用于對樣品中的稀少目標細胞進行細胞計數檢測的方法和組合物的制作方法

用于對樣品中的稀少目標細胞進行細胞計數檢測的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了用于對一個樣品中的稀少目標細胞進行檢測的細胞計數方法。在某些方面，這些方法和組合物可以協助對在一個生物樣品諸如血液中的稀少目標細胞例如循環腫瘤細胞（CTC）進行檢測。這些方法的方面包括使該樣品與特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物的第一和第二結合成員接觸，并且針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對該樣品進行細胞計數測定以檢測在該樣品中的該稀少目標細胞。還提供了用于實踐這些主題方法的系統、組合物、以及試劑盒。
【專利說明】用于對樣品中的稀少目標細胞進行細胞計數檢測的方法和組合物
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]根據35U.S.C.§ 119(e)，本申請案要求2011年9月6日提交的美國臨時專利申請序列號61/531，575的提交日期的優先權；將該申請案的披露通過引用結合于此。
[0003]簡介
[0004]流式細胞術是研究中被很好接受的工具，它允許用戶對樣品流體中的組分進行快速分析和分類。流式細胞計數器使用一種載液(例如，鞘液(sheath fluid))以使樣品組分(基本上一次一個組分)通過一個照射區。通過光源(例如激光)對每個樣品組分進行照射，并且對由每個樣品組分散射的光進行檢測并分析。這些樣品組分可以在它們退出照射區時基于它們的光學和其他特征來分離。
[0005]循環腫瘤細胞(CTC)是從腫瘤流出進入受試者血流中的細胞。一旦在血液中，這些細胞可以循環通過受試者的身體，在體內它們可以入侵其他組織并且生長出新的腫瘤。因此CTC牽涉到轉移，轉移是患有癌癥的受試者中死亡的主要致因。對CTC進行計數的努力已經通過以下事實受到妨礙:CTC極其難以檢測，它們是異常稀少的，并且難以將其與健康細胞區分開來。用于檢測CTC的現存方法在敏感性和/或特異性方面具有限制，導致許多健康細胞被錯誤表征為癌性的，并且許多癌細胞在分析中漏掉。
[0006]概述
[0007]本披露提供了用于對一個樣品中的稀少目標細胞進行檢測的細胞計數方法。在某些方面，這些方法可以協助對生物樣品(血液)中的稀少目標細胞(例如，循環腫瘤細胞(CTC))進行檢測。這些方法的方面包括使該樣品與特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物的第一和第二結合成員接觸，并且針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對該樣品進行細胞計數測定以檢測在該樣品中的該稀少目標細胞。還提供了用于實踐這些主題方法的系統、組合物、以及試劑盒。
[0008]感興趣的稀少目標細胞包括但不限于原核細胞(例如,細菌細胞或古細菌細胞)以及真核細胞(例如，哺乳動物細胞，例如神經細胞、肌細胞、上皮細胞(例如，循環腫瘤細胞)、干細胞(例如，造血干細胞)、脂肪細胞等等)。稀少目標細胞可以從一個范圍的樣品來檢測，這些樣品包括獲得自體外來源(例如，來自培養生長的實驗室細胞的細胞懸浮液)或來自體內來源(例如，哺乳動物受試者、人類受試者、等)的樣品。
[0009]各種結合成員可以用于實踐這些主題方法。結合成員可以特異性地結合至稀少目標細胞的一種標志物。感興趣的標志物可以包括但不限于⑶la、⑶2、⑶3、⑶4、⑶7、⑶8、CD10、CDllb、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD45、CD56、CD57、CD59、CD61、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD90、CD103、CDl 17、CD133、CD138、CD271、CD303、CD304、bcl_2、C_kit、TdT、FMC7、SCA-1、血型糖蛋白 A、細胞角蛋白、 EpCAM、EphB4、EGFR、CEA, HER2以及MUC-1。在某些方面，標志物可以位于稀少目標細胞的表面上、和/或稀少目標細胞內部。可以對有核細胞進行透化以允許第一和第二結合成員結合至細胞內標志物。在主題方法的某些方面，樣品中的非稀少細胞沒有進行染色(例如，對于⑶45沒有被染色)。
[0010]在某些方面中，結合成員可以被標記。結合成員的標記可以是直接的或間接的，如在此更完整地描述的。感興趣的標記包括但不限于吲哚碳菁(C3)、吲哚二碳菁(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克薩斯紅(Texas Red)、太平洋藍(Pacific Blue)、俄勒岡綠(Oregon Green) 488、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)-355、亞歷克薩熒光染料(Alexafluor) 488、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 532、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 546,亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)-555、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 568、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 594、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 647、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 660、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 680、亞歷克薩熒光染料(Alexafluor)700、JOE、麗絲胺(Lissamine)、羅丹明綠(Rhodamine Green)、B0DIPY、異硫氰酸突光素(FITC)、羧基熒光素(FAM)、藻紅蛋白、羅丹明、二氯羅丹明(dRhodamine)、羧基四甲基羅丹明(TAMRA)、羧基-X-羅丹明(R0X)、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、RiboGreen、等
坐寸ο
[0011]感興趣的結合成員包括抗體、及其抗原結合片段。在一些實施例中，在第一結合成員和第二結合成員是抗體或其抗原結合片段時，它們結合至標志物的相同的表位。
[0012]本披露還提供了試劑盒。試劑盒可以包括第一和第二結合成員，這些第一和第二結合成員特異性地結合至稀少目標細胞的標志物；說明書，用于指導使用這些第一和第二結合成員來針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對生物樣品進行流式細胞計數測定以檢測樣品中的稀少目標細胞。進一步提供了組合物和系統，如在此更完整地描述的。
