離子濃度依賴性結合分子文庫的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：6166973閱讀：1298來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            離子濃度依賴性結合分子文庫的制作方法
            
【專利摘要】本發明公開了主要由互相之間序列不同的多個抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子的抗原結合結構域中包含至少一個下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化。此外，本發明還公開了包含多個編碼所述抗原結合分子的多核苷酸分子的組合物、包含多個含有所述多核苷酸分子的載體的組合物、所述抗原結合分子的選擇方法、所述多核苷酸分子的分離方法、所述抗原結合分子的制造方法、包含所述抗原結合分子的醫藥組合物。
            
【專利說明】離子濃度依賴性結合分子文庫
            
【技術領域】
            
[0001]相關申請
            
[0002]本申請基于日本專利申請2011-218006(2011年9月30日申請)及2012-123479(2012年5月30日申請)主張優先權，日本專利申請2011-218006及2012-123479的內容作為參考并入本說明書中。
            
[0003]發明的領域
            
[0004]本發明涉及針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的抗原結合分子的文庫及其制造方法、此類抗原結合分子的選擇方法及制造方法、以及包含此類抗原結合分子的醫藥組合物。 【背景技術】
            
[0005]抗體在血漿中的穩定性高、副作用少，因此作為醫藥品備受關注。其中IgG型的抗體醫藥有多種已上市，現在還在開發多種抗體醫藥(非專利文獻1、非專利文獻2)。另一方面，作為可適用于第二代抗體醫藥的技術，已開發了各種各樣的技術，報道了提高效應器功能、抗原結合能力、藥物動力學、穩定性、或降低免疫原性風險的技術等(非專利文獻3)。因為抗體醫藥通常給藥量非常高，所以認為存在難于制作皮下給藥制劑、制造成本高等問題。作為降低抗體醫藥的給藥量的方法，考慮了提高抗體的藥物動力學的方法和提高抗體與抗原的親和性(affinity)的方法。
            
[0006]作為使抗體的藥物動力學提高的方法，報道了恒定區的人工氨基酸取代(非專利文獻4、5)。作為增強抗原結合能力、抗原中和能力的技術，已報道了親和性成熟化技術(非專利文獻6)，通過對可變區的CDR區等的氨基酸導入突變，能夠增強對抗原的結合活性。通過增強抗原結合能力，可以提高體外的生物活性、或降低給藥量，還可進一步提高體內的藥效(非專利文獻7)。
            
[0007]另一方面，每個抗體分子能中和的抗原量依賴于親和性，通過增強親和性，能夠以較少的抗體量來中和抗原，可通過各種各樣的方法增強抗體的親和性(非專利文獻6)。進而，如果能夠與抗原以共價鍵結合、使得親和性無限大的話，則能夠以一分子的抗體中和一分子的抗原(2價的情況下為2個抗原)。但是，迄今為止的方法中，以一分子的抗體中和一分子的抗原(2價的情況下為2個抗原)的化學計量上的中和反應為界限，不可能以抗原量以下的抗體量完全中和抗原。即，增強親和性的效果存在界限(非專利文獻9)。中和抗體的情況下，為了使其中和效果持續一定時間，必須要給予該時間內生物體內產生的抗原量以上的抗體量，而僅通過上述的提高抗體藥物動力學或者親和性成熟化技術，對于必需抗體給藥量的降低存在界限。因此，為了在目標時間內以抗原量以下的抗體量保持抗原中和效果，需要以一個抗體中和多個抗原。
            
[0008]作為達成此目的的新方法，最近報道了對抗原以pH依賴性方式結合的抗體(專利文獻I)。該文獻公開了，通過在抗原結合分子中導入組氨酸而在pH中性區域和pH酸性區域性質變化的PH依賴性抗原結合抗體。對于在血漿中的中性條件下對抗原強結合、在核內體內的酸性條件下從抗原離解的PH依賴性抗原結合抗體，能夠在核內體內從抗原離解。pH依賴性抗原結合抗體在離解抗原后，抗體可通過FcRn再循環進血漿中，再度與抗原結合，因此，能夠以一個抗體與多個抗原重復結合。
            
[0009]此外，抗原的血漿滯留性較之結合至FcRn并被再循環的抗體而言非常短。血漿滯留性長的抗體與這類血漿滯留性短的抗原結合的話，抗體抗原復合體的血漿滯留性將變得與抗體同樣長。因此，抗原通過與抗體結合，血漿滯留性變長，而且血漿中抗原濃度上升。這種情況下，即使提高抗體對抗原的親和性，也不能促進抗原從血漿中消失。有報道稱，較之通常的抗體而言，上述PH依賴性的抗原結合抗體作為促進抗原從血漿中消失的方法是有效的(專利文獻I)。
            
[0010]如上所述，pH依賴性抗原結合抗體以一個抗體與多個抗原結合，較之通常抗體而言能夠促進抗原從血漿中消失，因此具有以通常的抗體無法獲得的作用。通過對現有的抗體序列進行取代，能夠賦予針對抗原的PH依賴性結合活性。另一方面，通常認為，為了新獲得這樣的抗體，在從免疫動物獲得抗體的方法或從人抗體文庫獲得抗體的方法中有下述限制。
            
[0011]免疫非人動物的方法中，雖然存在獲得pH依賴性結合抗體的可能性，但是有時難于在短期內獲得針對多種抗原的 PH依賴性抗原結合抗體、或者選擇性獲得特異性地結合至特定表位的抗體。此外，可以以PH依賴性的針對抗原的結合能力作為指標，從人抗體文庫中濃縮抗體。但是，一般而言，對于(Kabat數據中所登記的)人抗體的抗體可變區部分中組氨酸殘基的出現頻率，已知重鏈⑶Rl中為5.9%，重鏈⑶R2中為1.4%，重鏈⑶R3中為1.6%，輕鏈⑶Rl中為1.5%，輕鏈⑶R2中為0.5%，輕鏈⑶R3中為2.2%，均不高，認為人抗體文庫中可具有PH依賴性的抗原結合能力的序列非常少。因此，希望提供下述抗體文庫，其中含有較多的可具有PH依賴性的針對抗原的結合能力的序列，所述序列與抗原的結合部位中組氨酸出現頻率被提高。
            
[0012]另一方面認為，如果能夠向針對抗原的結合能力賦予對除pH以外的、血漿中與早期核內體內的環境間不同的要素的依賴性，就能達成促進抗原從血漿中消失等的效果。
            
[0013]需要說明的是，本發明的現有技術文獻如下所示。
            
[0014][專利文獻1]冊2009125825
            
[0015][非專利文獻 I]Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura BFaden&Matthew C Dewitzj Monoclonal antibody successes in the clinic，Nat.Biotechnol.(2005)23，1073-1078
            
[0016][非專利文獻 2]Pavlou AKj Belsey MJ.，The therapeutic antibodies marketto2008,Eur J Pharm Biopharm.(2005)59 (3)，389-396.[0017][非專利文獻 3]Kim SJj Park Y，Hong HJ., Antibody engineering for thedevelopment of therapeutic antibodies.，Mol Cells.(2005)20 (I)，17-29
            
[0018][非專利文獻4]Hinton PR，Xiong JM，Johlfs MG，Tang MT，Keller Sj TsurushitaN., An engineered human IgGlantibody with longer serum half-life, J Immunol.(2006) 176(1)，346-356
            
[0019][非專利文獻 5] Ghetie V，Popov Sj Borvak J，Radu C，Matesoi D，Medesan Cj OberRJj Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by randommutagenesis, Nat.Biotechnol.(1997) 15(7)，637-640
            
[0020][非專利文獻 6]Rajpal A, Beyaz Nj Haber L，Cappuccilli G，Yee H，BhattRR，Takeuchi T，Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving theaffinity of antibodies by using combinatorial libraries,Proc.Natl.Acad.Sc1.U SA.(2005) 102(24),8466-8471
            
[0021][非專利文獻7]Wu Hj Pfarr DS，Johnson Sj Brewah YAj Woods RMj Patel NKj WhiteWIj Young JF，Kiener PA.Development of Motavizumabj an Ultra-potent Antibody forthe Prevention  of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and LowerRespiratory Tract, J.Mol.Biol.(2007) 368，652-665
            
[0022][非專利文獻 8]Hanson CVj Nishiyama Y，Paul S.Catalytic antibodies andtheir applications.Curr Opin Biotechnol, (2005) 16(6)，631-6
            
[0023][非專利文獻 9]Rathanaswami P，Roalstad S，Roskos L，Su QJj LackieS，Babcook J.Demonstration of an in vivo generated sub—picomolar affinityfully human monoclonal antibody to interleukin-8, Biochem.Biophys.Res.Commun.(2005)334(4)，1004-13.
            【發明內容】

            
[0024]本發明是考慮到上述狀況而做出的，本發明的目的是提供:主要由互相之間序列不同的多個抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子的抗原結合結構域中包含至少一個下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化，以及提供包含多個編碼所述抗原結合分子的多核苷酸分子的組合物、包含多個含有所述多核苷酸分子的載體的組合物、所述抗原結合分子的選擇方法、所述多核苷酸分子的分離方法、所述抗原結合分子的制造方法、包含所述抗原結合分子的醫藥組合物。
            
[0025]本發明的發明人等對下述文庫進行了銳意研究，所述文庫包含互相之間序列不同的多個抗原結合分子，所述抗原結合分子的抗原結合結構域中包含至少一個下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據生物體內環境要素的不同而變化。結果，本發明的發明人等發現，通過關注血漿中與早期核內體內的離子濃度(特別是鈣離子濃度)的差異和PH，使用具有鈣依賴性或pH依賴性的具有針對抗原的結合活性的抗原結合分子，能夠制作主要由下述抗原結合分子構成的文庫，通過所述抗原結合分子可促進抗原向細胞內的摻入、減少血漿中的抗原濃度。
            
[0026]即，本發明涉及主要由互相之間序列不同的多個抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子的抗原結合結構域中包含至少一個下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化，還涉及包含多個編碼所述抗原結合分子的多核苷酸分子的組合物、包含多個含有所述多核苷酸分子的載體的組合物、所述抗原結合分子的選擇方法、所述多核苷酸分子的分離方法、所述抗原結合分子的制造方法、包含所述抗原結合分子的醫藥組合物。更具體而言，涉及以下這些。本發明提供了:
            
[0027](I) 一種文庫，主要由互相之間序列不同的多個抗原結合分子構成，其特征在于，所述抗原結合分子中的抗原結合結構域包含至少一個下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化。[0028](2)如⑴所述的文庫，其中，離子濃度為鈣離子濃度。
            
[0029](3)如(2)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在所述抗原結合分子的重鏈的抗原結合結構域中。
            
[0030](4)如(3)所述的文庫，其中，重鏈的抗原結合結構域為重鏈可變區。
            
[0031](5)如(4)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在重鏈可變區的⑶R3中。
            
[0032](6)如(2)~(5)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于重鏈⑶R3的以Kabat編號法表示的第95位、96位、IOOa位和/或101位處。
            
[0033](7)如⑵~(6)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基以外的氨基酸序列包含天然序列的氨基酸序列。
            
[0034](8)如(3)~(7)中任一項所述的文庫，其中，所述抗原結合分子的輕鏈可變區包含天然序列的氨基酸序列。
            
[0035](9)如(2)所述的 文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在所述抗原結合分子的輕鏈的抗原結合結構域中。
            
[0036](10)如(9)所述的文庫，其中，輕鏈的抗原結合結構域為輕鏈可變區。
            
[0037](11)如(10)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈可變區的CDRl中。
            
[0038](12)如(11)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于CDRl的以Kabat編號法表示的第30位、31位和/或32位處。
            
[0039](13)如(10)~(12)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈可變區的⑶R2中。
            
[0040](14)如(13)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于輕鏈的CDR2的以Kabat編號法表不的第50位處。
            
[0041](15)如(10)~(14)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為輕鏈的CDR3。
            
[0042](16)如(15)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于輕鏈的CDR3的以Kabat編號法表不的第92位處。
            
[0043](17)如⑵或(9)~(16)中任一項所述的文庫，其中，所述抗原結合分子的輕鏈的框架包含生殖細胞系(germline)的框架序列。
            
[0044](18)如⑵或(9)~(17)中任一項所述的文庫，其中，所述抗原結合分子的重鏈可變區包含天然序列的氨基酸序列。
            
[0045](19)如(I)~(18)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基形成鈣結合基序。
            
[0046](20)如(19)所述的文庫，其中，鈣結合基序為鈣粘蛋白結構域、EF_HAND、C2結構域、Gla結構域、C型凝集素、結構域、膜聯蛋白、血小板反應蛋白3型結構域及EGF樣結構域、Vk5的部分、序列號10、序列號11中的任意的鈣結合基序。
            
[0047](21)如⑵~(22)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為具有金屬螯合作用的氨基酸。
            
[0048](22)如(21)所述的文庫，其中，具有金屬螯合作用的氨基酸為絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸中的任意一種以上的氨基酸。
            
[0049](23)如(I)所述的文庫，其中，離子濃度的條件為pH。
            
[0050](24)如(23)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在所述抗原結合分子的重鏈的抗原結合結構域中。[0051](25)如(24)所述的文庫，其中，重鏈的抗原結合結構域為重鏈可變區。
            
[0052](26)如(25)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于重鏈可變區的以Kabat編號法表示的第27位、31位、32位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61 位、62 位、95 位、96 位、97 位、98 位、99 位、IOOa 位、IOOb 位、IOOd 位、IOOf 位、IOOh 位、102位或107位的任意一處以上。
            
[0053](27)如(26)所述的文庫，其中，重鏈可變區的以Kabat編號法表示的第27位、31位、32位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位、62位、95位、96位、97位、98位、99位、IOOa位、IOOb位、IOOd位、IOOf位、IOOh位、102位或107位的任一的
            
氨基酸殘基以外的氨基酸序列包含天然序列的氨基酸序列。
            
[0054](28)如(23)~(27)中任一項所述的文庫，其中，所述抗原結合分子的輕鏈可變區包含生殖細胞系的序列。
            
[0055](29)如(23)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在所述抗原結合分子的輕鏈的抗原結合結構域中。
            
[0056](30)如(29)所述的文庫，其中，輕鏈的抗原結合結構域為輕鏈可變區。
            
[0057](31)如(30)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于輕鏈可變區的以Kabat編號法表示的第24位、27位、28位、30位、31位、32位、34位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、89位、90位、91位、92位、93位、94位或95a位的任意一處以上。
            
[0058](32)如(30)或(31)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈可變區的CDRl 中。
            
[0059](33)如(32)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于輕鏈的CDRl的以Kabat編號法表示的第24位、27位、28位、30位、31位、32位或34位的任意一處以上。
            
[0060](34)如(30)~(33)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDR2 中。
            
[0061](35)如(34)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于輕鏈的CDR2的以Kabat編號法表不的第50位、51位、52位、53位、54位、55位或56位的任意一處以上。
            
[0062](36)如(30)~(35)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDR3 中。
            
[0063](37)如(36)所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDR3的以Kabat編號法表示的第89位、90位、91位、92位、93、94位或95a位的任意一處以上。
            
[0064](38)如(29)~(37)中任一項所述的文庫，其中，輕鏈的框架包含生殖細胞系的框架序列。
            
[0065](39)如(29)~(38)中任一項所述的文庫，其中，重鏈可變區為天然序列。
            
[0066](40)如(23)~(39)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為側鏈的pKa為
            
4.0-8.0的氨基酸。
            
[0067](41)如(23)~(40)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為谷氨酸。 [0068](42)如(23)~(39)中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為側鏈的pKa為
            
5.5-7.0的氨基酸。
            
[0069](43)如(23)~(40)或(42)的任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為組氨酸。[0070](44) 一種文庫，主要由多個包含(I)~(43)任一項中記載的抗原結合分子的融合多肽構成，其特征在于，所述融合多肽為抗原結合分子的重鏈可變區與病毒外殼蛋白質的至少一部分融合而成的。
            
[0071](45)如(44)所述 的文庫，其中，所述病毒外殼蛋白質選自由蛋白質pill、主外殼蛋白質pVII1、pVI1、pIX、Soc、Hoc、gpD、pvl及其變體構成的組。
            
[0072](46) 一種組合物，其包含多個多核苷酸分子，所述多個多核苷酸分子分別編碼(I)~(43)中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或(44)或(45)中記載的互相之間序列不同的融合多肽。
            
[0073](47) 一種組合物，其包含多種載體，所述多種載體分別包含處于被可作用地連接的狀態的、(46)中記載的多個多核苷酸分子。
            
[0074](48)如(47)所述的組合物，其中，載體為可復制的表達載體。
            
[0075](49)如(48)所述的組合物，其中，可復制的表達載體中，所述多核苷酸被可作用地連接至lac Z啟動子系、堿性磷酸酶pho A啟動子(Ap)、噬菌體λ PL啟動子(溫度感受性啟動子)、tac啟動子、色氨酸啟動子、pBAD啟動子及噬菌體T7啟動子構成的組的啟動子區域。
            
[0076](50)如(48)或(49)所述的組合物，其中，可復制的表達載體為M13、H、fd、Pf3噬菌體或其衍生物、或λ型噬菌體或其衍生物。
            
[0077](51) 一種組合物，其包含多種病毒，所述多種病毒分別包含(47)~(50)任一項中記載的載體。
            
[0078](52) 一種組合物，其包含多種病毒，所述多種病毒在表面分別提呈(I)~(43)中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或(44)或(45)中記載的互相之間序列不同的融合多肽。
            
[0079](53) 一種文庫，其包含(I)~(43)中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或
            
(44)或(45)中記載的互相之間序列不同的融合多肽，所述文庫具有IXlO6至IXlO14個彼此不同的可變區序列。
            
[0080](54)如(53)所述的文庫，其具有IXlO8個以上的彼此不同的可變區序列。
            
[0081](55) 一種文庫的制作方法，所述文庫主要由互相之間序列不同的多個抗原結合分子構成，所述方法包括制造多個抗原結合分子，所述抗原結合分子被設計為:所述抗原結合分子中的抗原結合結構域包含至少一個下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化。
            
[0082](56)如(55)所述的制作方法，其中，所述抗原結合分子為⑵~(43)任一項中記載的抗原結合分子。
            
[0083](57)如(55)或(56)所述的制作方法，其中，所述抗原結合分子的重鏈可變區與病毒外殼蛋白質的至少一部分融合。
            
[0084](58)如(55)~(57)中任一項所述的制作方法,其中,所述病毒外殼蛋白質選自由蛋白質pill、主外殼蛋白質pVII1、pVI1、pIX、Soc、Hoc、gpD、pvl及其變體構成的組。
            
[0085](59) 一種選擇下述抗原結合分子的方法，所述抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化，所述方法包括:
            
[0086]a)制作文庫的步驟，所述文庫主要由(I)~(43)任一項中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或(44)或(45)任一項中記載的互相之間序列不同的融合多肽構成，
            
[0087]b)步驟，使所述文庫在離子濃度不同的兩種以上的條件下與抗原接觸，
            
[0088]c)步驟，從所述文庫中分級分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的抗原結合分子的集群，
            
[0089]d)步驟，從在c)中分級分離的集群中分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的抗原結合分子。
            
[0090](60) 一種分離下述多核苷酸的方法，所述多核苷酸編碼針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的抗原結合分子，所述方法包括下述步驟:
            
[0091]a)制作文庫的步驟，所述文庫包含多個可復制的表達載體，所述多個可復制的表達載體分別包含處于被可作用地連接的狀態的多個多核苷酸，所述多個多核苷酸分別編碼(I)~(43)任一項中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或(44)或(45)任一項中記載的互相之間序列不同的融合多肽，
            
[0092]b)步驟，在已經導入了所述文庫中包含的各表達載體的多種病毒的表面、表達通過所述多核苷酸編碼 的所述互相之間序列不同的抗原結合分子或融合多肽，
            
[0093]c)步驟，將所述的多種病毒在離子濃度不同的兩種以上的條件下與抗原接觸，
            
[0094]d)步驟，從所述文庫中分級分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒的集群，
            
[0095]e)步驟，從在d)中分級分離的病毒的集群中分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒，
            
[0096]f)步驟，從分離的病毒中分離多核苷酸。
            
[0097](61)如(60)所述的方法，其中，所述c)至d)的步驟追加反復至少I次。
            
[0098](62)如(59)~(61)中任一項所述的方法，其中，離子濃度為鈣離子濃度。
            
[0099](63)如(62)所述的方法，其中，選擇在低鈣濃度的條件下針對抗原的結合活性比在高鈣濃度的條件下的結合活性低的抗原結合分子。
            
[0100](64)如(63)所述的方法，其中，低鈣濃度的條件為0.1μΜ~30μΜ。
            
[0101](65)如(63)或(64)所述的方法，其中，高鈣濃度的條件為100 μ M~10mM。
            
[0102](66)如(59)~(61)中任一項所述的方法，其中，離子濃度的條件為pH。
            
[0103](67)如(66)所述的方法，其中，選擇在pH酸性區域條件下針對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下的結合活性低的抗原結合分子。
            
[0104](68)如(66)所述的方法，其中，pH酸性區域條件為pH4.0~6.5。
            
[0105](69)如(67)或(68)所述的方法，其中，pH中性區域條件為ρΗ6.7~10.0。
            
[0106](70) 一種抗原結合分子的制造方法，所述抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化，所述制造方法包含下述步驟:
            
[0107]a)制作文庫的步驟，所述文庫包含多個可復制的表達載體，所述多個可復制的表達載體分別包含處于被可作用地連接的狀態的多個多核苷酸，所述多個多核苷酸分別編碼(I)~(43)任一項中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或(44)或(45)任一項中記載的互相之間序列不同的融合多肽，
            
[0108]b)步驟，在已經導入了所述文庫中包含的各表達載體的多種病毒的表面、表達通過所述多核苷酸編碼的所述互相之間序列不同的抗原結合分子或融合多肽，[0109]c)步驟，將所述的多種病毒在離子濃度不同的兩種以上的條件下與抗原接觸，
            
[0110]d)步驟，從所述文庫中分級分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒的集群，
            
[0111]e)步驟，從在d)中分級分離的病毒的集群中分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒，
            
[0112]f)步驟，從分尚的病毒中分尚多核苷酸，
            
[0113]g)步驟，培養導入了下述載體的宿主細胞，所述載體中插入了經分離的多核苷酸，所述多核苷酸以處于被可作用地連接的狀態被插入，
            
[0114]h)步驟，從在g)中培養的培養液中回收抗原結合分子。
            
[0115](71) 一種抗原結合分子的制造方法，所述抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化，所述制造方法包含下述步驟:
            
[0116]a)制作文庫的步驟，所述文庫包含多個可復制的表達載體，所述多個可復制的表達載體分別包含處于被可操作連接的狀態的多個多核苷酸，所述多個多核苷酸分別編碼(I)~(43)任一項中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或(44)或(45)任一項中記載的互相之間序列不同的融合多肽，
            
[0117]b)步驟，在已經導入了所述文庫中包含的各表達載體的多種病毒的表面、表達通過所述多核苷酸編碼的所述互相之間序列不同的抗原結合分子或融合多肽，
            
[0118]c)步驟，將所述的多種病毒在離子濃度不同的兩種以上的條件下與抗原接觸，
            
[0119]d)步驟，從所述文庫中分級分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒的集群，
            
[0120]e)步驟，從在d)中分級分離的病毒的集群中分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒，
            
[0121]f)步驟，從分尚的病毒中分尚多核苷酸，
            
[0122]g)步驟，將經分離的多核苷酸以符合讀碼框的方式與編碼抗體恒定區的多核苷酸連接，
            
[0123]h)步驟，培養導入了下述載體的宿主細胞，所述載體中插入了在g)中被連接的多核苷酸，所述多核苷酸以處于被可作用地連接的狀態被插入，
            
[0124]i)步驟，從在h)中培養的培養液中回收抗原結合分子。
            
[0125](72)如(70)或(71)所述的制造方法，其中，所述c)至d)的步驟追加反復至少I次。
            
[0126](73)如(70)~(72)中任一項所述的制造方法，其中，離子濃度為鈣離子濃度。
            
[0127](74)如(73)所述的制造方法，其中，選擇在低鈣濃度的條件下針對抗原的結合活性比在高鈣濃度的條件下的結合活性低的抗原結合分子。
            
[0128](75)如(74)所述的方法，其中，低鈣濃度的條件為0.1 μ M~30 μ M。 [0129](76)如(74)或(75)所述的方法，其中，高鈣濃度的條件為100 μ M~10mM。
            
[0130](77)如(70)~(72)中任一項所述的方法，其中，離子濃度的條件為pH。
            
[0131](78)如(77)所述的方法，其中，選擇在pH酸性區域條件下針對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下的結合活性低的抗原結合分子。
            
[0132](79)如(78)所述的方法，其中，pH酸性區域條件為ρΗ4.0~6.5。[0133](80)如(78)或(79)所述的方法，其中，pH中性區域條件為ρΗ6.7~10.0。
            
[0134](81)根據(70)~(80)中任一項所述的制造方法制造的抗原結合分子。
            
[0135](82) 一種醫藥組合物，包含(81)所述的抗原結合分子或其經修飾體。
            
【專利附圖】
            

            
【附圖說明】
            
[0136][圖1]為展示從大腸桿菌(所述大腸桿菌導入有以pH依賴性方式結合抗原的抗體基因文庫)分離的132個克隆的序列信息的氨基酸分布(表示為“文庫”)和設計的氨基酸分布(表示為“設計”)的關系的圖。橫軸表示以Kabat編號法表示的氨基酸的位點。縱軸表示氨基酸的分布的比率。
            
[0137][圖2]表示抗 IL-6R 抗體(托珠單抗(Tocilizumab))、6RpH#01 抗體、6RpH#02 抗體及6RpH#03抗體在pH7.4處的傳感圖(sensorgram)。橫軸表示時間，縱軸表示RU值。
            
[0138][圖3]表示抗IL-6R抗體(托珠單抗)、6RpH#01抗體、6RpH#02抗體及6RpH#03抗體在pH6.0處的傳感圖。橫軸表不時間，縱軸表不RU值。
            
[0139][圖4A]為表示pH依賴性結合抗體在血漿中(pH7.4)和核內體內(pH6.0)與抗原的相互作用的模式的圖。
            
[0140][圖4B]為表示鈣依賴性結合抗 體在血漿中(Ca2+2mM)和核內體內(Ca2+3μ M)與抗原的相互作用的模式的圖。
            
[0141][圖4C]為表示pH和鈣依賴性結合抗體在血漿中(Ca2+2mM)和核內體內(Ca2+3μ Μ)與抗原的相互作用的模式的圖。
            
[0142][圖5]為包含人Vk5-2序列的抗體和包含hVk5_2_L65序列(所述h Vk5_2_L65序列是人Vk5-2序列中糖鏈附加序列經修飾的序列)的抗體的離子交換色譜。實線表示包含人Vk5-2序列的抗體(重鏈序列號:4)和輕鏈:hVk5_2(序列號:1)上融合了序列號:26而得的)的色譜圖，虛線表示具有hVk5-2_L65的序列的抗體(重鏈:CM_H(序列號:4)、輕鏈:hVk5-2_L65(序列號:5))的色譜圖。
            
[0143][圖6]為包含LfVkl_Ca序列的抗體(重鏈:GC_H、序列號:48，以及輕鏈:LfVkl_Ca、序列號:43)、與包含1^71^1_0&序列中的4鄧(0)殘基被修飾為Ala(A)殘基的序列的抗體在5°C保存后(實線)或在50°C保存后(虛線)的離子交換色譜。分別地，其為將5°C保存后的離子交換色譜中最高的峰作為主峰、通過主峰進行了 y軸歸一化的圖。
            
[0144][圖7]為包含LfVkl_Ca序列的抗體(重鏈:GC_H、序列號:48，以及輕鏈:LfVkl_Ca、序列號:43)、與包含LfVkl_Ca序列中的第30位(Kabat編號)的Asp (D)殘基被修飾為Ser(S)殘基的LfVkl_Ca6序列(重鏈:GC_H、序列號:48，以及輕鏈:LfVkl_Ca6、序列號:49)的抗體在5°C保存后(實線)或50°C保存后(虛線)的離子交換色譜。分別地，其為將5°C保存后的離子交換色譜中最高的峰作為主峰、通過主峰進行了 y軸歸一化的圖。
            
[0145][圖8]為展示從大腸桿菌(該大腸桿菌導入了以Ca依賴性方式結合抗原的抗體基因文庫)分離的290個克隆的序列信息的氨基酸分布(表示為“文庫”)和設計的氨基酸分布(表示為“設計”)的關系的圖。橫軸表示以Kabat編號法表示的氨基酸的位點。縱軸表示氨基酸的分布的比率。
            
