膿毒癥血液生物標志物系統的制作方法

膿毒癥血液生物標志物系統的制作方法
【專利摘要】一組血液生物標志物，其用于利用iNOS指示物結合患者對成為膿毒性的傾向、器官損傷的存在、或從膿毒癥發作癥狀(episode)的惡化或恢復的一種或多種指示物來評價膿毒癥病癥。
【專利說明】膿毒癥血液生物標志物系統
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請根據35U.S.C.§ 119(e)，要求于2010年9月22日提交的美國臨時專利申請號:61/403,919的優先權，其內容通過引用全部并入本文。
[0003]發明背景
[0004]本發明涉及一組新穎并實用的生物標志物，其顯示膿毒癥的傾向、發作、進展，以及由于膿毒癥病理的存在的器官損傷即膿毒癥病癥(sepsis condition)。
[0005]每年至少700萬例患者進入膿毒癥病理的早期階段，名為全身炎癥反應綜合征(SIRS)的醫學病癥，其將導致在美國每年超過250，000例死亡，并在世界范圍的每年超過750，000例死亡。隨著人口老齡化，預計更多人將罹患SIRS。膿毒癥從源自患者對感染無力抵抗的多種細菌和真菌來源發展而來，并通常在從重傷以及從在醫院的手術康復時獲得。
[0006]參考Levenson, D (2008) “The Quest For Faster Sepsis Diagnosis” ClinicalLab News, 34#1:1-5 ;以及Bone, R(1996)“Why Sepsis Trials Fail”JAMA, 276#7:565-566，其描述了對極惡的膿毒癥病理的早期診斷的需求，以提供早期患者治療以及重新安排治療的費用。對膿毒癥病理的補充測試也存在需求。也就是說，需要補充測試以提供以下數據:
[0007]1.區分被懷疑成為膿毒性的而將不會形成膿毒癥的患者，與被懷疑成為膿毒性的且將成為膿毒性的、嚴重膿毒性的或患有膿毒性休克的那些患者。
[0008]2.確定個體患者成為膿毒性的易感性。
[0009]3.按膿毒癥的發作癥狀(印isode)，將個體患者的當前狀態分為“非常早期〃、“早期”、或“中期”；以及
[0010]4.關于個體患者的癥狀被預期惡化或改善的可能性。
[0011]另外，此類測試對形成決策樹(decision tree)是必要的,允許主治醫師針對他們的患者做出關鍵重要的治療決定。
[0012]目前用于診斷膿毒癥的實驗室培養物方法具有很多問題:
[0013]1.它們是緩慢的。使用目前的培養物方法，只有在培養24小時后才得到第一答案，且絕對答案需要培養48小時的最小值。
[0014]2.血液培養只產生了約28 %的成為膿毒性的患者中的陽性結果(即，膿毒癥是存在的)。因此，超過70%的患者沒有產生陽性血液培養物。Sands, KE等人(1997) “Epidemiology Of Sepsis In The United States Froml979to2000”N Engl JMed, 348:1546-1554 ;以及 Martin, CS 等人(2003)“Epidemiology Of Sepsis In8AcademicMedical Centers” JAMA, 278:234-240。
[0015]膿毒癥和嚴重膿毒癥的潛在的生物標志物，例如TNFa、IL_1 β、IL_6、硝酸鹽/亞硝酸鹽、乳酸鹽、原降鈣素，以及許多其它潛在的生物標志物，已由不同的研究者評價了它們的預測值。僅有三種被報道是有用的。兩組研究者已經報道了很高水平的IL-6(大于1000pg/mL)與高炎性(hyperinflammatory)病癥相關聯,且可指示接受中和TNF α單克隆抗體的膿毒性患者的差的結果。
[0016] 已經在患有SIRS、膿毒癥及嚴重膿毒癥的患者中檢測到原降鈣素的增加的水平。循環原降?丐素的來源源自激活的實質細胞(parenchymal cell),但是它在血液中增加的存在與降鈣素或降鈣素基因相關肽的循環增加無關，降鈣素和降鈣素基因相關肽是從原降鈣素的加工獲得的兩種“正常”產物。在上述的Levenson.D.參考文獻中，報道了原降鈣素測定(PCT)已被FDA批準用于在ICU中診斷膿毒癥，但它的使用并沒有導致減少的發病率或
死亡率。
[0017]血液中硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度的增加已顯示與膿毒癥相關且可預見差的結果。增加的硝酸鹽/亞硝酸鹽水平的來源已被假定歸因于iNOS的誘導。iNOS的誘導已顯示不僅在革蘭氏陰性細菌存在的情況下發生，而且還在具有革蘭氏陽性細菌和真菌感染的情況下發生。血漿內毒素(脂多糖或LPS)的測試內毒素活性測定(EAA測試)也已被FDA批準用于膿毒癥的診斷:然而，如同原降鈣素PCT測定，根據上述Levenson參考文獻，它的使用沒有被證實可降低發病率或死亡率。
[0018]分子診斷PCR測試(Roche PCR)在歐洲已持續多年被采用，但Roche PCR測試并沒有降低膿毒癥病理的事件或嚴重程度。
[0019]PCT測試、內毒素EAA測試或基于Roche PCR的測試都沒有被證實滿足膿毒癥早期診斷的要求，即使這三種測試全部已被FDA批準。上述Levenson參考文獻得出以下結論:目前FDA批準的診斷方法沒有一個是有效的。