[0013]附圖簡要說明
[0014]當結合附圖閱讀時，本發明可以從以下詳細說明書得到最好的理解。以下圖包括在附圖中:
[0015]圖1是根據本披露的方法的圖解概述。在這個具體實例中，將稀少目標細胞(標記為“腫瘤細胞”)用細胞角蛋白(CK)-紅和CK-綠兩者來標記，而非稀少細胞(此處，為白細胞,或WBC)沒有進行標記。這些細胞在流式細胞計數器中向下流動,如由指示流動的箭頭所指示的。施用激發光(“Ex-光”)以產生CK-紅和/或CK-綠的熒光。在每個標記是熒光染料的情況下，將兩種顏色熒光燈的組合用作流式細胞計數測定中的閾值。所得到的CK-紅熒光(y-軸)對CK-綠熒光(X-軸)的密度圖顯示了由儀器檢測出的腫瘤細胞數目。
[0016]圖2，圖A-B描繪了異硫氰酸熒光素(FITC，圖A)標記以及亞歷克薩熒光染料647(圖B)標記的發射光譜。對于各自的激光激發光線是由箭頭指示。
[0017]圖3是本披露的測定程序的流程圖。根據生產商的說明書將7.5mL樣品在BDVacutainer CPT管中進行旋轉，以分離WBC部分。隨后將WBC部分進行固定、透化、染色、并且經由FACS (例如，通過BD Biosciences FACSCanto?流式細胞計數器)進行分析。
[0018]圖4，圖A-D是密度圖，顯示了在WBC存在下對來自血液的不同濃度的HT-29腫瘤細胞的富集和分析。圖A:使包含10，000HT-29細胞/mL的0.5mL血液樣品經歷紅細胞溶解、固定、和離心。將WBC部分去除并且透化。添加入CK-FITC和CK-Alexa647，持續60m。使用BD Biosciences FACSCanto?流式細胞計數器對樣品進行分析。圖B:HT_29細胞是以1，000HT-29細胞/mL的起始濃度存在。圖C:HT_29細胞是以100HT-29細胞/mL的起始濃度存在。圖D:HT-29細胞是以0HT-29細胞/mL的起始濃度存在。
[0019]圖5，圖A-C是密度圖，顯示了在WBC存在下對來自血液的HT-29腫瘤細胞的富集和分析。將血液樣品用Ix BD FACS細胞溶解溶液進行溶解，以將樣品中的紅細胞溶解。將這些樣品用Ix BD FACS透化溶液2進行透化，進行洗滌，然后以0.55mL Rx體積用CKAb-FITC和CK Ab-A647軛合物進行細胞內染色，并且在不用進一步洗滌的情況下，根據生產商說明書，在BD Biosciences FACSCanto?流式細胞計數器上在介質流速(36 μ L/min)下，對0.36mL的這種混合物進行計數。圖A:陽性計數，使用7.5mL血液和10，000HT-29細胞/mL的濃度。圖中顯示了 I分鐘計數。圖B:陰性計數，使用7.5mL血液和0HT-29細胞/mL的濃度。圖中顯示了 10分鐘計數。圖C:僅有緩沖液，15分鐘計數。累積地，圖A-C顯示了在34，363，636WBC的背景上觀察到一個HT-29腫瘤細胞，并且對于“僅緩沖液”而言在15分鐘運行過程中沒有假陽性點記錄。
[0020]圖6，圖A-C顯示了本披露的方法的辨別效率。將包含WBC和HT-29腫瘤細胞的樣品如在此描述地進行制備，并且用CK-APC和CK-FITC進行標記。圖A和B:典型的一種顏色密度圖，顯示SSC對APC (圖A)和FITC (圖B)。HT-29腫瘤細胞由圖中的顏色較深的點表示，并且可以易于從非特異事件中檢測到。圖C:測量樣品中的APC和FITC兩者導致窄對角地下行的點圖，并且腫瘤細胞易于鑒定。
[0021]圖7，圖A-C顯示了圖6的樣品中的陰性樣品。沒有HT-29腫瘤細胞存在于這些樣品中。圖A和圖B:—種顏色的密度圖，顯示SSC對APC (圖A)和FITC (圖B)揭示了許多假陽性。圖C:沒有觀察到假陽性事件。
[0022]圖8，圖A-C顯示樣品中的HT-29腫瘤細胞的圖像，使用不同起始濃度。將包含WBC和HT-29的樣品用CK-FITC和CK-PE進行染色。HT-29細胞是以5，000細胞/mL (圖A)、500細胞/mL (圖B)、或0.0細胞/mL (圖C)的濃度存在。在PE通道中甚至在0.0細胞/mL (圖C)的HT-29細胞濃度下，觀察到事件。
[0023]圖9，圖A-B顯示了在WBC存在下來自血液的HT-29腫瘤細胞的測定方案和圖像。圖A:用于使細胞成像的測定程序。如在圖5中上述的來制備樣品，并且使用蔡司(ZEISS)顯微鏡使用汞弧燈來成像。圖B:從左至右:分別是包含CK-FITC的細胞(FITC通道)、包含CK-Alexa647的細胞(APC通道)的圖像，以及圖像疊加。所有的圖表示100倍圖像。
[0024]圖10顯示了對樣品制備技術進行比較的圖。標有“細胞溶解”的圖涉及使用細胞溶解和離心來處理血液中的HT-29腫瘤細胞。標有“CPT”的圖涉及使用BD VacutainerCPT管的處理。
[0025]詳細說明
[0026]本披露提供了用于對一個樣品中的稀少目標細胞進行檢測的細胞計數方法。這些方法的方面包括使該樣品與特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物的第一和第二結合成員接觸，并且針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對該樣品進行細胞計數測定以檢測在該樣品中的該稀少目標細胞。還提供了用于實踐這些主題方法的系統、組合物、以及試劑盒。
[0027]在更詳細地描述本發明之前，應理解的是本發明不限于所描述的具體實施例，因為這些可以改變。還應理解的是，在此使用的術語僅是出于描述具體實施例的目的，并且不旨在限制，因為本發明的范圍將僅有所附權利要求書限制。[0028]在一個范圍的值被提供時，應理解的是，每個介于中間的值，到下限的第十個單位，除非上下文清楚地指出，該范圍的上限和下限之間以及在該陳述范圍內的其他陳述的或介于中間的值被涵蓋在本發明之內。這些更小范圍的上限和下限可以獨立地被包括在更小的范圍內，并且還被涵蓋在本發明之內，服從所陳述范圍內的任何確切排除的限制。在所陳述范圍包括一個或兩個這些限制時,排除那些被包括的限制的任一者或兩者的范圍也被包括在本發明之內。
[0029]除非另外限定，在此使用的所有的技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。雖然任何類似于或等同于在此描述的那些的方法和材料也可以用于本發明的實踐或測試中，現在仍描述了代表性的說明性方法和材料。
[0030]在本說明書中引用的所有公開物和專利通過引用結合于此，就好像每個單獨的公開物或專利被確切地并單獨地指示為通過引用結合，并且通過引用結合于此從而結合引用的公開物披露和描述這些方法和/或材料。任何公開物的引用是針對在提交日期之前它的披露，并且不應當解釋為承認本發明無權借助于先前發明提前于此公開物。另外，提供的
【公開日】期可以不同于需要獨立證實的實際
【公開日】期。
[0031 ] 應指出的是，如在此使用的，并且在所附權利要求書中，單數形式“一個”、“一種”、和“該”包括復數指示物，除非上下文另外清楚地指明。另外指出的是，權利要求書可以被撰寫為排除任何可選擇的要素。這樣，本聲明旨在充當對于結合了所要求要素的引用而使用此類排除性術語如“唯一地”、“僅”、等的先行基礎，或充當對于使用“陰性”限制的先行基礎。