[0146][圖9]表示高鈣離子濃度的條件(L2mM)下抗IL-6R抗體(托珠單抗)、6RClIgG_010抗體、6RClIgG_012抗體及6RClIgG_019抗體的傳感圖。橫軸表示時間，縱軸表示RU值。
            
[0147][圖10]表示低鈣離子濃度的條件(3μ Μ)下抗IL-6R抗體(托珠單抗)、6RClIgG_010抗體、6RClIgG_012抗體及6RClIgG_019抗體的傳感圖。橫軸表示時間，縱軸
            
表示RU值。
            
[0148][圖11]表示通過X射線結晶結構分析確定的6RL#9抗體的Fab片段的重鏈⑶R3的結構。(i)為表示在存在鈣離子的結晶化條件下得到的結晶結構的重鏈CDR3的圖，(ii)為表示在不存在鈣離子的結晶化條件下得到的結晶結構的重鏈CDR3的圖。
            
[0149][圖12]為表示使用Biacore的傳感圖,所述傳感圖表示抗人IgA抗體在Ca2+L2mM及Ca2+3yM下與人IgA的相互作用。
            
[0150][圖13]為使用ELISA法的、表示抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3)抗體在Ca2+L 2mM及Ca2+3 μ M下與人重組磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的相互作用的圖。
            
[0151][圖14]為表示使用Biacore的傳感圖，所述傳感圖表示抗小鼠IgA抗體在ρΗ7.4及ρΗ5.8時與小鼠IgA的相互作用。實線表示ρΗ7.4的條件，虛線表示ρΗ5.8的條件。
            
[0152][圖15]為表示使用Biacore的傳感圖，所述傳感圖表示抗人HMGBl抗體在ρΗ7.4及ρΗ5.8時與人HMGBl的相 互作用。實線表示ρΗ7.4的條件，虛線表示ρΗ5.8的條件。
            
[0153][圖16]為表示H54/L28-1gGl抗體、FH4_IgGl抗體及6RL#9_IgGl抗體在正常小鼠的血漿中的抗體濃度的推移的圖。
            
[0154][圖17]為表示給予了H54/L28-1gGl抗體、FH4_IgGl抗體及6RL#9_IgGl抗體的正常小鼠的血漿中可溶性人IL-6受體(hsIL-6R)的濃度的推移的圖。
            
[0155][圖18]為表示 H54/L28-N434W 抗體、FH4-N434W 抗體及 6RL#9-N434W 抗體在正常小鼠的血漿中的抗體濃度的推移的圖。
            
[0156][圖19]為表示給予了 H54/L28-N434W 抗體、FH4-N434W 抗體及 6RL#9-N434W抗體的正常小鼠的血漿中可溶型人IL-6受體(hsIL-6R)濃度的推移的圖。
            
【具體實施方式】
            
[0157]根據本發明的公開內容，提供了主要由互相之間序列不同的多個抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化。此外，根據本發明的公開內容，提供了下述文庫的新穎的系統性制造方法，所述文庫主要由互相之間序列不同的多個抗原結合分子構成，所述抗原結合分子針對抗原的結合活性根據金屬離子濃度和/或氫離子濃度的條件而變化。這樣的文庫可作為對于選擇和/或篩選具有下述活性的合成的抗原結合分子的克隆有用的組合文庫使用，所述活性為例如針對金屬離子濃度和/或氫離子濃度的條件而期望的活性，例如結合親和性(affinity)和親和力(avidity)。
            
[0158]這些文庫可用于鑒定抗原結合分子的多肽的序列，所述抗原結合分子能與任意的多種多樣的對象抗原發生相互作用。例如，以噬菌體展示的方式表達的本發明的包含經多樣化的抗原結合分子的多肽的文庫，對于選擇和/或篩選目標抗原結合分子特別有用，此外，根據本發明還提供了用于此的高通量、高效的、可自動化的系統。根據本發明的方法，可提供針對對象抗原以條件依賴性方式結合的抗原結合分子。進而，通過本發明，還提供含有該抗原結合分子作為有效成分的醫藥組合物。
            
[0159][0160]氨基酸
            
[0161]本說明書中，氨基酸以單字母編碼或三字母編碼或這兩種方式來表示，例如表示為 Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/ff, His/H、Tyr/Y、Ile/1、Val/V。
            
[0162]EU編號和Kabat編號
            
[0163]根據本發明中使用的方法，被分配為抗體的⑶R和FR的氨基酸位置是按照Kabat規定的(Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute ofHealth, Bethesda, Md., 1987年和1991年)。本說明書中，抗原結合分子為抗體或抗原結合片斷的情況下，可變區的氨基酸按照Kabat編號表示，恒定區的氨基酸按照遵循Kabat的氨基酸位置的EU編號來表不。
            
[0164]氨基酸的修飾
            
[0165]為了對抗原結合分子的氨基酸序列中的氨基酸進行修飾，可適當地采用位點特異性的突變誘導法(Kunkel 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1985) 82，488-492))或重疊延伸PCR(Overlap extension PCR)等公知的方法。此外，作為取代為天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸修飾方法，可采用多種公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35, 225-249, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(2003) 100 (11)，6353-6357)。例如，還可適合地使用含有tRNA的無細胞翻譯系統(Clover Direct (Protein Express))等,所述無細胞翻譯系統中，非天然氨基酸結合至作為終止密碼子之一的UAG密碼子(琥珀密碼子)的互補的琥珀抑制基因tRNA上。此外，作為顯示氨基酸的修飾的表示方式，可適當地使用下述表示方式:其中，在表示特定位置的數字前后使用修飾前和修飾后的氨基酸的單字母編碼。例如，在抗體恒定區含有的Fe區域中施加氨基酸取代時使用的P238D這樣的修飾，表不以EU編號表不的第238位的Pro被取代為Asp。即，數字表不以EU編號表不的氨基酸位置，其之前記載的氨基酸單字母編碼表示取代前的氨基酸，其之后記載的氨基酸單字母編碼表示取代后的氨基酸。
            
[0166]和/ 或
            
[0167]本說明書中，“和/或”的用語的意義包括“和”與“或”適當組合而得的所有組合。具體而言，例如，“第33位、55位和/或96位的氨基酸被取代”表示包括以下的氨基酸修飾的變化:(a)第33位，(b)第55位，(c)第96位，(d)第33位和第55位，(e)第33位和第96位，(f)第55位和第96位，(g)第33位和第55位和第96位。
            
[0168]抗原結合分子
            
[0169]本說明書中，用語“抗原結合分子”以表示包含抗原結合結構域的最廣義的含義來使用，具體而言，只要顯示出對抗原的結合活性，各種各樣的分子形式都包括在內。例如，作為抗原結合結構域與FcRn結合結構域結合的分子的例子，可舉出抗體。抗體可包括單一的單克隆抗體(包括激動性抗體和拮抗性抗體)、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體等。此外，在以抗體片斷的形式使用的情況下，可優選舉出抗原結合結構域和抗原結合片斷(例如，Fab、F(ab’)2、scFv和Fv)。使用已有的穩定的α/β桶狀蛋白質(barrel protein)結構等立體結構作為支架結構(scaffold ;基礎)、僅其一部分結構為了構建抗原結合結構域而被文庫化的支架分子 ，也包括在本發明的抗原結合分子內。
            
[0170]本說明書中，關于“抗原結合結構域”，只要能與目標抗原結合，則可使用任何結構的結構域。作為這樣的結構域的例子，可優選舉出例如:抗體的重鏈和輕鏈的可變區；存在于生物體內的細胞膜蛋白即Avimer中含有的35個氨基酸左右的被稱為A結構域的模塊(W02004044011、W02005040229);包含 10Fn3 結構域的 Adnectin，所述 10Fn3 結構域為與纖連蛋白(fibronectin)中的蛋白質結合的結構域，所述纖連蛋白為細胞膜上表達的糖蛋白(W02002032925);以構成3螺旋束(bundle)的IgG結合結構域作為支架結構的Affibody (W01995001937)，所述3螺旋束包含蛋白質A的58個氨基酸；DARPins (DesignedAnkyrin Repeat proteins),其為 ankyrin 重復(ankyrin repeat:AR)在分子表面露出的區域，所述ankyrin重復具有包含33個氨基酸殘基的轉角與2個逆平行螺旋及環的亞單位反復重疊而成的結構(W02002020565) ;Anticalin等，其為支承下述桶狀結構的單側的四個環區域，所述桶狀結構為嗜中性粒細胞明膠酶結合載脂蛋白(neutrophilgelatinase-associated Iipocalin(NGAL))等載脂蛋白中高度保守的8條逆平行鏈向中央方向彎曲而成的(W02003029462);作為七鰓鰻、盲鰻等無顎類動物的獲得性免疫系統不具有免疫球蛋白結構的可變淋巴細胞受體(variable lymphocyte receptor (VLR))的富含亮氨酸殘基的重復(leucine-rich-1^peat(LRR))模塊反復重疊而成的馬鞍形結構的內部的平行片層結構的凹陷區域(W02008016854)。作為本發明的抗原結合結構域的優選例，可舉出包含抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的抗原結合結構域。
            
[0171 ] 本說明書中，“抗體”表示天然存在的、或者部分或完全通過合成而制造的免疫球蛋白。抗體可從天然存在的血漿或血清等天然來源分離得到、或從產生抗體的雜交瘤細胞的培養上清液分離得到、 或者可通過使用基因重組等手段部分或完全地合成獲得。作為抗體的例子，可優選舉出免疫球蛋白的同種型及這些同種型的亞類。作為人的免疫球蛋白，已知 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2、IgD、IgE、IgM 這 9 個類別(同種型)。本發明的抗體可包含這些同種型中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。作為人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4 恒定區，在 Sequences of proteins of immunological interest, NIH PublicationN0.91-3242中記載了由于基因多態性產生的多個同種異型(allotype)序列，其中任意的序列均可用于本發明中。特別地，作為人IgGl的序列，以EU編號表示的356-358位的氨基酸序列可以為DEL也可以為EEM。作為人IgK(Kappa)恒定區與人IgL7 (Lambda)恒定區,在Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication N0.91-3242 中記載了由于基因多態性產生的多個同種異型序列，其中任意的序列均可用于本發明中。制作具有期望的結合活性的抗體的方法也是本領域技術人員公知的。
            
[0172]抗體可使用公知的手段以多克隆抗體或單克隆抗體的形式獲得。作為單克隆抗體，可適合地制作來源于哺乳動物的單克隆抗體。來源于哺乳動物的單克隆抗體包括通過雜交瘤產生的單克隆抗體，以及通過宿主細胞產生的單克隆抗體等，所述宿主細胞利用基因工程手段用包含抗體基因的表達載體進行了轉化。
            
[0173]單克隆抗體產生雜交瘤可使用公知技術來制作。即，通過致敏性(sensitive)抗原按照通常的免疫方法對哺乳動物進行免疫。將得到的免疫細胞通過通常的細胞融合法與公知的親本細胞融合。接著，利用通常的篩選法，對單克隆的抗體產生細胞進行篩選，由此能夠選擇出產生對該致敏性抗原的抗體的雜交瘤。
            
[0174]作為使用該致敏性抗原免疫的哺乳動物，不限于特定的動物，優選考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性來進行選擇。一般而言，優選使用嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠或兔，猴等。
            
[0175]按照公知的方法，通過致敏性抗原對上述動物進行免疫。例如，作為一般的方法，通過將致敏性抗原注射至哺乳動物的腹腔內或皮下進行給藥來實施免疫。具體而言，將經PBS(磷酸緩沖鹽水)、生理鹽水等以適當稀釋倍率稀釋的致敏性抗原根據需要與通常的佐劑(例如弗氏完全佐劑)混合、乳化后，將該致敏性抗原以每4~21天向哺乳動物給予數次。此外，在致敏性抗原的免疫時可使用合適的載體。特別地，將分子量小的部分肽作為致敏性抗原時，有時也優選對與清蛋白、鑰孔戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)等載體蛋白結合的該致敏性抗原肽進行免疫。
            
[0176]此外， 針對希望的多肽產生抗體的雜交瘤還可通過使用DNA免疫按照下文所述來制作。DNA免疫為下述免疫方法:以使得編碼抗原蛋白質的基因在免疫動物中能夠表達的形式構建載體DNA，將該載體DNA給予該免疫動物，通過致敏性抗原在該免疫動物的生物體內表達，從而在該免疫動物中給予免疫刺激。與向免疫動物給予蛋白質抗原的一般性免疫方法相比，DNA免疫具有下述優勢:
            
[0177]-抗原為膜蛋白質的情況下，能夠維持該結構并給予免疫刺激，
            
[0178]-不需要純化免疫抗原。
            
[0179]作為與所述免疫細胞融合的細胞，可使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞優選具備用于篩選的合適的選擇性標志物。所謂選擇性標志物，表示在特定的培養條件下能夠存活(或者不能存活)的特性。選擇性標志物中，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷(以下簡稱為HGPRT缺陷)或胸苷激酶缺陷(以下簡稱為TK)等是公知的。具有HGPRT或TK缺陷的細胞具有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下簡稱為HAT敏感性)。HAT敏感性的細胞在HAT選擇性培養基中死亡，不能進行DNA合成，但與正常的細胞融合的話則能夠利用正常細胞的救濟途徑(salvage pathway)繼續DNA合成，因此能夠在HAT選擇性培養基中生長。
            
[0180]HGPRT缺陷或TK缺陷的細胞分別可以通過包含6-硫雜鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)或5’ -溴脫氧尿苷的培養基來選擇。在DNA中摻入這些嘧啶類似物的正常細胞將死亡。另一方面，不摻入這些嘧啶類似物的、上述酶缺陷的細胞則能夠在選擇性培養基中存活。除此之外，被稱為G418抗性的選擇性標志物通過新霉素抗性基因而賦予針對2-脫氧鏈霉胺類抗生素(慶大霉素類似物)的抗性。適合于細胞融合的各種骨髓瘤細胞是公知的。
            
[0181]作為這類骨髓瘤細胞，例如，可優選使用P3 (P3x63Ag8.653) (J.1mmunol.(1979) 123 (4), 1548-1550)> P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiologyand Immunology (1978)81, 1-7)、NS-1 (C.Eur.J.1mmunol.(1976)6 (7)，511-519)、MPC-1l (Cell (1976) 8 (3)，405-415)、SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685)，269-270)、FO (J.1mmunol.Methods (1980) 35 (1-2)，1-21)、S194/5.ΧΧ0.BU.1 (J.Exp.Med.(1978) 148 (I)，313-323)、R210 (Nature (1979) 277 (5692)，131-133)等。
            
[0182]基本而言，可按照公知的方法，例如kohler和Milstein等人的方法(MethodsEnzymol.(1981)73，3_46)，來進行所述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合。
            
[0183]更具體而言，例如，可在細胞融合促進劑的存在下，在通常的營養培養液中，實施所述細胞融合。作為融合促進，例如使用聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等，為了進一步提高融合效率根據需要還可添加二甲亞砜等助劑。
            
[0184]免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例可任意設定。例如，對于骨髓瘤細胞而言，免疫細胞優選為I~10倍。作為用于所述細胞融合的培養，例如，可使用適用于所述骨髓瘤細胞株的生長的RPMI1640培養液、MEM培養液，以及用于該種細胞培養的通常的培養液，進而，還可合適地添加胎牛血清(FCS)等血清補充液。
            
[0185]細胞融合中，將所述免疫細胞與骨髓瘤細胞以給定量在所述培養液中良好地混合，將預先加熱至37°C左右的PEG溶液(例如平均分子量為1000~6000左右)以通常30~60% (w/v)的濃度添加。通過對混合液緩慢混合，形成期望的融合細胞(雜交瘤)。接著，順次添加上文舉出的合適的培養液，可通過反復進行離心除去上清液的操作，除去對于雜交瘤的生長來說不利的細胞融合劑等。
            
[0186]可使用通常的選擇性培養液，例如HAT培養液(包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養液)進行培養，來對上述得到的雜交瘤加以選擇。可使用上述HAT培養液繼續進行培養充分的時間(通常，所述足夠的時間為數天至數周)以使得期望的雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡。接著，通過通常的有限稀釋法，實施對產生期望的抗體的雜交瘤的篩選以
            
及單一克隆。
            
[0187]可通過利用與細胞融合中使用的骨髓瘤所具有的選擇性標志物相應的選擇性培養液，對上述得到的雜交瘤進行選擇。例如，可通過用HAT培養液(包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養液)進行培養，選擇具有HGPRT或TK的缺陷的細胞。即，將HAT感受性的骨髓瘤細胞用于細胞融合的情況下，可在HAT培養液中使與正常細胞的細胞融合成功的細胞選擇性地生長。可使用上述HAT培養液繼續進行培養充分的時間以使得期望的雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡。具體而言，一般，通過數天至數周的培養，可以選擇得到所希望的雜交瘤。接著，通過通常的有限稀釋法，實施對產生期望的抗體的雜交瘤的篩選以及單一克隆。
            
[0188]對期望的抗體的篩選以及單一克隆，可以根據基于公知的抗原抗體反應的篩選方法適當地實施。這樣的單克隆抗體例如可通過FACS(fluorescence activated cellsorting，熒光激活細胞分選)來篩選得到。FACS是能夠通過激光對與熒光抗體接觸的細胞進行分析、通過測定各細胞發出的熒光來測定抗體與細胞表面的結合的系統。
            
[0189]或者，可基于ELISA的原理來評價抗體對被固定化的抗原的結合活性。例如，抗原被固定于ELISA板的孔中。將雜交瘤的培養上清液與孔內的抗原接觸，檢測結合至抗原的抗體。單克隆抗體來自小鼠的情況下，結合至抗原的抗體可通過抗小鼠免疫球蛋白抗體來檢測。產生所期望的抗體(通過這些篩選選擇到的、具有針對抗原的結合能力)的雜交瘤可通過有限稀釋法等來克隆。這樣制作的產生單克隆抗體的雜交瘤可在通常的培養液中傳代培養。此外，該雜交瘤可在液氮中經歷長期保存。
            
[0190]可按照通常的方法培養該雜交瘤，從其培養上清液獲得期望的單克隆抗體。或者，可將雜交瘤給予與其具有相容性的哺乳動物并使其生長，從哺乳動物的腹水獲得單克隆抗體。前者的 方法對于獲得高純度來說是合適的方法。
            
[0191]還可優選地利用通過由該雜交瘤等的抗體產生細胞克隆的抗體基因編碼的抗體。將克隆的抗體基因并入適當的載體并導入宿主中，由此該基因編碼的抗體得以表達。用于抗體基因的分離和向載體的導入以及對宿主細胞的轉化的方法已由例如Vandamme等人確立(Eur.J.Biochem.(1990) 192 (3)，767-775)。如下文所述，重組抗體的制造方法也已公知。
            
[0192]例如，從產生目標抗體的雜交瘤細胞獲得編碼該抗體的可變區(V區)的cDNA。為此，通常，首先從雜交瘤提取總RNA。作為從細胞提取mRNA的方法，例如可利用下述方法。
            
[0193]-胍超離心法(Biochemistry(1979) 18(24)，5294-5299)
            
[0194]-AGPC 法(Anal.Biochem.(1987) 162(1), 156-159)
            
[0195]提取的mRNA可使用mRNA純化試劑盒(GE Healthcare Bioscience)等來純化。或者，如QuickPr印mRNA純化試劑盒(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE)等那樣、用于從細胞直接提取總mRNA的試劑盒也已市售。使用這樣的試劑盒,可從雜交瘤獲得mRNA。可使用逆轉錄酶從得到的mRNA合成編碼抗體V區的cDNA。cDNA可通過AMV逆轉錄酶第一鏈 cDNA 合成試劑盒(AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA SynthesisKit (生化學工業社))等來合成。此外，為了 cDNA的合成及擴增，可合適地利用SMARTRACE cDNA 擴增試劑盒(Clontech)及使用 PCR 的 5’ -RACE 法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1988) 85 (23)，8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989) 17 (8)，2919-2932)。此外，在這樣的cDNA的合成過程中，可向cDNA的兩個末端導入下文所述的適當的限制性酶位點。
            
[0196]從得到的PCR產物純化作為目標的cDNA片斷，接著與載體DNA連接。如上所述制作重組載體，導入大腸 桿菌等，對菌落加以選擇，之后可從形成了該菌落的大腸桿菌制備期望的重組載體。然后，針對該重組載體是否具有作為目標的cDNA的堿基序列，可通過公知的方法，例如，雙脫氧核苷酸鏈終止法等來確認。
            
[0197]為了獲得編碼可變區的基因，利用使用了可變區基因擴增用的引物的5’ -RACE法是簡便的。首先，將從雜交瘤細胞提取出的RNA作為模板合成cDNA，得到5’-RACE cDNA文庫。5’-RACE cDNA文庫的合成中，可合適地使用SMART RACE cDNA擴增試劑盒等市售的試劑盒。
            
[0198]將得到的5’_RACE cDNA文庫作為模板，通過PCR法擴增抗體基因。可基于公知的抗體基因序列來設計用于擴增小鼠抗體基因的引物。這些引物的堿基序列與免疫球蛋白的每個亞類不同。因此，優選地，使用Iso Strip小鼠單克隆抗體Isotyping試劑盒(RocheDiagnostics)等市售的試劑盒預先確定亞類。
            
[0199]具體而言，例如以獲得編碼小鼠IgG的基因為目的時，可利用可能擴增下述基因的引物，所述基因是編碼作為重鏈的Y 1、Y 2a> Y 2b> Y 3、作為輕鏈的κ鏈和λ鏈的基因。為了擴增IgG的可變區基因，對于3’側的引物而言，一般利用在與接近可變區的恒定區相當的部分進行退火的引物。另一方面，對于5’側的引物而言，利用附屬于5’RACE cDNA文庫制作試劑盒中的引物。
            
[0200]利用如上所述進行了擴增的PCR產物，可對由重鏈和輕鏈的組合構成的免疫球蛋白改型。以改型的免疫球蛋白的對抗原的結合活性作為指標，可對期望的抗體加以篩選。例如，以獲得針對抗原的抗體為目的時，關于抗體向抗原的結合而言，特異性結合是進一步優選的。可例如按照下文所述來篩選與抗原結合的抗體:
            
[0201](I)步驟，將包含V區的抗體與抗原接觸，所述V區由從雜交瘤得到的cDNA編碼；
            
[0202](2)步驟，檢測抗原與抗體的結合，及
            
[0203](3)步驟，選擇與抗原結合的抗體。
            
[0204]檢測抗體與抗原的結合的方法是公知的。具體而言，可通過前文描述過的FACS、ELISA等手段，檢測抗體與抗原的結合。
            
[0205]得到編碼目標抗體的V區的cDNA之后，通過識別向該cDNA的兩個末端插入的限制性酶位點的限制性酶，來消化該cDNA。優選的限制性酶對構成抗體基因的堿基序列中出現頻率低的堿基序列加以識別并消化。進而，為了將I個拷貝的消化片斷以正確的方向插入載體中，優選插入能夠賦予粘末端的限制性酶。通過如上文所述消化的編碼抗體的V區的cDNA插入適當的表達載體中，能夠獲得抗體表達載體。此時，編碼抗體恒定區(C區)的基因和編碼所述V區的基因以符合讀碼框的方式融合的話，則獲得嵌合抗體。此處，嵌合抗體表示恒定區與可變區的來源不同。因此，除了小鼠-人等異源嵌合抗體之外，人-人同種嵌合抗體也包括在本發明的嵌合抗體中。通過向預先具有恒定區的表達載體中插入所述V區基因，能夠構建嵌合抗體表達載體。具體而言，例如，可在保持有DNA (該DNA編碼期望的抗體恒定區(C區))的表達載體的5’側，適當地配置消化所述V區基因的限制性酶的限制性酶識別序列。通過將經相同組合的限制性酶消化的兩者以符合讀碼框的方式融合，嵌合抗體表達載體得以被構建。 [0206]為制造期望的抗體，抗體基因與控制序列可作用地連接，且并入表達載體中。用于表達抗體的控制序列包含例如增強子、啟動子。此外，可在氨基末端添加合適的信號序列，以使得表達的抗體分泌到細胞外。例如，作為信號序列，可使用具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列號13)的肽，但除此之外合適的信號序列也可被添加。表達的多肽在上述序列的羧基末端部分被切斷，切斷的多肽可作為成熟多肽分泌到細胞外。接著，通過利用該表達載體轉化合適的宿主細胞，能夠獲得表達DNA(其編碼期望的抗體)的重組細胞。
            
[0207]為了表達基因，編碼抗體的重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)的DNA分別被并入不同的表達載體。利用并入了重鏈和輕鏈的載體共轉染相同的宿主細胞，由此可表達具有重鏈和輕鏈的抗體分子。或者，可通過將編碼重鏈和輕鏈的DNA并入單一表達載體，來對宿主細胞進行轉化(參照W019994011523)
            
[0208]用于通過將分離的抗體基因導入合適的宿主來制作抗體的宿主細胞和表達載體的多種組合是公知的。這些表達系統均可應用于分離本發明的抗原結合分子。使用真核細胞作為宿主細胞的情況下，可適當地使用動物細胞、植物細胞或者真菌細胞。具體而言，作為動物細胞，可舉例下述細胞。
            
[0209](I)哺乳類細胞:CH0(中國倉鼠卵巢細胞系)、C0S (猴腎細胞系)、骨髓瘤(Sp2/0、NSO等)、BHK(幼倉鼠腎細胞)、HEK293 (具有經剪切的腺病毒(Ad) 5DNA的人胚胎腎細胞)、PER.C6細胞(經5型(Ad5)腺病毒ElA和ElB基因轉化的人胚胎視網膜細胞)、Hela、Ver0等(Current Protocols in Protein Science(May, 2001, Unit5.9, Table5.9.1)),
            
[0210](2)兩棲類細胞:非洲爪蟾卵母細胞等，
            
[0211](3)昆蟲細胞:sf9、sf21、Tn5 等。
            
[0212]或者，作為植物細胞，利用來自煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬的細胞的抗體基因表達系統是公知的。植物細胞的轉化可適當地利用愈傷組織培養的細胞。
            
[0213]此外，作為真菌細胞，可利用下述細胞。
            
[0214]-酵母:釀酒酵母(Saccharomycesserevisiae)等酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(巴斯德畢赤酵母，Pichia pastoris)等畢赤酵母屬
            
[0215]-絲狀菌:黑曲霉(Aspergillusniger)等曲霉(Aspergillus)屬
            
[0216]此外，利用原核細胞的抗體基因表達系統也是公知的。例如，使用細菌細胞的情況下，可適當地利用大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌等細菌細胞。這些細胞中，可通過轉化導入包含目標抗體基因的表達載體。通過體外培養經轉化的細胞，可從該轉化細胞的培養物獲得期望的抗體。
            
[0217]對重組抗體的產生而言，除了上述宿主細胞之外，還可利用轉基因動物。即，可從導入了基因(其編碼期望的抗體)的動物獲得該抗體。例如，將抗體基因以符合讀碼框的方式插入編碼蛋白質(在乳汁中固有地產生)的基因內部，由此抗體基因可作為融合基因而被構建。作為分泌進乳汁中的蛋白質，例如可利用山羊β酪蛋白。將包含插入了抗體基因的融合基因的DNA片斷注入山羊胚胎，將該經注入的胚胎導入雌性山羊。從由接受了胚胎的山羊生育的轉基因山羊(或者其子孫)所產生的乳汁中，期望的抗體能夠以與乳汁蛋白質的融合蛋白質的形式獲得。此外，為了增加由轉基因山羊產生的包含期望的抗體的乳汁的量，可向轉基因山羊給予激素(Bio/Technology (1994)，12 (7) ,699-702)。
            
[0218]本說明書中記載的抗原結合分子給予人的情況下，作為該分子中的抗原結合結構域，可當適地采用來自基因重組型抗體(其是為了降低對人的異源抗原性等而經過人工改變的基因重組型抗體)的抗原結合結構域。基因重組型抗體中包含例如人化(Humanized)抗體等。這些改變的抗體可使用公知的方法 合適地制造。
            
[0219]用于制作本說明書中記載的抗原結合分子中的抗原結合結構域的抗體的可變區，通常由在4個框架區(FR)中夾的3個互補性決定區(complementarity-determiningregion ;⑶R)而構成。⑶R是實質上決定抗體的結合特異性的區域。⑶R的氨基酸序列富含多樣性。另一方面，構成FR的氨基酸序列即使在具有不同結合特異性的抗體之間也多顯示出較高的同一性。因此，一般可通過CDR的移植將某抗體的結合特異性移植給其它抗體。
            