[0020]如迄今為止所述的，膿毒癥幾乎總是起始于細菌或真菌感染，但病理起因于個體患者對來自死亡的微生物的細胞壁成分的高炎性反應，其當機體試圖抵抗其中此類微生物被殺死后的感染時產生。死 亡的微生物釋放其細胞壁的部分進入血液中而引起“細胞因子風暴(cytokine storm)”。在一些個體中，這一系列事件最終導致已知為膿毒癥的病理。上述 Sands KE, Martin GS 的文章，以及其它文章；Kohn LT, Corrigan JM, Donaldson MS,編者，(2000) “To Err Is Human:Building A Safer Health System”.Washington (D.C.) !National Academies Press,第 1-287 頁，描述了此胺毒癥病理。
[0021]存在“無菌的”膿毒癥的概念，但很難被證明。“無菌膿毒癥(sterile s印sis) ”已被假定由來自重大創傷的壞死細胞引發，該壞死細胞釋放它們的細胞內含物尤其是線粒體核酸和蛋白進入循環系統，并從而引發“細胞因子風暴”。不論是怎樣的誘導方式，“細胞因子風暴”都導致iNOS的表達。此外，當細胞被誘導表達iNOS時，它注定通過程序性細胞死亡(細胞凋亡)的方式而死亡。為了了解膿毒癥病理的發作，人們需要了解膿毒癥中細胞凋亡過程如何不起作用(malfunction)。被“細胞因子風暴”誘導的表達iNOS的細胞，通常注定通過細胞凋亡的方式死亡并被巨噬細胞清除。待被巨噬細胞清除的細胞，通過在它們的外部細胞膜上表達新的受體并通過將來自細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸轉移到磷脂雙分子層的外側，用“吃掉我(eat me)”信號標記它們自己。這些是用于巨噬細胞吞噬凋亡細胞、
[0022]以及凋亡體(apoptotic body)或從細胞脫落的其它微泡的“吃掉我”信號。
[0023]該正常清除過程的結果是任何凋亡細胞的成分都未被釋放。
[0024]美國專利6，531，578 ;以及 7，188，904 以及 Webber, R.J.和 Dunnebacke, T.H.(2003)的文章 “ Inducible Nitric Oxide Synthase Is An Early Plasma BiomarkerFor The Onset Of Sepis，，43rd Inter.Conf.Antimicrob.Agents Chemothem.(Webber I) ；ffebber, R.J.等人(2005) “Development, Characterization, And EpitopeMapping Of A Panel Of Twenty-Four Monoclonal Antibodies Specific For HumanInducible Nitric Oxide Synthase Hybridoma，，24:6-13.(Webber II) ;Gambin,MH.等人(2007) ^Platelet-derived Exosomes Induce Endothelial Cell ApoptosisThrough Peroxynitrite Generation:Experimental Evidence For A Novel MechanismOf Septic Vascular Dysfunction”Critical Care2007, 11:R107 ；Azevedo LCP,等人(2007) “Platelet-derived Exosomes From Septic Shock Patients Induce MyocardialDysfunction” Critical Care2007, 11:R120 ；Mortaza S,等人(2009) “DetrimentalHemodynamic And Inflammatory Effects Of Microparticles Originating From SepticRats” Critical Care Med, 37#6:2045-2060 ;于 2005 年 5 月 19 日提交的基于美國專利申請系列 #11/129，452 的 Webber R.J., Webber, D.S.,和 Dixon T.H.(2005) “ImprovedTherapeutic Agent For iNOS Generating Illness，，PCT 申請 W02005/120569(WebberIII) ；ffebber, R.J., Dunnebacke, T.H.,和 Webber, D.S.(2006) “Neutralization In VivoOf Particulate iNOS With Humanized Ant1-1NOS mAbs Rescues Mice From Death BySepis，，46th Inter.Conf.Antimicrob.Agents Chemothem.(Webber IV)，都解決了與正常清除過程失敗相關的問題。這些參考文獻中的數據令人信服地證明了引發膿毒癥病理的是異常的細胞凋亡，其中由于以下任一原因巨噬細胞沒有適當地清除誘導的含有iNOS的凋亡細胞:
[0025]1.含有iNOS的凋亡細胞未用“吃掉我”記號(sign)正確地標記它們自己；
[0026]2.巨噬細 胞沒有正確識別含有iNOS的凋亡細胞上的“吃掉我”標記，或；
[0027]3.發生了巨噬細胞的局部耗竭且其它巨噬細胞未能被足夠快地招募到某個部位以清除含有iNOS的凋亡細胞。