[0032]如本領域的技術人員在閱讀本披露時將清楚的是，每一個在此描述和說明的單獨的實施例具有分離的組分和特征，它們可以易于與任何其他若干實施例的特征分離或組合，而不偏離本發明的范圍或精神。可以按照引用的事件的順序或按照邏輯上可能的任何其他順序進行任何引用的方法。
[0033]方法
[0034]如上所述，本披露提供了用于對樣品中的稀少目標細胞進行檢測的細胞計數方法。在此使用術語“細胞計數方法”來描述流式細胞計數方法和/或成像細胞計數方法。因此，“細胞計數測定”可以是指流式細胞計數測定和/或成像細胞計數測定，并且“細胞計數器”可以是指流式細胞計數器和/或成像細胞計數器。
[0035]本發明的實施例的方面包括使該樣品與至少第一和第二結合成員接觸，這些第一和第二結合成員特異性地結合至稀少目標細胞的標志物。通過經由細胞計數查詢樣品以檢測包含結合的第一和第二結合成員的細胞的存在，可以在樣品中檢測到稀少目標細胞。
[0036]在一些實施例中，本發明的檢測樣品中的稀少目標細胞的方法是定性的，其中稀少目標細胞的檢測是定性的，例如作出關于目標細胞存在或不存在于樣品中的確定。在一些實施例中，本發明檢測樣品中的稀少目標細胞的方法是定量的，其中稀少目標細胞的檢測是定量的。這些方法可以包括對樣品中的稀少目標細胞的數目的定量量度進行確定。在一些實施例中，對樣品中的稀少目標細胞的數目進行定量包括確定存在的稀少目標細胞的數目是否是在預先確定的閾值之上或之下。
[0037]現在將在下文中更詳細地描述這些方法的不同步驟和方面。
[0038]稀少目標細胞[0039]如上所述，本披露提供了用于對樣品中的稀少目標細胞進行檢測的細胞計數方法。如在此使用的，術語“稀少目標細胞”用于指代存在于樣品中的任何細胞類型，其中該類型細胞的數目小于樣品中細胞總數目的50.0%，例如小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于1%、小于0.1%、小于0.01%、或小于0.001%。在某些方面，在細胞樣品中非稀少細胞在數目上以IO4或更多(IO5或更多，包括IO6或更多、IO7或更多、IO8或更多、或IO9或更多)的系數超過稀少目標細胞。感興趣的稀少目標細胞類型包括但不限于原核細胞(例如，細菌細胞或古細菌細胞)以及真核細胞(例如，哺乳動物細胞，例如神經細胞、肌細胞、上皮細胞(例如，循環腫瘤細胞)、干細胞(例如，造血干細胞)、稀少淋巴細胞(例如，調節性T細胞)、脂肪細胞等)。
[0040]術語“非稀少細胞”可以用于指代樣品中不是稀少目標細胞的那些細胞。非稀少細胞可以是任何類型，包括但不限于，原核細胞(例如細菌細胞或古細菌細胞)以及真核細胞(例如，哺乳動物細胞，例如神經細胞、白細胞、肌細胞、上皮細胞、脂肪細胞等)。在這些主題方法的某些方面中，在細胞計數分析之前，非稀少細胞沒有進行特異性的標記和/或染色。例如，在某些方面中，非稀少細胞不是CD45染色的。在某些方面中，非稀少細胞可以比稀少細胞大幅更少地被標記(例如，由于非特異性結合)。在某些此類方面，通過細胞計數分析，可以將稀少細胞與大幅更少地標記的非稀少細胞區分開。
[0041]樣品
[0042]如在此使用的術語“樣品”和“細胞樣品”意指包含以任何希望濃度的在懸浮液中的一種或多種單獨細胞的任何樣品。例如，細胞樣品可以包含IO11或更少、101°或更少、IO9或更少、IO8或更少、IO7或更少、IO6或更少、IO5或更少、IO4或更少、IO3或更少、500或更少、100或更少、10或更少、或一個細胞/毫升。該樣品可以包含已知數目的細胞或未知數目的細胞。合適的細胞包括真核細胞(例如，哺乳動物)和/或原核細胞(例如，細菌細胞或古細菌細胞)。
[0043]在實踐本發明的方法中，該樣品可以獲得自體外來源(例如，來自培養生長的實驗室細胞的細胞懸浮液)或獲得自體內來源(例如，哺乳動物受試者、人類受試者、等)。在一些實施例中，細胞樣品是獲得自體外來源。體外來源包括但不限于，原核(例如，細菌、古細菌)細胞培養物、包含原核和/或真核(例如，哺乳類、protest、真菌，等)細胞的環境樣品、真核細胞培養物(例如，建立的細胞系的培養物，已知的或購買的細胞系的培養物，固定化細胞系的培養物，原代細胞培養物，實驗室酵母菌培養物，等)、組織培養物、等等。
[0044]在一些實施例中，該樣品是獲得自體內來源，并且可以包括獲得自組織(例如，來自組織活檢的細胞懸浮液，來自組織樣品的細胞懸浮液，等)和/或體液(例如，全血，分級的血液，血漿，血清，唾液，淋巴液，間質液，等)的樣品。在一些情況下，在評估之前，對衍生自受試者的細胞、流體、或組織進行培養、儲存或操作。體內來源包括活的多細胞生物，并且可以產生非診斷性或診斷性細胞樣品。
[0045]在某些實施例中，樣品的來源是“哺乳動物”或“哺乳類”，其中這些術語被廣泛地用于描述在哺乳綱之內的生物，包括食肉目(例如，狗和貓)、嚙齒目(例如，小鼠、豚鼠、和大鼠)、以及靈長類(例如，人類，黑猩猩，以及猴子)。在一些情況下，受試者是人類。這些方法可以應用于獲得自兩種性別的以及在任何發育階段(即新生兒、嬰兒、幼年、青春期、成年)的人類受試者的樣品，其中在某些實施例中，人類受試者是幼年、青春期、成年人。盡管本發明可以應用于來自人類受試者的樣品，但應理解的是，這些方法還可以對來自其他動物受試者(即，在“非人類受試者”中)的樣品來進行，這些其他動物受試者例如但不限于鳥、小鼠、大鼠、狗、貓、牲畜以及馬。
[0046]用于當前方法中的樣品可以是通過任何方便的方法獲得的。在某些方面，該樣品是通過靜脈穿刺獲得的血液。血液可以從受試者獲得，并且可以在細胞計數分析之前進行操作。對于細胞計數分析而言，獲得并操作樣品的方法在本領域中是熟知的。例如，在某些方面，可以使用如在圖3中呈現的測定來操作樣品。在此實例中，血液樣品是遵照標準靜脈穿刺方案通過靜脈穿刺從一個受試者中獲得的。將細胞樣品收集在BD Vacutainer? CPT管中，并且根據生產商說明書進行操作。將該管在大約室溫(大約18°C至大約25°C)下在大約1500至大約1800的相對離心力下離心20分鐘或更長。在離心之后，將單核細胞層和血小板層進行收集和再懸浮。可以使用任何方便的方案，例如通過使用可商購的試劑如BDFACS透化溶液2，將這個部分進行固定和/或透化。
[0047]結合成員
[0048]如上所述，本發明的方面可以包括使該樣品與至少第一和第二結合成員接觸，這些第一和第二結合成員特異性地結合至稀少目標細胞的標志物。如在此使用的術語“結合成員”是指特異性地結合至稀少目標細胞的標志物的任何試劑(例如，蛋白質、小分子，等等)。術語“特異結合”、“特異性地結合”等等是指相對于溶液或反應混合物中的其他分子或部分而言優先結合至一種分子。在一些實施例中，結合成員與它特異性結合至的稀少目標細胞的標志物之間(當它們特異性地結合彼此在結合復合物中時)的親和力被表征為以下Kd (解離常數):10-6Μ或更小，例如10-7Μ或更小，包括10-8Μ或更小，例如10-9Μ或更小、KTkiM或更小、10_nM或更小、10_12M或更小、10_13M或更小、10_14M或更小，包括10_15M或更小。“親和力”是指結合的強度，增加的結合親和力與更低的Kd相關。