[0220]人源化抗體也被稱為改型(reshaped)人抗體。具體而言,將除人之外的動物、例如小鼠抗體的CDR移植給人抗體的人源化抗體等是公知的。用于獲得人源化抗體的一般性的基因重組手段也是已知的。具體而言，作為用于將小鼠的抗體的CDR移植至人的FR的方法，例如重疊.延伸(Overlap Extension)PCR是公知的。重疊.延伸PCR中，向用于合成人抗體的FR的引物中添加堿基序列，該堿基序列編碼將被移植的小鼠抗體的CDR。針對4個FR分別準備引物。一般而言，在小鼠的CDR向人FR的移植中，選擇與小鼠的FR具有較高同一性的人FR，在CDR的功能的維持中被認為是有利的。即，一般而言，優選利用包含下述氨基酸序列的人FR，該氨基酸序列與將移植的小鼠CDR鄰近的FR的氨基酸序列具有較高同一I"生。
            
[0221]此外，連接的堿基序列被設計為互相以符合讀碼框的方式連結。通過各引物而個別地合成人FR。結果，可獲得向各FR添加了編碼小鼠CDR的DNA的產物。各產物的編碼小鼠CDR的堿基序列被設計為互相重疊。接著，使將人抗體基因作為模板合成的產物的重疊的⑶R部分互相退火，進行互補鏈合成反應。通過該反應，將人FR經由小鼠⑶R的序列連接起來。
            
[0222]最終3個⑶R和4個FR連接而得的V區域基因，通過向其5’末端和3’末端退火并添加了合適的限制性酶識別序列的引物而被全長擴增。通過將如上文所述獲得的DNA與編碼人抗體C區的DNA以符合讀碼框的方式融合的方式插入到表達載體中，能夠制作用于表達人化抗體的載體。將該具有并入物的載體導入宿主建立重組細胞后，通過培養該重組細胞、使得編碼該人源化抗體的DNA表達，該人源化抗體被產生于該培養細胞的培養物中(EP239400,W01996002576)。
            
[0223]對上文所述制作的人源化抗體與抗原的結合活性進行定性或定量測定、評價，由此能夠合適地選擇下述人抗體的FR，其使得在經由CDR而被連接時該CDR能形成良好的抗原結合位點。根據需要，還可取代FR的氨基酸序列，以使得改型人抗體的CDR形成合適的抗原結合位點。例如，應用在將小鼠CDR向人FR的移植中使用的PCR法，可向FR中導入氨基酸序列的突變。具體而言，可向對FR進行退火的引物中導入部分堿基序列的突變。通過這樣的引物合成的FR中就導入了堿基序列的突變。通過用上述方法對經氨基酸取代的突變型抗體對抗原的結合活性進行測定和評價，可選擇具有期望的性質的突變FR序列(Sato等人，Cancer Res (1993) 53，851-856)。
            
[0224]此外，將具有人抗體基因的全部結構(repertoires)的轉基因動物(參照 W01993012227、W01992003918、W01994002602、W01994025585、W01996034096、W01996033735)作為免疫動物，通過DNA免疫，可獲得期望的人抗體。
            
[0225]此外，使用人抗體文庫、通過淘選(panning)獲得人抗體的技術也是已知的。例如，人抗體的V區作為單鏈抗體(scFc)通過噬菌體展示法而表達于噬菌體的表面。可選擇出表達與抗原結合 的scFv的噬菌體。通過對選擇的噬菌體的基因進行分析，能夠確定編碼與抗原結合的人抗體的V區的DNA序列。確定與抗原結合的scFv的DNA序列后，可通過將該V區序列與期望的人抗體C區的序列以符合讀碼框的方式融合后插入到適當的表達載體中，來制作表達載體。將該表達載體導入上文舉出的那樣的合適的表達細胞中，通過使得編碼該人抗體的基因表達，獲得該人抗體。這些方法已是公知的(參照 W01992001047、W01992020791、W01993006213、W01993011236、W01993019172、W01995001438,W01995015388)。
            
[0226]本說明書中，“抗原結合結構域”指與抗原的一部分或全部特異性結合且互補的區域。作為抗原結合結構域的例子，可舉出具有抗體的抗原結合結構域的結構域。作為抗體的抗原結合結構域的例子，可舉出CDR、可變區。抗體的抗原結合結構域為CDR的情況下，其可含有抗體中包含的全部6個⑶R，也可含有I個或兩個以上的⑶R。作為抗體的結合區域含有CDR的情況下，只要具有對抗原的結合活性，可對含有的CDR進行氨基酸的缺失、取代、添加和/或插入等，或者還可使用CDR的一部分。抗原的分子量大的情況下，抗體可僅與抗原的特定部分結合。該特定部分被稱為表位。抗原結合結構域可通過一個或多個抗體的可變結構域來提供。優選地，抗原結合結構域含有抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)。作為這樣的抗原結合結構域的例子，可優選舉出“scFv(single chain Fv)”、“單鏈抗體(single chain antibody) ”、“Fv”、“scFv2 (single chain Fv2) ”、“Fab”、“二價抗體”、“線性抗體”或“F(ab，)2”等。
            
[0227]如在本說明書中使用的那樣，“抗體可變區”指包含互補性決定區(CDR ;即⑶R1、CDR2和CDR3)以及框架區(FR)的氨基酸序列的、抗體分子的輕鏈和重鏈的部分。VH指重鏈的可變區(重鏈可變區，Heavy chain variable region)。VL指輕鏈的可變區(輕鏈可變區，Light chain variable region)。通過本發明中使用的方法,被分配為⑶R和 FR 的氨基酸位置是遵循 Kabat 規定的(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (National Institute of Health, Bethesda, Md.，1987 年和 1991 年)。本說明書中，抗體或抗原結合片斷的氨基酸編號也是采用以Kabat的氨基酸位置為基準的Kabat編號法表不的。
            
[0228]如在本說明書中使用的那樣，用語“互補性決定區(CDR ;即⑶R1、⑶R2和⑶R3) ”指為了抗原結合而必須存在的抗體可變區的氨基酸殘基。各可變區一般包含表示為CDR1、⑶R2和⑶R3的3個⑶R區。各互補性決定區可含有來自如Kabat所記載那樣的“互補性決定區”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區的約第24~34位的殘基(⑶Rl)、第50~56位的殘基(CDR2)、及第89~97位的殘基(CDR3)，以及重鏈可變區的第31~35位氨基酸(CDRl)、第 50 ~65 位殘基(CDR2)及第 95 ~102 位殘基(CDR3) ；Kabat 等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5版，Public Health Service, NationalInstitute of Health, Bethesda, MD.(1991))、和/或來自“超可變環”的殘基(即，輕鏈可變區的約第26~32位的殘基 (⑶Rl)、第50~52位的殘基(⑶R2)及第91~96位的殘基(⑶R3)，以及重鏈可變區的第26~32位殘基(⑶Rl)、第53~55位的殘基(⑶R2)及第96 ~101 位的殘基(CDR3) ；Chothia 和 Lesk, J.Mol.Biol.(1987) 196，901-917)。某些情況下，互補性決定區可包含來自根據Kabat的記載所定義的CDR區和超可變環的兩者的氨基酸。
            
[0229]用語“Fab”片斷包含輕鏈的可變區及恒定區以及重鏈的可變區以及第I恒定區(CHl)。F(ab’)2抗體片斷包含一對Fab片斷，通常它們通過位于它們之間的鉸鏈區中的半胱氨酸在它們的羧基末端附近經由共價鍵而連接。抗體片斷的其它化學鍵也是本發明所屬的【技術領域】中公知的。
            
[0230]用語“單鏈Fv”或“scFv”抗體片斷包含抗體的VH和VL區，這些區域形成單一的多肽鏈。通常，Fv多肽在VH和VL區之間進一步包含多肽接頭，該接頭使得scFv能夠形成對于結合抗原來說優選的結構。關于scFv的綜述,例如被記載于Pluckthun, ThePharmacology of Monoclonal Antibodies(1994)Vol.113，269-315(Rosenburg和Moore編輯，Springer-Verlag, New York)等中。
            
[0231]用語“二價抗體(diabody) ”指具有兩個抗原結合位點的小的抗體片斷，該抗體片斷在相同多肽鏈(VH和VL)中包含與輕鏈可變區(VL)連接的重鏈可變區(VH)。使用過短而無法配對相同鏈上的2個區域的短接頭，將該區域與其它鏈的互補性區域強制配對，形成兩個抗原結合位點。二價抗體例如被詳細記載于第404097號歐洲專利、W01993011161等專利文獻以及 Holliger 等(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1993) 90, 6444-6448)等非專利文獻中。
            
[0232]用語“線性抗體”指被記載于Zapata et al., Protein Eng.(1995) 8 (10)，1057-1062中的抗體。也就是說，這些抗體與互補性的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合結構域，包含一對串聯Fd片斷(VH-CH1-VH-CH1).線性抗體可為雙特異性的或單特異性的。
            
[0233]技原
            
[0234]本說明書中，“抗原”只要包含抗原結合結構域結合的表位即可，其結構不限于特定的結構。換句話說，抗原可以是無機物也可以是有機物。作為抗原，可舉例如下分子:17-1A、4-lBB、4Dc、6-酮 _PGFla、8_ 異 _PGF2a、8_ 氧代 _dG、Al 腺苷受體、A33、ACE、ACE-2,激活素(activin)、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素 RIB ALK-4、激活素 RIIA、激活素 RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS, ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(addressin)、aFGF、ALCAM、ALK, ALK-UALK-7、a -1-抗胰蛋白酶、a -V/β -1 拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗 Id、ASPARTIC、心房性鈉利尿因子(利鈉妝，atrial natriureticfactor)、av/b3 整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴細胞刺激因子(BlyS)、BACE,BACE-1、Bad、BAFF, BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-U BCAM, Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM, BLC, BL-CAM、BLK, BMP、BMP_2BMP_2a、BMP-3 成骨素(Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP_6Vgr_l、BMP-7 (OP-1)、BMP-8(BMP_8a、0P-2)、BMPR、BMPR-1A (ALK-3)、BMPR-1B (ALK-6)、BRK-2、RPK-U BMPR-1I (BRK-3)、BMP、b_NGF、BOK、蛙皮素(bombesin)、骨源性神經營養因子、BPDE, BPDE-DNA, BTC、補體因子 3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、CIO、CA125、CAD-8、降鈣素(calcitonin)、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相關抗原、組織蛋白酶(cathepsin) A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPP1、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X/Z/P、CBL、CC1、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、C CL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCRU CCRlO, CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CDl、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67 蛋白質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-l)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、產氣莢膜梭菌毒素、CKb8-l、CLC、CMV, CMV UL、CNTF, CNTN-U COX、C-Ret、CRG-2、CT-U CTACK, CTGF,CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL, CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO, CXCLlU CXCLl2, CXCL13、CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCR、CXCRU CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細胞角蛋白腫瘤相關抗原、DAN、DCC, DcR3、DC-SIGN、補體控制因子(Decay accelerating factor)、des (1-3)-1GF-1 (腦 IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase, Dpp, DPPIV/CD26、Dtk、ECAD, EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF, EGFR(ErbB-1)、EMA,EMMPRIN、ENA、內皮素受體、腦啡肽酶、eN0S、Eot、嗜酸性粒細胞活化趨化因子I (Eotaxinl)、EpCAM,Ephrin B2/EphB4、EP0、ERCC、E_ 選擇素、ET-1、因子 Ila、因子 VI1、因子 VIIIc、因子IX、成纖維細胞活化蛋白質(FAP)、Fas、FcRl、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白(fibrin)、FL、FLIP、Flt_3、Flt_4、促卵泡成熟激素、不規則趨化因子(Fractalkine)、FZDl、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF,⑶2、⑶3、⑶F、⑶F-1、⑶F_3 (Vgr-2)、⑶F_5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F-6 (BMP-13、CDMP-2)、⑶F_7 (BMP-12、CDMP-3)、⑶F-8 (肌抑素(myostatin))、⑶F-9、a)F-15(MIC-l)、ffl)NF、a)NF、GFAP、GFRa-l、GFR-a 1、GFR-a 2、GFR-a 3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白 IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gpl30、gp72、GR0、生長激素釋放因子、半抗原(NP-cap 或 NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB 包膜糖蛋白、HCMV gH 包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF), Hep B gp 120、肝素酶、Her2、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV) gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑素瘤相關抗原(HMW-MAA)、HIV gpl20、HIV IIIB gpl20V3 環、HLA、HLA-DR、HMl.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心臟肌球蛋白、人巨細胞病毒(HCMV)、人生長因子(HGH)、HVEM、1-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、I COS, IFNg、Ig、IgA 受體、IgE、IGF、IGF 結合蛋白質、IGF-1R、IGFBP,IGF-1、IGF-11、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(INF)-a ,INF-β、INF_ y、抑制素(inhibin)、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素樣生長因子1、整合素a 2、整合素a 3、整合素a 4、整合素a 4/β 1、整合素α4/β7、整合素a5(aV)、整合素a 5/β 1、整合素a 5/β 3、整合素a 6、整合素β 1、整合素β 2、干擾素Y、IP_10、I_TAC、JE、激肽釋放酶(kal I ikrein) 2、激肽釋放酶5、激肽釋放酶6、激肽釋放酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽釋放酶L1、激肽釋放酶L2、激肽釋放酶L3、激肽釋放酶L4、KC、KDR、角化細胞生長因子(KGF)、層粘連蛋白(Iaminin) 5、LAMP、LAP、LAP (TGF-1)、潛在的TGF-1、潛在的 TGF-1bp 1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y 抗原、Lewi s-Υ 相關抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo, LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn, L-選擇素、LT_a、LT_b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黃體形成激素、淋巴毒素 β 受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、ΜΑΡ2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、 M-CSF, MDC, Mer、金屬蛋白酶、MGDF 受體、MGMT、MHC (HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1- α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo, MSK, MSP、粘蛋白(Mucl)、MUC18、苗勒管抑制物質(mullerian-1nhibiting substance)、Mug、MuSK> NAIP、NAP、NCAD> N-C adherin、NCA90、NCAM、NCAM、腦啡肽酶、神經營養因子_3、神經營養因子-4或神經營養因子-6、neurturin、神經生長因子(NGF)、NGFR、NGF- β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGGl、OPG, OPN、OSM、0X40L、0X40R、pl50、p95、PADPr^ij 甲狀腺激素、PARC、PARP, PBR、PBSF, PCAD, P-鈣粘蛋白、PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE, PGF, PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP, PP14、胰島素原、松弛素原(prorelaxin)、蛋白質 C、PS、PSA、PSCA,前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp, Ptk, PTN、R51、RANK、RANKL, RANTES,RANTES、松弛素A鏈、松弛素B鏈、腎素、呼吸道合胞體病毒(RSV) F、RSV Fgp、Ret、風濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清清蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-USLAM、SLP I, SMAC, SMDF, SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP, STEAP-11, TACE, TAC1、TAG-72 (腫瘤相關糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(例如，T細胞受體α / β )、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TER T、睪丸 PLAP 樣堿性磷酸酶、TfR, TGF、TGF-a、TGF-β、TGF- β PanSpecific、TGF-β RI (ALK-5)、TGF-β RH、TGF-β RIIb、TGF-PRII1、TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-0 4、TGF-0 5、凝血酶、胸腺Ck_l、甲狀腺刺激激素、Tie、HMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-a、TNF- α β、TNF-β 2、TNFc、TNF-R1、TNF-RI1、TNFRSF10A (TRAIL RlApo-2、DR4)、TNFRSFIOB (TRAIL R2DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3DcRl、LIT、TRID)、TNFRSF10D (TRAIL R4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCER)、TNFRSFIlB(OPG OCIF、TRl)、TNFRSFI2(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEM ATAR、HveA, LIGHT R、TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ、TRADE)、 TNFRSF19L (RELT)、TNFRSFIA (TNF RI CD120a、p55_60)、TNFRSF1B(TNF RIICD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RII1、TNFC R)、TNFRSF4(0X40ACT35、TXGPIR)、TNFRSF5 (CD40p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-U APTl、CD95)、TNFRSF6B(DcR3M68、TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21 (DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配體，TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配體 ODF、OPG 配體)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLU THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHTHVEM 配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSF1A (TNF_a連接素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC, p33)、TNFSF4 (0X40 配體 gp34、TXGPI)、TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMU IMD3, TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-1 配體、APTl 配體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配體 CD 137 配體)、TP-U t_PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、TRANCE、轉鐵蛋白受體、TRF, Trk, TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤相關抗原 CA125、腫瘤相關抗原表達LewisY相關碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD, VE-鈣粘蛋白、VE-鈣粘蛋白-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEGF, VEGFR、VEGFR-3 (flt-4)、VEG1、VM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR 整合素、von Willebrand 因子、WIF-1、WNTl、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNTIOA、WNTIOB、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD, HMGBl、IgA, A β、CD81、CD97、CD98、DDRl、DKKl、EREG, Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、酸化 LDL、PCSK9、前激肽釋放酶、RON、TMEM16F、SODl、嗜鉻粒蛋白 A、嗜鉻粒蛋白 B、tau、VAPl、高分子量激肽原、IL-31、IL-31R、NavL UNavl.2,Nav1.3,Navl.4、Navl.5、Navl.6、Navl.7、Navl.8、Navl.9、EPCR、Cl、Clq、Clr、Cls、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子 B、因子 D、因子 H、備解素(properdin)、硬骨素(sclerostin)、纖維蛋白原、纖維蛋白、凝血酶原、凝血酶、組織因子、因子V、因子Va、因子VI1、因子Vila、因子VII1、因子Villa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子X1、因子XIa、因子XI1、因子Xlla、因子XII1、因子XIIIa、TFP1、抗凝血酶II1、EPCR、血栓調節素(thrombomodulin)、TAP1、tPA、血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)、血纖維蛋白溶酶、PA1-1、PA1-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA> SIP、乙酸膽堿受體、AdipoRl、AdipoR2、ADP 核糖環化酶-1、α -4/β -7 整合素、α -5/β -1 整合素、α -ν/β-6整合素、α νβ I整合素、血管生成素配體-2、Angptl2、炭疽(Anthrax)、鈣粘蛋白、碳酸酐酶-1X、CD105、CD155、CD158a、CD37、CD49b、CD51、CD70、CD72、緊密連接蛋白(Claudin) 18、艱難梭菌毒素、CSl、Delta樣蛋白配體4、DHICA氧化酶、Dickkopf-1配體、二肽基肽酶IV、EPOR、RSV的F蛋白、因子la、FasL、葉酸受體α、胰高血糖素受體、胰高血糖素樣肽I受體、谷氨酸羧肽酶I1、GMCSFR、丙型肝炎病毒Ε2糖蛋白、鐵調素Ofepcidin)、IL-17受體、IL-22受體、IL-23受體、IL-3受體、Kit酪氨酸激酶、富亮氨酸α -2-糖蛋白I (LRGl)、溶血鞘脂(Lysosphingolipid)受體、膜糖蛋白 0X2、間皮素(Mesothelin)、MET、MICA、MUC-16、髓磷脂相關糖蛋白、神經纖毛蛋白-1、神經纖毛蛋白-2、Nogo受體、PLXNAl、PLXNA2、PLXNA3、PLXNA4A、PLXNA4B、PLXNB1、PLXNB2、PLXNB3、PLXNCl、PLXNDl、程序化細胞死亡配體1、前蛋白轉化酶PC9、P-選擇素糖蛋白配體-1、RAGE、Reticulon4、RF、RON-8,SEMA3A,SEMA3B、SEMA3C、SEMA3D、SEMA3E、SEMA3F、SEMA3G、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4D、SEMA4F, SEMA4G、SEMA5A、SEMA5B、SEMA6A、SEMA6B、SEMA6C、SEMA6D、SEMA7A、Shiga 樣毒素I1、鞘氨醇-1-磷酸鹽受體-1、ST2、葡萄球菌脂磷壁酸、腱蛋白(Tenascin)、TG2、胸腺基質淋巴細胞生成素蛋白(thymic stromal lymphopoietin)受體、TNF超家族受體12A、跨膜糖蛋白匪8、丁1?]\1-1、丁1?]\1-2、滋養層(Trophoblast)糖蛋白、TSH 受體、TTR、微管蛋白、ULBP2以及激素及生長因子的受體。此外，還可舉例為所述受體中在生物體的體液中不錨定于細胞上而是以可溶形式存在的分子。
            
[0235]表示抗原中存在的抗原決定基的表位，是指本說明書中公開的抗原結合分子中的抗原結合結構域所結合的抗原上的部位。因此，例如，表位是根據其結構而被定義的。此外，還可根據識別該表位的抗原結合分子中針對抗原的活性，來對表位進行定義。抗原為肽或多肽的情況下，還可通過構成表位的氨基酸殘基來對表位進行特定。此外，表位為糖鏈的情況下，還可通過特定的糖鏈結構來對表位進行特定。
            
[0236]線性表位是包含識別氨基酸一級序列的表位的表位。線性表位典型地在固有的序列中含有至少3個氨基酸，最常見而言在固有的序列中含有至少5個、例如約8個~約10個、6個~20個氨基酸。 [0237]與線性表位相對，立體構象表位為下述表位:其中包含表位的氨基酸的一級序列并非被識別的表位的單一規定成分(例如，其氨基酸的一級序列不一定能被規定表位的抗體識別的表位)。立體構象表位有可能包含對于線性表位而言增加的數量的氨基酸。與立體構象表位的識別相關，抗體識別肽或蛋白質的三級結構。例如，蛋白質分子折疊形成三級結構的情況下，形成立體構象表位的某氨基酸和/或多肽主鏈成為平行排列的狀態，抗體得以能夠識別表位。確定表位的立體結構的方法包括例如X射線結晶法、二維核磁共振分光法以及位點特異性自旋標記及電子順磁共振分光法，但不限于這些。例如，參照EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996),第 66 卷，Morris (編著)。
            
[0238]基因重組手段
            
[0239]用語“密碼子組合”指用于編碼期望的氨基酸的一組不同的核苷酸三聯體序列。一組寡核苷酸包括編碼期望的氨基酸群的序列，所述序列表示由密碼子組合提供的核苷酸三聯體的全部組合。這樣的一組寡核苷酸例如可通過固相法來合成。標準的密碼子指定形式為IUB編碼的那樣，該編碼是本【技術領域】公知的。密碼子組合一般表示為3個大寫字母，例如 NNK、NNS、DVK、DVD 等。
            
[0240]IUB 編碼
            
[0241]G:鳥嘌呤
            
[0242]A:腺嘌呤
            
[0243]T:胸腺嘧啶
            
[0244]C:胞嘧啶
            
[0245]R(A*G)
            
[0246]Y (C 或 T)
            
[0247]M(A*C)
            
[0248]K (G 或 T)[0249]S (C 或 G)
            
[0250]W(A*T)
            
[0251]H(A、C 或 T)
            
[0252]B(C、G*T)
            
[0253]V (A、C 或 G)
            
[0254]D(A、G*T)
            
[0255]N(A、C、G*T)
            
[0256]例如，密碼子組合DVK中，D為核苷酸A或G或T、V為A或G或C、K為G或T。該密碼子組合表示18個不同的密碼子,可編碼氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly 和 Cys0
            
[0257]在特定的位置具有“簡并”核苷酸的寡核苷酸的設計方法是本發明所屬的【技術領域】中公知的(例如Garrard and Henner, Gene (1993) 128，103-109等)。具有這樣的某種密碼子組合的寡核苷酸組 合可使用市售的核酸合成儀(可從Applied Biosystems, FosterCity, CA獲得)合成,或者可購買市售品(例如Life Technologies, Rockville, MD)。因此，具有特定的密碼子組合的合成寡核苷酸組合一般含有不同序列的多個寡核苷酸。此外，作為本發明的非限定性的方式，例如還可包含對克隆有用的限制性酶位點。
            
[0258]“細胞”、“細胞系”和“細胞培養”在本說明書中可作為相同含義使用，這樣的稱呼中也包含細胞系的全部后代。由此，例如，“轉化體”或“轉化細胞”這樣的用語包含與傳代數無關的來自它們的一級目標細胞和培養物。還應當理解，由于刻意或偶然的突變，全部后代中DNA的內容不一定完全相同。對最初的轉化細胞進行篩選而得的具有實質上相同的功能或生物學活性的變體的后代也可包括在內。在記載了意指不同的稱呼的情況下，將從該記載的上下文關系中明白其意指。
            
[0259]提到編碼序列的表達的情況下的用語“控制序列”，是指為了在特定的宿主生物中可作用地連接的編碼序列的表達而必需的DNA堿基序列。例如，適用于原核生物的控制序列包括啟動子、根據需要的操縱子序列、核糖體結合位點、以及可能還有尚未被完全理解的其它序列。真核細胞中，為表達編碼序列，利用啟動子、聚腺苷化信號以及增強子是公知的。
            
[0260]與核酸相關的“可作用地連接”表示該核酸與其它核酸序列在功能上相關。例如，前序列(presequence)或分泌引導序列的DNA作為與某多肽的分泌相關的前體蛋白質表達的情況下，與該多肽的DNA以可發揮作用的方式結合。啟動子或增強子在影響某編碼序列的轉錄的情況下與該序列可作用地連接。此外，核糖體結合部在其位于翻譯容易的位置的情況下與編碼序列可作用地連接。通常，“可作用地連接”表示結合的DNA序列連續、在分泌引導序列的情況下連續且位于讀碼框內。但是，增強子則沒有連續的必要。連接通過在限制性位點連接而實現。不存在這樣的位點的情況下，按照慣常的方法使用合成寡核苷酸適體(adapter)或接頭。此外,還可通過前述重疊.延伸PCR的手段制作連接的核酸。
            
[0261]“連接”指在兩條核酸片斷之間形成磷酸二酯鍵的方法。為了連接兩條片斷，片斷的末端必須要相互適合。根據情況，進行內切核酸酶消化之后其末端即具有適合性。但是為了使其適合連接，首先，必須要將內切核酸酶消化之后形成的粘附末端變為平末端。為了成為平末端，將在合適的緩沖液中，于15°C、在4種脫氧核糖核苷酸三磷酸存在下、用約10單位的DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶的Klenow片斷對DNA處理至少15分鐘。接著，通過苯酚.氯仿提取和乙醇沉淀或者二氧化硅純化，對DNA進行純化。將待連接的DNA片斷以等摩爾量加入到溶液中。該溶液中除了 ATP、連接酶緩沖液之外，T4DNA連接酶那樣的連接酶以相對于每0.5 μ g DNA而言約10個單位被含有。將DNA連接于載體的情況下，首先利用合適的限制性內切核酸酶通過消化作用使載體線性化。接著通過用細菌的堿性磷酸或幼牛腸道磷酸酶對線性化的片斷進行處理，防止該片斷在連接步驟中自身連接。
            
[0262] 用語“外殼蛋白質”指蛋白質中至少一部分存在于病毒粒子表面的蛋白質。從功能上的觀點來看，外殼蛋白指在病毒于宿主細胞中的構建過程中與病毒粒子結合的任何蛋白質，在直到病毒感染其它宿主細胞之前保持與病毒的結合狀態。外殼蛋白質可以是主要外殼蛋白質，也可以是次要外殼蛋白質。次要外殼蛋白質為通常存在于病毒衣殼中的外殼蛋白質，優選地，每I個病毒粒(virion)中存在至少約5個、更優選至少約7個、更優選至少約10個上述蛋白質的拷貝。主要外殼蛋白質可以以相對I個病毒粒而言數十個、數百個或者數千個的拷貝存在。作為主要外殼蛋白指的例子，可舉出纖維狀噬菌體的P8蛋白質。
            
[0263]特定的測定中，某化學無機物質、有機物質、生物等物體的“檢測限”指在該測定中以高于背景水平而被檢測到的該物體的最小限度的濃度。例如，噬菌體ELISA中，呈示特定抗原結合片斷的特定噬菌體的“檢測限”指特定噬菌體產生比由不呈示該抗原結合片斷的對照噬菌體所產生ELISA信號多的ELISA信號的噬菌體濃度。
            