[0028]在上述Webber III和Webber IV中也已表明，未被清除的凋亡細胞經歷二次壞死。即，細胞膨脹，爆裂，并釋放其內含物進入循環系統。之前引用的參考文獻的數據清楚地顯示誘導的含有iNOS的凋亡細胞的破裂導致釋放iNOS進入循環系統，該凋亡細胞經歷異常的凋亡并通過二次壞死而不是程序性細胞死亡的方式死亡。數據已經證明這種機制僅出現在膿毒性患者中，由于獲自膿毒性患者或將在接下來的24-72小時內成為膿毒性的患者的血漿樣品中iNOS的存在可通過夾心EIA并通過蛋白質印跡分析專門地被檢測并被測量。這樣的結果已在獲自超過100例懷疑成為膿毒性的不同患者的樣本中被證實。最近，三個獨立的研究者組已經證實了這些發現。Gambin等人，同上，報道了在來自他們測試的所有膿毒性ICU患者的血漿樣品中發現iNOS，但未在來自之前引用的正常健康志愿者或非膿毒性ICU患者的血漿中發現iNOS。此外，上述Gambin等人的參考文獻，證實了血漿中的iNOS被包含在微泡(MV)中。Azeved0等人，同上，擴展了這些發現，報道了在被測試的每位膿毒性ICU患者的血漿中檢測到iNOS，但是同樣，未在來自健康對照或非膿毒性ICU患者的血漿中檢測到iNOS。如在之前引用的Gambin等人中所述的，血漿中的iNOS被包含在循環的微泡內。最近，Mortaza等人，同上，通過導致多種微生物腹膜炎的盲腸結扎和穿刺在大鼠中誘導膿毒癥。Mortaza,同上，分離來自正常大鼠、假手術大鼠以及患有腹膜炎的膿毒性大鼠的循環MV;并然后給健康的大鼠服用純化的MV。當施用于健康的接受者(recipient)大鼠時，從正常和假手術大鼠分離的MV沒有效果。然而，從患有腹膜炎的膿毒性大鼠分離的MV，由于通過MV易位到主動脈和心臟(并且可能地其它部位)的iNOS過量產生NO，造成健康的接受者大鼠中的低血壓。這最終導致接受者動物中的血液動力學塌陷(hemodynamiccollapse)(很多大鼠在研究階段結束之前就死于血液動力學塌陷)。概括地說，這些參考文獻的組合數據證明了，在膿毒癥中發生的是異常的細胞凋亡，其導致:
[0029][I]被誘導產生iNOS的細胞的二次壞死，[2] iNOS,包括MV相關的iNOS釋放進入循環系統，以及
[0030][3]最終，導致威脅生命的膿毒癥級聯反應。因此，被誘導的含有iNOS的凋亡細胞中正常清除過程的破壞，導致了該膿毒癥的級聯反應。換句話說，含有iNOS的凋亡細胞沒直被巨噬細胞適當地清除:相反它們經歷了二次壞死、膨脹、爆裂，并釋放它們的細胞內含物包括血漿iNOS進入循環系統。 [0031]如Gambin等人，同上，Azevedo等人，同上，Mortaza等人，同上，美國專利6，531，578和7，198,904，Webber 1、I1、III和IV,同上，所顯示的，由循環MV相關的iNOS造成的心臟、肺、腎以及其它器官的細胞和組織的損傷引發了膿毒癥級聯反應。只要iNOS保留在循環系統中，它就是無活性的酶，因為它所需要的輔因子(cofactor)中的兩種(NADPH和四氫生物蝶呤)不存在于血漿中。然而，當循環的微泡駐留(lodge)在遠端部位的細胞的外膜上時，兩種脂質雙分子層融合，且微泡的內含物被內在化到“接受者”細胞。關于從血小板、白細胞和內皮細胞釋放的微粒和微泡的這些過程，在以下的文章中已被最好地描述:Ratajczak J,等人(2006) “Membrane-derived Microvesicles:1mportantAnd Underappreciated Mediators Of Cell-to-cell Communication”Leukemia, 20:1487-1495 ；Ardoin SP (2007) “The Role Of Microparticles In Inflammation AndThrombosis^Scand J Immun, 66:159-165 ；Lynch SF,等人(2007)“Plasma MicroparticlesAnd Vascular Disorders^Brit J.Haemotol, 137:36-48 ；Distler JHW,等人(2005) “TheRelease Of Microparticles By Apoptotic Cells And Their Effects On MacrophageApoptosis” 10:731-741 ;Majka M,等人(2007) “Evidence That Platelet-derivedMicrovesicles May Transfer Platelet-specific Immunoreactive Antigens ToThe Surface Of Endothelial Cells And CD34+Hematopoietic Stem/ProgenitorCells-1mplication For The Pathogenesis Of Immune Thrombocytopenias”FoliaHistochem et Cytobiol, 45:27-32 ；Valadi H,等人(2007) “Exosome-mediated TransferOf mRNAs And MicroRNAs Is A Novel Mechanism Of Genetic Exchange BetweenCells^Nature Cell Biol, 9#1:654-659。含有iNOS的微泡嵌入“接受者”細胞之后，MV相關的iNOS成為活性酶，因為它具有所有其需要的底物和輔因子。然而，iNOS酶現在成為從未被誘導的細胞的成分，iNOS酶處在不適當的部位，并且宿主“接受者”細胞脫離正常的細胞調節。