[0049]在本發明的某些方面，可以將一個樣品與多于兩種的特異性結合至稀少目標細胞的標志物上的結合成員進行接觸，例如，3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種，包括大約10至15種，或大約15或更多種。
[0050]結合成員可以特異性地結合至稀少目標細胞的一種標志物。如在此使用的，術語“標志物”被廣泛地使用，并且通常是指存在于稀少目標細胞的表面上或之內的任何分子，正常而言，該標志物當其在稀少目標細胞上時不是以與在健康的非稀少細胞上的濃度相同的濃度存在的。在某些方面，結合成員可以特異性地結合至稀少目標細胞的不同標志物(例如，不同類型的標志物，例如EpCam和細胞角蛋白)。在某些方面，標志物可存在于稀少目標細胞的表面上。在其他方面，標志物被包含于稀少目標細胞中。在此類方面，可能需要對樣品的細胞進行透化，以便使得第一和第二結合成員能夠特異性地結合至細胞內標志物。使樣品的細胞透化的方法在本領域中是熟知的，并且包括例如，商業試劑和方案，例如BDFACS透化溶液2的使用。任何使細胞透化的方便手段可以用于實踐這些方法中。
[0051]感興趣的標志物可 以包括但不限于⑶la、⑶2、⑶3、⑶4、⑶7、⑶8、⑶10、⑶I lb、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD45、CD56、CD57、CD59、CD61、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD90、CD103、CD117、CD133、CD138、CD271、CD303、CD304、bcl_2、C_kit、TdT、FMC7、SCA-1、血型糖蛋白 A、細胞角蛋白、EpCAM、EphB4、EGFR、CEA, HER2 以及 MUC-1。
[0052]在一些實施例中，結合成員包括標記或經標記的結合成員。如在此使用的，術語“標記”和“可檢測的標記”是指能夠檢測的分子，包括但不限于放射性同位素、熒光劑、化學發光劑、發色團、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、發色團、染料、金屬離子、金屬溶膠、配體(例如，生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素或半抗原)、嵌入染料等等。術語“熒光劑”是指能夠展現可檢測范圍內的熒光的一種物質或其部分。
[0053]感興趣的標記包括直接和間接可檢測的標記兩者。合適的用于在此處描述的方法中使用的標記包括通過光譜的、光化學的、生物化學的、免疫化學的、電子的、光學的、化學的或其他手段間接或直接可檢測的任何分子。感興趣的標記包括但不限于:熒光素及其衍生物；羅丹明及其衍生物；菁藍及其衍生物；香豆素及其衍生物；瀑布藍(Cascade Blue)及其衍生物；熒光黃(Lucifer Yellow)及其衍生物；B0DIPY及其衍生物；等等。感興趣的標記還包括:熒光團，例如吲哚碳菁(C3)、吲哚二碳菁(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克薩斯紅(Texas Red)、太平洋藍(Pacific Blue)、俄勒R綠(Oregon Green)488、亞歷克薩突光染料(Alexa fluor)_355、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)488、亞歷克薩熒光染料(Alexafluor)532、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)546、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)-555,亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 568、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 594、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 647、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 660、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 680、亞歷克薩突光染料(Alexa fluor) 700、JOE、_絲胺(Lissamine)、羅丹明綠(Rhodamine Green)、B0DIPY、異硫氰酸熒光素(FITC)、羧基熒光素(FAM)、藻紅蛋白、羅丹明、二氯羅丹明(dRhodamine)、羧基四甲基羅丹明(TAMRA)、羧基-X-羅丹明(R0X)、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、RiboGreen、等等。
[0054]可以使用光檢測器(例如在流式細胞計數器中)檢測發射光來對熒光標記進行檢測。典型地，酶標記是通過以下方式來檢測:為酶提供底物，并且對通過酶對底物的作用產生的反應產物進行檢測；比色標記可以通過簡單地使帶色標記可視化來檢測；并且抗原標記可以通過提供一種特異性地結合至該抗原標記的抗體(或其結合片段)來檢測。特異性地結合至抗原標記的抗體可以是直接或間接可檢測的。例如，該抗體可以軛合至一種提供信號(例如，熒光)的標記部分(例如，熒光團);該抗體可以軛合至酶(例如，過氧化物酶、堿性磷酸酶、等)，該酶在供有適當底物(例如，熒光-酪胺，FastRed等)時產生可檢測產物(例如，突光廣物)；等等。
[0055]這些方法的結合成員可以用不同的標記進行標記。在某些方面，標記被選擇為使得這些標記可以與彼此區分開，例如，第一標記與第二標記的發射光譜基本上是不重疊的。例如，圖2的圖A-B描繪了兩種標記一異硫氰酸熒光素(FITC ;圖A)和亞歷克薩熒光染料647 (圖B)的發射光譜，它們基本上不重疊。可以使用具有在大約488nm處的波長的光激發FITC，并且它的發射光譜可以使用過濾器(例如530/30過濾器)來檢測，基本上不與亞歷克薩熒光染料647的發射光譜重疊。采用具有非重疊可檢測發射光譜的兩種不同標記使得產生的流式細胞計數測定結果能夠被繪制為密度圖，該密度圖中y軸上為第一標記的熒光度，而X軸上為第二標記的熒光度(參見例如圖1)。
[0056]在某些方面，結合成員可以是抗體、或其抗原結合片段。如在此使用的，術語“抗體”包括任何同型抗體或免疫球蛋白，保持對抗原的特異性結合的抗體片段(包括但不限于Fab、Fv、scFv、以及Fd片段)、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、以及融合蛋白(包括抗體的抗原結合部分和非抗體蛋白質)。抗體可以進一步軛合至其他部分，例如，特異性結合對的成員，例如，生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結合對的成員)等等。被該術語涵蓋的還有Fab’、Fv、F(ab’ )2和或其他保持對抗原的特異性結合的抗體片段、以及單克隆抗體。
