物中的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與陰性對照接觸；測量第一小組的每種細胞系的苦味受體活性；使第二小組中的每種細胞系與所述組合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。如果與第一小組相比在第二小組中組合物誘導TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60苦味受體活性，并且與第一小組相比在第二小組中組合物不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 和TAS2R55苦味受體活性，則乳酸鉀存在于所述組合物中。在一些實施方案中，所述組合物是食品提取物。在一些實施方案中，所述組合物包含藥物活性成分。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配的小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加組合物之前的測定緩沖液。
[0308]在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的兩種或更多種不同的苦味受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的不同苦味受體的兩種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的三種或更多種不同味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的不同苦味受體的三種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的四種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 的不同苦味受體的四種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑 + 測試化合物與選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60的五種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑 + 測試化合物與各自表達選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和TAS2R60的不同苦味受體的五種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑 + 測試化合物與選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的六種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的不同苦味受體的六種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的七種或更多種的不同味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的不同苦味受體的七種或更多種細胞接觸。
[0309]在一些實施方案中，其中鑒定調節、抑制、增強或模擬由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法包括使TAS2R44或表達TAS2R44的細胞與促味劑或測試化合物接觸，所述方法還包括使至少一種另外的苦味受體或表達至少一種另外的苦味受體的細胞與促味劑或測試化合物接觸，其中所述至少一種另外的苦味受體選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R46 和 TAS2R60。
[0310]在一些實施方案中，所述方法進一步包括將調節、抑制、增強或模擬由乳酸鉀引起的苦味的測試化合物與食材、食材生產中使用的任何食材前體材料或任何添加物混合。在一些實施方案中，所述食材是供人消耗的。在一些實施方案中，所述食材是供動物消耗的，諸如供寵物或家畜消耗。在一些實施方案中，所述方法還包括將調節、抑制、增強或模擬由乳酸鉀引起的苦味的測試化合物與活性劑以藥學上可接受的形式混合。
[0311]鑒定調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法
[0312]根據另一方面，本發明提供鑒定調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強乙酰磺胺酸鉀對苦味受體活化的化合物。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強乙酰磺胺酸鉀及隨后的下游信號傳導對苦味受體活化的化合物。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強由乙酰磺胺酸鉀刺激之后信號傳導路徑活化的化合物。在一些實施方案中，所述方法鑒定調節、抑制或增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味感覺的化合物。如下實施例4所示，乙酰磺胺酸鉀活化苦味受體 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44。因此，調節乙酰磺胺酸鉀對 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 苦味受體的一者或多者活化的化合物應為由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的調節劑。在一些實施方案中，所述化合物抑制乙酰磺胺酸鉀對TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44苦味受體的一者或多者的活化。在此類實施方案中，所述化合物是由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的抑制劑。在一些實施方案中，所述化合物增強乙酰磺胺酸鉀對TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 苦味受體的一者或多者的活化。在此類實施方案中，所述化合物是由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的促進劑。在一些實施方案中，所述化合物活化 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 苦味受體的一者或多者。在此類實施方案中，所述化合物模擬由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，使用活化 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 苦味受體的一者或多者的促味劑，進行以上公開的鑒定調節苦味的化合物的任何方法。在一些實施方案中，所述促味劑選自KCl、乳酸鉀、乙酰磺胺酸鉀和普通苦味化合物。在一些實施方案中，所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為 5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM*50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為約5mM、約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM或約50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少5mM、至少10mM、至少15mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少35mM、至少40mM、至少45mM或至少50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少約5mM、至少約10mM、至少約15mM、至少約20mM、至少約25mM、至少約30mM、至少約35mM、至少約40mM、至少約45mM或至少約50mM。
[0313]在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的兩者或更多者的乙酰磺胺酸鉀-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的三者或更多者的乙酰磺胺酸鉀-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的四者或更多者的乙酰磺胺酸鉀-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的五者或更多者的乙酰磺胺酸鉀-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的六者或更多者的乙酰磺胺酸鉀-誘導的活化。在一些實施方案中，所述測試化合物調節、抑制或增強 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的每一者的乙酰磺胺酸鉀-誘導的活化。