[0264]“噬菌體展示”是將變體多肽在噬菌體、例如纖維樁噬菌體的粒子表面作為與外殼蛋白質的至少一部分融合的蛋白質呈示的手段。噬菌體展示的有用性體現在:能從隨機化蛋白質變體的大文庫迅速、高效地選擇辨別出與對象抗原以高親和性結合的序列。肽和蛋白質文庫在噬菌體上的呈示，被用于對數百萬量級的多肽與特異性結合特性相關地進行篩選。多價噬菌體展示方法，被用于通過與纖維狀噬菌體的基因III或基因VIII的融合來呈不小的隨機妝和小蛋白質(Wells 及 Lowman(Curr.0pin.Struct.Biol.(1992)3，355-362)和其中的引用文獻)。一價噬菌體展示中，蛋白質或肽的文庫與基因III或其一部分融合，噬菌體粒子在野生型基因III蛋白質的存在下以低水平表達，以呈示融合蛋白質的I個或O個拷貝。因為親和力效果比多價噬菌體低，因此篩選是基于內在的配體親和性、使用噬粒載體進行的，該載體使得DNA操作單純化(Lowman和Wells、Methods:A Companion toMethods in Enzymology(1991)3，205-216)。
            
[0265]“噬粒”為具有細菌的復制起點、例如ColEl和噬菌體的基因間區域的拷貝的質粒載體。關于噬粒，還可適當地使用任何公知的噬菌體、例如纖維狀噬菌體以及λ型噬菌體。質粒通常也包含抗生素耐性的選擇標志物。在這些載體中克隆的DNA片斷能夠作為質粒增殖。導入了這些載體的細胞具備噬菌體粒子的生產所必需的全部基因時，質粒的復制模式變化為滾環型(rolling cycle)復制，生成質粒DNA的一條鏈的拷貝與包裝噬菌體粒子。噬粒能夠形成感染性或非感染性噬菌體粒子。該用語包括下述噬粒，所述噬粒包含:以基因融合的方式與該異源多肽的基因結合以使異源多肽在噬菌體粒子的表面呈示的、噬菌體外殼蛋白質基因或其片斷。
            
[0266]用語“噬菌體載體”意指含有異源基因并能夠復制的噬菌體的雙鏈復制型。噬菌體載體具有使得噬菌體能夠復制并且噬菌體粒子能夠形成的噬菌體復制起點。噬菌體優選為纖維狀噬菌體，例如M13、fl、fd、Pf3噬菌體或其衍生物，或λ型噬菌體，例如λ、21、phi80、phi81、82、424、434 等或其衍生物。[0267]“寡核苷酸”為通過公知的方法(例如，利用固相手段、例如EP266032中記載的手段的磷酸三酯、亞磷酸鹽或亞磷酰胺化學法，或Froeshler等人(Nucl.Acids.Res.(1986) 14, 5399-5407)中記載的通過脫氧核苷酸H-膦酸鹽中間體的方法)化學合成的短的單鏈或雙鏈的多聚脫氧核苷酸。其它方法包括下文記載的聚合酶鏈式反應或其它自動引物法以及在固體載體上的寡核苷酸合成。這些方法全部被記載于Engels等(Agnew.Chem.1nt.Ed.Engl.(1989)28,716-734)中。基因的全部核酸序列是公知的話，或者能夠利用與編碼鏈互補的核酸的序列的話，則可使用這些方法。或者，對象氨基酸序列是公知的話，則可使用各氨基酸殘基的公知優選的編碼殘基適當地推測可能的核酸序列。寡核苷酸可通過聚丙烯酰胺凝膠或分子尺寸排除色譜、或通過沉淀法來純化。
            
[0268]用語“融合蛋白質”和“融合多肽”指具有以共價鍵相互鍵合的2個部分的多肽，其為各部分具有不同特性的多肽。該特性可為例如體外或體內活性等生物學性質。此外，該特性可為單一的化學性質或物理性質，例如與對象抗原的結合、反應的催化劑等。該2個部分可通過單一的肽鍵直接鍵合，或經由包含I個或多個氨基酸殘基的肽接頭而鍵合。通常、該2個部分與接頭存在于相同讀碼框中。優選地，多肽的2個部分是從異源或不同的多妝獲得的。
            
[0269]用語“異源DNA”指導入宿主細胞中的任意的DNA。DNA可來自各種各樣的來源，包括基因組DNA、cDNA、合成DNA以及它們的融合或組合。DNA可包括來自與宿主或受體細胞相同的細胞或細胞型的DNA或者來自不同的細胞型、例如哺乳類或植物的DNA。DNA可任選地包括標志物或選擇性 基因,例如抗生素耐性基因、耐熱性基因等。
            
[0270]如本說明書中使用的，用語“非常多樣化的位置”是指:與公知的和/或天然抗體或抗原結合片斷的氨基酸序列進行比較時，在該位置中具有數個不同的氨基酸的輕鏈和重鏈可變區上的氨基酸的位置。非常多樣化的位置一般存在于⑶R區。在一種實施方式中，確定公知的和/或天然抗體的非常多樣化的位置時，Kabat, Sequences of Proteins ofImmunological Interest (National Institute of Health Bethesda Md.) (1987 年和 1991年)提供的數據是有效的。此外，互聯網上的多個數據庫(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http: / / www.bio inf.0rg.uk/abs/index, html)中提供了收集的多種人輕鏈和重鏈的序列及其配置，這些序列及其配置的信息對于確定本發明中非常多樣化的位置是有用的。根據本發明，氨基酸在某個位置上具有優選約2~約20、優選約3~約19、優選約4~18、優選約5~17、優選為6~16、優選約7~15、優選約8~14、優選約9~13、優選約10~12個可能的不同氨基酸殘基的多樣性的情況下，該位置可被稱為非常多樣。在數個實施方式中，某個氨基酸位置上可具有優選至少約2、優選至少約4、優選至少約6、優選至少約8、優選約10、優選約12個可能的不同氨基酸殘基的多樣性。本說明書中，這樣的氨基酸殘基也可被稱為靈活(flexible)殘基。用語“非隨機密碼子組合”指編碼下述氨基酸的密碼子組合，所述氨基酸是部分地或優選完全地滿足本說明書中記載的用于氨基酸選擇的標準而選擇出的氨基酸。此外，如本說明書中使用的，用語“隨機密碼子組合”是指將編碼下述氨基酸的密碼子被組合而得的密碼子組合，所述氨基酸是20個氨基酸(Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/ff> His/H、Tyr/Y、Ile/1、Val/V)中任意的氨基酸。
            
[0271]文座[0272]根據某一實施方式，本發明提供了主要由互相之間序列不同的多個抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中的抗原結合結構域包含至少一個下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化。作為離子濃度的例子可優選舉出金屬離子濃度、氫離子濃度。
            
[0273]本說明書中，“文庫”指多個抗原結合分子或多個包含抗原結合分子的融合多肽，或者編碼這些序列的核酸、多核苷酸。文庫中包含的多個抗原結合分子或多個包含抗原結合分子的融合多肽的序列并非單一的序列，而是互相之間序列不同的抗原結合分子或包含抗原結合分子的融合多肽。 [0274]本說明書中，“金屬離子”指除氫以外的堿金屬以及銅族等的第I族、堿土金屬和鋅族等的第II族、除硼之外的第III族、除碳和硅以外的第IV族、鐵族和鉬族等的第VIII族、屬于V、VI和VII族的各A亞族中的元素、和銻、鉍、針等的金屬元素的離子。金屬原子具有釋放原子價電子成為陽離子的性質，這被稱為離子化傾向。離子化傾向大的金屬被認為富有化學活性。
            
[0275]作為本發明中優選的金屬離子的例子，可舉出鈣離子。鈣離子與對多種生命現象的調節相關，鈣離子參與骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收縮、白細胞的運動和吞噬等的活化、血小板的變形和分泌等的活化、淋巴細胞的活化、組氨酸的分泌等肥大細胞的活化、由兒茶酚胺α受體、乙酰膽堿受體介導的細胞的應答、胞吐作用、從神經元末梢的遞質釋放、神經元的軸突流。作為細胞內的鈣離子受體，已知有具有多個鈣離子結合位點、被認為在分子進化上來自共同起源的肌鈣蛋白C、鈣調蛋白、小清蛋白、肌球蛋白輕鏈等，其結合基序多數也是已知的。例如熟知的有丐粘蛋白結構域、鈣調蛋白中含有的EF-HAND、蛋白激酶C中含有的C2結構域、血液凝固蛋白質因子IX中含有的Gla結構域、無唾液酸糖蛋白受體和甘露糖結合受體中含有的C型凝集素、LDL受體中含有的A結構域、膜聯蛋白、血小板反應蛋白3型結構域和EGF樣結構域。
            
[0276]本發明中，金屬離子為鈣離子的情況下，作為鈣離子濃度的條件，可舉出低鈣離子濃度的條件和高鈣離子濃度的條件。結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化指:抗原結合分子針對抗原的結合活性根據低鈣離子濃度和高鈣離子濃度的條件不同而變化。例如可舉出:較之在低鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言，在高鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性更高的情況。此外，也還可舉出:較之在高鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言，在低鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性更高的情況。
            
[0277]本說明書中，高鈣離子濃度并不被特別限定為某個明確的數值，但優選可為選自100 μ M~IOmM之間的濃度。此外，在一些其它方式中，也可為選自200 μ M~5mM之間的濃度。此外，在不同的實施方式中，還可為選自500 μ M~2.5mM之間的濃度,在另外的實施方式中，還可為選自200μΜ~2mM之間的濃度。此外，還可為選自400 μ M~1.5mM之間的濃度。特別地，可優選舉出選自與生物體內的血漿中(血中)的鈣離子濃度接近的、500 μ M~2.5mM之間的濃度。
            
[0278]本說明書中，低鈣離子濃度并不被特別限定為某個明確的數值，但優選可為選自0.ΙμΜ~30μΜ之間的濃度。此外，在一些其它實施方式中，也可為選自0.2μΜ~20μΜ之間的濃度。此外，在不同的實施方式中，還可為選自0.5μΜ~ΙΟμΜ之間的濃度，在另外的實施方式中，還可為選自I μ M~5 μ M之間的濃度。此外,還可為選自2μΜ~4μΜ之間的濃度。特別地，可優選舉出選自與生物體內的早期核內體內的鈣離子濃度接近的、I μ M~5 μ M之間的濃度。
            
[0279]本發明中，“抗原結合分子在低鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性比在高鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性低”表示:抗原結合分子在選自0.1 μ M~30 μ M之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性比在選自100 μ M~IOmM之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性弱。優選表示:抗原結合分子在0.5 μ M~10 μ M之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性比在選自200 μ M~5mM之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性弱，特別優選表示:在生物體內的早期核內體內的鈣離子濃度下的抗原結合活性比在生物體內的血漿中的鈣離子濃度下的抗原結合活性弱，具體而言，表示:抗原結合分子在選自I μ M~5 μ M之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性比在選自500 μ M~2.5mM之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性弱。
            
[0280]抗原結合分子針對抗原的結合活性是否根據離子濃度的條件而變化可使用公知的測定方法來確定。例如，為了確認到較之在低鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言、在高鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性變高，可以對低鈣離子濃度和高鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性進行比較。[0281 ] 進而，本發明中，“抗原結合分子在低鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性比在高鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性低”這樣的表述也表示:抗原結合分子在高鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性比在低鈣離子濃度條件下的針對抗原的結合活性高。需要說明的是，本發明中，“在低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性比在高鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性低 ”有時也記載為“在低鈣離子濃度條件下的抗原結合能力比在高鈣離子濃度條件下針對抗原的結合能力弱”，此外，“使在低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性與在高鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性相比較低”有時也記載為“使在低鈣離子濃度條件下的抗原結合能力比在高鈣離子濃度條件下針對抗原的結合能力弱”。
            
[0282]測定對抗原的結合活性時除鈣離子濃度以外的條件是本領域技術人員可適當選擇的，沒有特別限定。例如，可在HEPES緩沖液、37°C的條件下進行測定。例如，可使用Biacore (GE Healthcare)等進行測定。關于對抗原結合分子與抗原的結合活性的測定，當抗原為可溶型抗原時，可通過向固定化有抗原結合分子的芯片流動作為待分析物的抗原，來評價對可溶型抗原的結合活性，當抗原為膜型抗原時，可通過向固定化有抗原的芯片流動作為待分析物的抗原結合分子，來評價對膜型抗原的結合活性。
            
[0283]本發明的抗原結合分子中，只要在低鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性比在高鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性弱即可，對低鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性和高鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性之比沒有特別限定，優選針對抗原而言在低鈣離子濃度條件下的KD (Dissociation constant:解離常數)與在高|丐離子濃度條件下的 KD 之比 KD (Ca3 μ M) /KD (Ca2mM)的值為 2 以上，進一步優選 KD (Ca3 μ M) /KD (Ca2mM)的值為 10 以上，進一步優選1?(033 4]\0/1(0(0321111)的值為 40 以上。KD (Ca3 μ M)/KD (Ca2mM)的值的上限沒有特別限定，只要本領域技術人員的技術可制作，則可為400、1000、10000等、或任意值。此外，還可對KD(Ca3 μ M)/KD(Cal.2mM)的值加以特定。即，KD(Ca3 μ M)/KD (Ca1.2mM)的值為2以上，進一步優選KD (Ca3 μ M)/KD (Cal.2mM)的值為10以上，進一步優選KD (Ca3 μ Μ) /KD (Cal.2mM)的值為 40 以上。KD (Ca3 μ Μ) /KD (Cal.2mM)的值的上限沒有特別限定，只要本領域技術人員的技術可制作，則可為400、1000、10000等、或任意值。
            
[0284]作為針對抗原的結合活性的值，在抗原為可溶型抗原的情況下可使用KD(解離常數)，但在抗原為膜型抗原的情況下可使用表觀KD(Apparent dissociation constant:表觀解離常數)。KD (解離常數)以及表觀KD (表觀解離常數)可通過本領域技術人員公知的方法來測定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、Scatchard作圖、或流式細胞儀等。 [0285] 此外，作為表示本發明的抗原結合分子在低鈣濃度條件下針對抗原的結合活性與在高鈣濃度條件下針對抗原的結合活性之比的其它指標，例如還可優選使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant:解離速度常數)。作為表示結合活性之比的指標使用kd (解離速度常數)代替KD (解離常數)的情況下，針對抗原而言低鈣濃度條件下的kd (解離速度常數)與高鈣濃度條件下的kd(解離速度常數)之比、即kd(低鈣濃度條件下)/kd(高鈣濃度條件下)的值優選為2以上，進一步優選為5以上，進一步優選為10以上，更優選為30以上。kd(低鈣濃度條件下)/kd(高鈣濃度條件下)的值的上限沒有特別限定，只要根據本領域技術人員的技術常識可制作，則可為50、100、200等、或任意值。
            
[0286]作為抗原結合活性的值，在抗原為可溶型抗原的情況下可使用kd(解離速度常數)，在抗原為膜型抗原的情況下可使用表觀kd (Apparent dissociation rate constant:表觀解離速度常數)。kd (解離速度常數)和表觀kd (表觀解離速度常數)可使用本領域技術人員公知的方法進行測定，例如可使用Biacore (GE healthcare)、流式細胞儀等。需要說明的是，本發明中，對不同的鈣離子濃度下抗原結合分子針對抗原的結合活性進行測定時，鈣濃度以外的條件優選為相同。
            
[0287]本發明中，質子即氫原子的原子核的濃度的條件與氫指數(pH)的條件被視為相同含義。水溶液中的氫離子的活性量以aH+表示的話，pH則被定義為-logl0aH+。水溶液中的離子強度低(例如低于10_3)時，aH+與氫離子強度基本相等。例如25°C、1個大氣壓下水的尚子積為Kw = aH+a0H = 10，因此對純水而曰，aH+ = a0H = 10。此時pH = 7為中性，PH比7小的水溶液為酸性，pH比7大的水溶液為堿性。
            
[0288]本發明中，作為氫離子濃度的條件使用pH的條件的情況下，作為pH的條件可舉出pH酸性區域的條件和pH中性區域的條件。結合活性根據pH的條件而變化是指:抗原結合分子針對抗原的結合活性根據PH酸性區域和pH中性區域的條件不同而變化。例如可舉出:較之在PH酸性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言，在pH中性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性更高的情況。此外，也還可舉出:較之在pH中性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言，在PH酸性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性更高的情況。
            
[0289]本說明書中，pH中性區域并不被特別限定為某個明確的數值，但優選可選自pH6.7~pH10.0之間。此外，在一些其它實施方式中，可選自pH6.7~pH9.5之間。此外，在不同的實施方式中，還可選自PH7.0~pH9.0之間，在另外的實施方式中，還可選自pH7.0~pH8.0之間。特別地，可優選舉出選自與生物體內的血漿中(血中)的pH接近的ρΗ7.4。
            
[0290]本說明書中，pH酸性區域并不被特別限定為某個明確的數值，但優選可選自pH4.0~pH6.5之間。此外，在一些其它實施方式中，可選自pH4.5~pH6.5之間。此外，在不同的實施方式中，還可選自pH5.0~pH6.5之間，在另外的實施方式中，還可選自pH5.5~PH6.5之間。特別地，可優選舉出選自與生物體內的早期核內體內的pH接近的pH5.8。
            
[0291]本發明中，抗原結合分子在pH酸性區域條件下針對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下針對抗原的結合活性低表示:抗原結合分子在選自pH4.0~pH6.5之間的pH下針對抗原的結合活性比在選自PH6.7~ρΗΙΟ.0之間的pH下針對抗原的結合活性弱。優選表示:抗原結合分子在選自pH4.5~pH6.5之間的pH下針對抗原的結合活性比在選自pH6.7~pH9.5之間的pH下針對抗原的結合活性弱，更優選表示:抗原結合分子在選自pH5.0~pH6.5之間的pH下針對抗原的結合活性比在選自pH7.0~pH9.0之間的pH下針對抗原的結合活性弱。此外，優選表示:抗原結合分子在選自pH5.5~pH6.5之間pH下針對抗原的結合活性比在選自PH7.0~pH8.0之間的pH下針對抗原的結合活性弱。特別優選表示:在生物體內的早期核內體內的pH下的抗原結合活性比在生物體內的血漿中的pH下的抗原結合活性弱，具體而言，抗原結合分子在PH5.8下針對抗原的結合活性比在pH7.4下針對抗原的結合活性弱。
            
[0292]關于抗原結合分子針對抗原的結合活性是否根據pH的條件而變化，可例如通過測定在前述不同的pH的條件下的結合活性的方法來實施。例如，為了確認到較之在pH酸性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言、在PH中性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性變 高，對PH酸性區域和pH中性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性進行比較。
            
[0293]進而，本發明中，“抗原結合分子在pH酸性區域的條件下針對抗原的結合活性比在PH中性區域的條件下針對抗原的結合活性低”這樣的表述也表示:抗原結合分子在pH中性區域的條件下針對抗原的結合活性比在PH酸性區域的條件下的針對抗原的結合活性高。需要說明的是，本發明中，“在PH酸性區域的條件下的抗原結合活性比在pH中性區域的條件下針對抗原的結合活性低”有時也記載為“在PH酸性區域的條件下的抗原結合能力比在PH中性區域的條件下針對抗原的結合能力弱”，此外，“使在pH酸性區域的條件下的抗原結合活性與在PH中性區域的條件下針對抗原的結合活性相比較低”有時也記載為“使在pH酸性區域的條件下的抗原結合能力比在PH中性區域的條件下針對抗原的結合能力弱”。
            
[0294]作為如上文所述使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基的例子，例如，金屬離子為鈣離子的情況下，為形成鈣結合基序的氨基酸即可，其種類不被限定。鈣結合基序是本領域技術人員公知的，其已被詳細記載(例如 Springer 等人(Cell (2000) 102，275-277)、Kawasaki 和 Kretsinger (Protein Prof.(1995)2，305-490)、Moncrief 等人(J.Mol.Evol.(1990) 30，522-562)、Chauvaux 等人(Biochem.J.(1990) 265，261-265)、Bairoch 和 Cox (FEBS Lett.(1990)269,454-456)、Davis(New Biol.(1990)2，410-419)、 Schaefer 等人(Genomics(1995)25，638 ~643)、Economou 等人(ΕΜΒ0 J.(1990)9, 349-354) > Wurzburg 等人(Structure.(2006) 14，6，1049-1058))。gp，ASGPR、CD23、MBR、DC_SIGN 等 C 型凝集素等任意的公知的鈣結合基序包含在本發明的抗原結合分子中。上述之外，作為這樣的鈣結合基序的優選例子，如下文所述，還可舉出具有Vk5-2等生殖細胞系的序列的抗體的輕鏈可變區中存在的Vk5的部分中包含的鈣結合基序。
            
[0295]此外，作為使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基的例子，還可優選使用具有金屬螯合作用的氨基酸。作為具有金屬螯合作用的氨基酸的例子，可優選舉出例如絲氨酸(Ser(S))、蘇氨酸(Thr(T))、天冬酰胺(Asn(N))、谷氨酰胺(Gin (Q))、天冬氨酸(Asp(D))和谷氨酸(Glu(E))等。
            
[0296]所述的包含氨基酸殘基的抗原結合結構域的位置不限定于特定的位置，只要使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化即可，可為形成抗原結合結構域的重鏈可變區或輕鏈可變區中的任何位置。即，本發明的一種實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基被包含在重鏈的抗原結合結構域中。此外，其它一些實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，所述氨基酸殘基被包含在重鏈的CDR3中。另一些實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，所 述氨基酸殘基被包含在重鏈的CDR3的Kabat編號法表示的第95位、96位、IOOa位和/或101位處。
            
[0297]此外，本發明的一種實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基被包含在輕鏈的抗原結合結構域中。此外，其它一些實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDRl中。另一些實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的⑶Rl的Kabat編號法表示的第30位、31位、和/或32位處。
            
[0298]此外，其它一些實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDR2中。另一些實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDR2的Kabat編號法表示的第50位處。
            
[0299]此外，其它一些實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDR3中。另一些實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDR3的Kabat編號法表示的第92位處。
            
[0300]此外，作為本發明的不同實施方式，還提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，所述氨基酸殘基被包含在選自上文所述的輕鏈的⑶R1XDR2和⑶R3中的2個或3個⑶R中。此外，還提供了主要由互相之間序列不同的下述抗原結合分子構成的文庫，所述抗原結合分子中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的以Kabat編號法表示的第30位、31位、32位、50位和/或92位中的任一處以上。
            
[0301]一種特別優選的實施方式中，抗原結合分子的輕鏈和/或重鏈可變區的框架序列優選具有人的生殖細胞系框架序列。因此，本發明的一種實施方式中，如果框架序列完全為人的序列的話，則認為在給予人的情況下(例如對疾病的治療)，本發明的抗原結合分子基本不或完全不引起免疫原性反應。從上述意義來看，本發明的“包含生殖細胞系的序列”表示本發明的框架序列的一部分與任何的人的生殖細胞系框架序列的一部分相同。例如，本發明的抗原結合分子的重鏈FR2的序列為多個不同的人的生殖細胞系框架序列的重鏈FR2序列組合而得的序列的情況下，其仍是本發明的“包含生殖細胞系的序列”的抗原結合分子。
            
[0302]作為框架的例子，可優選舉出例如V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等網站中包含的現在已知的完全人源性的框架區的序列。這些框架區的序列可作為本發明的抗原結合分子中包含的生殖細胞系的序列適當地使用。生殖細胞系的序列可基于其相似性被分類(Tomlinson 等人(J.Mol.Biol.(1992) 227，776-798)、Williams 和 Winter (Eur.J.1mmunol.(1993)23，1456-1461)、以及 Cox 等人(Nat.Genetics (1994) 7，162-168))。可從分類進分為7個亞組的V K 10的亞組中的V λ、分成7個亞組的VH中適當地選擇優選的生殖細胞系的序列。
            
[0303]完全人源性的VH序列不僅限于下述這些，但例如可優選舉出VHl亞組(例如、VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2 亞組(例如、VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3 亞組(VH3-7、VH3-9、VH3-ll、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4 亞組(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5 亞組(VH5-51)、VH6 亞組(VH6-1)、VH7 亞組(VH7-4、VH7-81)的 VH序列等。這些也被記載于公知文獻(Matsuda等人(J.Exp.Med.(1998) 188，1973-1975))等中，本領域技術人員能夠 根據這些序列信息來適當地設計本發明的抗原結合分子。這些以外的完全人源性的框架或準框架區也可優選被使用。
            
[0304]完全人源性的VK序列不僅限于下述這些，但例如可優選舉出分類為Vkl亞組中的 A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、LU、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、02、04、08、012、014、018，分類為 Vk2 亞組中的 Al、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、01、011，分類為Vk3亞組中的A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25，分類為Vk4亞組中的B3、分類為Vk5亞組中的B2(本說明書中還稱為Vk5-2)、分類為Vk6亞組中的A10、A14、A26等(Kawasaki等人(Eur.J.1mmunol.(2001) 31，1017-1028)、Schable 和 Zachau (Biol.Chem.HoppeSeyler (1993) 374, 1001-1022)和 Brensing-Kuppers 等人(Gene (1997) 191，173-181))。
            
[0305]完全人源性的VL序列不僅限于下述這些，但例如可優選舉出分類為VLl亞組中的 V1-2、V1-3、V1-4、V1_5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22，分類為 VL2 亞組中的 V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19,分類 VL3 亞組中的 V3-2、V3-3、V3-4，分類為 VL4 亞組中的 V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6,分類為 VL5 亞組中的 V5-1、V5-2、V5-4、V5-6 等(Kawasaki 等人(Genome Res.(1997)7，250-261))。
            
[0306]通常，這些框架序列因一個或更多個的氨基酸殘基的不同而互相不同。這些框架序列可與“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”共同使用。作為與本發明的“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”共同使用的完全人源性的框架的例子，不僅限于這些，除此之外還可舉出 K0L、NEWM、RE1、EU、TUR、TE1、LAY、P0M 等(例如，Kabat 等人(1991)和 Wu 等人(J.Exp.Med.(1970) 132,211-250))。
            
[0307]雖然本發明不受特定理論束縛，但對使用生殖細胞系的序列排除幾乎所有對個人有害的免疫反應有所期待的理由之一如下文所考慮的那樣。作為通常的免疫反應中產生的親和性成熟步驟的結果，免疫球蛋白的可變區中頻繁發生體細胞的突變。雖然這些突變主要在序列為高度可變的CDR的周邊產生，但是也會影響到框架區的殘基。通常也認為這些框架的突變不存在于生殖細胞系的基因中、另外其導致患者免疫原性的可能性低。另一方面，通常的人群暴露給生殖細胞系的基因表達的框架序列中的大多數，因此預想:作為免疫耐性的結果，這些生殖細胞系的框架在患者中免疫原性低或者為非免疫原性的。為了使得免疫耐性的可能性最大，對可變區編碼化的基因可選自通常存在的功能性的生殖細胞系基因簇。
            
[0308]為了制作本發明的“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”包含在所述框架序列中的抗原結合分子，可合適地采用位點特異性誘變法(Kunkel 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985) 82，488-492))、重疊.延伸PCR等公知的方法。
            
[0309]例如，通過將作為預先包含“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸 殘基”的框架序列而選擇的輕鏈可變區以及作為隨機化可變區序列文庫制作的重鏈可變區組合起來，可制作本發明的包含多個互相之間序列不同的抗原結合分子的文庫。作為這樣的非限定性的例子，離子濃度為鈣離子濃度的情況下，例如，可優選舉出將序列號l(Vk5-2)中記載的輕鏈可變區序列與作為隨機化可變區序列文庫而制作的重鏈可變區組合而得的文庫。作為包含在具有上述Vk5-2等生殖細胞系序列的抗體輕鏈可變區中存在的Vk5結構域的輕鏈可變區序列的優選例，除了序列號I (Vk5-2)中記載的輕鏈可變區序列以外，還可合適地使用下文所述的序列號2表示的Vk5-2變體I或序列號3表示的Vk5-2變體2等。這些分子中包含的含有“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的Vk5-2的部分，可作為本發明的包含鈣結合基序的結構域使用。本發明的一種非限定性的實施方式中，形成鈣結合基序的至少一個氨基酸可作為本發明的“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”而使用。
            
[0310]此外，所述作為預先包含“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的框架序列而選擇的輕鏈可變區的序列中，還可涉及為含有多樣的氨基酸作為該氨基酸殘基以外的殘基。本發明中，這樣的殘基被稱為靈活殘基。只要本發明的抗原結合分子的針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化即可，對該靈活殘基的數量和位置沒有特定的方式上的限定。即，重鏈和/或輕鏈的CDR序列和/或FR序列中可包含一個或多個靈活殘基。例如，離子濃度為鈣離子的濃度的情況下，作為向序列號l(Vk5-2)記載的輕鏈可變區序列中導入的靈活殘基的非限定性的例子，可舉出表13、表14、表17或表18記載的氨基酸殘基。
            