[0057]可以使樣品與對于稀少目標細胞的相同標志物具有特異性的至少兩種結合成員進行接觸。在結合成員是抗體時，稀少目標細胞的標志物可以因此包括由這些抗體結合的一種或多種抗原。“抗原”是本領域中很好理解的術語，并且包括可以特異性地由抗體分子或T細胞受體的抗原結合部位結合的任何物質。通過“表位”意指特異性B細胞和/或T細胞所響應的抗原上的一個部位。識別相同表位的抗體可以用簡單的免疫測定來鑒定，這種免疫測定顯示一個抗體阻斷另一個抗體結合目標抗原的能力。在某些方面，抗體(例如，第一結合成員，第二結合成員，第三結合成員，等)結合相同的表位。在其他方面，抗體結合不同的表位。
[0058]各種結合成員可以用于給定的感興趣的標志物。例如，在感興趣的標志物是CD45時，感興趣的結合成員包括但不限于，可商購的由克隆C0-F11、HI100、HI30、UCHL1、30-F11、2D1、L48、RA3-6B2和D058-1283產生的抗體(所有的均來自BD Biosciences公司)。然而，在一些情況下，這些方法不包括對⑶45進行染色。
[0059]在標志物是細胞角蛋白時，感興趣的結合成員包括但不限于:可商購的由克隆CAM5.2產生的抗體，主要與人類細胞角蛋白7和細胞角蛋白8 (BD Biosciences公司)發生反應；由克隆KA4產生的抗體，主要與人類細胞角蛋白14、15、16和19 (BD Biosciences公司)發生反應；由克隆RCK102產生的抗體，主要與人類、小鼠、大鼠、倉鼠、豬、狗、和/或兔子細胞角蛋白5和8發生反應，如在羅迪西(Lodish)等人，MCB，2000, 795-847中描述的，將其披露通過引用結合于此；由克隆RCK105產生的抗體，主要與人類、小鼠、大鼠、倉鼠、豬、和/或狗細胞角蛋白7發生反應,如在羅迪西(Lodish)等人(如上)中描述的；由克隆AEl/AE3 (Millipore)產生的抗體；由克隆C-1l產生的抗體,如在米凱利安(Mikaelian)等人(2004)《毒理病理學》(Toxicol Pathol),32:181-191中描述的，將其披露通過引用結合于此；由克隆Ldsl03產生的抗體,如在索思蓋特(Southgate)等人1987《實驗室研究》(Lab.1nvest.),56:211-223中描述的，將其披露通過引用結合于此；以及由克隆CK2產生的抗體，如在瓦克泰(Wachter)等人(1990)《肝病學雜志》(J.Hepatol.)，11:232-239中描述的。
[0060]感興趣的EpCAM結合成員包括但不限于，抗EpCAM抗體BerEP4，如在舍巴尼(Sheibani)等人《外科病理學年度雜志》(Am J Surg Pathol)，1991年8月，15 (8): 779-784中描述的，將其披露通過引用結合于此；KSl/4，如在安托羅維奇(Antolovic)，等人(2010)《BMC生物技術》(BMC Biotechnol)10:35中所描述的，將其披露通過引用結合于此；由克隆G8.8產生的抗體，主要與小鼠EpCAM (BD Biosciences公司)發生反應；以及由克隆EBA-1產生的抗體，主要與人類EpCAM發生反應(BD Biosciences公司)。
[0061]感興趣的EGFR結合成員包括但不限于，由克隆13/EGFR產生的抗體；由克隆9H2產生的抗體；由克隆EGFR.1產生的抗體；由克隆12A3產生的抗體；以及由克隆17/印sl5產生的抗體(BD Biosciences公司)。
[0062]感興趣的CEA結合成員包括但不限于，由克隆C0L-1產生的抗體；由克隆B1.1/CD66產生的抗體；以及由克隆B6.2/CD66產生的抗體(BD Bioscience公司)。
[0063]感興趣的HER2結合成員包括但不限于，由克隆Neu24.7產生的抗體；由克隆42/c-erbB-2產生的抗體；由克隆3B5產生的抗體(BD Biosciences公司)；以及由克隆9G6產生的抗體，如在漢考克(Hancock)等人1991《癌癥研究》(Cancer Res.) 51:4575-4589中描述的，將其披露通過弓I用結合于此。
[0064]感興趣的MUC-1結合成員包括但不限于由克隆HMPV產生的抗體(BD Biosciences公司)。
[0065]細胞計數分析
[0066]本披露的方法可以涉及對樣品進行流式細胞計數測定。流式細胞計數測定程序在本領域中是熟知的。參見，例如，奧默羅德(Ormerod)(編著)，《流式細胞術:實踐方法》(Flow Cytometry:A Practical Approach),牛津大學出版社(Oxford Univ.Press)(1997);喬羅謝夫斯基(Jaroszeski)等人(編著)，《流式細胞術方案》(Flow CytometryProtocols),分子生物學中的方法(Methods in Molecular Biology) 91期，胡馬納出版社(Humana Press) (1997);《實踐流式細胞術》(Practical Flow Cytometry),第三版，Wiley-Liss (1995);弗戈(Virgo)等人(2012)《臨床生物化學年鑒》(Ann Clin Biochem.)I 月；49 (ptl): 17-28 ;林登(Linden),等人，《凝血止血研討會》(Semin Throm Hemost.)2004 年 10 月；30(5):502-11 ;Alison，等人《病理學雜志》(J Pathol )，2010 年 12 月；222(4):335-344 ;以及赫爾比希(Herbig)等人(2007)《治療性藥物載體系統銳評》(CritRev Ther Drug Carrier Syst.) 24(3):203-255 ;將它們的披露通過引用結合于此。在某些方面中，對樣品進行流式細胞計數測定涉及使用能夠同時激發并檢測多熒光團的流式細胞計數器，例如BD Biosciences FACSCanto?流式細胞計數器,基本上根據生產商說明書使用。本披露的方法可以涉及成像細胞計數，例如描述于霍爾登(Holden)等人(2005)《自然方法》(Nature Methods) 2:773和沃萊特(Valet)等人2004《細胞計數》(Cytometry)59:167-171中的，將它們的披露通過引用結合于此。
[0067]在這些方法的某些方面中，細胞計數測定包括前向光散射(FSC)和/或側向光散射(SSC)。在其他方面中，細胞計數測定包括對第一結合成員的標記和第二結合的標記兩者進行檢測(圖4，圖A-D和圖5，圖A-C)，其中取代散射光，標記的組合(例如兩種顏色熒光燈的組合，其中每個標記是熒光染料)用作測定中的閾值。在此類方面中，對樣品中的稀少目標細胞的鑒定可以需要第一標記和第二標記兩者的檢測。在某些方面中，對樣品中的稀少目標細胞的鑒定可以需要多于兩種標記的檢測(例如，第三結合成員，第四結合成員，等)。
[0068]在某些方面中，可以在細胞計數分析之前將非稀少細胞從樣品中進行分離。可以采用將非稀少細胞從樣品中去除的任何方便手段。感興趣的分離方法包括但不限于:磁力分離技術，例如描述于以下文獻中的那些:美國專利號5，945, 281、6，858, 440 ；6，645，777 ;6，630，355 ;以及 6，254，830 ;美國專利申請號 PCT/US2012/032423 ;以及霍普納(Hoeppener)，等人(2012)《癌癥研究當前結果》(Recent Results Cancer Res.)195:43-58;將它們的披露通過引用結合于此。感興趣的分離方法進一步包括包含聲集中器或分離器的那些，例如，在美國專利號6，929，750中描述的那些，特此將其披露通過引用結