[0314]如上所述，在該段中描述的鑒定調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的任何方法中，所述方法使用的苦味受體可與G-蛋白復合。可使用上述的任何G-蛋白。在一些實施方案中，所述G-蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。在一些實施方案中，所述Gq蛋白是Ga 15蛋白。
[0315]在該段中描述的鑒定調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的任何方法中，上述任何測定可用于測量苦味受體活性。在一些實施方案中，所述苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。在一些實施方案中，胞內鈣濃度是使用鈣敏感性熒光染料測量的。在一些實施方案中，所述鈣敏感性熒光染料選自Indo-1、Fura-2、Fluo-3, Fluo-4, Rhod-2,Rhod_5N、I丐黃綠素、I丐黃綠素藍、cytoCalcein 紫羅蘭、Quin-2、Quest Fluo_8H?、QuestFluo-8L?、Quest Fluo8?、Quest Rhod-4?、腔腸素和鈣-3。在具體的實施方案中，所述鈣敏感性熒光染料是Fluo-4或鈣-3。
[0316]在一些實施方案中，所述方法包括提供選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的一種或多種苦味受體；使一種或多種苦味受體與活化所述一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量一種或多種苦味受體的活性；洗漆一種或多種苦味受體；使一種或多種苦味受體與促味劑和測試化合物接觸；和測量一種或多種苦味受體的活性。如果由促味劑引起的一種或多種苦味受體的活性不同于由促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果由于促味劑引起的一種或多種的苦味受體活性高于由于促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果由于苦味劑引起的一種或多種苦味受體的活性低于由于促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使所述受體在洗滌之前或之后與所述測試化合物接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使一種或多種苦味受體與促味劑接觸之前、同時或之后，使一種或多種苦味受體與測試化合物接觸。
[0317]在一些實施方案中，所述方法包括提供第 種或多種苦味受體和第二一種或多種苦味受體，所述苦味受體各自選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44 ;使第 種或多種苦味受體與活化所述一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量第 種或多種苦味受體的活性；使第二一種或多種苦味受體與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二一種或多種苦味受體活性。如果第 種或多種苦味受體的活性不同于第二一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果第一一種或多種苦味受體的活性高于第二一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果第一一種或多種苦味受體的活性低于第二一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，將第 種或多種苦味受體在測量活性之后洗漆，以提供第二一種或多種苦味受體。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二一種或多種苦味受體與促味劑接觸之前、同時或之后，使第二一種或多種苦味受體與測試化合物接觸。
[0318]在一些實施方案中，所述方法包括提供表達一種或多種苦味受體的細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和TAS2R44 ;使細胞與活化一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量一種或多種苦味受體的活性；洗滌細胞；使細胞與促味劑和測試化合物接觸；和測量一種或多種苦味受體的活性。如果由促味劑引起的一種或多種苦味受體的活性不同于由促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果由于促味劑引起的一種或多種的苦味受體活性高于由于促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果由于苦味劑引起的一種或多種苦味受體的活性低于由于促味劑和測試化合物引起的一種或多種苦味受體的活性，則所述測試化合物增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，所述細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，所述細胞存在于一組體外細胞系中。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使所述細胞在洗滌之前或之后與所述測試化合物接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使細胞與促味劑接觸之前、同時或之后，使細胞與測試化合物接觸。
[0319]在一些實施方案中，所述方法包括提供表達一種或多種苦味受體的第一細胞和表達一種或多種苦味受體的第二細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44 ;使第一細胞與活化一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量第一細胞的苦味受體活性；使第二細胞與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二細胞的苦味受體活性。如果第一細胞的苦味受體活性不同于第二細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果第一細胞的苦味受體活性高于第二細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果第一細胞的苦味受體活性低于第二細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，第一和第二細胞存在于體外細胞系的一個或多個小組中。在一些實施方案中，將第一細胞在測量苦味受體活性之后洗滌以提供第二細胞。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二細胞與促味劑接觸之前、同時或之后使第二細胞與測試化合物接觸。
[0320]在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第三細胞和表達一種或多種苦味受體的第四細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 ;其中第三和第四細胞中的一種或多種苦味受體相同；并且其中第三和第四細胞中的苦味受體不同于第一和第二細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第五細胞和表達一種或多種苦味受體的第六細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 ;其中第五和第六細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第五和第六細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一、第二、第三和第四細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第七細胞和表達一種或多種苦味受體的第八細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 ;其中第七和第八細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第七和第八細胞中的苦味受體不同于第一、第二、第三、第四、第五和第六細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第九細胞和表達一種或多種苦味受體的第十細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44 ;其中第九和第十細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第九和第十細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第i 細胞和表達一種或多種苦味受體的第十二細胞，其中所述一種或多種苦味受體選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 ;其中第十一和第十二細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第i 和第十二細胞中的一種或多種苦味受體不同于第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十細胞中的苦味受體。