[0311]此外，也可將導入了所述“使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的輕鏈可變區和作為隨機化可變區序列文庫制作的重鏈可變區組合起來，由此制作本發明的包含互相之間序列不同的多個抗原結合分子的文庫。作為這樣的非限定性的例子，離子濃度為鈣離子濃度的情況下，優選可舉出例如序列號6 (Vkl)、序列號7 (Vk2)、序列號8 (Vk3)、序列號9 (Vk4)等的生殖細胞系的特定的殘基被“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”取代而得的輕鏈可變區序列與作為隨機化可變區序列文庫制作的重鏈可變區組合而得的文庫。作為該氨基酸殘基的非限定性例子，可例示輕鏈的CDRl中含有的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基的非限定性例子，還可例示輕鏈的CDR2中含有的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基的非限定性的其它例子，還可例示輕鏈的CDR3中含有的氨基酸殘基。
            
[0312] 如前文所述，作為該氨基酸殘基為包含在輕鏈的CDRl中的氨基酸殘基的非限定性例子，可舉出輕鏈可變區的CDRl中以Kabat編號法表示的第30位、31位和/或32位的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基為包含在輕鏈的CDR2中的氨基酸殘基的非限定性例子，可舉出輕鏈可變區的CDR2中以Kabat編號法表示的第50位的氨基酸殘基。進而，作為該氨基酸殘基為包含在輕鏈的CDR2中的氨基酸殘基的非限定性例子，可舉出輕鏈可變區的⑶R3中的以Kabat編號法表示的第92位的氨基酸殘基。此外,這些氨基酸殘基只要能形成鈣結合基序、和/或、抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化即可，這些氨基酸殘基可被單獨含有，或者這些氨基酸可兩個以上組合而被含有。此外，具有多個鈣離子結合位點、被認為在分子進化上來自共同起源的肌鈣蛋白C、鈣調蛋白、小清蛋白、肌球蛋白輕鏈等是已知的，因此也可以以包含其結合基序的方式設計輕鏈CDR1、CDR2和/或CDR3。例如，為了上述目的，可適當地使用鈣粘蛋白結構域、鈣調蛋白中含有的EF-HAND、蛋白激酶C中含有的C2結構域、血液凝固蛋白質因子IX中含有的Gla結構域、無唾液酸糖蛋白受體和甘露糖結合受體中含有的C型凝集素、LDL受體中含有的A結構域、膜聯蛋白、血小板反應蛋白3型結構域和EGF樣結構域。
            
[0313]在將導入了前述“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的輕鏈可變區序列與作為隨機化可變區序列文庫制作的重鏈可變區組合的情況下，與前述相同，也可設計為使靈活殘基被包含在該輕鏈可變區的序列中。本發明的抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化即可，對該靈活殘基的數量和位置沒有特定的方式上的限定。即，重鏈和/或輕鏈的CDR序列和/或FR序列中可包含一個或多個靈活殘基。例如，離子濃度為鈣離子的濃度的情況下，作為向輕鏈可變區序列中導入的靈活殘基的非限定性的例子，可舉出表13、表14、表17或表18記載的氣基酸殘基。
            
[0314]作為被組合的重鏈可變區的例子，可優選舉出隨機化可變區文庫。關于隨機化可變區文庫的制作方法，可適當地組合公知的方法。本發明的一種非限定性的實施方式中，基于下述抗體基因構建的免疫文庫，可優選地作為隨機化可變區文庫而使用，所述抗體基因來自經特定抗原免疫的動物、感染癥的患者和經疫苗接種從而血中抗體價數上升的人、癌患者、自身免疫性疾病患者的淋巴細胞。
            
[0315]此外，本發明的一種非限定性的實施方式中，基因組DNA中的V基因和改型的功能性V基因的CDR序列被包含編碼適當長的密碼子組合的合成寡核苷酸組合取代而得的合成文庫也可作為隨機化可變區文庫而優選地使用。該情況下，因為觀察到重鏈的CDR3的基因序列的多樣性，因此還可僅取代CDR3的序列。抗原結合分子的可變區中氨基酸的多樣性的產生基于使暴露于抗原結合分子表面的位置的氨基酸殘基具有多樣性。暴露于表面的位置是指:被判斷為基于抗原結合分子的結構、結構的集合和/或模型化的結構從而可能暴露于表面、和/或可能與抗原接觸的位置，一般而言是其⑶R。優選地，可使用InsightII程序(Accelrys)這樣的計算機程序，使用來自抗原結合分子的三維模型的坐標來確定暴露于表面的位置。暴露于表面的位置可使用本【技術領域】中公知的算法(例如、Lee和Richards (J.Mol.Biol.(1971) 55, 379-400) ,Connolly (J.Appl.Cryst.(1983) 16, 548-558))來確定。暴露于表面的位置的確定可使用適合蛋白質建模的軟件以及從抗體得到的三維結構信息來進行。作為能用于這樣的目的的軟件，可優選舉出SYBYL生物體高分子模塊軟件(TriposAssociates)。一般而言，優選在算法需要用戶輸入尺寸參數的情況下，計算中使用的探針(proble)的“尺寸(size) ”被設定為半徑約L 4埃以下。進而，Pacios (Comput.Chem.(1994) 18 (4) ,377-386 和 J.Mol.Model.(1995) 1,46-53)中記載了使用個人電腦用的軟件來確定暴露于表面的區域及面積的確定方法。
            
[0316]進而，在本發明的非限定性的一種實施方式中，由來自健康人的淋巴細胞的抗體基因構建的、由在其所有組成成分(repertoire)中不含偏差的抗體序列即天然序列(Naive序列)構成的天然文庫(Naive文庫)，也特別優選地作為隨機化可變區文庫使用(Gejima等人(Human Antibodies (2002) 11, 121-129)、和 Cardoso 等人(Scand.J.1mmunol.(2000)51, 337-344))。包含本發明中記載的天然序列的氨基酸序列是指:可從這樣的天然文庫獲得的氨基酸序列。
            
[0317]本發明的一種實施方式中，將作為預先包含“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的框架序列而選擇的重鏈可變區、與作為隨機化可變區序列文庫而制作的輕鏈可變區組合，由此制作本發明的包含多個互相之間序列不同的抗原結合分子的文庫。作為這樣的非限定性的例子，離子濃度為鈣離子濃度的情況下，例如可優選舉出將序列號10(6RL#9H-1gGl)或序列號ll(6KC4-l#85H-1gGl)記載的重鏈可變區序列和作為隨機化可變區序列文庫制作的輕鏈可變區組合而得的文庫。此外，代替作為隨機化可變區序列文庫而制作的輕鏈可變區，可通過從具有生殖細胞系的序 列的輕鏈可變區中適當選擇來制作文庫。例如，可優選舉出序列號10(6RL#9H-1gGl)或序列號11 (6KC4-l#85H_IgGl)記載的重鏈可變區序列和具有生殖細胞系的序列的輕鏈可變區組合而得的文庫。
            
[0318]此外，上述的作為預先包含“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的框架序列而選擇的重鏈可變區的序列中，還可設計為含有靈活殘基。只要本發明的抗原結合分子的針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化即可，對該靈活殘基的數量和位置不限于特定方式。即，重鏈和/或輕鏈的CDR序列和/或FR序列中可包含一個或多個靈活殘基。例如，離子濃度為鈣離子的濃度的情況下，作為向序列號10(6RL#9H-1gGl)記載的重鏈可變區序列中導入的靈活殘基的非限定性的例子，除重鏈⑶Rl和⑶R2的全部氨基酸殘基之外還可舉出重鏈⑶R3中除了第95位、96位和/或IOOa位以外的CDR3的氨基酸殘基。此外，作為向序列號11 (6KC4-l#85H_IgGl)記載的重鏈可變區序列中導入的靈活殘基的非限定性的例子，除重鏈CDRl和CDR2的全部氨基酸殘基之外還可舉出重鏈CDR3中除了第95位和/或101位以外的CDR3的氨基酸殘基。
            
[0319]此外，也可將上述的導入了“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的重鏈可變區和作為隨機化可變區序列文庫制作的輕鏈可變區或具有生殖細胞系的序列的輕鏈可變區組合起來，由此制作本發明的包含互相之間序列不同的多個抗原結合分子的文庫。作為這樣的非限定性的例子，離子濃度為鈣離子濃度的情況下，例如，可優選舉出下述文庫，即，重鏈可變區的特定的殘基被“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”取代的重鏈可變區序列與作為隨機化可變區序列文庫而制作的輕鏈可變區或具有生殖細胞系的序列的輕鏈可變區組合而得的文庫。作為該氨基酸殘基的非限定性例子，可例示重鏈的CDRl中含有的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基的非限定性例子，還可例示重鏈的CDR2中含有的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基的非限定性的其它例子，還可例示重鏈的CDR3中含有的氨基酸殘基。作為該氨基酸殘基為包含在重鏈的CDR3中的氨基酸殘基的非限定性例子，可舉出重鏈可變區的⑶R3中以Kabat編號法表示的第95位、96位、IOOa位和/或101位的氨基酸殘基。此外，這些氨基酸殘基只要能形成鈣結合基序、和/或、抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化即可，這些氨基酸殘基可被單獨含有，或者這些氨基酸可兩個以上組合而被含有。
            
[0320]將上述的導入了“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的重鏈可變區和作為隨機化可變區序列文庫制作的輕鏈可變區或具有生殖細胞系的序列的輕鏈可變區組合的情況下，與前述相同，也可設計為在該重鏈可變區的序列中含有靈活殘基。只要本發明的抗原結合分子的針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化即可，對該靈活殘基的數量和位置沒有特定方式上的限定。即，重鏈和/或輕鏈的CDR序列和/或FR序列中可包含一個或多個靈活殘基。此外，作為“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基”以外的重鏈可變區的CDRl、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列，還可優選使用隨機化可變區文庫。使用生殖細胞系的序列作為輕鏈可變區的情況下，作為非限定性的例子，可舉出序列號6 (Vkl)、序列號7 (Vk2)、序列號8 (Vk3)、序列號9 (Vk4)等的生殖細胞系的序列。 
            
[0321]作為上述的使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基，只要能形成鈣結合基序即可，可優選使用任何的氨基酸殘基，作為這樣的氨基酸殘基，具體可舉出具有電子供給性的氨基酸。作為這樣具有電子供給性的氨基酸，可優選例示絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。
            
[0322]作為本發明的一種實施方式，還可通過將導入了“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的輕鏈可變區與作為隨機化可變區序列文庫而制作的重鏈可變區組合起來，來制作本發明的包含互相之間序列不同的多個抗原結合分子的文庫。
            
[0323]作為該氨基酸殘基的非限定性例子，可例示輕鏈的CDRl中包含的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基的非限定性例子，可例示輕鏈的CDR2中包含的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基的非限定性的其它例子，還可例示輕鏈的CDR3中包含的氨基酸殘基。
            
[0324]如前文所述，作為該氨基酸殘基為輕鏈的CDRl中包含的氨基酸殘基的非限定性例子，可舉出輕鏈可變區的⑶Rl中以Kabat編號法表示的第24位、27位、28位、30位、31位、32位和/或34位的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基為輕鏈的CDR2中包含的氨基酸殘基的非限定性例子，可舉出輕鏈可變區的CDR2中以Kabat編號法表示的第50位、51位、52位、53位、54位、55位和/或56位的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基為輕鏈的CDR3中包含的氨基酸殘基的非限定性例子，可舉出輕鏈可變區的CDR3中以Kabat編號法表示的第89位、90位、91位、92位、93位、94和/或95a位的氨基酸殘基。此外,這些氨基酸殘基只要能使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化即可，這些氨基酸殘基可被單獨含有，或者這些氨基酸可兩個以上組合而被含有。
            
[0325]將上述的導入了“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的輕鏈可變區和作為隨機化可變區序列文庫制作的重鏈可變區組合的情況下，與前述相同，也可設計為在該輕鏈可變區的序列中含有靈活殘基。只要本發明的抗原結合分子的針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化即可，對該靈活殘基的數量和位置不限于特定方式。即，重鏈和/或輕鏈的CDR序列和/或FR序列中可包含一個或多個靈活殘基。例如，作為向輕鏈可變區序列中導入的靈活殘基的非限定性例例子，可舉出表4或表5中記載的氨基酸殘基。此外，作為使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基、或靈活殘基以外的輕鏈可變區的氨基酸序列，作為非限定性的例子，可優選使用Vkl (序列號6)、Vk2 (序列號7)、Vk3 (序列號8)、Vk4(序列號9)等的生殖細胞系的序列。
            
[0326]作為被組合的重鏈可變區的例子，可優選舉出隨機化可變區文庫。關于隨機化可變區文庫的制作方法，可適當地組合公知的方法。本發明的一種非限定性的實施方式中，基于下述抗體基因構建的免疫文庫，可優選地作為隨機化可變區文庫而使用，所述抗體基因來自經特定抗原免疫的動物、感染癥的患者和經疫苗接種從而血中抗體價數上升的人、癌患者、自身免疫性疾病患者的淋巴細胞。 [0327]此外，本發明的非限定性的一種實施方式中，與前述相同，基因組DNA中的V基因和改型的功能性V基因的CDR序列被合成寡核苷酸組合(包含編碼適當長的密碼子組合的序列)取代而得的合成文庫，也可作為隨機化可變區文庫而優選地使用。
            
[0328]此外，本發明的非限定性的一種實施方式中，由來自健康人的淋巴細胞的抗體基因構建、由在其所有組成成分中不含偏差的抗體序列即天然序列構成的天然文庫，也可作為隨機化可變區文庫特別優選地使用(Gejima等人(Human Antibodies(2002) 11，121-129)、和 Cardoso 等人(Scand.J.1mmunol.(2000)51，337-344))。
            
[0329]作為本發明的其他方案，通過將上述的導入了 “使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的重鏈可變區和作為隨機化可變區序列文庫制作的輕鏈可變區或具有生殖細胞系的序列的輕鏈可變區組合起來，來制作本發明的包含互相之間序列不同的多個抗原結合分子的文庫。作為這樣的非限定性的例子，可優選舉出重鏈可變區的特定的殘基被“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”取代的重鏈可變區序列與作為隨機化可變區序列文庫而制作的輕鏈可變區或具有生殖細胞系的序列的輕鏈可變區組合而得的文庫。作為該氨基酸殘基的非限定性例子，可例示重鏈的CDRl中含有的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基的非限定性例子，還可例示重鏈的CDR2中含有的氨基酸殘基。此外，作為該氨基酸殘基的非限定性的其它例子，還可例示重鏈的CDR3中含有的氨基酸殘基。
            
[0330]作為該氨基酸殘基為包含在重鏈的CDRl中的氨基酸殘基的非限定性例子，可舉出重鏈可變區的⑶Rl中以Kabat編號法表示的第27位、31位、32位、33位和/或35位的氨基酸殘基。作為該氨基酸殘基為包含在重鏈的CDR2中的氨基酸殘基的非限定性例子，可舉出重鏈可變區的⑶R2中以Kabat編號法表示的第50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位和/或62位的氨基酸殘基。作為包含在重鏈的CDR3中的氨基酸殘基的非限定性例子，可舉出重鏈可變區的⑶R3中以Kabat編號法表示的第95位、96位、97位、98位、
            
99位、IOOa位、IOOb位、IOOd位、IOOf位、IOOh位、102位和/或107位的氨基酸殘基。此外，這些氨基酸殘基只要能使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化即可，這些氨基酸殘基可被單獨含有，或者這些氨基酸可兩個以上組合而被含有。
            
[0331]將上述的導入了“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的重鏈可變區和作為隨機化可變區序列文庫制作的輕鏈可變區或具有生殖細胞系的序列的輕鏈可變區組合的情況下，與前述相同，也可設計為在該重鏈可變區的序列中含有靈活殘基。只要本發明的抗原結合分子的針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化即可，對該靈活殘基的數量和位置沒有特定方式上的限定。即，重鏈和/或輕鏈的CDR序列和/或FR序列中可包含一個或多個靈活殘基。此外，作為“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基”以外的重鏈可變區的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列，還可優選地使用隨機化可變區文庫。作為輕鏈可變區使用生殖細胞系的序列的情況下，作為限定性的例子，可舉出序列號6(Vkl)、序列號7 (Vk2)、序列號8 (Vk3)、序列號9 (Vk4)等的生殖細胞系的序列。
            
[0332]作為上述的使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據氫離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基，可合適地使用任何氨基酸殘基，作為這樣的氨基酸殘基，具體可舉出側鏈的pKa為4.0-8.0的氨基酸。作為這樣具有電子供給性的氨基酸，除組氨酸或谷氨酸等天然的氨基酸以外，還可優選例示組氨酸類似物(US20090035836)或m-N02_Tyr (pKa7.45)、3, 5-Br2~Tyr (pKa7.21)或 3，5-12-Tyr (pKa7.38)等的非天然的氨基酸(Bioorg.Med.Chem.(2003) 11 (17)，3761-2768)。此外，作為該氨基酸殘基的特別優選的例子，可舉出側鏈的pKa為5.5-7.0的氨基酸。作 為這樣的具有電子供給性的氨基酸，可優選例示組氨酸。
            
[0333]為了修飾抗原結合結構域的氨基酸，可適當地采用位點特異性誘變法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985)82，488-492))、重疊.延伸 PCR 等公知的方法。此外，作為取代為天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸修飾方法，也可采用多種公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006) 35，225-249、Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(2003) 100(11)，6353-6357)。例如，還可優選地使用無細胞翻譯系統(CloverDirect (Protein Express))等,所述無細胞翻譯系統中，包含在作為終止密碼子之一的UAG密碼子(琥珀密碼子)的互補琥珀抑制基因tRNA上結合了非天然氨基酸的tRNA。
            
[0334]作為被組合的輕鏈可變區的例子，可優選舉出隨機化可變區文庫。關于隨機化可變區文庫的制作方法，可適當地組合公知的方法。本發明的一種非限定性的實施方式中，基于下述抗體基因構建的免疫文庫，可優選地作為隨機化可變區文庫而使用，所述抗體基因來自經特定抗原免疫的動物、感染癥的患者和經疫苗接種從而血中抗體價數上升的人、癌患者、自身免疫性疾病患者的淋巴細胞。
            
[0335]此外，本發明的一種非限定性的實施方式中，基因組DNA中的V基因和改型的功能性V基因的CDR序列被合成寡核苷酸組合(包含編碼適當長的密碼子組合的序列)取代而得的合成文庫，也可作為隨機化可變區文庫而優選地使用。該情況下，觀察到重鏈的CDR3的基因序列的多樣性，因此還可僅取代CDR3的序列。抗原結合分子的可變區中產生氨基酸多樣性的基準在于，使暴露于抗原結合分子表面的位置的氨基酸殘基具有多樣性。暴露于表面的位置是指:被判斷為基于抗原結合分子的結構、結構的集合和/或模型化的結構從而可能暴露于表面、和/或可能與抗原接觸的位置，一般而言是其CDR。優選地，可使用InsightII程序(Accelrys)這樣的計算機程序,使用來自抗原結合分子的三維模型的坐標來確定暴露于表面的位置。暴露于表面的位置可使用本【技術領域】中公知的算法(例如、Lee 和 Richards (J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly (J.Appl.Cryst.(1983) 16，548-558))來確定。暴露于表面的位置的確定可使用適合蛋白質建模的軟件以及從抗體得到的三維結構信息來進行。作為能用于這樣的目的的軟件，可優選舉出SYBYL生物體高分子模塊軟件(Tripos Associates)。一般而言，優選在算法需要用戶輸入尺寸參數的情況下，計算中使用的探針(proble)的“尺寸(size)”被設定為半徑約1.4埃以下。進而，Pacios (Comput.Chem.(1994) 18 (4)，377-386 和 J.Mol.Model.(1995) I, 46-53)中記載了使用個人電腦用的軟件來確定暴露于表面的區域及面積的確定方法。
            
[0336] 此外，本發明的非限定性的一種實施方式中，由來自健康人的淋巴細胞的抗體基因構建、由其所有組成成分中不含偏差的抗體序列即天然序列構成的天然文庫，也可作為隨機化可變區文庫特別優選地使用(Gejima等人(Human Antibodies (2002) 11，121-129)、和 Cardoso 等人(Scand.J.1mmunol.(2000)51，337-344))。
            
[0337]作為使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基以外的氨基酸，只要本發明的抗原結合分子與抗原結合，則可使用任意的氨基酸，作為優選的例子，可適當地適用J.D.Marks等人(J.Mol.Biol.(1991)222, 581-597)等的公知的抗體噬菌體展示文庫技術。即，作為使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的氨基酸殘基以外的氨基酸，可被采用于上述抗體噬菌體文庫中。
            
[0338]本發明中的、在互相之間序列不同的多個抗原結合分子這樣的記載中的“互相之間序列不同”的用語，表示文庫中各抗原結合分子的序列相互之間不同。即，文庫中互相之間不同的序列的數量反映了文庫中的序列不同的獨立克隆的數量，有時也被稱為“文庫大小”。通常的噬菌體展示文庫為IO6至1012，通過適用脂質體展示法等公知的技術，可將文庫大小擴大至1014。但是，在噬菌體文庫的淘選選擇時使用的噬菌體粒子的實際數量通常是文庫大小的10至10，000倍大。該過量倍數也被稱為“文庫當量數”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆可以10至10，000的數量存在。因此，本發明中的“互相之間序列不同”的用語表示:排除文庫當量數后的文庫中各抗原結合分子的序列相互之間不同、更具體而言互相之間序列不同的抗原結合分子為IO6至IO14個分子、優選IO7至IO12個分子、進一步優選IO8至IO11個分子、特別優選IO8至101°個分子。
            
[0339]此外，本發明中的、主要由多個抗原結合分子構成的文庫這樣的記載中的“多個”的用語表示:例如，就本發明的抗原結合分子、融合多肽、多核苷酸分子、載體或病毒而言，通常該物質的2個以上的種類的集合。例如，某2個以上的物質在與特定的性狀相關的方面互相之間不同的話，則表示該物質以2種以上存在。作為例子，可舉出在氨基酸序列中的特定氨基酸位置觀察到的變體氨基酸。例如，除了靈活殘基以外、或者除了暴露于表面的非常多樣化的氨基酸位置的特定的變體氨基酸以外，存在實質上相同、優選為同一序列的本發明的2條以上的抗原結合分子的情況下，本發明的抗原結合分子以多個存在。其它實施例中，除了編碼靈活殘基的堿基、或者除了編碼暴露于表面的非常多樣化的氨基酸位置的特定的變體氨基酸以外，存在實質上相同、優選為同一序列的本發明的2條以上的多核苷酸分子的情況下，本發明的多核苷酸分子以多個存在。[0340]此外，本發明中的、主要由多個抗原結合分子構成的文庫這樣的記載中的“主要由……構成”的用語反映了文庫中的序列不同的獨立克隆的數量中、抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而不同的抗原結合分子的數量。具體而言，優選地，顯示這樣的結合活性的抗原結合分子在文庫中以至少IO4個分子存在。進而，更優選地，本發明提供了顯示這樣的結合活性的抗原結合分子以至少IO5個分子存在的文庫。進一步優選地，本發明提供了顯示這樣的結合活性的抗原結合分子以至少IO6個分子存在的文庫。特別優選地，本發明提供了顯示這樣的結合活性的抗原結合分子以至少IO7個分子存在的文庫。此外，優選地，本發明提供了顯示這樣的結合活性的抗原結合分子以至少IO8個分子存在的文庫。換句話說，其還可適當地表達為:文庫中的序列不同的獨立克隆的數量中，抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而不同的抗原結合分子的比例。具體而言，本發明提供了下述文庫，其中，這樣的結合活性的抗原結合分子以文庫中的序列不同的獨立克隆的數量的0.1 %~80%、優選0.5%~60%、更優選I %~40%、進一步優選2%~20%、特別優選4%~10%被包含。為融合多肽、多核苷酸分子或載體的情況下，與上述同樣，可以以分子的數量、分子在全體中比例來表示。此外，病毒的情況也與上述同樣，可以以病毒個體的數量、個體在全體中的比例來表示。
            
[0341]包含抗原結合分子的融合多肽
            
[0342]本發明的一種實施方式中，可制作本發明的抗原結合分子和異源多肽的融合分子。某實施方式中，融合多肽可以是與病毒外殼蛋白質例如選自pill、pVII1、pVI1、pix、Soc、Hoc、gpD、pVI及其變體構成的組的病毒外殼蛋白質的至少一部分融合而得的。
            
[0343]某實施方式中，本發明的抗原結合分子可以是ScFv、Fab片斷、F (ab) 2或F (ab’)2,在另一實施方式中，提供了主要由互相之間序列不同的多個融合分子構成的文庫，所述融合分子為這些抗原結 合分子和異源多肽的融合分子。具體而言，提供了主要由互相之間序列不同的多個融合分子構成的文庫，所述融合分子為這些抗原結合分子和病毒外殼蛋白質例如選自pII1、pVII1、pVI1、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI及其變體構成的組的病毒外殼蛋白質的至少一部分融合而得的融合蛋白質。本發明的抗原結合分子還可含有二聚體化結構域。某種實施方式中，所述二聚體化結構域可存在于抗體的重鏈或輕鏈的可變區與病毒外殼蛋白質的至少一部分之間。該二聚體化結構域中可包含二聚體化序列中的至少之一、和/或包含一個或多個半胱氨酸殘基的序列。該二聚體化結構域優選可與重鏈可變區或恒定區的C末端連接。關于二聚體化結構域，基于所述抗體可變區是否作為與病毒的外殼蛋白質成分的融合蛋白質成分而被制作(二聚體化結構域之后沒有琥珀終止密碼子)、或者基于所述抗體可變區是否主要是以不含病毒外殼蛋白質成分的方式而被制作的(例如、二聚體化結構域之后具有琥珀終止密碼子)，其可以為各種各樣的結構。所述抗體可變區主要作為與病毒的外殼蛋白質成分的融合蛋白質而被制作時，二價展示是通過I個或多個二硫鍵和/或單一的二聚體化序列而獲得的。本發明的抗原結合分子主要是以不與病毒的外殼蛋白質成分融合的方式制作的抗體可變區(例如具有琥珀終止密碼子)的情況下，優選具有包含半胱氨酸殘基和二聚體化序列二者的二聚體化結構域。某種實施方式中，F (ab) 2的重鏈為通過不含鉸鏈區的二聚體化結構域二聚體化而成的。該二聚體化結構域中可包含例如公知的GCN4 序列:GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG(序列號 12)等的亮氨酸拉鏈序列。
            
[0344]編碼抗原結合分子的多核苷酸[0345]用于制作編碼抗原結合分子的多核苷酸的寡核苷酸或引物的組合可使用標準的方法來合成。例如，包含含有通過密碼子組合可提供的核苷酸三聯體的全部可能組合、編碼期望的氨基酸群體的序列的一組寡核苷酸可通過固相法來合成。因此，具有特定的密碼子組合的合成寡核苷酸組合通常包含不同序列的多個寡核苷酸，該不同是由于整條序列中的密碼子組合而導致的。對于具有在某個位置上選擇的“簡并”核苷酸的寡核苷酸來說，其合成是本【技術領域】公知的。具有這樣的某種密碼子組合的核苷酸的組合可使用市售的核酸合成儀(Applied Biosystems)來合成,或者可購買其市售品(例如Life Technologies)。如在本發明中所使用的那樣，寡核苷酸可具有可能與可變結構域核酸模板雜交的序列，并且包含對克隆有用的限制性酶位點。
            
[0346]文庫可通過使用上游和下游的寡核苷酸組合來產生。各寡核苷酸組合具有多個寡核苷酸，所述多個寡核苷酸具有由寡核苷酸序列內提供的密碼子組合確立的不同序列。上游和下游的寡核苷酸組合可與可變區模板核酸序列一起用于制作PCR產物的“文庫”。可使用已建立的分子生物學手段，將PCR產物與其它相關或無關的核酸序列、例如編碼病毒外殼蛋白質的構成成分以及二聚體化結構域的核酸序列融合，因此這樣的寡核苷酸組合有時也被稱為“核酸盒(cassette) ”。
            