八
口 ο
[0069]細胞計數分析可以包括分類。可以通過任何方便的分析技術對樣品中被鑒定為稀少目標細胞的細胞進行分類并隨后進行分析。感興趣的隨后的分析技術包括但不限于，測序；通過CellSearch進行的測定，如在《食品與藥品管理》(Food and DrugAdministration) (2004)最終條例 Fed Regist69:26036-26038 中描述的；通過 CTC 芯片進行的測定，如在納格瑞思(Nagrath)，等人(2007)《自然》(Nature) 450:1235-1239中描述的；通過MagSweeper進行的測定,如在塔拉薩茲(Talasaz),等人(2009),《美國國家科學院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA) 106:3970-3975中描述的；以及通過納米結構底物進行的測定，如在王(Wang) S,等人(2011) Angew Chem Int Ed Engl50:3084-3088 中描述的；將它們的披露通過引用結合于此。在希望時，分類方案可以包括區分可變的和死亡的稀少細胞，其中對于鑒定此類細胞來說任何方便的染色方案可以結合進這些方法中。
[0070]蓋統
[0071]還提供了用于實踐這些主題方法的細胞計數系統。這些細胞計數系統可以包括細胞計數樣品流體子系統，如下文所述。另外，這些細胞計數系統包括流體地連接至細胞計數樣品流體子系統的細胞計數器。本披露的系統可以包括若干另外的部件，例如，數據輸出裝置(如監測器、打印機、和/或揚聲器)，數據輸入裝置(如界面接口、鼠標、鍵盤等)，流體處理部件、電源、等。
[0072]在某些方面中，一種細胞計數系統包括細胞計數樣品流體子系統，該子系統被配置為使一個包含一種稀少目標細胞的樣品與第一和第二結合成員接觸，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物。該子系統可以進一步被配置為使得樣品的非稀少細胞不會特異性地被標記和/或染色(例如，對于CD45沒有進行染色)。系統可以包括一種細胞計數器，該細胞計數器流體地連接至該細胞計數樣品流體子系統。
[0073]在其他方面，系統可以包括細胞計數樣品流體子系統，該子系統被配置為使一個包含一種稀少目標細胞的樣品與第一和第二結合成員接觸，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物；以及細胞計數器，該細胞計數器流體地連接至該流式細胞計數樣品流體子系統，該細胞計數器被配置為針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對樣品進行測定以檢測樣品中的稀少目標細胞。在某些方面中，細胞計數器被配置為使用第一標記和第二標記的熒光組合作為檢測閾值，該第一標記附接至第一結合成員，該第二標記附接至第二結合成員。
[0074]試劑盒
[0075]還提供了用于實踐以上所述方法的一個或多個實施例的試劑盒。這些主題試劑盒可以包括不同的組件和試劑。在一些情況下，這些試劑盒包括:至少在這些方法(例如，如上所述的)中發現用途的試劑；以及具有儲存于其中的計算機程序的計算機可讀取介質，其中該計算機程序在加載在計算機中時運行計算機以執行如在此所述的細胞計數測定；以及具有地址的物理基質，從該地址可獲得計算機程序。
[0076]除了以上組件之外，這些主題試劑盒可以進一步包括用于實踐這些方法的說明書。這些說明書可以按多種形式存在于這些主題試劑盒中，這些形式中的一種或多種可以存在于試劑盒中。這些說明書可以存在的一種形式是:作為在合適介質或基質上打印的信息(例如，上面打印信息的一張或多張紙)，在試劑盒的包裝中打印的信息，在包裝插入物中打印的信息，等等。又另外的手段可以是在其上已經記錄有信息的計算機可讀取介質，例如⑶、DVD、藍光光碟(Blu-Ray)、閃存盤、等等。可以存在的又另外的手段是可以在遠離的地方經由因特網用來獲取信息的網址。任何方便的手段可以存在于這些試劑盒中。
[0077]實用性
[0078]這些主題方法、組合物、系統以及試劑盒發現在希望檢測樣品中的稀少目標細胞時的各種不同應用中發現用途。
[0079]本披露的非限制性示例性實施例提供如下:
[0080]1.一種用于對一個樣品中的一種稀少目標細胞進行檢測的方法，該方法包括:
[0081]使該樣品與第一和第二結合成員接觸，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物，并且
[0082]針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對該樣品進行細胞計數測定以檢測該樣品中的該稀少目標細胞。
[0083]2.根據I的方法，其中對樣品的細胞計數測定包括對樣品的流式細胞計數測定。
[0084]3.根據I或2的方法，其中對樣品的細胞計數測定包括對樣品的成像細胞計數測定。
[0085]4.根據1-3中任一項所述的方法，進一步包括使該樣品與特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物的三結合成員接觸，并且針對包括結合的第一、第二和第三結合成員的細胞的存在對該樣品進行細胞計數測定以檢測在該樣品中的該稀少目標細胞。
[0086]5.根據1-4中任一項所述的方法，其中至少這些第一和第二結合成員是抗體、或其抗原結合片段。
[0087]6.根據5所述的方法，其中這些抗體或其抗原結合片段結合至該標志物上的重疊表位。
[0088]7.根據6所述的方法，其中這些抗體或其抗原結合片段結合至該標志物的相同的表位。
[0089]8.根據1-7中任一項所述的方法，其中這些結合成員被標記。
[0090]9.根據8所述的方法，其中這些結合成員被直接進行了標記。
[0091]10.根據8-9中任一項所述的方法，其中該第一或第二結合成員被選自以下項的標記進行了標記:吲哚碳菁(C3)、吲哚二碳菁(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克薩斯紅(Texas Red)、太平洋藍(Pacific Blue)、俄勒R綠(Oregon Green)488、亞歷克薩突光染料(Alexa fluor)-355、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 488、亞歷克薩熒光染料(Alexafluor)532、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)546、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)-555,亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 568、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 594、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 647、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 660、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 680、亞歷克薩突光染料(Alexa fluor) 700、JOE、_絲胺(Lissamine)、羅丹明綠(Rhodamine Green)、B0DIPY、異硫氰酸熒光素(FITC)、羧基熒光素(FAM)、藻紅蛋白、羅丹明、二氯羅丹明(dRhodamine)、羧基四甲基羅丹明(TAMRA)、羧基-X-羅丹明(R0X)、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、以及 RiboGreen。