在一些實施方案中，所述方法進一步包括提供表達一種或多種苦味受體的第十三細胞和表達一種或多種苦味受體的第十四細胞,其中所述一種或多種苦味受體選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 ;其中第十三和第十四細胞中的一種或多種苦味受體是相同的；并且其中第十三和第十四細胞中的苦味受體不同于第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一和第十二細胞中的苦味受體。在此類實施方案中，所述方法包括使第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞與活化一種或多種苦味受體的促味劑接觸；測量第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞的苦味受體活性；使第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞與促味劑和測試化合物接觸；并且測量第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞的苦味受體活性。如果第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞的苦味受體活性分別不同于第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞的苦味受體活性分別低于第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞的苦味受體活性分別高于第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三和/或第十四細胞存在于體外細胞系中。在一些實施方案中，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三和/或第十四存在于體外細胞系的一個或多個小組中。在一些實施方案中，將第三、第五、第七、第九、第十一和/或第十三細胞在測量苦味受體活性之后洗滌，以分別提供第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞與促味劑接觸之前、同時或之后，使第四、第六、第八、第十、第十二和/或第十四細胞與測試化合物接觸。
[0321]在一些實施方案中，所述方法包括提供一組細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60，其中每種受體在至少一種細胞系中表達；使每種細胞系與活化選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的四者或更多者的促味劑接觸；測量每種細胞系的苦味受體活性；洗滌每種細胞系；使每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量每種細胞系的苦味受體活性。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的四種或更多種細胞系的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的五種或更多種細胞系中不同。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的六種或更多種細胞系中不同。在一些實施方案中，苦味受體活性在 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和TAS2R44細胞系中不同。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的五種或更多種細胞系中較高。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的六種或更多種細胞系中較高。在一些實施方案中，苦味受體活性在 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和TAS2R44細胞系中較高。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的五種或更多種細胞系中較低。在一些實施方案中，苦味受體活性在TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 細胞系中較低。在一些實施方案中，如果化合物不誘導 TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和TAS2R60苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，所述小組是體外細胞系的匹配小組。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使每種細胞系與測試化合物接觸。
[0322]在一些實施方案中，所述方法包括提供一組細胞系,其中所述小組包括表達選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的苦味受體的細胞系，其中每種受體在至少一種細胞系中表達；使每種細胞系與活化選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的兩者的促味劑接觸；測量每種細胞系的苦味受體活性；洗滌每種細胞系；使每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量每種細胞系的苦味受體活性。在一些實施方案中，在每個小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60，其中每種受體在至少一種細胞系中表達。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少兩種細胞系的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44的至少三種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少四種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少五種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少六種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 細胞系的每一者中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少兩種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和TAS2R44的至少三種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時，選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少四種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少五種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少六種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時苦味受體活性在TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 細胞系的每一者中較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少兩種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當用促味劑和測試化合物接觸時相比，當用促味劑接觸時選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少三種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少四種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少五種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少六種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與當與促味劑和測試化合物接觸時相比，當與促味劑接觸時苦味受體活性在TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44細胞系的每一者中較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果化合物不誘導TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，所述小組是體外細胞系的匹配小組。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使每種細胞系與測試化合物接觸。