[0347]PCR引物序列包含針對暴露于抗原結合分子的表面、非常多樣化的靈活殘基而設計的一種或復數種密碼子組合。如前文所述，密碼子組合為用于編碼期望的變體氨基酸的一組不同的核苷酸三聯體序列。此外，寡核苷酸組合的序列的長度是足夠長到能雜交至模板核酸的長度，此外，雖然并非必需，但其可包含限制性位點。DNA模板是通過來自噬菌體M13載體的載體、或Viera等人(Meth.Enzymol.(1987) 153, 3)記載的包含單鏈噬菌體的復制起點的載體生成的。這樣，待突變的DNA被插入到這些載體中之一，以生成單鏈模板。單鏈模板的生產被記載S ambrook等教科書中。
            
[0348]此外，本發明的非限定性的一種實施方式中記載的、將選擇的氨基酸導入抗原結合分子中的方法是本【技術領域】中已經建立的，其中一些被描述于本說明書中。例如，可使用Kunkel 等人(Methods Enzymol.(1987) 154, 367-382)提供的 Kunkel 方法,通過暴露于至少一個抗原結合分子的表面、和/或導入“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”或非常多樣化的靈活殘基，來制作文庫。例如，在通過將導入了本發明的“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的輕鏈可變區與作為隨機化可變區序列文庫而制作的重鏈可變區組合起來、來制作本發明的包含互相之間序列不同的多個抗原結合分子的文庫的情況下，可合適地采用這樣的方法。作為這樣的非限定性例子，在金屬離子為鈣離子的情況下，例如，可舉例為:制作序列號6 (Vkl)、序列號7 (Vk2)、序列號8 (Vk3)、序列號9 (Vk4)等的生殖細胞系的特定的殘基被“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”取代的輕鏈可變區序列，這樣的輕鏈可變區的制作中可采用這樣的方法。
            
[0349]該情況下，作為用于制作核酸盒的模板，可使用可變區的核酸模板(template)序列，作為PCR反應的引物，可使用寡核苷酸組合。可變區的模板序列，也可優選使用包含對象核酸序列(即，編碼作為取代的對象的氨基酸的核酸序列)的免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的任何部分。就前述的例子而言，序列號6 (Vkl)、序列號7 (Vk2)、序列號8 (Vk3)、序列號9 (Vk4)等的生殖細胞系的可變區可作為模板序列使用。可變區的模板序列包含至少一部分可變區、此外包含至少一個CDR。根據情況，可變區的模板序列包含多個CDR。可變區的模板序列的上游部分和下游部分可成為上游區域的寡核苷酸組合和下游區域的寡核苷酸組合的構成成員的雜交對象。上游的引物組合的第I寡核苷酸能與第I核酸鏈雜交，下游的引物組合的第2寡核苷酸能與第2核酸鏈雜交。寡核苷酸引物包含I個或多個的密碼子組合，其可被設計為與可變區的模板序列的一部分雜交。通過使用這些寡核苷酸，可在PCR之后將2個以上的密碼子組合導入PCR產物(即核酸盒)中。編碼抗體可變區的核酸序列的區域中雜交的寡核苷酸引物可包含編碼作為氨基酸取代的對象的CDR殘基的部分。
            
[0350]此外，作為本發明的非限定性的一種實施方式中記載的、將選擇的氨基酸導入抗原結合分子的方法，如本說明書中所記載的那樣，還可合適地采用重疊.延伸PCR法(W01993003151)。可通過暴露于至少一個抗原結合分子的表面、和/或導入“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”或非常多樣化的靈活殘基，來制作文庫。用于重疊.延伸PCR法中的上游區域和下游區域的寡核苷酸組合中，除了包含“使抗 原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”或非常多樣化的靈活殘基之外，還可包含用以雜交至可變區的模板序列的足夠長的框架序列。
            
[0351]例如，為了制作作為本發明的非限定性的一種實施方式記載的、編碼導入了 “使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”的輕鏈可變區的多核苷酸分子，制作編碼所述氨基酸殘基的密碼子組合以及附加的靈活殘基的密碼子組合的寡核苷酸組合。該寡核苷酸組合中，為了雜交至可變區的模板序列，足夠長的框架序列與其上游或下游以符合讀碼框的方式連接。
            
[0352]例如，向輕鏈可變區的CDR2和CDR3中導入所述氨基酸殘基或添加的靈活殘基的情況下，可制作如下引物，所述引物是向寡核苷酸組合的5’末端連接了編碼與CDR2鄰接的足夠長的FR2的氨基酸序列的寡核苷酸、向3’末端連接了編碼與CDR2鄰接的FR3的氨基酸序列的寡核苷酸而得的。進而，還制作如下的互補引物，所述互補引物是向與寡核苷酸組合互補的寡核苷酸組合的5’末端連接了編碼與CDR3鄰接的足夠長的FR4的氨基酸序列的寡核苷酸、向3’末端連接了編碼與CDR3鄰接的FR3的氨基酸序列的寡核苷酸而得的。在含有使得該引物的編碼FR3的氨基酸的寡核苷酸與該互補引物的編碼FR3的氨基酸的寡核苷酸互相雜交的長度的重疊序列的情況下，通過不存在模板序列的條件下的PCR反應，可制作向CDR2和CDR3導入了所述氨基酸殘基或添加的靈活殘基的輕鏈可變區。不含有這樣的重疊序列的情況下，例如通過將序列號6 (Vkl)、序列號7 (Vk2)、序列號8 (Vk3)、序列號9(Vk4)等的生殖細胞系的可變區作為模板序列進行PCR反應，同樣可制作向CDR2和CDR3導入了所述氨基酸殘基或添加的靈活殘基的輕鏈可變區。
            
[0353]例如，制作向輕鏈可變區的CDR3中導入所述氨基酸殘基或添加的靈活殘基、CDRl和CDF2包含隨機化的可變區的文庫的情況下，通過使用向與寡核苷酸組合互補的寡核苷酸組合的5’末端連接了編碼與CDR3鄰接的足夠長的FR4的氨基酸序列的寡核苷酸、向3’末端連接了編碼與CDR3鄰接的FR3的氨基酸序列的寡核苷酸而得的引物與具有編碼FRl的核苷酸序列的引物，用包含天然序列等隨機化的可變區的文庫作為模板序列進行PCR，同樣可制作向CDR2中導入了所述氨基酸殘基和添加的靈活殘基、CDRl和CDF2編碼隨機化的輕鏈可變區的多核苷酸的文庫。向上述輕鏈中導入了 “使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”和/或靈活殘基的多核苷酸文庫的制作方法，也可合適地用于制作向重鏈中導入了所述氨基酸殘基和添加的靈活殘基的多核苷酸文庫。
            
[0354] 此外，上游區域和下游區域的寡核苷酸組合還可被合成為使寡核苷酸序列內包含限制性位點。這些限制性位點使得向具有額外的抗體序列的表達載體中插入核酸盒(即PCR反應生成物)變得容易。優選地，限制性位點被設計為不導入外來的核酸序列、或不除去原有的CDR或框架核酸序列而使得核酸盒的克隆變得容易。
            
[0355]為了表達構成所制作的本發明的抗原結合分子的輕鏈或重鏈的序列的一部分或全部，可將核酸盒克隆于合適的載體中。根據本發明中詳述的方法，核酸盒被克隆進下述載體，所述載體能夠生產與病毒外殼蛋白質的全部或一部分融合的輕鏈或重鏈序列的一部分或全部(即，形成融合蛋白質)。如下文所述，這樣的載體可以是被設計為使得所述融合蛋白質在粒子或細胞的表面呈示的表達載體。為了這樣的目的，可獲得數種載體并將其用于本發明的實施中，但噬粒載體為本說明書中優選使用的載體。如本領域技術人員公知的那樣，噬粒載體中通常可包含各種各樣的構成成分，包括啟動子、信號序列等控制序列、表型選擇基因、復制起點部位和其它必要構成成分。
            
[0356]在表達特定的變體氨基酸的組合的非限定性實施方式中，核酸盒中可編碼重鏈或輕鏈的可變區的全部或一部分。例如，作為本發明的非限定性的一種實施方式的、設計為將“使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的至少一個氨基酸殘基”和/或靈活殘基包含在重鏈的CDR3中的情況下，可在制作具有重鏈CDR3的序列多樣性的核酸盒之后，將其連接至編碼天然序列等隨機化的可變區的核酸盒。在文庫的情況下，為了制作包含這些變體氨基酸或變體氨基酸的組合的抗原結合分子，可將核酸盒插入包含額外的抗體序列、例如輕鏈和重鏈可變區的可變或恒定區的全部或一部分的表達載體中。這些額外的抗原結合分子的序列與其它核酸序列、例如編碼病毒外殼蛋白質構成成分的序列融合，作為其結果，融合蛋白質得以被生產。
            
[0357]載體
            
[0358]在本發明的非限定性的一種實施方式中，包含含有編碼基因融合的核酸序列的可復制的表達載體，所述基因融合編碼下述融合蛋白質，所述融合蛋白質與病毒外殼蛋白質的全部或一部分融合，并且包含一個抗原結合分子的可變區、或者I個抗原結合分子的可變區與I個恒定區。如前文所述，還包含可以以多種方式復制的表達載體的文庫，所述文庫包含編碼多個不同的融合蛋白質的多個基因融合，所述融合蛋白質包含以多樣化的序列生成的互相之間序列不同的多個抗原結合分子。載體可包含各種各樣的構成成分,其優選地被構建為使得抗原結合分子的可變區可在不同的載體之間移動、和/或融合蛋白質可以以不同的形式呈示。
            
[0359]作為載體的例子，可優選舉出曬菌體載體。曬菌體載體具有使得曬菌體復制和曬菌體粒子形成成為可能的噬菌體復制起點。關于噬菌體，作為優選例子，可優選舉出包括M13、fl、fd、Pf3噬菌體或其衍生物的纖維狀噬菌體、或包括λ、21、phi80、phi81、82、424、434等、或其衍生物的λ型噬菌體。
            
[0360]病毒外殼蛋白質的例子包含感染性蛋白質ΡΙΙΙ、主外殼蛋白質PVII1、pVI1、pIX、Soc (T4)、Hoc (T4)、gpD (噬菌體λ )、次要噬菌體外殼蛋白質6 (pVI)(纖維狀噬菌體(J.1mmunol.Methods.(1999) 231 (1-2)，39-51)、M13 噬菌體主外殼蛋白質變體(P8)(Protein Sc1.(2000) 9 (4)，647-654))。融合蛋白質呈示于噬菌體的表面，合適的噬菌體系統包括 M13K07 輔助(helper)噬菌體、M13R408、M13-VCS 和 Phi X174、pJuFo噬菌體系統(J.Virol.(2001)75(15)，7107-7113)、Hyper 噬菌體(Nat.Biotechnol.(2001)19 (I)，75-78)、KMl3 (Fold Des.(1998) 3 (5)，321-328)。優選的輔助噬菌體為M13K07，優選的外殼蛋白質為M13噬菌體基因III外殼蛋白質。優選的宿主為大腸桿菌、和大腸桿菌的蛋白酶缺失株。例如fthl載體(Nucleic Acids Res.(2001) 29 (10) e50)等載體可用于融合蛋白質的表達中。
            
[0361]表達載體可包含與編碼抗原結合分子的重鏈可變區或輕鏈可變區或其片斷的DNA融合的分泌信號序列。該序列典型地位于編碼融合蛋白質的基因的鄰接5’側，因此在融合蛋白質的氨基末端被轉錄。但是，有些情況下證實信號序列在編碼待分泌的蛋白質的基因的5’以外的位置。該序列以橫跨細菌細胞的內膜而結合的蛋白質為對象。編碼信號序列的DNA，可以以限制性內切核酸酶片斷的形式、由編碼具有信號序列的蛋白質的基因的任何一種而獲得。關于原核生物的適當的信號序列，還可使用例如編碼LamB或OmpF (Wong等人(Gene (1983)，68(2)，193-203)、MalE, PhoA的基因和其它基因。用于實施本發明的優選的原核生物信號序列為Chang等(Gene (1987) 55 (2-3)，189-196)中記載的大腸桿菌耐熱性腸毒素II (STII)信號序列、pelB和malE。
            
[0362]載體中一般包含啟動子作為促進融合蛋白質的表達的控制序列。原核生物載體中一般使用的啟動子包括lac Z啟動子系、堿性磷酸酶pho A啟動子(Ap)、噬菌體λ PL啟動子(溫度感受性啟動子)、tac啟動子(由Iac遏制子控制的雜種trp-lac啟動子)、色氨酸啟動子、pBAD啟動子和 噬菌體T7啟動子。關于啟動子的綜述,被記載于前述Sambrook等教科書中。這些是最通常使用的啟動子，但還同樣可以使用其它合適的微生物啟動子。
            
[0363]載體中還可含有其它核酸序列，例如編碼gD標簽、c-Myc表位、多聚組氨酸標簽、熒光蛋白質(例如GFP)或用于檢測或純化在噬菌體或細胞的表面表達的融合蛋白質的β -半乳糖苷酶蛋白質的序列。例如通過編碼gD標簽的核酸序列，能夠對表達融合蛋白質的細胞或病毒的正或負加以選擇。若干實施方式中，gD標簽優選與不融合至病毒外殼蛋白質的構成成分上的抗原結合分子的可變區融合。例如，編碼多聚組氨酸標記的核酸序列有益于使用免疫組織化學手段、鑒定包含與特異性抗原結合的抗原結合分子的可變區的融合蛋白質。對抗原結合的檢測有用的標簽可與不融合至病毒外殼蛋白質構成成分上的抗原結合分子的可變區、或融合至病毒外殼蛋白質構成成分上的抗原結合分子的可變區融合。
            
[0364]作為用于實施本發明的載體的其它有用構成成分，可優選舉出表型選擇基因。典型的表型選擇基因為編碼向宿主細胞賦予抗生素耐性的蛋白質的基因。作為其例子，可優選使用氨芐青霉素耐性基因(ampr)和四環素耐性基因(tetr)等。
            
[0365]載體中還可包含含有獨特的限制性位點和抑制性終止密碼子的核酸序列。獨特的限制性位點可用于使抗原結合分子的可變區在不同的載體和表達系統之間移動。特別地，對于通過細胞培養進行的對全長抗原結合分子或抗原結合片斷的生產有用。抑制性終止密碼子對調節融合蛋白質的表達水平有用，并使可溶型的抗原結合分子的片斷的純化變得容易。例如，琥珀終止密碼子在能夠進行噬菌體展示的supE宿主中可被翻譯為Gln，而在非supE宿主中其被解釋為終止密碼子，產生與噬菌體外殼蛋白質不融合的可溶型的抗原結合分子的片斷。這些合成序列可與載體內的I個或多個抗原結合分子的可變區融合。
            
[0366]可優選使用下述載體，所述載體使編碼目標抗原結合分子的序列的核酸能容易地從載體取出、且并入其它載體中。例如，為了容易地取出編碼本發明的抗原結合分子或其可變區的核酸序列，可向載體中并入合適的限制性位點。關于限制性序列，通常，為了使得高效切割和向新載體中的連接容易進行，可選擇在載體內獨特的限制性序列。抗原結合分子或其可變區可從作為下述分子的載體表達，所述分子具有不含之后外來的融合序列、例如病毒外殼蛋白質或其它序列標簽的結構。
            
[0367]編碼抗原結合分子的可變區或恒定區的核酸(基因I)和病毒的外殼蛋白質構成成分(基因2)之間，可插入編碼終結或終止密碼子的DNA。這樣的終結密碼子包括UAG(琥珀)、UAA (赭石)或 UGA(蛋白石)(Davis 等人(Microbiology (1980), 237, 245-247，374Harper&Row, New York))。在野生型宿主細胞中表達的終結或終止密碼子使得能夠合成與基因2蛋白質不結合的基因I的蛋白質產物。但是，融合蛋白質以能夠通過在抑制性宿主細胞中的生長被檢測到的量被合成。這樣的抑制性宿主細胞是公知的，記載了大腸桿菌抑制基因株(Bullock等人(BioTechniques (1987) 5，376-379))等。這樣的終結密碼子可插入編碼融合多肽的 mRNA中。
            
[0368]抑制性密碼子可被插入到編碼抗原結合分子的可變區或恒定區的第I基因和編碼噬菌體外殼蛋白質的至少一部分的第2基因之間。或者，抑制性終結密碼子可通過取代抗原結合分子的可變區的最后一個氨基酸三聯體或噬菌體外殼蛋白質的第一個氨基酸而與融合位點鄰接而插入。抑制性終結密碼子可插入到二聚體化結構域的C末端或其之后。含有抑制性密碼子的質粒在抑制基因宿主細胞中復制的情況下，將產生可被檢測到的量的包含多肽和外殼蛋白質的融合多肽。質粒在非抑制基因宿主細胞中復制的情況下，為了使得在被插入的抑制性三聯體UAG、UAA或UGA處的翻譯終結，以實質上不與噬菌體外殼蛋白質融合的方式合成抗原結合分子的可變區。因此，因為不含宿主膜上固定的融合噬菌體外殼蛋白質，所以在非抑制基因細胞中表達的抗原結合分子的可變區在合成后從宿主細胞分泌。
            
[0369]抗原結合分子的輕鏈和/或重鏈的可變區或恒定區可進一步與下述肽序列融合，所述肽序列使得病毒粒子或細胞表面上I個或多個融合多肽的相互作用成為可能。這些肽序列在本說明書中被稱為“二聚體化結構域”。二聚體化結構域可包含至少一個或多個二聚體化序列、或包含半胱氨酸殘基的序列中的至少一者或者兩者均包含。合適的二聚體化序列包含具有下述兩親性α螺旋的蛋白質的那些序列，所述兩親性α螺旋使得疏水殘基以一定的間隔存在、通過各蛋白質的疏水殘基的相互作用形成二聚體成為可能。這樣的蛋白質和蛋白質部分中，含有例如亮氨酸拉鏈區。二聚體化結構域可包含I個或多個半胱氨酸殘基(例如通過在二聚體化結構域內包含抗體鉸鏈序列而提供的)。半胱氨酸殘基使得通過I個或多個二硫鍵的形成而二聚體化成為可能。其中終止密碼子存在于二聚體化結構域后方的一種實施方式中，二聚體化結構域包含至少一個半胱氨酸殘基。二聚體化結構域優選位于抗體可變或恒定結構域與病毒外殼蛋白質構成成分之間。
            
[0370]根據情況，載體編碼例如單鏈形式的單一抗原結合分子的噬菌體多肽，其中含有與外殼蛋白質融合的重鏈和輕鏈的可變區。這些情況下，認為載體為在某種啟動子控制下表達一種轉錄產物的“單順反子性”。例示下述載體:所述載體在重鏈可變區和輕鏈可變區之間具有接頭肽，為促進編碼VL和VH結構域的單順反子性序列的表達利用堿性磷酸酶(AP)或Tac啟動子。這類順反子序列在5’末端連接至大腸桿菌的malE或耐熱性腸毒素(STII)信號序列，在3’末端(例如PIII蛋白質等的)連接至病毒外殼蛋白質的全部或一部分上。若干實施方式中，載體可在第2可變區序列和病毒外殼蛋白質序列之間的其3’末端處，進一步包含編碼(例如亮氨酸拉鏈等的)二聚體化結構域的序列號12所示的那樣的序列。
            
[0371]其它情況下，重鏈和輕鏈的可變區作為各多肽而表達，這樣的載體為“雙順反子性”，可能表達各種轉錄產物。這些載體中，為了促進雙順反子性mRNA的表達，可利用合適的啟動子，例如tac或PhoA啟動子。例如，編碼輕鏈可變區和恒定區的第I順反子在5’末端連接至大腸桿菌的malE、pelB或耐熱性腸毒素(STII)信號序列，在3’末端連接至編碼gD標簽的核酸序列。例如，編碼重鏈可變區和恒定區CHl的第2順反子在5’末端連接至大腸桿菌的malE或耐熱性腸毒素(STII)信號序列,在3’末端連接至病毒外殼蛋白質的全部或一部分。
            
[0372]生成雙順反子性mRNA、呈示F (ab’)2_pIII的載體中，合適的啟動子,例如tac或PhoA(AP)啟動子在5’末端可作用地連接至大腸桿菌的malE或耐熱性腸毒素(STII)信號序列，在3’末端連接至編碼gD標簽的核酸序列，這促進由此得到的編碼輕鏈可變區和恒定區的第I順反子的表達。第2順反子例如編碼在5’末端與大腸桿菌的malE或耐熱性腸毒素II(STII)信號序列可作用地連接而得的重鏈可變區和恒定區，在3’末端包含含有IgG鉸鏈序列和亮氨酸拉鏈序 列進而在其之后含有至少一部分病毒外殼蛋白質的二聚體化結構域。
            
[0373]融合多肽的呈示
            
[0374]抗原結合分子的可變區的融合多肽在細胞、病毒或噬粒粒子的表面以各種各樣的形式呈示。這些形式中，包括單鏈Fv片斷(scFv)、F(ab)片斷以及這些片斷的多價形式。多價形式優選為ScFv、Fab或F(ab’ )的二聚體，它們在本說明書中分別被稱為(ScFv) 2、F(ab)2和F(ab’)2。多價形式的呈示為優選的理由之一被認為是:通過多價形式的呈示，通常可鑒定低親和性克隆，或者，具有多個抗原結合位點，使得能夠在選擇過程中更高效地選擇稀少的克隆。
            
[0375]在噬菌體的表面呈示含有抗體片斷的融合多肽的方法是本【技術領域】中公知的，例如，如W01992001047和本說明書記載所示。此外，W01992020791、W01993006213、W01993011236和1993019172中也記載了關聯的方法，本領域技術人員可適當地使用這些方法。其它公知文獻(H.R.Hoogenboom&G.Winter (1992) J.Mol.Biol.227，381-388、W01993006213和W01993011236)中，給出了針對噬菌體表面呈示的各種抗原、通過人工再配置的可變區基因貯庫進行的抗體鑒定。
            
[0376]在構建用于以scFv的形式呈示的載體的情況下，編碼抗原結合分子的輕鏈可變區和重鏈可變區的核酸序列包含在該載體中。一般而言，編碼抗原結合分子的重鏈可變區的核酸序列與病毒外殼蛋白質構成成分融合。編碼抗原結合分子的輕鏈可變區的核酸序列通過編碼肽接頭的核酸序列與抗原結合分子的重鏈可變區連接。肽接頭一般包含約5~15個氨基酸。任意地，例如編碼對純化或檢測有用的標記的其它序列可融合至編碼抗原結合分子的輕鏈可變區或抗原結合分子的重鏈可變區中的任一或兩者的核酸序列的3’末端。
            
[0377]在構建用于以F(ab)的形式呈示的載體的情況下，編碼抗原結合分子的可變區和抗原結合分子的恒定區的核酸序列包含在該載體中。編碼輕鏈可變區的核酸與編碼輕鏈恒定區的核酸序列融合。編碼抗原結合分子的重鏈可變區的核酸序列與編碼重鏈恒定CHl區的核酸序列融合。一般而言，編碼抗原結合分子的重鏈可變區和恒定區的核酸序列與編碼病毒外殼蛋白質的全部或一部分的核酸序列融合。重鏈可變區和恒定區優選作為與病毒外殼蛋白質的至少一部分的融合體表達，輕鏈可變區和恒定區則與重鏈病毒外殼融合蛋白質分開表達。重鏈和輕鏈相互結合，該結合可以是共價結合也可以是非共價結合。任意地，例如編碼對純化或檢測有用的多肽標記的其它序列可融合至編碼抗原結合分子的輕鏈可變區或抗原結合分子的重鏈可變區中的任一或兩者的核酸序列的3’末端。
            
[0378] 向宿主細胞中導入載體
            
[0379]為擴增和/或表達，按前文所述構建的載體被導入宿主細胞中。載體可通過包括電穿孔、磷酸鈣沉淀等的公知轉化法導入宿主細胞。載體為病毒這樣的感染性粒子的情況下，載體自身侵入宿主細胞。利用插入了編碼融合蛋白質的多核苷酸的可復制的表達載體轉染宿主細胞、和利用公知的手段，產生噬菌體粒子，由此使融合蛋白質在噬菌體粒子的表面呈不。
            
[0380]可復制的表達載體可使用各種各樣的方法導入宿主細胞中。在一種非限定性的實施方式中，按照W02000106717所記載的那樣，使用電穿孔法將載體導入細胞中。細胞在標準培養液中于37°C被培養任選約6~48小時(或者培養至600nm處的OD達到0.6~0.8)，接著通過對培養液離心分離(例如通過傾析)，取出培養上清液中。在純化的初期階段中，優選地，將細胞沉淀再懸浮于緩沖液(例如1.0mM的HEPES (pH7.4))中。接著通過再次離心分離，從懸浮液獲得上清液。將得到的細胞沉淀再懸浮于例如稀釋為5-20% V/V的甘油中。通過再次離心分離，從懸浮液獲得上清液，由此得到細胞沉淀。通過將該細胞沉淀再懸浮于水或經稀釋的甘油中，基于對得到的菌體濃度的測定值，使用水或經稀釋的甘油，將最終的菌體濃度制備為期望的濃度。
            
[0381]例如，作為優選的受體細胞，可舉出可應答電穿孔的大腸桿菌菌株SS320 (Sidhu等人(Methods Enzymol.(2000)328, 333-363)) ?大腸桿菌菌株SS320為在足以使得致育性附加體(F，質粒)或XLl-BLUE轉移到MC1061細胞中的條件下，將MC1061細胞與XLl-BLUE細胞偶合而制備的。在 ATCC(10801University Boulevard, Manassas, Virginia)保藏的大腸桿菌菌株SS320被給予了保藏號98795。該菌株中使得噬菌體復制成為可能的任何F’附加體均可用于本發明。合適的附加體可從ATCC保藏的菌株獲得，或者可從市售品獲得(TG1、CJ236、CSH18、DHF，、ER2738、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110、KS1000、XL1-BLUE,71-18 等)。
            
[0382]在電穿孔中使用更高的DNA濃度(約10倍)的話，轉化率提高，被轉化進宿主細胞中的DNA的量增加。高菌體濃度的使用也提高效率(約10倍)。通過轉移的DNA的量的增加，可以制作具有更高的多樣性、序列不同的獨立克隆數量更大的文庫。通常可根據在含有抗生素的培養基上是否生長來選擇轉化細胞。
            
[0383]結合活性根據條件而變化的抗原結合分子的選擇方法以及編碼該分子的多核苷酸的分離方法[0384]使用噬菌體展示以鑒定展示出針對抗原的期望結合活性的抗原結合分子的方法包括進行了各種各樣的改變的方法，其是本【技術領域】中已經建立的。在一種非限定性的實施方式中，可復制載體的文庫被構建為包含與編碼融合多肽的基因融合體可作用地連接的轉錄調節因子，該可復制載體的文庫被轉化至合適的宿主細胞。培養經轉化的細胞，形成所述融合多肽在噬菌體粒子表面呈示的噬菌體粒子。之后，為了使在選擇過程中與抗原不結合的粒子群體相比與抗原結合的粒子的群體增加，可實施伴隨選擇、分選的“選擇結合分子”的步驟，所述選擇、分選通過將重組體噬菌體粒子與對象抗原接觸來進行，使得粒子群體的至少一部分與抗原結合。為了在不同或相同反應條件下對相同群體再進行一次篩選，通過使已經分選的群體感染例如新鮮的XLl-Blue細胞等宿主細胞，來擴增該群體。接著，實施將得到的抗原結合分子被擴增了的群體在離子濃度不同的條件下與抗原接觸的步驟，篩選出在期望的條件下結合抗原的抗原結合分子。此外，還可將在離子濃度不同的條件下與抗原接觸的步驟作為前述選擇方法的最初步驟來實施，“選擇結合分子”的步驟與選擇在離子濃度不同的條件下結合活性變化的結合分子的步驟的組合可被適當變更。此外，所述的選擇和分選的步驟可實施數次。這些離子濃度不同的條件下與抗原結合的抗原結合分子，作為在給予生物體時具有從生物體快速除去作為病因的抗原的能力的治療藥物而有用。
            
[0385]本發明的、包含使抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的氨基酸和/或靈活殘基的可變區或其一部分的融合多肽被表達于噬菌體、噬粒粒子或細胞的表面。接著可針對在離子濃度不同的條件下融合多肽的群體中構成成員對抗原的結合能力進行選擇和/或分選。對融合多肽進行選擇、分選和篩選的方法還包括在與抗原結合分子的可變區具有親和性的一般的蛋白質(如蛋白質L或與在噬菌體上呈示的抗原結合分子或其片斷結合的標記抗體)上進行選擇、分選和篩選的方法。這樣的方法可用于使得呈示被正確折疊的抗原結 合分子(或包含它們的融合多肽)的片斷的文庫大小或文庫當量數豐富。
            