進入“接受者”細胞并有活性之后，iNOS酶產生大量有毒的一氧化氮，導致對“接受者”細胞的損傷和/或致其死亡:對心肌細胞的損傷導致血液動力學塌陷(AzevedoLCP和Mortaza，S，同上)；且對肺的損傷導致肺功能障礙。同樣，對組成血腦屏障的細胞、腸的緊密連接、腎的腎小球內皮細胞、以及循環系統的毛細血管床的損傷則導致微穿孔的形成，通過其可發生滲漏，如以下文章中所描述的:Han X，等人(2004) “Increased iNOSActivity Is Essential For Pulmonary Epithelial Tight Junction DysfunctionIn Endotoxemic Mice，，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 286:L259-267 ；Han X,等人(2004) “Increased iNOS Activity Is Essential For Hepatic EpithelialTight Junction Dysfunction In Endotoxemic Mice，，Am J Physiol GastrointestLiver Physiol，286:G126_G136 ;Han X，等人(2004) “Increased iNOS Activity IsEssential For Intestinal Epithelial Tight Junction Dysfunction in EndotoxemicMice” Shock, 21#3:261_270。
[0032]美國專利6，531，578和7，198，904描述了利用一組接觸單克隆抗體的針對人iNOS的一種優越的體外診斷(IVD)測試，且這些美國專利通過引用以其整體并入本文。iNOS，一種細胞內酶，是僅在膿毒性患者或在接下來的24-72小時內將成為膿毒性的患者中發現的血漿生物標志物。iNOS正常不存在于血液循環中，但在出現膿毒癥的生理癥狀前I至3天被發現出現于血漿之中。這種IVD測試可區別ICU中將不會成為膿毒性的創傷患者和ICU中將會惡化為膿毒癥并伴有器官功能障礙的那些創傷患者，或將會惡化為膿毒性休克并伴有多器官衰竭的那些創傷患者。
[0033]對向主治醫師提供另外的至關重要的信息的另外的并更有效的IVD測試存在需求，其應允許主治醫師評價個體患者的膿毒性病癥，諸如患者成為膿毒性的易感性、患者目前的膿毒性狀態以及患者可沿著膿毒性通路發展的風險。
[0034]發明概述
[0035]根據本發明，本文提供了補充用于顯示血漿中的iNOS的已知測試的一組IVD測試，以評價人受試者中的膿毒癥病癥。
[0036]這組精確并可靠的血液生物標志物IVD測試被用于:
[0037]1.區分患有炎癥的將不會形成膿毒癥的危重患者和將成為膿毒性的那些危重患者；
[0038]2.確定個體患者成為膿毒性的易感性；
[0039]3.確定個體患者目前狀態為膿毒癥發作癥狀中的“非常早期”、“早期”、或“中期”；以及
[0040]4.指示個體患者的病癥是否被預期惡化或改善。
[0041]該組補充的IVD測試代表了與膿毒癥病理斗爭中的重大醫學突破和主要醫學進步。此組血液測試允許更早地積極應用目前的護理治療標準，是救生步驟。應認識到的是，該組血液生物標志物預期與美國專利6，581，578和7，198，904中發現的iNOS IVD測試結合被米用。
[0042]此補充測試包括血液生物標志物諸如乳凝集素(Iactadherin)和相似的實體的測量，以確定患者成為膿毒性的傾向。同樣，在膿毒癥的發作癥狀過程期間，血液乳凝集素水平的變化將指示病人病癥的改善或惡化。
[0043]同樣，為了確認膿毒癥的發作，測試被包括用于測量成熟的炎性細胞因子的前體形式(pro-form)諸如Pro-1L-1 ?、Pro-1L-18、Pro-11-33。此類前體細胞因子(pro-cytokine)增強了血衆iNOS的早期檢測。
[0044]此外，顯示異常的細胞凋亡/ 二次壞死的其它血液生物標志物酶也被發現是有用的。具體地，環氧酶2(C0X-2)和血紅素加氧酶-1 (H0-1)已被鑒定為實現這種作用。
[0045]Regla (亦稱膜石妝(pancreatic stone peptide,PSP))、L_ 乳酸鹽(L-Lactate)等的測量，在非常早期的時候被采用以確定器官損傷。同樣，Regla等水平的增加，指示與膿毒癥病理相關的增加的器官損傷。[0046]顯示持續的和或增加的炎癥的血漿/血清生物標志物，例如，TNFa、IL-1 β、和IL-6可被使用。這些細胞因子的高水平指示患者病癥的惡化。
[0047]抗炎生物標志物也可被采用以顯示患者的改善。例如，IL-8和IL-10的高水平將表明患者的恢復。
[0048]初次壞死和二次壞死的血液生物標志物也被用于本發明。血漿/血清蛋白或蛋白復合物諸如LDH和細胞色素C (初次壞死和二次壞死)當被發現處于高水平時顯示惡化的
患者病癥。
[0049]已形成了上述公開的生物標志物的決策算法以提供關于膿毒癥信息的決定性基礎，以允許主治醫師決定針對患者的治療過程。
[0050]可以明顯的是，上文已描述了一組新穎并實用的生物標志物用于在確定患者狀態中使用。
[0051]因此，本發明的一個目的是提供一組精確并可靠的IVD測試，其與用于鑒定血漿iNOS的精確測試的結合可區分不會發展為膿毒癥的危重患者和將形成膿毒癥的那些危重患者。
[0052]本發明的另一個目的是提供一組IVD測試，其可提供關于患者的膿毒癥易感性的有價值的診斷信息并鑒定此患者所處的膿毒性通路的階段。