[0323]在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55和TAS2R60苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與活化選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的四者或更多者的促味劑接觸；測量第一小組的每種細胞系的苦味受體活性；使第二小組中的每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的四種或更多種細胞系的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的五種或更多種細胞系中不同。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的六種或更多種細胞系中不同。在一些實施方案中，苦味受體活性在TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44細胞系中不同。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的五種或更多種細胞系中較高。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的六種或更多種細胞系中較高。在一些實施方案中，苦味受體活性在 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和TAS2R44細胞系中較高。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的四種或更多種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的五種或更多種細胞系中較低。在一些實施方案中，苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的六種或更多種細胞系中較低。在一些實施方案中，苦味受體活性在 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 細胞系中較低。在一些實施方案中，如果與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配的小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二小組中的每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使第二小組中的每種細胞系與測試化合物接觸。
[0324]在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每個小組包括表達選自以下的苦味受體的細胞系:TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與活化選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少兩者的促味劑接觸；測量第一小組的每種細胞系的苦味受體活性；使第二小組中的每種細胞系與促味劑和測試化合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。在一些實施方案中，第一和第二小組中的每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55和TAS2R60，其中每種受體在每個小組的至少一種細胞系中表達。如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少兩種細胞系的苦味受體活性不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少三種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少四種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少五種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少六種細胞系中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果苦味受體活性在TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44細胞系的每一者中不同，則所述測試化合物選擇性調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少兩種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少三種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少四種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少五種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少六種細胞系的苦味受體活性較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相t匕，在第一小組中苦味受體活性在 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和TAS2R44細胞系的每一者中較高，則所述測試化合物選擇性抑制由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少兩種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少三種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少四種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的至少五種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的至少六種細胞系的苦味受體活性較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第二小組相比，在第一小組中苦味受體活性在 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44細胞系的每一者中較低，則所述測試化合物選擇性增強由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，如果與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體活性，則所述測試化合物選擇性調節、抑制或活化由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。可依次或同時添加促味劑和測試化合物，即可在使第二小組中的每種細胞系與促味劑接觸之前、同時或之后，使第二小組中的每種細胞系與測試化合物接觸。
[0325]在一些實施方案中，鑒定由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的調節劑的以上任何方法所用的促味劑選自KCl、乳酸鉀、乙酰磺胺酸鉀和普通苦味化合物。在一些實施方案中，所述普通苦味化合物是苯甲地那銨或糖精地那銨。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM*50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為約 5mM、約 10mM、約 15mM、約 20mM、約 25mM、約 30mM、約 35mM、約 40mM、約 45mM 或約50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少5mM、至少10mM、至少15mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少35mM、至少40mM、至少45mM或至少50mM。在一些實施方案中，所述促味劑的濃度為至少約5mM、至少約10mM、至少約15mM、至少約20mM、至少約25mM、至少約30mM、至少約35mM、至少約40mM、至少約45mM或至少約50mM。