[0092]11.根據8-10中任一項所述的方法，其中該第一結合成員的標記和該第二結合成員的標記是不同的標記。
[0093]12.根據1-11中任一項所述的方法，其中該樣品中的非稀少細胞沒有被特異性地染色。[0094]13.根據1-12中任一項所述的方法，其中該樣品中的非稀少細胞沒有被針對CD45而進行染色。
[0095]14.根據1-13中任一項所述的方法，其中該標志物是一種細胞內標志物。
[0096]15.根據14所述的方法，包括用一種透化試劑將該樣品中的有核細胞進行透化。
[0097]16.根據1-15中任一項所述的方法，其中該標志物是選自⑶la、⑶2、⑶3、⑶4、CD7、CD8、CD10、CDllb, CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD45、CD56、CD57、CD59、CD61、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD90、CD103、CD117、CD133、CD138、CD271、CD303、CD304、bcl_2、C_kit、TdT、FMC7、SCA-1、血型糖蛋白 A、細胞角蛋白、EpCAM、EphB4、EGFR、CEA, HER2 以及 MUC-1。
[0098]17.根據1-16中任一項所述的方法，其中該樣品是血液。
[0099]18.根據1-17中任一項所述的方法，其中該樣品是全血。
[0100]19.根據1-18中任一項所述的方法，其中該樣品是獲得自哺乳類受試者。
[0101]20.根據1-19中任一項所述的方法，其中該樣品是獲得自人類受試者。
[0102]21.根據1-20中任一項所述的方法，其中該稀少目標細胞是一種上皮細胞。
[0103]22.根據21所述的方法，其中該上皮細胞是一種循環腫瘤細胞。
[0104]23.根據22所述的方法，其中該標志物是一種選自CK4、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK18、CK19、以及CK20的細胞角蛋白。
[0105]24.根據22所述的方法，其中這些第一和第二結合成員是抗體，并且作為由克隆CAM5.2、KA4、RCK102、RCK105、C_ll、Ldsl03、或CK2產生的抗體結合基本上相同的表位。
[0106]25.根據1-24中任一項所述的方法，其中對該樣品進行細胞計數測定包括分類。
[0107]26.根據25所述的方法，其中將該稀少目標細胞進行收集。
[0108]27.根據26所述的方法，其中隨后將該稀少目標細胞進行測定。
[0109]28.—種細胞樣品，包括:
[0110]一種稀少目標細胞，該稀少目標細胞包括一種標志物；以及
[0111]第一和第二結合成員，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的該標志物。
[0112]29.根據28所述的細胞樣品，進一步包括一種第三結合成員，該第三結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的該標志物。
[0113]30.根據28或29所述的細胞樣品，其中這些結合成員是抗體、或其抗原結合片段。
[0114]31.根據30所述的細胞樣品，其中這些抗體或其抗原結合片段結合至該標志物上
的重疊表位。
[0115]32.根據31所述的細胞樣品，其中這些抗體或其抗原結合片段結合至該標志物的相同的表位。
[0116]33.根據28-32中任一項所述的細胞樣品，其中這些結合成員被標記。
[0117]34.根據33所述的細胞樣品，其中這些結合成員被直接進行了標記。
[0118]35.根據33-34中任一項所述的細胞樣品，其中該第一或第二結合成員被選自以下項的標記進行了標記:Π引哚碳菁(C3)、D引哚二碳菁(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克薩斯紅(Texas Red)、太平洋藍(Pacific Blue)、俄勒 R綠(Oregon Green) 488、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)-355、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 488、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 532、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 546、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)-555、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 568、亞歷克薩熒光染料(Alexafluor) 594、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 647、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 660,亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 680、亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor) 700、JOE、麗絲胺(Lissamine)、羅丹明綠(Rhodamine Green)、BODIPY>異硫氰酸突光素(FITC)、羧基突光素(FAM)、藻紅蛋白、羅丹明、二氯羅丹明(dRhodamine)、羧基四甲基羅丹明(TAMRA)、羧基-X-羅丹明(R0X)、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、以及 RiboGreen。
[0119]36.根據33-35中任一項所述的細胞樣品，其中該第一結合成員的標記和該第二結合成員的標記是不同的標記。
[0120]37.根據28-35中任一項所述的細胞樣品，其中該樣品中的非稀少細胞沒有被特異性地染色。