[0053]本發明的另一個目的是提供一組IVD測試，其具有挽救處于膿毒性病癥中的患者的生命的潛能。
[0054]本發明的又另一個目的是提供一組IVD測試作為檢測膿毒性病癥發作的測試的補充。
[0055]本發明的另一個目的是提供一組IVD測試，其將顯著減少治療幸免于膿毒癥、嚴重膿毒癥、或膿毒性休克的發作癥狀的個體的巨大長期費用。
[0056]本發明的另外的目的是提供一組IVD測試，其通過經由決策樹向治療這些患者的醫師提供關鍵的預后、診斷、以及正在進行的監測信息實現臨床實驗室需求。
[0057]本發明的另一個目的是提供基于血清/血漿生物標志物的決策樹算法或系統，其輔助主治醫師針對膿毒癥病癥為他們的患者決定治療。
[0058]本發明具有其它目的及優勢，其根據接下來的說明書將變得明顯。
[0059]附圖的一些視圖的簡要說明
[0060]圖1為描繪采用本發明測試的具有陽性iNOS EIA測試的決策樹的流程圖。
[0061]圖2為描繪采用本發明測試的具有陰性iNOS EIA測試的決策樹的流程圖。
[0062]圖3是表2的視圖，顯示獲自創傷患者和健康個體的關于與膿毒癥病理相關的心臟、肺或腎功能障礙的數據的分析。
[0063]圖4是表3的視圖，指示臨床試驗中血漿成分和其它成分的相關性。
[0064]圖5是兩個散點圖的視圖，顯示創傷患者中關于SIRS/膿毒癥病理的血漿iNOS和原降鈣素的水平。
[0065]圖6是描繪取自多個人受試者的血漿樣品中的iNOS水平的圖。
[0066]圖7是描繪取自多個人受試者的血漿樣品中的乳凝集素水平的圖。
[0067]圖8是描繪來自多個人受試者的血漿樣品中的Pro-1L-1 ?濃度的圖。
[0068] 圖9是描繪取自多個人受試者的血漿樣品中的Pro-1L-18水平的圖。[0069]圖10是描繪取自多個人受試者的血漿樣品中的Pro-1L-33水平的圖。
[0070]圖11是描繪取自多個人受試者的血漿樣品中的C0X-2濃度的圖。
[0071]圖12是描繪取自多個人受試者的血漿樣品中的血紅素加氧酶-1 (H0-1)水平的圖。
[0072]圖13是描繪取自多個人受試者的血漿樣品中的Regl α水平的圖。
[0073]圖14是描繪取自多個人受試者的血漿樣品中的CRP濃度的圖。
[0074]為了更好地理解本發明，應結合以上描述的附圖，參考以下本發明優選實施方案的詳述。
[0075]本發明優選實施方案的詳述
[0076]本發明的多個方面將從以下其優選實施方案的詳述展開，其應參考先前描述的附圖。
[0077]本文提供了用于與美國專利6，531，578和7，198，904中描述的用于確定iNOS的存在的診斷測試結合的一組優選的血液生物標志物:
[0078]患者的膿毒癥傾向的指示物是有用的，例如:
[0079]乳凝集素(還被稱為乳脂球蛋白表皮生長因子因子-8以及被稱為BA-46)是血漿/血清蛋白，其充當巨噬細胞外部和其它清除劑細胞上的外部受體到與凋亡細胞外部的磷脂酰絲氨酸部分之間的橋聯分子(bridging molecule)。由于減少了被誘導的凋亡細胞的清除，乳凝集素的低血液水平使個體傾向于成為膿毒性的。如果個體的乳凝集素血液水平低于正常水平，則該個體將傾向于成為膿毒性的，且如果在膿毒癥的發作癥狀過程期間，乳凝集素的血液水平降低(其將減少被誘導的凋亡細胞的清除)，則患者的病癥將可能惡化。如果血液水平是低的并且開始增加，則患者將可能改善。
[0080]另外的生物標志物在預測/診斷膿毒癥病理的發作中也同樣重要。由于在其中異常的細胞凋亡轉變為二次壞死的其它情況下，此類生物標志物也可被釋放進入血液中，這些生物標志物的任一個都將不可能是膿毒癥病理特異性的。這些生物標志物的每一個都是成熟的炎性細胞因子的“前體形式”。每一個前體形式都被生物合成為無活性的前體細胞因子，其隨后在不同的情況下被非常特異性的蛋白酶加工，該蛋白酶裂解氨基末端的“前體”序列以產生成熟的細胞因子。對成熟細胞因子的裂解和激活通常與細胞分泌相協調。然而，被誘導產生iNOS (其也會導致這些前體細胞因子的表達)、隨后變為二次壞死、膨脹、爆裂的并從而釋放iNOS進入循環的細胞，也將釋放這些前體細胞因子(以細胞因子的“前體形式”而不是加工的成熟形式)。因此，這些“前體細胞因子”而不是成熟細胞因子的檢測和測量，反映了 iNOS的早期檢測，也就是說，此類“前體細胞因子”證實被誘導以產生iNOS的細胞經歷異常的細胞凋亡/ 二次壞死，并與來自美國專利6，531，578或7，198，904的血漿iNOS測試的陽性結果結合，證實患者進入膿毒癥病理，例如:
[0081]a.前體-白介素-1 β (Pro-1L-1 β )測定涉及為成熟IL-1 β的31kDa、269個氨基酸長的蛋白前體的Pro-1L-1 β。Pro-1L-1 β響應大多數微生物、死亡微生物的細胞壁成分以及其它促炎刺激諸如TNFa和INFy而合成。存在表達和激活的解離，前體的轉錄和翻譯與前體蛋白水解裂解為有活性的成熟細胞因子受獨立的細胞調節。Pro-1L-1 β不具有IL-Ιβ生物活性，并在細胞分泌之前被區室化在細胞質中。從細胞的分泌通常與Pro-1L-1 β裂解為成熟的、有活性的IL-1 β相耦合。因此，細胞外的IL-1 β通常是成熟的循環形式。Pro-1L-Ιβ裂解為IL-Ιβ的成熟形式由在Asp116-Ala117之間裂解的胱天蛋白酶-1催化。成熟的IL-1 β是153個氨基酸、17.5KDa的炎性細胞因子，其起源于Pro-1L-1 β的殘基117至269。然而，在某些情況下，少量的Pro-1L-1 β還在細胞外被發現，其在那里經受蛋白酶諸如胰蛋白酶和彈性蛋白酶在接近位置117的殘基處的非特異性裂解。由細胞外的蛋白水解裂解產生的變體IL-1 β形式的尺寸不同。一些形式是完全有活性的而其它形式只有部分生物活性或無生物活性。被用于測量來自膿毒性ICU患者的血漿樣品中的Pro-1L-1 β的Pro-1L-1 β測定，是比色夾心酶免疫測定(EIA)。涂覆在微量滴試孔上的“捕獲”抗體是分子的前段(pro-piece)即前116個殘基特異性的，且“檢測”抗體是成熟的IL-β I特異性的。因此，測定不是檢測單獨的前段或單獨的成熟IL-1 β形式一相反其是完整的Pro-1L-1 β特異性的。