[0326]在另一方面，本發明提供鑒定模擬由乙酰磺胺酸鉀弓I起的苦味的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和TAS2R60苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與陰性對照接觸；測量第一小組中的每種細胞系的苦味受體活性；使第一小組的每種細胞系與陰性對照接觸；使第二小組中的每種細胞系與測試化合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。如果測試化合物誘導 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的苦味受體活性，則所述測試化合物模擬由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味。在一些實施方案中，與第一小組相比，在第二小組中所述測試化合物不誘導TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55和TAS2R60苦味受體活性。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配的小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加測試化合物之前的測定緩沖液。
[0327]在另一方面，本發明提供確定乙酰磺胺酸鉀是否存在于組合物中的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供第一小組的細胞系和第二小組的細胞系，其中每種細胞系表達選自以下的苦味受體:TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體，其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系；使第一小組中的每種細胞系與陰性對照接觸；測量第一小組的每種細胞系的苦味受體活性；使第二小組中的每種細胞系與所述組合物接觸；和測量第二小組中的每種細胞系的苦味受體活性。如果與第一小組相比在第二小組中組合物誘導TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44苦味受體活性，并且與第一小組相比在第二小組中組合物不誘導 TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55和TAS2R60苦味受體活性，則乙酰磺胺酸鉀存在于所述組合物中。在一些實施方案中，所述組合物是食品提取物。在一些實施方案中，所述組合物包含藥物活性成分。在一些實施方案中，第一和第二小組是體外細胞系的匹配的小組。在一些實施方案中，將第一小組的細胞系在測量其苦味受體活性之后洗滌，以提供第二小組的細胞系。換言之，第一和第二小組的細胞系是相同的，所述洗滌步驟在第一測量步驟和第二接觸步驟之間。技術人員將認識到在此類實施方案中測試順序不重要。可使細胞系與所述測試化合物在洗滌之前或之后接觸。在一些實施方案中，所述陰性對照是添加組合物之前的測定緩沖液。
[0328]在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的兩種或更多種不同的苦味受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的不同苦味受體的兩種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的三種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的不同苦味受體的三種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44 的四種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44的不同苦味受體的四種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑 + 測試化合物與選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和 TAS2R44的五種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑 + 測試化合物與各自表達選自 TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16 和TAS2R44的不同苦味受體的五種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的六種或更多種不同的味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的不同苦味受體的六種或更多種細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的七種或更多種不同味道受體接觸。在一些實施方案中，所述方法包括使促味劑和促味劑+測試化合物與各自表達選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的不同苦味受體的七種或更多種細胞接觸。
[0329]在一些實施方案中，其中鑒定調節、抑制、增強或模擬由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法包括使TAS2R44或表達TAS2R44的細胞與促味劑或測試化合物接觸，所述方法還包括使至少一種另外的苦味受體或表達至少一種另外的苦味受體的細胞與促味劑或測試化合物接觸，其中所述至少一種另外的苦味受體選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14 和 TAS2R16。
[0330]在一些實施方案中，所述方法進一步包括將調節、抑制、增強或模擬由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的測試化合物與食材、食材生產中使用的任何食材前體材料或任何添加物混合。在一些實施方案中，所述食材是供人消耗的。在一些實施方案中，所述食材是供動物消耗的，諸如供寵物或家畜消耗。在一些實施方案中，所述方法進一步包括將調節、抑制、增強或模擬由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的測試化合物與活性劑以藥學上可接受的形式混合。
[0331]鑒定調節苦味的化合物的細胞系小組
[0332]根據另一方面，本發明提供鑒定調節苦味的化合物的細胞系小組。
[0333]在一些實施方案中，所述細胞系小組用于鑒定調節由KCl引起的苦味的化合物。在一些實施方案中，所述小組包括表達選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的苦味受體的細胞系。在一些實施方案中，TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的每一者在小組中的至少一種細胞系中表達。在一些實施方案中，所述小組基本上由表達選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的苦味受體的細胞系組成。在一些實施方案中，細胞系小組進一步包括陰性對照細胞系。在一些實施方案中，所述陰性對照是鑒定調節由KCl引起的苦味的化合物的方法的陰性對照。
[0334]在一些實施方案中，所述細胞系小組用于鑒定調節由乳酸鉀引起的苦味的化合物。在一些實施方案中，所述小組包括表達選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的苦味受體的細胞系。在一些實施方案中，TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的每一者在小組中的至少一種細胞系中表達。在一些實施方案中，所述小組基本上由表達選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46和TAS2R60的苦味受體的細胞系組成。在一些實施方案中，細胞系小組進一步包括陰性對照細胞系。在一些實施方案中，所述陰性對照是鑒定調節由乳酸鉀引起的苦味的化合物的方法的陰性對照。