[0386]為進行所述的選擇、分選和篩選，可使用兩種主要的策略。第I策略為固體載體方法或平板篩選或固定化抗原篩選，第2策略為溶液結合方法。
            
[0387]“固體載體方法”中，抗原可與本【技術領域】公知的合適的固體或半固體基質結合，所述基質例如瓊脂糖珠粒、丙烯酰胺珠粒、玻璃珠粒、纖維素、各種各樣的丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸羥基烷基凝膠、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龍和中性和離子性載體。抗體對基質的結合可按照Methods in Enzymology (1976) 44中記載的方法或本【技術領域】中公知的其它手段實現。
            
[0388]抗原結合至基質之后，在適于噬菌體粒子群體的至少一個亞組和固定化抗原的結合的條件下，將固定化的抗原與表達融合多肽的文庫接觸。通常，pH、離子強度、溫度等條件選擇為模擬生理學條件的條件。與所述固定化的抗原結合的粒子(“結合體”)通過水洗與未和對象結合的粒子分離。清洗條件可被調節，以使得高親和性的結合體之外的全部物質均被除去。可通過各種各樣的方法使得結合體從固定化的對象解離。這些方法包括例如使用過量抗原等的野生型配體的競爭性解離、PH和/或離子強度的變更以及本【技術領域】公知的方法。結合體可通過合適的溶出材料(一般而言，0.1M的HCl等酸或配體之類的)從親和性基質溶出。通過使得配體的濃度上升并溶出，可能使得呈示的、親和性更高結合分子溶出。
            
[0389]通過使分離的結合體、即病毒粒子(以及，例如病毒粒子為噬粒粒子的情況下，則根據需要為輔助噬菌體)感染細胞，可在合適的宿主細胞中再擴增結合體。在適合擴增粒子(該粒子呈示期望的融合多肽)的條件下培養由此得到的宿主細胞。接著，采集噬菌體粒子，重復進行I次或復數次選擇工序，使得抗原的結合體占到相當的比例。選擇或篩選可進行數次。作為選擇或篩選方法之一，可包括分離與蛋白質L或針對被呈示的多肽中存在的多肽標簽的抗體(例如針對gD蛋白質或多聚組氨酸標簽的抗體)這樣的一般的親和性蛋白質結合的結合體。 [0390]作為本發明的一種實施方式，可合適地使用被稱為“溶液結合方法”的溶液相篩選法。可使用溶液結合方法，以從隨機的文庫、或者從以改善期望的結合克隆或克隆群的結合活性為目的的文庫發現改善的結合體。多種多肽、例如噬菌體或噬粒粒子(文庫)上呈示的多肽和經標簽分子標記的或與標簽分子融合的抗原的接觸也包括在該方法中。關于標簽，可利用生物素或其它特異性的結合體。在第I溶液結合相中使用濃度梯度降低的經標記的或融合的抗原，可改變溶液相的嚴格性(stringency)。進而，為了提高嚴格性，還可合適地實施下述方法:在第I溶液相中與經最初的標簽分子標記或與標記標簽分子融合的抗原結合之后，與第2溶液相接觸，所述第2溶液相具有未再經標簽分子標記或未再與標記標簽分子融合的高濃度的抗原。該情況下，通常，在第2相中使用標記對象的100~1000倍的量的未經標簽分子標記的或未與標記標簽分子融合的抗原。第I溶液相的孵育時間在2、3分鐘到1、2個小時或更長的范圍內，直至達到平衡。結合速度快的結合體具有在該第I相中的結合時間短的性質的傾向，因此采用結合時間較短的接觸條件。第2相的孵育時間和溫度可為了提高嚴格性而變化。通過這樣的孵育條件的變化，產生對從對象脫離的速度(解離速度)慢的結合體的選擇偏向。噬菌體/噬粒粒子上呈示的多種多肽與抗原接觸后，與經標簽分子標記的或與標記標簽分子融合的抗原結合的噬菌體或噬粒粒子與未結合的噬菌體或噬粒粒子分離。通過在使得與經標簽分子標記的或與標記標簽分子融合的抗原的結合成為可能的范圍內，使得噬菌體或噬粒粒子與抗原接觸較短的時間(例如2~5分鐘)，曬菌體或曬粒粒子與抗原的混合可從溶液相被分尚。經標簽分子標記的或與標記標簽分子融合的抗原的初期濃度的范圍為約0.1nM~約ΙΟΟΟηΜ。為了接著的篩選，可使得從該混合物溶出的粒子增殖。在各次的篩選中，優選使用經標簽分子標記的或與標記標簽分子融合的低濃度的抗原，重復多次篩選。如下文的實施例中記載的那樣，作為標記標簽分子使用生物素的情況下，涂布有鏈親和素的磁性珠粒等可合適地用于溶液結合方法中。
            
[0391]固體載體方法與溶液結合方法的組合可單獨或組合實施，以分離具有期望的特性的結合體。針對抗原重復進行2次、3次或4次選擇和篩選，之后為了鑒定出具有期望的性質/特性的特異性結合體，通常可實施從選擇的群體中進行對各個克隆的篩選。優選地，可通過使得針對文庫的高通量篩選成為可能的自動化系統來實行篩選的過程。
            
[0392]通過針對抗原的結合鑒定結合體之后，可從該結合體提取核酸。提取的DNA接著可直接用于對大腸桿菌宿主細胞進行轉化。或者，可例如通過PCR使用適當的引物來擴增其編碼序列，再通過典型的測序方法來確定其序列。接著，為了表達其編碼的抗原結合分子，編碼結合體的可變區的DNA可被插入經限制性酶消化的載體中。
            
[0393]為了選擇、篩選表達本發明的抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的抗原結合分子或其融合多肽的噬菌體粒子，通過改變將固定化的抗原與包含表達抗原結合分子或融合多肽的噬菌體粒子的文庫接觸的條件，可分選出針對抗原的結合活性發生變化的噬菌體粒子的群體。
            
[0394]例如，作為金屬離子的優選例子而關注鈣離子的情況下，作為鈣離子濃度的條件，可舉出低鈣離子濃度的條件和高鈣離子濃度的條件。結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化是指:抗原結合分子針對抗原的結合活性根據低鈣離子濃度和高鈣離子濃度的條件不同而變化。例如可舉出:較之在低鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言，在高鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性更高的情況。此外，也還可舉出:較之在高鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言，在低鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性更高的情況。
            
[0395]本說明書中，高鈣離子濃度并不被特別限定為某個明確的數值，但優選可為選自100μΜ~IOmM之間的濃度。此外，在一些其它實施方式中，也可為選自200 μ M~5mM之間的濃度。此外，在不同的實施方式中，還可為選自500μΜ~2.5mM之間的濃度，在另外的實施方式中，還可為選自200μΜ~2mM之間的濃度。此外，還可為選自400 μ M~1.5mM之間的濃度。特別地，可優選舉出選自接近生物體內的血漿中(血中)的鈣離子濃度的、500 μ M~2.5mM之間的濃度。
            
[0396]本說明書中，低鈣離子濃度并不被特別限定為某個明確的數值，但優選可為選自0.ΙμΜ~30μΜ之間的濃度。此外，在一些其它實施方式中，也可為選自0.2μΜ~20μΜ之間的濃度。此外，在不 同的實施方式中，還可為選自0.5μΜ~ΙΟμΜ之間的濃度，在另外的實施方式中，還可為選自I μ M~5 μ M之間的濃度。此外,還可為選自2 μ M~4μ M之間的濃度。特別地，可優選舉出選自接近生物體內的早期核內體內的鈣離子濃度的、I μ M~5 μ M之間的濃度。
            
[0397]本發明中，抗原結合分子在低鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性比在高鈣離子濃度條件下針對抗原的結合活性低表示:抗原結合分子在選自0.1 μ M~30 μ M之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性比在選自100 μ M~IOmM之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性弱。優選表示，抗原結合分子在0.5 μ M~10 μ M之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性比在選自200 μ M~5mM之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性弱，特別優選表示在生物體內的早期核內體內的鈣離子濃度下的抗原結合活性比在生物體內的血漿中的鈣離子濃度下的抗原結合活性弱，具體而言，表示抗原結合分子在選自I μ M~5 μ M之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性比在選自500 μ M~2.5mM之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合活性弱。
            
[0398]例如，為了選擇、篩選表達抗原結合分子(該抗原結合分子較之在低鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言在高鈣離子濃度的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性更高)或其融合多肽的噬菌體粒子，在高鈣濃度的條件下與固定化的抗原結合的噬菌體粒子的群體首先被分選出之后，將該被分選出的群體和抗原與在低鈣濃度的條件下固定化的抗原和包含表達抗原結合分子或融合多肽的噬菌體粒子的文庫接觸。未與低鈣濃度的條件下固定化的抗原結合的噬菌體粒子被分選至上清液或之后的清洗液中。高鈣濃度和低鈣濃度的條件可在上文記載的范圍內合適地采用。在非限定性的一種實施方式中，可基于選自0.1 μ M~30 μ M之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合與在選自100μ M~1OmM之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合的活性差異進行分選。此外，在其它的非限定的實施方式中，可基于選自0.5 μ M~10 μ M之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合與在選自200μ M~5mM之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合的活性差異進行分選。此外，在其它非限定的實施方式中，可基于生物體內的早期核內體內的鈣離子濃度下針對抗原的結合與生物體內的血漿中的鈣離子濃度下針對抗原的結合的活性差異進行分選，具體而言，基于選自1μΜ~5μΜ之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合與在選自500μΜ~2.5mM之間的鈣離子濃度下針對抗原的結合的活性差異進行分選。
            
[0399]例如，作為離子濃度的優選例子而關注氫離子濃度的情況下，作為氫離子濃度的條件可舉出PH酸性區域的條件和pH中性區域的條件。結合活性根據pH的條件而變化是指:抗原結合分子針對抗原的結合活性根據PH酸性區域和pH中性區域的條件不同而變化。例如可舉出:較之在pH酸性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言，在pH中性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性更高的情況。此外，也還可舉出:較之在pH中性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言，在pH酸性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性更高的情況。
            
[0400]本說明書中，pH中性區域并不被特別限定為某個明確的數值，但優選可選自pH6.7~ρΗΙΟ.0之間。此外，在一些其它實施方式中，可選自pH6.7~pH9.5之間。此外，在不同的實施方式中，還可選自PH7.0~pH9.0之間，在另外的實施方式中，還可選自pH7.0~pH8.0之間。特別地，可優選舉出選自與生物體內的血漿中(血中)的pH接近的ρΗ7.4。
            
[0401]本說明書中，pH酸性區域并不被特別限定為某個明確的數值，但優選可選自pH4.0~pH6.5之間。此外，在一些其它實施方式中，可選自pH4.5~pH6.5之間。此外，在不同的實施方式中，還可選自pH5.0~pH6.5之間，在另外的實施方式中，還可選自pH5.5~PH6.5之間。特別地，可優選舉出選自與生物體內的早期核內體內的pH接近的pH5.8。
            
[0402]本發明中，抗原結合分子在pH酸性區域條件下針對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下針對抗原的結合活性低表示:抗原結合分子在選自PH4.0~pH6.5之間的pH下針對抗原的結合活性比在選自PH6.7~ρΗΙΟ.0之間的pH下針對抗原的結合活性弱。優選地表示抗原結合分子在選自pH4.5~pH6.5之間的pH下針對抗原的結合活性比在選自pH6.7~pH9.5之間的pH下針對抗原的結合活性弱，更優選表示抗原結合分子在選自pH5.0~pH6.5之間的pH下針對抗原的結合活性比在選自pH7.0~pH9.0之間的pH下針對抗原的結合活性弱。此外，優選地表示，抗原結合分子在選自pH5.5~pH6.5之間的pH下針對抗原的結合活性比在選自PH7.0~pH8.0之間的pH下針對抗原的結合活性弱。特別優選表示在生物體內的早期核內體內的pH下的抗原結合活性比在生物體內的血漿中的pH下的抗原結合活性弱，具體而言，抗原結合分子在PH5.8下針對抗原的結合活性比在pH7.4下針對抗原的結合活性弱。
            
[0403]關于抗原結合分子針對抗原的結合活性是否根據pH的條件而變化，可例如按照測定在前述不同的pH的條件下的結合活性的方法來實施。例如，為了確認到較之在pH酸性區域的條件下抗原 結合分子針對抗原的結合活性而言、在PH中性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性變高，對PH酸性區域和pH中性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性進行比較。[0404]例如，為了選擇、篩選表達抗原結合分子(該抗原結合分子較之在pH酸性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性而言在PH中性區域的條件下抗原結合分子針對抗原的結合活性更高)或其融合多肽的噬菌體粒子，在PH中性區域的條件下與固定化的抗原結合的噬菌體粒子的群體首先被分選出之后，將該被分選出的群體和抗原與在低鈣濃度的條件下固定化的抗原和包含表達抗原結合分子或融合多肽的噬菌體粒子的文庫接觸。未與PH酸性區域的條件下固定化的抗原結合的噬菌體粒子被分選至上清液或之后的清洗液中。PH中性區域和pH酸性區域的條件可在上文記載的范圍內合適地采用。在非限定性的一種實施方式中，可基于選自pH4.0~pH6.5之間的pH下針對抗原的結合與在選自pH6.7~ρΗΙΟ.0之間的pH下針對抗原的結合的活性差異進行分選。此外，在其它的非限定的實施方式中，可基于選自PH4.5~pH6.5之間的pH下的針對抗原的結合與在選自pH6.7~pH9.5之間的pH下針對抗原的結合的活性差異進行分選。此外，可基于選自pH5.0~pH6.5之間的PH下的針對抗原的結合與在選自pH7.0~pH9.0之間的pH下針對抗原的結合的活性差異進行分選。除此之外，可基于選自pH5.5~pH6.5之間的pH下的針對抗原的結合與在選自pH7.0~pH8.0之間的pH下針對抗原的結合的活性差異進行分選。此外，在其它非限定的實施方式中，可基于生物體內的早期核內體內的PH下的針對抗原的結合與生物體內的血漿中的PH下的針對抗原的結合的活性差異，具體而言，基于pH5.8下的針對抗原的結合與在pH7.4下的針對抗原的結合的活性差異進行分選。
            
[0405] 結合活性根據條件而變化的抗原結合分子的制造方法
            
[0406]在本發明的非限定性的一種實施方式中，分離出多核苷酸(該多核苷酸編碼如前文所述選擇的結合活性根據條件而變化的抗原結合分子)之后，將該多核苷酸插入合適的表達載體中。即，得到編碼目標抗原結合分子的可變區的cDNA之后，通過識別向該cDNA的兩個末端插入的限制性酶位點的限制性酶來消化該cDNA。優選的限制性酶對在構成抗原結合分子的基因的堿基序列中出現頻率低的堿基序列加以識別并消化。進而，為了將I個拷貝的消化片斷以正確的方向插入載體中，優選插入能夠賦予粘末端的限制性酶。通過如上文所述消化的編碼抗原結合分子的可變區的cDNA插入適當的表達載體中，能夠獲得本發明的抗原結合分子的表達載體。此時，編碼抗體恒定區(C區)的基因和編碼所述可變區的基因可以以符合讀碼框的方式融合。
            
[0407]為制造期望的抗原結合分子，編碼抗原結合分子的多核苷酸以與控制序列可作用地連接的形式并入表達載體中。控制序列包含例如增強子、啟動子。此外，可在氨基末端添加合適的信號序列，以使得表達的抗原結合分子分泌到細胞外。例如，作為信號序列，可使用具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS (序列號13)的肽，但除此之外合適的信號序列也可被添加。表達的多肽在上述序列的羧基末端部分被切斷，切斷的多肽可作為成熟多肽分泌到細胞外。接著，通過利用該表達載體轉化合適的宿主細胞，能夠獲得表達編碼期望的抗原結合分子的多核苷酸的重組細胞。
            
[0408]為表達編碼抗原結合分子的多核苷酸，編碼抗原結合分子的重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)的多核苷酸分別被并入不同的表達載體。通過利用并入了重鏈和輕鏈的載體共轉染相同的宿主細胞，可表達具有重鏈和輕鏈的抗原結合分子。或者，可通過將編碼重鏈和輕鏈的多核苷酸并入單一表達載體，來對宿主細胞進行轉化(參照W019994011523)。
            
[0409]用于通過將分離的編碼抗原結合分子的多核苷酸導入合適的宿主來制作抗原結合分子的宿主細胞和表達載體的多種組合是公知的。這些表達系統中的任何一個均可應用于分離本發明的抗原結合分子。使用真核細胞作為宿主細胞的情況下，可合適地使用動物細胞、植物細胞或者真菌細胞。具體而言，作為動物細胞，可舉例下述細胞。
            
[0410](I)哺乳類細胞:CH0(中國倉鼠卵巢細胞系)、C0S (猴腎細胞系)、骨髓瘤(Sp2/0、NSO等)、BHK(幼倉鼠腎細胞)、HEK293 (具有經剪切的腺病毒(Ad) 5DNA的人胚胎腎細胞)、PER.C6細胞(經5型(Ad5)腺病毒ElA和ElB基因轉化的人胚胎視網膜細胞)、Hela、Ver0等(Current Protocols in Protein Science(May, 2001, Unit5.9, Table5.9.1)),
            
[0411](2)兩棲類細胞:非洲爪蟾卵母細胞等，
            
[0412](3)昆蟲細胞:sf9、sf21、Tn5 等。
            
[0413]或者，作為植物細胞，利用來自煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬的細胞的抗體基因表達系統是公知的。植物細胞的轉化可合適地利用愈傷組織培養的細胞。
            
[0414]此外，作為真菌細胞，可利用下述細胞。
            
[0415]-酵母:釀酒酵母(Saccharomycesserevisiae)等酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(巴斯德畢赤酵母，Pichia pastoris)等畢赤酵母屬
            
[0416]-絲狀菌:黑曲霉等曲霉屬
            
[0417]此外，利用原核細胞的、編碼抗原結合分子的多核苷酸的表達系統也是公知的。例如，使用細菌細胞的情況 下，可合適地利用大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌等細菌細胞。這些細胞中，可通過轉化導入包含編碼目標抗原結合分子的多核苷酸的表達載體。通過體外培養經轉化的細胞，可從該轉化細胞的培養物獲得期望的抗原結合分子。
            
[0418]對重組抗原結合分子的產生而言，除了上述宿主細胞之外，還可利用轉基因動物。即，可從導入了編碼期望的抗原結合分子的多核苷酸的動物獲得該抗原結合分子。例如，將編碼抗原結合分子的多核苷酸以符合讀碼框的方式插入編碼乳汁中固有地產生的蛋白質的基因內部，其可作為融合基因而被構建。作為分泌進乳汁中的蛋白質，可利用山羊β酪蛋白。將包含融合基因(其中插入了編碼抗原結合分子的多核苷酸)的DNA片斷注入山羊胚胎，將該經注入的胚胎導入雌性山羊。由接受了胚胎的山羊生育轉基因山羊(或者其子孫)，從由該轉基因山羊(或者其子孫)產生的乳汁中，能夠獲得期望的抗原結合分子與乳汁蛋白質的融合蛋白質。此外，為了增加從轉基因山羊產生的包含期望的抗原結合分子的乳汁的量，可向轉基因山羊給予激素(Bio/Technology (1994)，12 (7) ,699-702)。
            
[0419]將本說明書中記載的抗原結合分子給予人的情況下，作為該分子中的抗原結合結構域，可合適地采用來自基因重組型抗體(該基因重組型抗體為了降低對人的異源抗原性等目的而進行了人工改變)的抗原結合結構域。基因重組型抗體中包含例如人化(Humanized)抗體等。這些改變的抗體可使用公知的方法合適地制造。
            
[0420]用于制作本說明書中記載的抗原結合分子中的抗原結合結構域的抗原結合分子的可變區通常以在4個框架區(FR)中夾的3個互補性決定區(complementarity-determining region ;Q)R)而構成。⑶R是實質上決定抗原結合分子的結合特異性的區域。CDR的氨基酸序列富含多樣性。另一方面，構成FR的氨基酸序列即使在具有不同結合特異性的抗原結合分子之間也多顯示出較高的同一性。因此，一般可通過CDR的移植將某抗原結合分子的結合特異性移植給其它抗原結合分子。[0421]人源化抗體也被稱為改型(reshaped)人抗體。具體而言,將除人之外的動物、例如小鼠抗體的CDR移植給人抗體的人源化抗體等是公知的。用于獲得人源化抗體的一般性的基因重組手段也是已知的。具體而言，作為用于將小鼠的抗體的CDR移植至人的FR的方法，例如重疊.延伸(Overlap Extension)PCR是公知的。重疊.延伸PCR中，向用于合成人抗體的FR的引物中添加編碼將被移植的小鼠抗體的CDR的堿基序列。針對4個FR分別準備引物。一般而言，在小鼠的CDR向人FR的移植中，選擇與小鼠的FR具有較高同一性的人FR，在CDR的功能的維持中被認為是有利的。即，一般而言，優選利用包含與將移植的小鼠CDR鄰近的FR的氨基酸序列具有較高同一性的氨基酸序列的人FR。
            
[0422]此外，連接的堿基序列被設計為互相以符合讀碼框的方式連結。通過各引物而個別地合成人FR。結果，可獲得向各FR添加了編碼小鼠CDR的DNA的產物。各產物的編碼小鼠CDR的堿基序列被設計為互相重疊。接著，使將人抗體基因作為模板合成的產物的重疊的⑶R部分互相退火，進行互補鏈合成反應。通過該反應，將人FR經由小鼠⑶R的序列連接起來。
            
[0423]最終，3個⑶R和4個FR連接而得的V區域基因通過向其5’末端和3’末端退火并添加了合適的限制性酶識別序列的引物而被全長擴增。通過將如上文所述獲得DNA與編碼人抗體C區的DNA以符合讀碼框的方式融合的方式插入到表達載體中，能夠制作獲得用于表達人化抗體的載體。將該具有并入物的載體導入宿主建立重組細胞后，通過培養該重組細胞、使得編碼該人源化抗體的DNA表達，該人源化抗體被產生于該培養細胞的培養物中(EP239400、W01996002576)。
            
[0424]通過對上文所述制作的人源化抗體與抗原的結合活性進行定性或定量測定、評價，能夠合適地選擇下述人抗體的FR，其使得在經由CDR而被連接時該CDR能形成良好的抗原結合位點。根據需要 ，還可取代FR的氨基酸序列，以使得改型人抗體的CDR形成合適的抗原結合位點。例如，應用在將小鼠CDR向人FR的移植中使用的PCR法，可向FR中導入氨基酸序列的突變。具體而言，可向退火至FR的引物中導入部分堿基序列的突變。由這樣的引物合成的FR中就導入了堿基序列的突變。通過用上述方法對經氨基酸取代的突變型抗體對抗原的結合活性進行測定和評價，可選擇具有期望的性質的突變FR序列(Sato等人，Cancer Res(1993)53，851—856)。
            
[0425]本發明的非限定性的一種實施方式中，分離出編碼抗原結合分子(如前文所述選擇的結合活性根據條件而變化)的多核苷酸之后，將該多核苷酸的修飾體插入合適的表達載體中。作為這樣的修飾體之一，可優選舉出編碼篩選出的本發明的抗原結合分子的多核苷酸分子被人化的修飾體，所述篩選是通過將合成文庫、以非人動物作為起源制作的免疫文庫用作為隨機化可變區文庫而進行的。人化的抗原結合分子的修飾體的制作方法可采用與前述人源化抗體的制作方法相同的方法。
            
[0426]此外，作為修飾體的其它方式，可優選舉出向分離的多核苷酸序列施加了下述修飾的修飾體，所述修飾使通過使用合成文庫或天然文庫作為隨機化可變區文庫篩選出的本發明的抗原結合分子針對抗原的結合親和性增強(親和性成熟化)。這樣的修飾體可通過各種親和性成熟化的公知手段來獲得，例如，CDR誘變(Yang等人(J.Mol.Biol.(1995)254，392-403))、鏈改組(Marks 等人(Bio/Technology (1992) 10，779-783))、大腸桿菌誘變株的使用(Low等人(J.Mol.Biol.(1996)250, 359-368))、DNA改組(Patten 等人(Curr.0pin.Biotechnol.(1997)8, 724-733))> 曬菌體展不(Thompson等人(J.Mol.Biol.(1996)256,77-88))和有性 PCR(sexual PCR) (Clameri 等人(Nature(1998)391，288-291))。
            
[0427]如前文所述，作為通過本發明的制造方法制作的抗原結合分子，可舉出包含FcRn (特別是人FcRn)結合結構域的抗原結合分子，作為FcRn (特別是人FcRn)結合結構域，可使用各種各樣的修飾體。作為本發明的修飾體的一種實施方式，還可優選舉出編碼下述抗原結合分子的多核苷酸，所述抗原結合分子具有編碼上述FcRn (特別是人FcRn)結合結構域的修飾體的多核苷酸和編碼如前文所述選擇的結合活性根據條件而變化的抗原結合分子的多核苷酸以符合讀碼框的方式連接而得的重鏈。
            
[0428]本發明的非限定性的一種實施方式中，作為FcRn(特別地，人FcRn)結合結構域，可優選舉出例如序列號14表不的IgGl (N末端添加了 Ala的AAC82527.1)、序列號15表不的IgG2(N末端添加了 Ala的AAB59393.1)、序列號16表示的IgG3 (CAA27268.1)、序列號17表示的IgG4(N末端添加了 Ala的AAB59394.1)等的抗體的恒定區。IgG分子在血漿中滯留性較長(從血漿中的消失較慢)，這是因為作為IgG分子的補救受體已知的FcRn能發揮功能。通過胞飲作用并入核內體的IgG分子與在核內體內的酸性條件下表達于核內體內的FcRn結合。不能與FcRn結合的IgG分子將進入溶酶體并在此處分解,而與FcRn結合的IgG分子將移動到細胞表面，通過在血漿中的中性條件下從FcRn解離而再次回到血漿中。 [0429]在血漿中的高鈣濃度的條件下針對抗原較強地結合、在核內體內的低鈣濃度的條件下從抗原解離的本發明的“針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的抗原結合分子”可在核內體內從抗原解離。在血漿中的高鈣濃度的條件下針對抗原較強地結合、在核內體內的低鈣濃度的條件下從抗原解離的本發明的“針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的抗原結合分子”在解離抗原后通過FcRn再循環進血漿中的話，則有可能再次結合至抗原。即，I分子的該抗原結合分子可重復結合至多個抗原。此外，結合至抗原結合分子的抗原在核內體內解離而不再循環進血漿中，因此可促進通過抗原結合分子向細胞內并入抗原，通過給予抗原結合分子促進抗原的消失，使得血漿中的抗原濃度降低。
            
[0430]在血漿中的pH中性區域的條件下針對抗原較強地結合、在核內體內的酸性條件下從抗原解離的本發明的“針對抗原的結合活性根據PH的條件而變化的抗原結合分子”可在核內體內從抗原解離。在血漿中的PH中性區域的條件下針對抗原較強地結合、在核內體內的酸性條件下從抗原解離的本發明的“針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的抗原結合分子”在解離抗原后通過FcRn再循環進血漿中的話，則有可能再次結合至抗原。即，I分子的該抗原結合分子可重復結合至多個抗原。此外，結合至抗原結合分子的抗原在核內體內解離而不再循環進血漿中，因此可促進通過抗原結合分子向細胞內并入抗原，通過給予抗原結合分子促進抗原的消失，使得血漿中的抗原濃度降低。
            
[0431]關于在血漿中的高鈣濃度的條件下針對抗原較強地結合、在核內體內的低鈣濃度的條件下從抗原解離的本發明的“針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的抗原結合分子”，通過向其賦予在血漿中的高鈣濃度的條件下針對FcRn的結合，促進該抗原結合分子與抗原的復合體向細胞內的并入。即，通過給予該抗原結合分子，可促進抗原從血漿中消失，降低血漿中的抗原濃度。
            
[0432]關于在血漿中的pH中性區域的條件下針對抗原較強地結合、在核內體內的pH酸性條件下從抗原解離的本發明的“針對抗原的結合活性根據PH的條件而變化的抗原結合分子”，通過向其賦予在血漿中的PH中性區域的條件下針對FcRn的結合，促進該抗原結合分子與抗原的復合體向細胞內的并入。即，通過給予該抗原結合分子，可促進抗原從血漿中消失，降低血漿中的抗原濃度。
            