[0082]b.前體-白介素-18 (Pro-1L-18)測定涉及被合成為193個氨基酸長、24kDa的無活性的分子的Pro-1L-18，其必須被裂解以產生有活性的成熟細胞因子。Pro-1L-18不具有已知的生物活性。成熟的IL-18是18kDa的細胞因子并且是用于產生干擾素-Y (IFN- Y )的共刺激因子。胱天蛋白酶-1在Asp36-Tyr37殘基之間裂解(并從而激活)Pro-1L-18以產生成熟的、有生物活性的容易從細胞分泌的細胞因子。IL-18由激活的巨噬細胞、角質細胞、腸道上皮細胞、成骨細胞、腎上腺皮質細胞、枯否細胞(Kupffer cell)以及鼠(murine)間腦產生。IL-18作用于I型輔助性T(Thl)細胞并與IL-12組合地強烈誘導Thl細胞產生IFN- Y，IFN- Y在針對微生物病原體的防御中起著關鍵作用。IL-18的多效性作用也已被報道，諸如，外周血單核細胞(PBMC)中IFN-Y和GM-CSF的增強的產生、T細胞中IL-2、GM-CSF和IFN- Y的產生、Fas配體被Thl細胞增強的表達，以及Thl細胞因子增強的產生。用于Pro-1L-18的血清/血漿測定，是化學發光的夾心酶免疫測定(EIA)。“捕獲”抗體與人Pro-1L-18和成熟的IL-18 二者結合，但“檢測”小鼠單克隆抗體僅與人Pro-1L-18的“前區域(pro-region) ”結合，并且不與成熟的IL-18細胞因子交叉反應。因此，該EIA是人Pro-1L-18特異性的。
[0083]c.前體-白介素-33 (Pro-1L-33)測定涉及人Pro-1L-33，其為270個氨基酸長、是IL-1蛋白家族的31kDa成員，并且是還調節基因轉錄的核因子。Pro-1L-33在平滑肌和氣道上皮中組成型表達，其中其被報道具有兩個功能。第一，它誘導Th2-型細胞因子，且第二，它充當核轉錄因子。Pro-1L-33包含“前區域”(殘基1-111)和成熟細胞因子羧基末端區段(殘基112-270)。“前區域”包含α-螺旋同源域-樣(homeodomain-like)螺旋-轉角-螺旋(HTH)DNA結合基序(殘基1-65)，以及雙組分核定位序列(殘基61-78)。HTH基序介導核定位以及異染色質關聯(heterochromatin association)。IL-1 β誘導后，Pro-1L-33的表達在動脈平滑肌、皮膚成纖維細胞以及角質細胞中被上調。Pro-1L-33在殘基Ser111-Ser112之間被胱天蛋白酶-1裂解以產生成熟的IL-33細胞因子，其從細胞中被釋放。分泌的IL-33誘導Th2極化的淋巴細胞以分泌IL-5和IL-13，增加IgA和IgE的產生，并增強粘膜組織的炎性浸潤。使用的Pro-1L-18測定是使用“前區域”特異性的親和純化的山羊多克隆IgG作為“捕獲”抗體的化學發光的夾心EIA。羧基末端成熟的IL-33區域特異性的生物素化的親和純化的山羊多克隆IgG，在夾心EIA中用作“檢測”抗體。
[0084]其它血液生物標志物已經被發現顯示異常的細胞凋亡/ 二次壞死。此類生物標志物包括共誘導的酶。同樣，結合來自美國專利6，581，578和7，198, 904的IVD測試的陽性iNOS結果，這些可誘導的應激相關酶的存在確認了患者進入了膿毒癥病理，例如:
[0085]a.環氧酶2 (C0X-2,還稱為可誘導的C0X)是催化花生四烯酸轉化為2_系列前列腺素類的前體前列腺素H2 (PGH2)的72kD的酶,其為前列腺素(PG)、血栓素以及前列環素的生物合成中的第一步。在正常條件下，除了在參與生殖、免疫、骨吸收(bone resorption)和胰腺分泌的一些專門的細胞外，C0X-2在大多數細胞和組織中是不可檢測的。然而，C0X-2是可誘導的酶，其在活化的巨噬細胞和炎癥部位的其它細胞中變得豐富。C0X-2的表達受脂多糖(LPS)、肽聚糖以及炎性細胞因子誘導，并且是最初被鑒定為即刻早期的生長響應基因(immediate-early growth response gene)。C0X-2與催化相同酶促反應的組成型表達的C0X-1酶共享約60%的序列同源性，C0X-1酶是70kD的蛋白。兩種酶都包含兩個活性位點:環氧酶位點，其中花生四烯酸被轉化為氫過氧化內過氧化物(hydroperoxy endoperoxide)前列腺素G2 (PGG2)，以及具有過氧化物酶活性的血紅素位點，其負責將PGG2還原為PGH2。由于iNOS和C0X-2被相同的刺激共誘導，誘導之后它們在相同的細胞內表達。被誘導的含有iNOS的細胞通過二次壞死的破裂，將導致血液中C0X-2的存在。因此，C0X-2的存在是用于導致MV-A iNOS的釋放并最終導致膿毒癥病理的誘導、異常的細胞凋亡以及二次壞死的過程的證實性測試。