[0335]在一些實施方案中，所述細胞系小組用于鑒定調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物。在一些實施方案中，所述小組包括表達選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的苦味受體的細胞系。在一些實施方案中，TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的每一者在小組中的至少一種細胞系中表達。在一些實施方案中，所述小組基本上由表達選自TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44的苦味受體的細胞系組成。在一些實施方案中，細胞系小組進一步包括陰性對照細胞系。在一些實施方案中，所述陰性對照是鑒定調節由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的化合物的方法的陰性對照。實施例
[0336]為了更充分地理解本發明，列出了以下實施例。這些實施例僅用于說明的目的，而并不被理解為以任何形式限制本發明的范圍。
[0337]按照國際專利申請公開W02010/088633所述產生一組表達二十五種苦味受體的每一者的細胞系(參見，如實施例26)。因此，所述小組的每種細胞系表達人苦味受體和小鼠Ga1Jf號傳導蛋白。
[0338]以下每個實施例使用下列功能測定:
[0339]第I天:將穩定細胞系接種至黑壁/透明底96孔板(如，Corning, 3904)上。每孔添加大約40K細胞，并將其在37°C、5% CO2下在細胞生長培養基(補充有10%胎牛血清(Sigma，5178)、2mM 谷氨酰胺(Sigma, G7513)的 DMEM(Sigma, D5796))中孵育過夜。
[0340]第2天:棄去生長培養基，并將細胞在37°C、5% CO2下在IOOul負載溶液中孵育60分鐘，所述負載溶液含有在緩沖溶液中的IX Ca-3染料(Molecular Devices, R8090) U %DMS0，所述緩沖溶液含有 130mM NaCl、2mM CaCl2、5mM KC1、1.2mM MgCl2UOmM HEPES 和 IOmM葡萄糖(pH7.0)。丙磺舒未被包括在負載溶液中。
[0341]功能測定:在染料加載后，將細胞板置于熒光分析儀(如，FDSS6000 (Hamamatsu,Japan))中，并且通過添加50ul3X濃縮的配體/激動劑儲備液測量受體刺激。在添加激動劑之前持續監測熒光10s，并在用激動劑刺激之后監測熒光100-250S。
[0342]受體活化如下所定義:
[0343]%活化=[((最大信號熒光-最小信號熒光)-(最大對照熒光-最小對照熒光))/(最大緩沖熒光-最小緩沖熒光)]*100
[0344]功能響應=[(最大信號熒光-最小信號熒光)-(最大對照熒光-最小對照熒光)]
[0345]信號熒光:是指對添加配體所見的熒光變化
[0346]對照熒光:是指對添加緩沖液(陰性對照)所見的熒光變化
[0347]將來自配體和對照的鈣信號在刺激之前針對細胞的基礎熒光歸一化。
[0348]進行濃度分析，并通過非線性回歸計算EC5tl值，使用下式:Y =底部+(頂部-底部)/ (1+10" ((LogEC50-X) *希耳斜率))。X = log劑量或濃度，Y =響應(隨著X增加而增加)，頂部=最大信號，底部=最小信號。EC5tl(半數最大有效濃度)是指激動劑的摩爾濃度，其產生50%的來自此激動劑的最大可能有效響應。
[0349]實施例1苦味受體小組中的功能信號傳導的驗i正
[0350]為了確認25種苦味受體細胞系的每一者功能性并穩定地表達G蛋白(Ga 15)，如上所述地用遞增濃度的異丙腎上腺素(一種在HEK293T宿主細胞系中內源性表達的β2-腎上腺素能受體的激動劑)測試整個小組。已知異丙腎上腺素經由G Ci15信號傳導級聯傳導信號以增加胞內鈣水平。
[0351]如圖1所示，在功能測定中，存在于小組中的所有二十五種苦味受體細胞系一致地響應于異丙腎上腺素。對于二十五種細胞系的每一者，EC5tl值大約為4.9±0.41ηΜ，該值與文獻公開的值接近一致。所述EC5tl值顯示在二十五種克隆細胞系之間有顯著的重現性，并確認苦味細胞系小組可用于功能測定。
[0352]實施例2響應于KCl的苦味受體的鑒定[0353]為了鑒定對KCl敏感并可能介導由KCl引起的苦味的受體集合，二十五種苦味受體表達細胞系的整個小組獨立并且同時暴露于20mM KCl0使用上述的熒光報告系統，通過胞內鈣的變化測量苦味受體活化。如圖2所示，在二十五種苦味受體表達細胞系中只有六種強烈且特異性響應于KCl刺激。KCl在其它十九種細胞系中引發弱或背景響應。KCl誘導TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 苦味受體活性(圖 2 和 6)。KCl 不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50 或 TAS2R55 苦味受體活性(圖2和6)。迄今為止，沒有配體已被鑒定為針對TAS2R60，所述TAS2R60現在已經脫孤。
[0354]為了 通過 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 進一步表征KCl-誘導的信號傳導,功能特征(functional profile)通過如上所述測量KCl對每一種受體的活化(經由用遞增濃度的KCl刺激)并計算EC5tl值來確立。如圖3所示，每種細胞系的EC5tl值大約為5-15mM。由于受體和配體性質的差異，TAS2R活性測定中的劑量-響應曲線不直接與圖1中的劑量-響應曲線相當。
[0355]實施例3響應于乳酸鉀的苦味受體的鑒定
[0356]為了鑒定對乳酸鉀敏感且可能介導由乳酸鉀引起的苦味的受體組，二十五種苦味受體表達細胞系的整個小組獨立且同時暴露于20mM乳酸鉀。使用上述的熒光報告系統，通過胞內鈣的變化測量苦味受體活化。如圖4所示，在二十五種苦味受體表達細胞系中僅有七種強烈并且特異性響應于乳酸鉀刺激。乳酸鉀在其它十八種細胞系中引發弱或背景響應。乳酸鉀誘導 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44、TAS2R46 和 TAS2R60 苦味受體活性(圖 4 和 6)。乳酸鉀不誘導 TAS2R1、TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50和TAS2R55苦味受體活性(圖4和6)。迄今為止，沒有配體已被鑒定為針對TAS2R60，所述TAS2R60現在已經脫孤。
[0357]實施例4響應于乙酰磺胺酸鉀的苦味受體的鑒定
[0358]為了鑒定對乙酰磺胺酸鉀敏感且可能介導由乙酰磺胺酸鉀引起的苦味的受體組，二十五種苦味受體表達細胞系的整個小組獨立且同時暴露于20mM乙酰磺胺酸鉀。使用上述的熒光報告系統，通過胞內鈣的變化測量苦味受體活化。如圖5所示，在二十五種苦味受體表達細胞系中只有七種強烈且特異性響應于乙酰磺胺酸鉀刺激。乙酰磺胺酸鉀在其它十八種細胞系中引發弱或背景響應。乙酰磺胺酸鉀誘導TAS2R1、TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16和TAS2R44苦味受體活性(圖5和6)。乙酰磺胺酸鉀不誘導TAS2R3、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R10、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 或 TAS2R60 苦味受體活性(圖 5 和6)。
[0359]序列表
[0360]人GNA15
[0361 ] MARSLTWRCCPWCLTEDEKAAARVDQEINRILLEQKKQDRGELKLLLLGPGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSEEERKGFRPLVYQNIFVSMRAMIEAMERLQIPFSRPESKHHASLVMSQDPYKVTTFEKRYAAAMQWLWRDAGIRACYERRREFHLLDSAVYYLSHLERITEEGYVPTAQDVLRSRMPTTGINEYCFSVQKTNLRIVDVGGQKSERKKWIHCFENVIALIYLASLSEYDQCLEENNQENRMKESLALFGTILELPWFKSTSVILFLNKTDILEEKIPTSHLATYFPSFQGPKQDAEAAKRFILDMYTRMYTGCVDGPEGSKKGARSRRLFSHYTCATDTQNIRKVFKDVRDSVLARYLDEINLL(SEQ ID NO:1)
[0362]TAS2R1 CDS