[0433]因為通常的包含Fe區的抗體在血漿中的pH中性區域的條件下不具有針對FcRn的結合活性，因此通常的抗體和抗體-抗原復合體通過非特異性的內吞作用被并入細胞內，通過在核內體內的pH酸性區域的條件下結合至FcRn而被輸送至細胞表面。FcRn將抗體從核內體內輸送到細胞表面，因此認為FcRn的一部分也存在于細胞表面，但因為細胞表面的pH中性區域的條件下抗體從FcRn解離，抗體被再循環進血漿中。
            
[0434]考慮到所述的包含作為FcRn結合結構域的Fe區的抗體在生物體內的動態的話，在血漿中的高鈣濃度的條件下針對抗原較強地結合、在核內體內的低鈣濃度的條件下從抗原解離的本發明的“針對抗原的結合活性根據鈣離子濃度的條件而變化的抗原結合分子”在血漿中結合至抗原、在核內體內解離結合的抗原，因此認為抗原的消失速度變得與非特異性的內吞作用導致的向細胞中的并入速度相同。抗原結合分子針對抗原的結合對鈣離子濃度的依賴性不充分的情況下，核內體內未解離的抗原再循環進血漿中，而在抗原結合分子針對抗原的結合對鈣離子濃度的依賴性充分的情況下，抗原的消失速度受非特異性的內吞作用導致的向細胞中的并入所限。
            
[0435]此外，在血漿中的pH中性區域的條件下針對抗原較強地結合、在核內體內的pH酸性條件下從抗原解離的本發明的“針對抗原的結合活性根據PH的條件而變化的抗原結合分子”在血漿中結合至抗原、在核內體內解離結合的抗原，因此認為抗原的消失速度變得與非特異性的內吞作用導致的向細胞中的并入速度相同。抗原結合分子針對抗原的結合的PH依賴性不充分的情況下，核內體內未解離的抗原再循環進血漿中，而在抗原結合分子針對抗原的結合的PH依賴性 充分的情況下，抗原的消失速度取決于非特異性的內吞作用導致的向細胞中的并入速度。
            
[0436]因此，通過向包含FcRn結合結構域的抗原結合分子賦予在pH中性區域中的與FcRn的結合能力，結合至細胞表面存在的FcRn的該抗原結合分子以FcRn依賴性方式并入細胞中。FcRn介導的向細胞中的并入速度比非特異性的內吞作用導致的向細胞中并入速度更快，因此通過賦予在pH中性區域中與FcRn的結合能力，可進一步加速抗原從血漿中消失的速度。即，具有在PH中性區域中針對FcRn的結合能力的抗原結合分子比通常的(血漿中的pH中性區域的條件下沒有針對FcRn的結合活性)包含Fe區的抗原結合分子更快地將抗原送入細胞內，在核內體內解離抗原，再次被再循環至細胞表面或血漿中，在此處再次結合至抗原，再由FcRn介導而并入細胞內。因為在pH中性區域中針對FcRn的結合能力變高，可加速該循環的運轉速度，因此可加速使抗原從血漿中消失的速度。進而，通過使抗原結合分子在PH酸性區域中的抗原結合活性比在pH中性區域中的抗原結合活性降低，能夠進一步提高該效率。此外認為，通過增加利用I分子的抗原結合分子的運轉數，能夠結合至I分子的抗原結合分子的抗原的數量也變多。
            
[0437]本發明的抗原結合分子包含抗原結合結構域和FcRn (特別是FcRn)結合結構域，FcRn結合結構域對與抗原的結合不產生影響，并且即使從上述機制來考慮其也不依賴于抗原的種類，認為通過使得抗原結合分子在低鈣離子濃度的條件下的抗原結合活性(結合能力)較在高鈣離子濃度的條件下的抗原結合活性降低、和/或、通過增加血漿中的PH中性區域中與FcRn的結合活性，可促進抗原結合分子向細胞內并入抗原，加速抗原的消失速度。 [0438] 本發明的抗原結合分子包含抗原結合結構域和FcRn (特別是FcRn)結合結構域，FcRn結合結構域對與抗原的結合不產生影響，并且即使從上述機制來考慮其也不依賴于抗原的種類，認為通過使得抗原結合分子在PH酸性區域的條件下的抗原結合活性(結合能力)較在PH中性區域的條件下的抗原結合活性降低、和/或、通過增加血漿中的pH中性區域中與FcRn的結合活性，可促進抗原結合分子向細胞內并入抗原，加速抗原的消失速度。
            
[0439]如關于前述結合活性的項目中所述的那樣，抗體恒定區等FcRn結合結構域對FcRn的結合活性可通過本領域技術人員公知的方法來測定，關于pH以外的條件，可由本領域技術人員合適地確定。抗原結合分子的抗原結合活性和人FcRn結合活性可作為KD (Dissociation constant:角軍離常數)、表觀 KD (Apparent dissociation constant:表觀解離常數)、作為解離速度的kd(Dissociation rate:解離速度)、或表觀kd(Apparentdissociation:表觀解離速度)等而被評價。這些可通過本領域技術人員公知的方法測定。例如可使用Biacore (GE healthcare)、Scatchard作圖、流式細胞儀等。
            
[0440]測定抗體恒定區等FcRn結合結構域針對人FcRn的結合活性時，pH以外的條件可由本領域技術人員合適地選擇，沒有特別限定。例如，如W02009125825中記載的那樣，可在MES緩沖液、37°C的條件下測定。此外，抗體恒定區等FcRn結合結構域針對人FcRn的結合活性的測定可通過本領域技術人員公知的方法來進行，例如，可使用Biac0re(GEHealthcare)等測定。抗體恒定區等FcRn結合結構域與人FcRn的結合活性的測定可通過下述方法來評價:向固定化有FcRn結合結構域或包含FcRn結合結構域的本發明的抗原結合分子或人FcRn的芯片上分別流動作為待分析物的人FcRn或FcRn結合結構域或包含FcRn結合結構域的本發明的抗原結合分子。
            
[0441]作為具有結合活性(該結合活性是指抗體恒定區等FcRn結合結構域或包含FcRn結合結構域的抗原結合分子與FcRn的結合活性)的條件的pH中性區域，通常表示pH6.7~ρΗΙΟ.0。pH中性區域優選為通過pH7.0~pH8.0的任意pH值表示的范圍，優選選自pH7.0、7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9和8.0，特別優選為接近體內的血漿中(血中)的pH的pH7.4。pH7.4處的人FcRn結合結構域與人FcRn的結合親和性低，因此在難于評價該結合親和性的情況下，可使用PH7.0代替pH7.4。本發明中，作為具有結合活性(該結合活性是指人FcRn結合結構域或包含人FcRn結合結構域的抗原結合分子與FcRn的結合活性)的條件的pH酸性區域，通常表示pH4.0~pH6.5。優選表示pH5.5~pH6.5，特別優選表示接近體內早期核內體內的pH的pH5.8~pH6.0。作為測定條件中使用的溫度，人FcRn結合結構域或包含人FcRn結合結構域的抗原結合分子與FcRn的結合親和性也可使用10°C~50°C中的任意溫度來評價。優選地，為了確定人FcRn結合結構域或包含人FcRn結合結構域的抗原結合分子與FcRn的結合親和性，使用15°C~40°C的溫度。更優選地，20°C~35°C 中的任意溫度，例如 20°C、2rC、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C和35 °C中的任一溫度，也可同樣用于確定人FcRn結合結構域或包含人FcRn結合結構域的抗原結合分子與FcRn的結合親和性。25°C這樣的溫度是本發明的實施方式的一個非限定性例子。[0442]根據The Journal of Immunology (2009) 182:7663-7671，天然型人 IgGl 的人FcRn結合活性在pH酸性區域(pH6.0)下為KDl.7 μ M，但在pH中性區域中則基本檢測不到。因此,在優選的方式中,在pH酸性區域和pH中性區域中具有人FcRn結合活性的本發明的抗原結合分子(包括pH酸性區域中的人FcRn結合活性為KD20 μ M或更強、pH中性區域中的人FcRn結合活性為與天然型人IgG同等或更強的抗原結合分子)可被篩選。在更優選的實施方式中，pH酸性區域中的人FcRn結合活性為KD2.ΟμΜ或更強、pH中性區域中的人FcRn結合活性為KD40 μ M或更強的抗原結合分子可被篩選。在進一步更優選的實施方式中，pH酸性區域中的人FcRn結合活性為KD0.5μ M或更強、pH中性區域中的人FcRn結合活性為KD15 μ M或更強的抗原結合分子可被篩選。上述KD值可根據The Journal ofImmunology(2009) 182:7663-7671中記載的方法(將抗原結合分子固定于芯片上，將人FcRn作為待分析物流動)來確定。
            
[0443]本發明中，優選在pH酸性區域和pH中性區域中具有人FcRn結合活性的FcRn結合結構域。該結構域如果本來就是在PH酸性區域和pH中性區域中具有人FcRn結合活性的FcRn結合結構域的話，則其可原樣使用。該結構域在pH酸性區域和/或pH中性區域中沒有人FcRn結合活性或者人FcRn結合活性弱的情況下，可通過修飾抗原結合分子中的氨基酸，來獲得具有期望的對人FcRn的結合活性的FcRn結合結構域，但也可通過修飾人FcRn結合結構域中的氨基酸，來獲得在PH酸性區域和/或pH中性區域中具有期望的對人FcRn的結合活性的FcRn結合結構域。另外，通過預先在pH酸性區域和/或pH中性區域中具有人FcRn的結合活性的FcRn結合結構域中的氨基酸的修飾，也可以獲得具有所期望的對人FcRn的結合活性的FcRn結合結構域。這樣的獲得所期望的結合活性的人FcRn結合結構域的氨基酸修飾，可通過對氨基酸修飾前和修飾后的PH酸性區域和/或pH中性區域中的人FcRn結合活性加以比 較來發現。本領域技術人員還可使用公知的手段來實施合適的氨基酸修飾。
            
[0444]本發明中，FcRn結合結構域的“氨基酸的修飾”或“氨基酸修飾”包括修飾為與起始FcRn結合結構域的氨基酸序列不同的氨基酸序列。起始FcRn結合結構域的修飾體能在PH酸性區域和/或中性區域中結合人FcRn即可(因此，起始FcRn結合結構域并不需要要有在pH酸性區域和/或中性區域的條件下對人FcRn的結合活性)，任一 FcRn結合結構域均可作為起始結構域使用。作為起始FcRn結合結構域的例子,可優選舉出IgG抗體的恒定區，即序列號14~17中任一表示的天然型的恒定區。此外，將已經添加了修飾的FcRn結合結構域作為起始FcRn結合結構域、額外進行了修飾的修飾FcRn結合結構域也可優選作為本發明的修飾FcRn結合結構域而使用。起始FcRn結合結構域可表示多肽自身、包含起始FcRn結合結構域的組合物、或者編碼起始FcRn結合結構域的氨基酸序列。起始FcRn結合結構域中可包含抗體的項目中概述的通過重組產生的公知的IgG抗體的FcRn結合結構域。起始FcRn結合結構域的來源沒有限定，其可從非人動物的任意生物或從人獲得。優選地，作為任意生物，可優選舉出選自小鼠、大鼠、旱獺、倉鼠、沙鼠、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝和非人靈長類的生物。其它形式中，起始FcRn結合結構域還可從食蟹獼猴、狨猴、獼、黑猩猩或人獲得。雖然起始FcRn區優選從人IgG獲得，但不限于IgG的特定類別。這表示可合適地使用人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fe區作為起始Fe區。作為人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fe區，由于基因多態性產生的多條異型(allotype)序列被記載于Sequencesof proteins of immunological interest, NIH Publication N0.91-3242 中，其任一均可用于本發明中。特別地，作為人IgGl的序列，EU編號356-358位的氨基酸序列可以為DEL也可以為EBL同樣，在本說明書中意味著來自前述任意生物的IgG的任意類別或亞類的FcRn結合結構域可優選作為起始FcRn結合結構域使用。天然存在的IgG的變體或經操作的形式的例子被記載于公知的文獻(Curr.0pin.Biotechnol.(2009) 20 (6)，685-91、Curr.0pin.1mmunol.(2008)20 (4)，460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23 (4)，195-202、W02009086320、W02008092117、W02007041635JPW02006105338)中，但不限于那些。
            
[0445]為了向包含FcRn (特別是人FcRn)結合結構域的抗原結合分子賦予在pH中性區域中對FcRn (特別是人FcRn)的結合能力，可向與FcRn的結合相關的FcRn結合結構域中的氨基酸施加合適的變異。使用抗體IgG分子的恒定區作為FcRn結合結構域的情況下,可舉出下述經修飾的恒定區，其中，以EU編號表示的第221位~225位、227位、228位、230位、232 位、233 ~241 位、243 ~252 位、254 ~260 位、262 ~272 位、274 位、276 位、278 ~289 位、291 ~312 位、315 ~320 位、324 位、325 位、327 ~339 位、341 位、343 位、345 位、360 位、362 位、370 位、375 ~378 位、380 位、382 位、385 ~387 位、389 位、396 位、414 位、416位、423位、424位、426~438位、440位和442位的位置處的氨基酸與天然型IgG的恒定區的相應氨基酸不同。更具體而言，可舉出下述恒定區的修飾體，其中例如以EU編號表示的第256位的氨基酸為Pro、第280位的氨基酸為Lys、第339位的氨基酸為Thr、第385位的氨基酸為His、第428位的氨基酸為Leu、和/或第434位的氨基酸為Trp、Tyr、Phe、Ala或His中的任一個。通 過使用這些修飾體，可使得IgG型免疫球蛋白的Fe區在pH中性區域中對人FcRn的結合活性變強。
            
[0446]此外,還可合適地使用能使得在pH酸性區域中對人FcRn的結合比天然型IgG的恒定區強的修飾體。這些修飾體中，可合適地選擇即使在pH中性區域中對人FcRn的結合也能變強的修飾體，將其用于本發明中。作為這樣的例子，可舉出下述經修飾的恒定區，其中恒定區中以EU編號表示的氨基酸與天然型IgG的恒定區的相應氨基酸不同。作為這樣的氨基酸的修飾例，可優選地使用包含表1中列舉的氨基酸的恒定區的修飾體。
            
[0447]表1
            
【權利要求】
            
1.一種文庫，主要由互相之間序列不同的多個抗原結合分子構成，其特征在于，所述抗原結合分子中的抗原結合結構域包含至少一個下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化。
            
2.如權利要求1所述的文庫，其中，離子濃度為鈣離子濃度。
            
3.如權利要求2所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在所述抗原結合分子的重鏈的抗原結合結構域中。
            
4.如權利要求3所述的文庫，其中，重鏈的抗原結合結構域為重鏈可變區。
            
5.如權利要求4所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在重鏈可變區的CDR3中。
            
6.如權利要求2~5中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于重鏈CDR3的以Kabat編號法表示的第95位、96位、IOOa位和/或101位處。
            
7.如權利要求2~6中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基以外的氨基酸序列包含天然序列的氨基酸序列。
            
8.如權利要求3~7中任一項所述的文庫，其中，所述抗原結合分子的輕鏈可變區包含天然序列的氨基酸序列。
            
9.如權利要求2所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在所述抗原結合分子的輕鏈的抗原結合結構域中。
            
10.如權利要求9所述 的文庫，其中，輕鏈的抗原結合結構域為輕鏈可變區。
            
11.如權利要求10所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈可變區的CDRl中。
            
12.如權利要求11所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于CDRl的以Kabat編號法表示的第30位、31位和/或32位處。
            
13.如權利要求10~12中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈可變區的⑶R2中。
            
14.如權利要求13所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于輕鏈的CDR2的以Kabat編號法表不的第50位處。
            
15.如權利要求10~14中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為輕鏈的CDR3。
            
16.如權利要求15所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于輕鏈的CDR3的以Kabat編號法表不的第92位處。
            
17.如權利要求2或9~16中任一項所述的文庫，其中，所述抗原結合分子的輕鏈的框架包含生殖細胞系的框架序列。
            
18.如權利要求2或9~17中任一項所述的文庫，其中，所述抗原結合分子的重鏈可變區包含天然序列的氨基酸序列。
            
19.如權利要求1~18中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基形成鈣結合基序。
            
20.如權利要求19所述的文庫，其中，鈣結合基序為鈣粘蛋白結構域、EF-HAND,C2結構域、Gla結構域、C型凝集素、結構域、膜聯蛋白、血小板反應蛋白3型結構域及EGF樣結構域、Vk5的部分、序列號10、序列號11中的任意的鈣結合基序。
            
21.如權利要求2~20中任一項所述的文庫,其中,所述氨基酸殘基為具有金屬螯合作用的氨基酸。
            
22.如權利要求21所述的文庫，其中，具有金屬螯合作用的氨基酸為絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸中的任意一種以上的氨基酸。
            
23.如權利要求1所述的文庫，其中，離子濃度的條件為pH。
            
24.如權利要求23所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在所述抗原結合分子的重鏈的抗原結合結構域中。
            
25.如權利要求24所述的文庫，其中，重鏈的抗原結合結構域為重鏈可變區。
            
26.如權利要求25所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于重鏈可變區的以Kabat編號法表示的第27位、31位、32位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61 位、62 位、95 位、96 位、97 位、98 位、99 位、IOOa 位、IOOb 位、IOOd 位、IOOf 位、IOOh 位、.102位或107位的任意一處以上。
            
27.如權利要求26所述的文庫，其中，重鏈可變區的以Kabat編號法表示的第27位、.31位、32位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位、62位、95位、.96 位、97 位、98 位、99 位、IOOa 位、IOOb 位、IOOd 位、IOOf 位、IOOh 位、102 位或 107 位的任一處的氨基酸殘基以外的氨基酸序列包含天然序列的氨基酸序列。
            
28.如權利要求23~27中任一項所述的文庫，其中，所述抗原結合分子的輕鏈可變區包含生殖細胞系的序列。
            
29.如權利要求23所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在所述抗原結合分子的輕鏈的抗原結合結構域中。
            
30.如權利要求29所述的文庫，其中，輕鏈的抗原結合結構域為輕鏈可變區。
            
31.如權利要求30所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于輕鏈可變區的以Kabat編號法表示的第24位、27位、28位、30位、31位、32位、34位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、89位、90位、91位、92位、93位、94位或95a位的任意一處以上。
            
32.如權利要求30或31所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈可變區的CDRl 中。
            
33.如權利要求32所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于輕鏈的CDRl的以Kabat編號法表示的第24位、27位、28位、30位、31位、32位或34位的任意一處以上。
            
34.如權利要求30~33中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDR2 中。
            
35.如權利要求34所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含于輕鏈的CDR2的以Kabat編號法表示的第50位、51位、52位、53位、54位、55位或56位的任意一處以上。
            
36.如權利要求30~35中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDR3 中。
            
37.如權利要求36所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基被包含在輕鏈的CDR3的以Kabat編號法表示的第89位、90位、91位、92位、93位、94位或95a位的任意一處以上。
            
38.如權利要求29~37中任一項所述的文庫，其中，輕鏈的框架包含生殖細胞系的框架序列。
            
39.如權利要求29~38中任一項所述的文庫，其中，重鏈可變區為天然序列。
            
40.如權利要求23~39中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為側鏈的pKa為.4.0-8.0的氨基酸。
            
41.如權利要求23~40中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為谷氨酸。
            
42.如權利要求23~39中任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為側鏈的pKa為.5.5-7.0的氨基酸。
            
43.如權利要求23~40或42的任一項所述的文庫，其中，所述氨基酸殘基為組氨酸。
            
44.一種文庫，主要由包含權利要求1~43任一項中記載的抗原結合分子的多個融合多肽構成，其特征在于，所述融合多肽為抗原結合分子的重鏈可變區與病毒外殼蛋白質的至少一部分融合而成的。
            
45.如權利要求44所述的文庫，其中，所述病毒外殼蛋白質選自由蛋白質pill、主外殼蛋白質pVII1、pVI1、pIX、Soc、Hoc、gpD、pvl及其變體構成的組。
            
46.—種組合物,其包含多個多核苷酸分子,所述多個多核苷酸分子分別編碼權利要求1~43中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或權利要求44或45中記載的互相之間序列不同的融合多肽。
            
47.一種組合物，其包含多種載體，所述載體分別包含處于可作用地連接的狀態的、權利要求46中記載的多個多核苷酸分子。
            
48.如權利要求47所述的組合物，其中，載體為可復制的表達載體。
            
49.如權利要求48所述的組合物，其中，可復制的表達載體中，所述多核苷酸被可作用地連接至選自lac Z 啟動子系、堿性磷酸酶pho A啟動子(Ap)、噬菌體λ PL啟動子(溫度感受性啟動子)、tac啟動子、色氨酸啟動子、pBAD啟動子及噬菌體T7啟動子中的啟動子區域。
            
50.如權利要求48或49所述的組合物，其中，可復制的表達載體為M13、fl、fd、Pf3噬菌體或其衍生物、或λ型噬菌體或其衍生物。
            
51.一種組合物，其包含多種病毒，所述多種病毒分別包含權利要求47~50的任一項中記載的載體。
            
52.一種組合物，其包含多種病毒，所述多種病毒在表面分別提呈權利要求1~43中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或權利要求44或45中記載的互相之間序列不同的融合多肽。
            
53.一種文庫，其包含權利要求1~43中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或權利要求44或45中記載的互相之間序列不同的融合多肽，所述文庫具有IX IO6至IXlO14個彼此不同的可變區序列。
            
54.如權利要求53所述的文庫，其具有IXlO8以上的彼此之間不同的可變區序列。
            
55.一種文庫的制作方法，所述文庫主要由互相之間序列不同的多個抗原結合分子構成，所述方法包括制造多個抗原結合分子，所述抗原結合分子被設計為:所述抗原結合分子中的抗原結合結構域包含至少一個下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基使得抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化。
            
56.如權利要求55所述的制作方法，其中，所述抗原結合分子為權利要求2~43任一項中記載的抗原結合分子。
            
57.如權利要求55或56所述的制作方法，其中，所述抗原結合分子的重鏈可變區與病毒外殼蛋白質的至少一部分融合。
            
58.如權利要求55~57中任一項所述的制作方法,其中,所述病毒外殼蛋白質選自由蛋白質pill、主外殼蛋白質pVII1、pVI1、pIX、Soc、Hoc、gpD、pvl及其變體構成的組。
            
59.一種選擇抗原結合分子的方法，所述抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化，所述方法包括:  a)制作文庫的步驟，所述文庫主要由權利要求1~43任一項中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或權利要求44或45任一項中記載的互相之間序列不同的融合多肽構成，  b)步驟，使所述文庫在離子濃度不同的兩種以上的條件下與抗原接觸，  c)步驟，從所述文庫中分級分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的抗原結合分子的集群，  d)步驟，從c)中分級分離的集群中分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的抗原結合分子。
            
60.一種分離多核苷酸的方法，所述多核苷酸編碼針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的抗原結合分子，所述方法包括下述步驟:  a)制作文庫的步驟，所述文庫包含多個可復制的表達載體，所述多個可復制的表達載體分別包含處于被可作用地連接的狀態的多個多核苷酸，所述多個多核苷酸分別編碼權利要求I~43任一項中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或權利要求44或45任一項中記載的互相之間序列不同的融合多肽，   b)步驟，在已經導入了所述文庫中包含的各表達載體的多種病毒的表面、表達通過所述多核苷酸編碼的所述互相之間序列不同的抗原結合分子或融合多肽，  c)步驟，將所述的多種病毒在離子濃度不同的兩種以上的條件下與抗原接觸，  d)步驟，從所述文庫中分級分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒的集群，  e)步驟，從d)中分級分離的病毒的集群中分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒，  f)步驟，從分尚的病毒中分尚多核苷酸。
            
61.如權利要求60所述的方法，其中，所述c)至d)的步驟追加反復至少I次。
            
62.如權利要求59~61中任一項所述的方法，其中，離子濃度為鈣離子濃度。
            
63.如權利要求62所述的方法，其中，選擇在低鈣濃度的條件下針對抗原的結合活性比在高鈣濃度的條件下的結合活性低的抗原結合分子。
            
64.如權利要求63所述的方法，其中，低鈣濃度的條件為0.1μΜ~30μΜ。
            
65.如權利要求63或64所述的方法，其中，高鈣濃度的條件為100μ M~10mM。
            
66.如權利要求59~61中任一項所述的方法，其中，離子濃度的條件為pH。
            
67.如權利要求66所述的方法，其中，選擇在pH酸性區域條件下針對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下的結合活性低的抗原結合分子。
            
68.如權利要求66所述的方法，其中，pH酸性區域條件為pH4.0~6.5。
            
69.如權利要求67或68所述的方法，其中，pH中性區域條件為pH6.7~10.0。
            
70.一種抗原結合分子的制造方法，所述抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化，所述制造方法包括下述步驟:  a)制作文庫的步驟，所述文庫包含多個可復制的表達載體，所述多個可復制的表達載體分別包含處于被可作用地連接的狀態的多個多核苷酸，所述多個多核苷酸分別編碼權利要求I~43任一項中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或權利要求44或45任一項中記載的互相之間序列不同的融合多肽，  b)步驟，在已經導入了所述文庫中包含的各表達載體的多種病毒的表面、表達通過所述多核苷酸編碼的所述互相之間序列不同的抗原結合分子或融合多肽，  C)步驟，將所述的多種病毒在離子濃度不同的兩種以上的條件下與抗原接觸，  d)步驟，從所述文庫中分級分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒的集群，  e)步驟，從d)中分級分離的病毒的集群中分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒，  f)步驟，從分尚的病毒中分尚多核苷酸，  g)步驟，培養導入了下述載體的宿主細胞，所述載體中插入了經分離的多核苷酸，所述多核苷酸處于被可作用地連接的狀態被插入，  h)步驟，從g)中培養的培養液中回收抗原結合分子。
            
71.—種抗原結合分子的制造方法，所述抗原結合分子針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化，所述制造方法包括下述步驟:  a)制作文庫的步驟，所述文庫包含多個可復制的表達載體，所述多個可復制的表達載體分別包含處于被可作用地連接的狀態的多個多核苷酸，所述多個多核苷酸分別編碼權利要求I~43任一項中記載的互相之間序列不同的抗原結合分子或權利要求44或45任一項中記載的互相之間序列不同的融合多肽，  b)步驟，在已經導入了所述文庫中包含的各表達載體的多種病毒的表面、表達通過所述多核苷酸編碼的所述互相之間序列不同的抗原結合分子或融合多肽，  c)步驟，將所述多種病毒在離子濃度不同的兩種以上的條件下與抗原接觸，  d)步驟，從所述文庫中分級分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒的集群，  e)步驟，從在d)中分級分離的病毒的集群中分離針對抗原的結合活性根據離子濃度的條件而變化的病毒，  f)步驟，從分尚的病毒中分尚多核苷酸，  g)步驟，將經分離的多核苷酸以符合讀碼框的方式與編碼抗體恒定區的多核苷酸連接，  h)步驟，培養導入了下述載體的宿主細胞，所述載體中插入了在g)中被連接的多核苷酸，所述多核苷酸以處于被可作用地連接的狀態被插入，  i)步驟，從在h)中培養的培養液中回收抗原結合分子。
            
72.如權利要求70或71所述的制造方法，其中，所述c)至d)的步驟追加反復至少I次。
            
73.如權利要求70~72中任一項所述的制造方法，其中，離子濃度為鈣離子濃度。
            
74.如權利要求73所述的制造方法，其中，選擇在低鈣濃度的條件下針對抗原的結合活性比在高鈣濃度的條件下的結合活性低的抗原結合分子。
            
75.如權利要求74所述的制造方法，其中，低鈣濃度的條件為0.1 μΜ~30 μΜ。
            
76.如權利要求74或75所述的制造方法，其中，高鈣濃度的條件為100μ M~10mM。
            
77.如權利要求70~72中任一項所述的制造方法，其中，離子濃度的條件為pH的條件。
            
78.如權利要求77所述的制造方法，其中，選擇在pH酸性區域條件下針對抗原的結合活性比在PH中性區域條件下的結合活性低的抗原結合分子。
            
79.如權利要求78所述的制造方法，其中，pH酸性區域條件為pH4.0~6.5。
            
80.如權利要求78或79所述的制造方法，其中，pH中性區域條件為pH6.7~10.0。
            
81.根據權利要求70~80中任一項所述的制造方法制造的抗原結合分子。
            
82.—種醫藥組合物，包 含權利要求81所述的抗原結合分子或其經修飾體。
            
【文檔編號】G01N33/15GK103975060SQ201280058080 
            
【公開日】2014年8月6日   申請日期:2012年9月28日   優先權日:2011年9月30日
            
【發明者】井川智之, 石井慎也, 舩木美步, 廣庭奈緒香, 清水駿   申請人:中外制藥株式會社
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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