[0086]b.血紅素加氧酶-1(H0-1，其也被稱為熱休克蛋白32(Hsp32))，是一種普遍存在的可溶的可誘導的應激響應酶，具有至關重要的代謝功能。其在血紅素降解通路和鐵平衡的維持中催化限速步驟。H0-1將游離的血紅素裂解成一氧化碳、鐵(其誘導重鏈鐵蛋白，一種鐵-螯合蛋白的表達)、和膽綠素(其通過膽綠素還原酶轉化為膽紅素)。動物實驗已揭示了 H0-1在組織穩態、防護氧化應激以及在某些疾病的發病機理中的核心作用。H0-1的誘導響應多種形式的細胞應激，包括暴露于LPS和炎性細胞因子而發生。已發現H0-1的表達在患有嚴重膿毒癥和膿毒性休克的患者的單核細胞內被誘導。患有急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的患者的血漿中H0-1的檢測和測量也已被報道。盡管未被報道，由于iNOS和H0-1被相同的刺激共誘導，被誘導之后，它們將在相同細胞中表達。被誘導的含有iNOS的細胞通過二次壞死的破裂，將導致來自膿毒癥患者的血清和血漿樣品中H0-1的存在。因此，H0-1的存在是用于導致MV-A iNOS的釋放并最終導致膿毒癥病理的誘導、異常的細胞凋亡和二次壞死的過程的證實性測試。
[0087]器官損害或功能障礙指示物可以被采用，例如:
[0088]a.Regl α (亦稱PSP =胰石肽)是用于由膿毒癥的發作癥狀期間循環的血漿iNOS導致的器官損傷的一種非常靈敏的血液生物標志物。如果血漿iNOS和血漿/血清Regl α都存在，那么器官損傷就已經開始，并且隨著Regla水平的增加，器官損傷的量增加。因此，它是增加的內部器官損傷的指示物，并使個體患者處于“嚴重膿毒癥”階段。如果血漿iNOS存在，但血漿/血清Regl α不存在，那么患者的病理就處于非常早期的階段且器官損傷很小或不存在。
[0089]b.L-乳酸鹽測定是一種血漿生物標志物并與缺氧相關。該標志物的血清/血漿(血液水平)濃度隨器官/組織損傷而增加。在膿毒癥測試組中，它的出現將與嚴重膿毒癥中發生的器官功能障礙相一致，且隨著患者惡化為膿毒性休克，其血液水平將增加。如果應用有效的治療，血液水平將隨著患者的改善而降低，因為隨著血液動力學問題的改善，由低灌注導致的器官/組織缺氧被解決。因此，具有陽性iNOS測試的L-乳酸鹽的增加確認了患者是膿毒性的并具有器官損傷。換句話說，在這種情況下，患者至少處于嚴重的膿毒癥且可能地膿毒性休克狀態。不存在L-乳酸鹽的增加的陽性iNOS測試表明患者處于膿毒癥發作癥狀的早期階段，因為由缺氧導致的器官損傷還沒有開始。
[0090]持續和/或增加的炎癥的血液指示物也被用于本發明。這些血漿/血清生物標志物的一個或多個可被用來監測經歷膿毒癥發作癥狀的個體中的炎性狀態，例如
[0091]a.TNFa是誘導iNOS表達的炎性細胞因子。
[0092]b.1L-1 β是誘導iNOS表達的炎性細胞因子；以及
[0093]c.1L-6是誘導iNOS表達的炎性細胞因子。如果血漿iNOS存在且這些炎性細胞因子中的一個或多個以高于正常血漿/血清水平存在，那么患者的病癥將可能惡化。
[0094]d.C-反應性蛋白測定(CRP)是一種呈急性期蛋白形式的血漿生物標志物。此蛋白出現于膿毒癥和其它炎性病癥的發作癥狀中的相對早期的血液樣品中。由于由感染造成的多種炎性細胞因子的釋放導致這一急性期蛋白的表達，其與感染和許多其它炎性過程相關。其血清/血漿濃度隨著感染的惡化而增加且更多的炎性細胞因子被釋放。然而，由于很多感染從未惡化為膿毒癥病理(只有?15%的患有確認的感染的患者發展為膿毒癥)，其不具體地指示膿毒癥病理。此外，隨著感染被成功治療，即使患者由于來自死亡微生物的細胞壁成分的釋放可能是膿毒性的或可能進入膿毒性通路，CRP的血液水平也是下降的。在美國專利6，531，578和7，198，904的iNOS測試中，iNOS的出現將與血漿CRP的早期出現一致，并確認感染的存在。這些測試一起將指示該個體是膿毒性的或正進入膿毒性通路。
[0095]抗炎狀態的血液指示物也可見于本發明的組中。這些血漿/血清生物標志物中的一個或多個可被用于監測正在經歷膿毒癥的發作癥狀的個體中的抗炎狀態以顯示他們正在恢復。例如:
[0096]a.1L-8是為膿毒癥的陰性預測物的抗炎細胞因子；以及
[0097]b.1L-10是為膿毒癥的陰性預測物的抗炎細胞因子。如果iNOS的血漿水平正在下降，且抗炎狀態的這些血漿/血清生物標志物的一個或多個超過正常水平而存在，那么該患者很有可能從其膿毒癥發作癥狀中恢復。
[0098]初次和二次壞死的血液生物標志物也可見于本發明。這些血漿/血清蛋白或蛋白復合物中的一個或多個可被用于監測凋亡細胞正在進行的二次壞死，其導致循環的血漿iNOS的釋放并造成膿毒癥病理，例如:
[0099]a.LDH作為初次壞死和二次壞死二者的生物標志物；以及
[0100]b.與其血清結合蛋白結合作為蛋白復合物的細胞色素C，是用于凋亡細胞正在進行的二次壞死的生物標志物。如果一種或多種炎性細胞子存在并且細胞色素C+CyC結合蛋白復合物的血漿/血清水平也增加，那么被誘導的含有iNOS的凋亡細胞仍然經歷二次壞死。這將導致iNOS包括微泡相關的iNOS的循環水平的增加以及該患者病癥的惡化。
[0101]應認識到的是，上述被命名的生物標志物的每一個作為用于膿毒癥病理的生物標志物都已被單獨地測試，并發現是不可用的。單獨地，只有美國專利6，531，578或7，198，904的血漿iNOS測試被發現預測膿毒癥的發作；通過區分患有炎癥的患者和那些患有炎癥的將發展為高炎伴有器官損傷和功能障礙的患者而診斷膿毒癥，高炎伴有器官損傷和功能障礙是膿毒癥發作癥狀的特征；以及準確地監測膿毒癥病理的過程。然而，到目前為止所描述的血液測試組中的補充的生物標志物可向主治醫師提供有價值的另外的信息，并用作治療決策樹的基礎。也就是說，基于血漿中iNOS的存在或不存在和其它生物標志物的血液水平，關鍵性地協助醫師針對個體患者決定最佳療程。