[0363]ATGCTAGAGTCTCACCTCATTATCTATTTTCTTCTTGCAGTGATACAATTTCTTCTTGGGATTTTCACAAATGGCATCATTGTGGTGGTGAATGGCATTGACTTGATCAAGCACAGAAAAATGGCTCCGCTGGATCTCCTTCTTTCTTGTCTGGCAGTTTCTAGAATTTTTCTGCAGTTGTTCATCTTCTACGTTAATGTGATTGTTATCTTCTTCATAGAATTCATCATGTGTTCTGCGAATTGTGCAATTCTCTTATTTATAAATGAATTGGAACTTTGGCTTGCCACATGGCTCGGCGTTTTCTATTGTGCCAAGGTTGCCAGCGTCCGTCACCCACTCTTCATCTGGTTGAAGATGAGGATATCCAAGCTGGTCCCATGGATGATCCTGGGGTCTCTGCTATATGTATCTATGATTTGTGTTTTCCATAGCAAATATGCAGGGTTTATGGTCCCATACTTCCTAAGGAAATTTTTCTCCCAAAATGCCACAATTCAAAAAGAAGATACACTGGCTATACAGATTTTCTCTTTTGTTGCTGAGTTCTCAGTGCCATTGCTTATCTTCCTTTTTGCTGTTTTGCTCTTGATTTTCTCTCTGGGGAGGCACACCCGGCAAATGAGAAACACAGTGGCCGGCAGCAGGGTTCCTGGCAGGGGTGCACCCATCAGCGCGTTGCTGTCTATCCTGTCCTTCCTGATCCTCTACTTCTCCCACTGCATGATAAAAGTTTTTCTCTCTTCTCTAAAGTTTCACATCAGAAGGTTCATCTTTCTGTTCTTCATCCTTGTGATTGGTGTATACCCTTCTGGACACTCTCTCATCTTAATTTTAGGAAATCCTAAATTGAAACAAAATGCAAAAAAGTTCCTCCTCCACAGTAAGTGCTGTCAGTGA(SEQ ID NO:2)
[0364]TAS2R3 CDS
[0365]ATGATGGGACTCACCGAGGGGGTGTTCCTGATTCTGTCTGGCACTCAGTTCACACTGGGAATTCTGGTCAATTGTTTCATTGAGTTGGTCAATGGTAGCAGCTGGTTCAAGACCAAGAGAATGTCTTTGTCTGACTTCATCATCACCACCCTGGCACTCTTGAGGATCATTCTGCTGTGTATTATCTTGACTGATAGTTTTTTAATAGAATTCTCTCCCAACACACATGATTCAGGGATAATAATGCAAATTATTGATGTTTCCTGGACATTTACAAACCATCTGAGCATTTGGCTTGCCACCTGTCTTGGTGTCCTCTACTGCCTGAAAATCGCCAGTTTCTCTCACCCCACATTCCTCTGGCTCAAGTGGAGAGTTTCTAGGGTGATGGTATGGATGCTGTTGGGTGCACTGCTCTTATCCTGTGGTAGTACCGCATCTCTGATCAATGAGTTTAAGCTCTATTCTGTCTTTAGGGGAATTGAGGCCACCAGGAATGTGACTGAACACTTCAGAAAGAAGAGGAGTGAGTATTATCTGATCCATGTTCTTGGGACTCTGTGGTACCTGCCTCCCTTAATTGTGTCCCTGGCCTCCTACTCTTTGCTCATCTTCTCCCTGGGGAGGCACACACGGCAGATGCTGCAAAATGGGACAAGCTCCAGAGATCCAACCACTGAGGCCCACAAGAGGGCCATCAGAATCATCCTTTCCTTCTTCTTTCTCTTCTTACTTTACTTTCTTGCTTTCTTAATTGCATCATTTGGTAATTTCCTACCAAAAACCAAGATGGCTAAGATGATTGGTGAAGTAATGACAATGTTTTATCCTGCTGGCCACTCATTTATTCTCATTCTGGGGAACAGTAAGCTGAAGCAGACATTTGTAGTGATGCTCCGGTGTGAGTCTGGTCATCTGAAGCCTGGATCCAAGGGACCCATTTTCTCTTAG(SEQ ID NO:3)
[0366]TAS2R4 CDS
[0367]ATGCTTCGGTTATTCTATTTCTCTGCTATTATTGCCTCAGTTATTTTAAATTTTGTAGGAATCATTATGAATCTGTTTATTACAGTGGTCAATTGCAAAACTTGGGTCAAAAGCCATAGAATCTCCTCTTCTGATAGGATTCTGTTCAGCCTGGGCATCACCAGGTTTCTTATGCTGGGACTATTTCTGGTGAACACCATCTACTTCGTCTCTTCAAATACGGAAAGGTCAGTCTACCTGTCTGCTTTTTTTGTGTTGTGTTTCATGTTTTTGGACTCGAGCAGTGTCTGGTTTGTGACCTTGCTCAATATCTTGTACTGTGTGAAGATTACTAACTTCCAACACTCAGTGTTTCTCCTGCTGAAGCGGAATATCTCCCCAAAGATCCCCAGGCTGCTGCTGGCCTGTGTGCTGATTTCTGCTTTCACCACTTGCCTGTACATCACGCTTAGCCAGGCATCACCTTTTCCTGAACTTGTGACTACGAGAAATAACACATCATTTAATATCAGTGAGGGCATCTTGTCTTTAGTGGTTTCTTTGGTCTTGAGCTCATCTCTCCAGTTCATCATTAATGTGACTTCTGCTTCCTTGCTAATACACTCCTTGAGGAGACATATACAGAAGATGCAGAAAAATGCCACTGGTTTCTGGAATCCCCAGACGGAAGCTCATGTAGGTGCTATGAAGCTGATGGTCTATTTCCTCATCCTCTACATTCCATATTCAGTTGCTACCCTGGTCCAGTATCTCCCCTTTTATGCAGGGATGGATATGGGGACCAAATCCATTTGTCTGATTTTTGCCACCCTTTACTCTCCAGGACATTCTGTTCTCATTATTATCACACATCCTAAACTGAAAACAACAGCAAAGAAGATTCTTTGTTTCAAAAAATAG(SEQ ID NO:4)
[0368]TAS2R5 CDS
[0369]ATGCTGAGCGCTGGCCTAGGACTGCTGATGCTGGTGGCAGTGGTTGAATTTCTCATCGGTTTAATTGGAAATGGAAGCCTGGTGGTCTGGAGTTTTAGAGAATGGATCAGAAAATTCAACTGGTCCTCATATAACCTCATTATCCTGGGCCTGGCTGGCTGCCGATTTCTCCTGCAGTGGCTGATCATTTTGGACTTAAGCTTGTTTCCACTTTTCCAGAGCAGCCGTTGGCTTCGCTATCTTAGTATCTTCTGGGTCCTGGTAAGCCAGGCCAGCTTATGGTTTGCCACCTTCCTCAGTGTCTTCTATTGCAAGAAGATCACGACCTTCGATCGCCCGGCCTACTTGTGGCTGAAGCAGAGGGCCTATAACCTGAGTCTCTGGTGCCTTCTGGGCTACTTTATAATCAATTTGTTACTTACAGTCCAAATTGGCTTAACATTCTATCATCCTCCCCAAGGAAACAGCAGCATTCGGTATCCCTTTGAAAGCTGGCAGTACCTGTATGCATTTCAGCTCAATTCAGGAAGTTATTTGCCTTTAGTGGTGTTTCTTGTTTCCTCTGGGATGCTGATTGTCTCTTTGTATACACACCACAAGAAGATGAAGGTCCATTCAGCTGGTAGGAGGGATGTCCGGGCCAAGGCTCACATCACTGCGCTGAAGTCCTTGGGCTGCTTCCTCTTACTTCACCTGGTTTATATCATGGCCAGCCCCTTCTCCATCACCTCCAAGACTTATCCTCCTGATCTCACCAGTGTCTTCATCTGGGAGACACTCATGGCAGCCTATCCTTCTCTTCATTCTCTCATATTGATCATGGGGATTCCTAGGGTGAAGCAGACTTGTCAGAAGATCCTGTGGAAGACAGTGTGTGCTCGGAGATGCTGGGGCCCATGA(SEQ ID NO:5)
[0370]TAS2R7 CDS
[0371]ATGGCAGATAAAGTGCAGACTACTTTATTGTTCTTAGCAGTTGGAGAGTTTTCAGTGGGGATCTTAGGGAATGCATTCATTGGATTGGTAAACTGCATGGATTGGGTCAAGAAGAGGAAAATTGCCTCCATTGATTTAATCCTCACAAGTCTGGCCATATCCAGAATTTGTCTATTGTGCGTAATACTATTAGATTGTTTTATATTGGTGCTATATCCAGATGTCTATGCCACTGGTAAAGAAATGAGAATCATTGACTTCTTCTGGACACTAACCAATCATTTAAGTATCTGGTTTGCAACCTGCCTCAGCATTTACTATTTCTTCAAGATAGGTAATTTCTTTCACCCACTTTTCCTCTGGATGAAGTGGAGAATTGACAGGGTGATTTCCTGGATTCTACTGGGGTGCGTGGTTCTCTCTGTGTTTATTAGCCTTCCAGCCACTGAGAATTTGAACGCTGATTTCAGGTTTTGTGTGAAGGCAAAGAGGAAAACAAACTTAACTTGGAGTTGCAGAGTAAATAAAACTCAACATGCTTCTACCAAGTTATTTCTCAACCTGGCAACGCTGCTCCCCTTTTGTGTGTGCCTAATGTCCTTTTTCCTCTTGATCCTCTCCCTGCGGAGACATATCAGGCGAATGCAGCTCAGTGCCACAGGGTGCAGAGACCCCAGCACAGAAGCCCATGTGAGAGCCCTGAAAGCTGTCATTTCCTTCCTTCTCCTCTTTATTGCCTACTATTTGTCCTTTCTCATTGCCACCTCCAGCTACTTTATGCCAGAGACGGAATTAGCTGTGATTTTTGGTGAGTCCATAGCTCTAATCTACCCCTCAAGTCATTCATTTATCCTAATACTGGGGAACAATAAATTAAGACATGCATCTCTAAAGGTGATTTGGAAAGTAATGTCTATTCTAAAAGGAAGAAAATTCCAACAACATAAACAAATCTGA (SEQID NO:6)
[0372]TAS2R8 CDS
[0373]ATGTTCAGTCCTGCAGATAACATCTTTATAATCCTAATAACTGGAGAATTCATACTAGGAATATTGGGGAATGGATACATTGCACTAGTCAACTGGATTGACTGGATTAAGAAGAAAAAGATTTCCACAGTTGACTACATCCTTACCAATTTAGTTATCGCCAGAATTTGTTTGATCAGTGTAATGGTTGTAAATGGCATTGTAATAGTACTGAACCCAGATGTTTATACAAAAAATAAACAACAGATAGTCATTTTTACCTTCTGGACATTTGCCAACTACTTAAATATGTGGATTACCACCTGCCTTAATGTCTTCTATTTTCTGAAGATAGCCAGTTCCTCTCATCCACTTTTTCTCTGGCTGAAGTGGAAAATTGATATGGTGGTGCACTGGATCCTGCTGGGATGCTTTGCCATTTCCTTGTTGGTCAGCCTTATAGCAGCAATAGTACTGAGTTGTGATTATAGGTTTCATGCAATTGCCAAACATAAAAGAAACATTACTGAAATGTTCCATGTGAGTAAAATA
【權利要求】
1.一種鑒定抑制由KCl引起的苦味的化合物的方法，其包括: a)提供第一和第二細胞， 其中每種細胞表達獨立選自以下的一種或多種苦味受體: TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60，其中每種細胞表達相同的一種或多種苦味受體； b)使所述第一細胞與促味劑接觸， 其中所述促味劑活化所述一種或多種苦味受體； c)使所述第二細胞與測試化合物和所述促味劑接觸； d)測定所述第一和第二細胞的苦味受體活化；和 e)比較所述第一細胞的苦味受體活化與所述第二細胞的苦味受體活化， 其中如果所述第二細胞的苦味受體活性低于所述第一細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物是由KCl引起的苦味的抑制劑。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述苦味受體與G蛋白復合。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述Gq蛋白是Ga15蛋白。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述胞內鈣濃度是使用鈣敏感性熒光染料來測定的。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述鈣敏感性熒光染料選自Indo-1、Fura-2、Fluo-3、Fluo-4、Rhod-2、Rhod_5N、|丐黃綠素、鈣黃綠素藍、cytoCalcein 紫羅蘭、Quin-2、Quest Fluo-8H?> Quest Fluo8L?> Quest Fluo8?> Quest Rhod-4?、腔腸素和鈣-3。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述第一和第二細胞存在于體外細胞系中。
9.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述第一和第二細胞存在于體外細胞系的小組中。
10.一種鑒定選擇性作用于受體以抑制由KCl引起的苦味的化合物的方法，所述方法包括: a)提供第一和第二小組的細胞系， 其中每個小組包括表達選自:TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60的苦味受體的細胞系； 其中每種受體在至少一種細胞系中表達，并且 其中所述第一和第二小組包括相同的細胞系； b)使所述第一小組中的每種細胞系與促味劑接觸， 其中所述促味劑活化選自 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 的至少兩者； c)使所述第二小組中的每種細胞系與測試化合物和所述促味劑接觸； d)測定每種細胞系的苦味受體活化； 其中，如果與所述第一小組相比，在所述第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少兩者的苦味受體活性較低，則所述測試化合物是由KCl引起的苦味的選擇性抑制劑。
11.根據權利要求10所述的方法，其中與所述第一小組相比，在所述第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少三者的苦味受體活性較低。
12.根據權利要求10所述的方法，其中與所述第一小組相比，在所述第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少四者的苦味受體活性較低。
13.根據權利要求10所述的方法，其中與所述第一小組相比，在所述第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的至少五者的苦味受體活性較低。
14.根據權利要求10所述的方法，其中與所述第一小組相比，在所述第二小組中選自TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44和TAS2R60的每個成員的苦味受體活性較低。
15.根據權利要求10-14中任一項所述的方法，其中所述第一和第二小組包括TAS2R1、TAS2R3、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R43、TAS2R44、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R47、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、TAS2R55 和 TAS2R60 苦味受體。
16.根據權利要求10-15中任一項所述的方法,其中所述苦味受體與G蛋白復合。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述G蛋白是Gq蛋白、α轉導素或α味蛋白。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述Gq蛋白是Ga15蛋白。
19.根據權利要求10-18中任一項所述的方法，其中苦味受體活性是通過測量胞內鈣濃度來測定的。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述胞內鈣的濃度是使用鈣敏感性熒光染料來測定的。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述鈣敏感性熒光染料選自Indo-1、Fura-2、Fluo-3、Fluo-4> Rhod-2> Rhod_5N、|丐黃綠素、鈣黃綠素藍、cytoCalcein 紫羅蘭、Quin-2、Quest Fluo-8H?> Quest Fluo8L?> Quest Fluo8?> Quest Rhod-4?、腔腸素和鈣-3。
22.一種鑒定增強由KCl引起的苦味的化合物的方法，所述方法包括: a)提供第一和第二細胞， 其中每種細胞表達獨立選自以下的一種或多種苦味受體: TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60，其中每種細胞表達相同的一種或多種苦味受體； b)使所述第一細胞與促味劑接觸， 其中所述促味劑活化 TAS2R4、TAS2R9、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R44 和 TAS2R60 苦味受體的一者或多者； c)使所述第二細胞與測試化合物和所述促味劑接觸； d)測定所述第一和第二細胞的苦味受體活化；和 e)比較所述第一細胞的苦味受體活化與所述第二細胞的苦味受體活化， 其中如果所述第二細胞的苦味受體活性高于所述第一細胞的苦味受體活性，則所述測試化合物是由KCl引起的苦味的促進劑。
【文檔編號】G01N33/53GK103998933SQ201280062863
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年10月22日 優先權日:2011年10月20日
【發明者】K·夏柯達, P·M·沙阿, J·古奈特, J·V·里蘭, P·H·布朗, L·斯雷德 申請人:卓莫賽爾公司, 卡夫食品集團品牌有限責任公司