[0102]因此，如果iNOS未存在于患者的血漿中但該患者的乳凝集素的血漿/血清水平是低的，那么此患者在任何炎性病癥諸如大手術的情況下都將處于形成膿毒癥的風險。由于TNFa、IL-1 β和IL_6作為與重大創傷諸如手術相關的“細胞因子風暴”的部分被釋放，而且由于它們在許多不同細胞類型中單獨地以及結合地誘導iNOS的表達，這些分子的增加的血液水平預示iNOS在許多不同細胞類型中的表達，這些炎性分子的增加的血液水平預示炎性狀態和/或高炎性狀態的發作。在乳凝集素的低水平和這些炎性細胞因子的一個或多個的高水平的情況下，個體可非常迅速地形成膿毒癥。如果iNOS存在并檢測到細胞色素C-結合蛋白復合物的增加的水平，則存在該患者的病癥將惡化的高可能性，因為更多的被誘導的含有iNOS的凋亡細胞經歷二次壞死并釋放更多的iNOS包括MV-A iNOS進入循環系統。類似地，如果iNOS存在并且發現炎性細胞因子諸如TNFa、IL_1 β和IL-6的增加的水平，那么該患者的病癥將最有可能惡化。iNOS的血漿水平開始下降并且抗炎細胞因子的血漿/血清水平開始增加之后,那么該患者開始恢復并且提供的治療已經成功。
[0103]總之，已發現血漿樣品中iNOS包括MV-A iNOS的存在，與膿毒癥病理的發作以及與由該高炎性病癥引起的器官損傷和功能障礙非常高地相關。因此，血漿iNOS的存在或不存在可被用作決策樹中的核心參數，與本申請的血液測試組中其它生物標志物的血液水平以及血液水平中的增加或減少結合。如迄今為止陳述的，該血液測試組可向主治醫師提供關于他們的患者的關于膿毒癥病理的非常有用的信息，并可協助他們針對他們的患者決定最佳療程。
[0104]表I示出了使用迄今為止討論的血漿生物標志物的組以確定患者中的膿毒癥病癥的決策表。
[0105]表I
[0106]
【權利要求】
1.一種用于評價人受試者中膿毒癥病癥的測定，所述測定包括: a.用于確定所述人受試者的血衆中iNOS的存在的測試；以及 b.用于確定所述人受試者中膿毒癥病癥的發作的測試。
2.根據權利要求1所述的測定，其中用于確定所述人受試者的血漿中iNOS的存在的所述測試包括識別iNOS的單克隆抗體。
3.根據權利要求2所述的測定，其中用于確定膿毒癥病癥的發作的所述測試包括用于確定所述人受試者的血漿中前體細胞因子的水平的測試。
4.根據權利要求3所述的測定，其中所述前體細胞因子選自包括以下的組:Pro-1L-1 ?、Pro-1L-18、以及 Pro-1L-33。
5.一種用于評價人受試者中膿毒癥病癥的測定，所述測定包括: a.用于確定所述人受試者的血衆中iNOS的存在的測試；以及 b.用于確定所述人受試者的異常的細胞凋亡/二次細胞壞死的測試。
6.根據權利要求5所述的測定，其中用于確定所述血漿中iNOS的存在的所述測試包括識別iNOS的單克隆抗體。
7.根據權利要求6所述的測定，其中用于確定所述人受試者的異常的細胞凋亡和二次細胞壞死的所述測試包括用于確定所述人受試者的血漿中可誘導的應激相關酶的水平的測試。
8.根據權利要求7所述的測定，其中所述可誘導的應激相關酶選自包括以下的組:HO-1、和 C0X-2。
9.一種用于評價人受試者中膿毒癥病癥的測定，所述測定包括: a.用于確定所述人受試者的血衆中iNOS的存在的測試；以及 b.用于確定所述人受試者的器官損傷或功能障礙的測試。
10.根據權利要求9所說的測定，其中用于確定所述人受試者的血漿中iNOS的存在的所述測試包括識別iNOS的單克隆抗體。
11.根據權利要求9所述的測定，其中用于確定所述人受試者的器官損傷或功能障礙的所述測試包括用于確定選自包括以下的組的生物標志物的存在的測試=Regl α和L-乳酸鹽。
12.一種用于評價人受試者中的膿毒癥病癥的測定，所述測定包括: a.用于確定所述人受試者的血衆中iNOS的存在的測試；以及 b.用于確定人受試者中持續的或增加的炎癥的測試。
13.根據權利要求12所述的測定，其中用于確定iNOS的存在的所述測試包括識別iNOS的單克隆抗體。
14.根據權利要求12所述的測定，其中用于確定人受試者中持續的或增加的炎癥的所述測試包括用于確定選自包括以下的組的生物標志物的存在的測試=TNFa、IL-1 ?、IL-6、以及 CRP。
15.一種用于評價人受試者中膿毒癥病癥傾向的測定，所述測定包括: a.用于確定所述人受試者的血衆中iNOS的存在的測試；以及 b.用于確定所述人受試者的血漿中乳凝集素的存在的測試。
16.根據權利要求1所述的測定，其另外包括:用于確定所述人受試者的異常的細胞凋亡/二次細胞壞死的測試。
17.根據權利要求16所述的測定，其另外包括: 用于確定所述人受試者的器官損傷或功能障礙的測試。
18.根據權利要求17所述的測定，其另外包括: 用于確定人受試者中持續的或增加的炎癥的測試。
19.根據權利要求18所述的測定，其另外包括 : 用于確定所述人受試者的血漿中乳凝集素的存在的測試。
20.一種用于評價人受試者中膿毒癥病癥的決策樹系統，所述決策樹系統包括: a.用于確定所述人受試者的血衆中iNOS的存在的測試；以及 b.用于確定所述人受試者的血漿中血液生物標志物的存在的測試，所述血液生物標志物選自由以下構成的組:乳凝集素、regia、環氧酶2、血紅素加氧酶-1、前體白介素I?、前體白介素33、以及前體白介素-18、或其組合。
【文檔編號】G01N33/577GK103946707SQ201280056831
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年9月19日 優先權日:2010年9月22日
【發明者】羅伯特·韋伯 申請人:羅伯特·韋伯