[0121]38.根據28-37中任一項所述的細胞樣品，其中該樣品中的非稀少細胞沒有被針對⑶45而進行染色。
[0122]39.根據28-38中任一項所述的細胞樣品，其中該標志物是一種細胞內標志物。
[0123]40.根據28-39中任一項所述的細胞樣品，其中該標志物是選自⑶la、⑶2、⑶3、CD4、CD7、CD8、CD10、CDllb, CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD45、CD56、CD57、CD59、CD61、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD90、CD103、CD117、CD133、CD138、CD271、CD303、CD304、bcl_2、C_kit、TdT、FMC7、SCA-1、血型糖蛋白 A、細胞角蛋白、EpCAM、EphB4、EGFR、CEA, HER2 以及 MUC-1。
[0124]41.根據28-40中任一項所述的細胞樣品，其中該樣品是血液。
[0125]42.根據28-41中任一項所述的細胞樣品，其中該樣品是全血。
[0126]43.根據28-42中任一項所述的細胞樣品，其中該樣品是獲得自哺乳類受試者。
[0127]44.根據28-43中任一項所述的細胞樣品，其中該樣品是獲得自人類。
[0128]45.根據28-44中任一項所述的細胞樣品,其中該稀少目標細胞是一種上皮細胞。
[0129]46.根據45所述的細胞樣品，其中該上皮細胞是一種循環腫瘤細胞。
[0130]47.—種細胞計數系統，包括:
[0131]一種細胞計數樣品流體子系統，該子系統被配置為使一個包含一種稀少目標細胞的樣品與第一和第二結合成員接觸，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物，其中該樣品的非稀少細胞沒有被標記；以及
[0132]一種細胞計數器，該細胞計數器流體地連接至該細胞計數樣品流體子系統。
[0133]48.如47所述的細胞計數系統，其中該細胞計數樣品流體子系統是流式細胞計數樣品流體子系統，并且該細胞計數器是一種流式細胞計數器。
[0134]49.一種細胞計數系統，包括:
[0135]一種細胞計數樣品流體子系統，該子系統被配置為使一個包含一種稀少目標細胞的樣品與第一和第二結合成員接觸，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物；以及
[0136]一種細胞計數器，該細胞計數器流體地連接至該細胞計數樣品流體子系統，該細胞計數器被配置為針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對該樣品進行測定以檢測該樣品中的該稀少目標細胞。[0137]50.如49所述的細胞計數系統，其中該細胞計數樣品流體子系統是流式細胞計數樣品流體子系統，并且該細胞計數器是一種流式細胞計數器。
[0138]51.一種用于對一個樣品中的一種稀少目標細胞進行鑒定的試劑盒，該試劑盒包括:
[0139]第一和第二結合成員，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物；
[0140]說明書，用于指導使用這些第一和第二結合成員來針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對該生物樣品進行流式細胞計數測定以檢測該樣品中的該稀少目標細胞。
[0141]實例
[0142]如可以從以上提供的披露所理解的，本披露具有各種各樣的應用。因此，提出以下實例以便為本領域普通技術人員提供如何制造和使用本發明的完整披露和描述，并且不旨在限制諸位發明人考慮作為他們的發明的范圍，也不旨在表示以下實驗是進行的所有或僅有的實驗。本領域的技術人員將易于認識到多種可以改變或修飾以產生本質上相似結果的非關鍵參數。因此，提出以下實例以便為本領域普通技術人員提供如何制造和使用本發明的完整披露和描述，并且不旨在限制諸位發明人考慮作為他們的發明的范圍，它們也不旨在表示以下實驗是進行的所有或僅有的實驗。已經作出努力以確保關于使用數目的準確性(例如，量，溫度，等)，但一些實驗誤差和偏差應被考慮在內。
[0143]材料與方法
[0144]以下是在下述實例中使用的總體材料與方案。
[0145]純化的抗-細胞角蛋白抗體是獲得自BD (富蘭克林湖(Franklin Lakes),新澤西州(New Jersey))。抗體分為兩個類群，并且兩個類群的軛合熒光染料的抗-細胞角蛋白抗體分別是通過將FITC或亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)647熒光染料軛合至一個類群的抗體上來產生的。HT-29結腸腺癌細胞獲得自ATCC (ATCC HTB38)。
[0146]使用Ix BD FACS細胞溶解溶液將血液樣品進行細胞溶解。使用Ix BD FACS透化溶液2將樣品進行透化。所有的流式細胞計數測定是使用BD Biosciences FACSCanto?流式細胞計數器進行的。所有的試劑和材料是遵照以下生產商方案使用的。
[0147]實例1:檢測血 液樣品中的腫瘤細胞
[0148]將正常供體的靜脈血收集于肝素鈉BD Vacutainer管中。以(i) 10，000HT-29細胞 /mL ； (ii) I, 000HT-29 細胞 /mL ； (iii) 100HT-29 細胞 /mL ;或(iv)0HT_29 細胞 /mL 的濃度，將HT-29腫瘤細胞添加至血液樣品。對于四個樣品的每一種，取7.5mL抽取物，并且在BD Vacutainer CPT管中進行旋轉以分離WBC部分。CPT樣品制備技術對于涉及細胞溶解和離心的方案是可比的(圖10)。隨后對WBC部分進行固定、透化，用CK-FITC和CK-Alexa647染色60m，并且經由FACS進行分析(圖3)。
[0149]所得的密度圖(圖4，圖A-D)，APC通道(y軸)對FITC通道(x軸)，顯示樣品中的一群細胞，其中HT-29腫瘤細胞具有⑴10，000HT-29細胞/mL (圖A) ； (ii) I, 000HT-29細胞/mL (圖B);以及(iii)100HT-29細胞/mL (圖C)的起始濃度。在每個圖中觀察到的細胞數目與HT-29腫瘤細胞的起始濃度成比例地降低。在起始HT-29腫瘤細胞濃度是O細胞/mL時，沒有觀察到細胞(圖D)。[0150]甚至在WBC的背景較高時，可以檢測HT-29腫瘤細胞（圖5，圖A-C)。將包含濃度為10，000細胞/mL的HT-29細胞的血液樣品（7. 5mL)用Ix FACS細胞溶解溶液進行溶解，用Ix BD FACS透化溶液2進行透化，進行洗滌，然后以O. 55mL Rx體積用CK Ab-FITC和CKAb-A647軛合物染色,并且在不用進一步洗漆的情況下，在BD Biosciences FACSCanto?流式細胞計數器上以（36 μ L/min)的介質流速對此混合物的O. 36mL進行計數。在34，363，636個WBC的背景中觀察到一個HT-29腫瘤細胞（圖A-B)，并且在15分鐘運行期間對于“僅緩沖液”來說沒有記錄到假陽性點（圖C)。
[0151]通過要求檢測至少第一和第二結合成員，改進HT-29細胞與假陽性事件的區分。例如，當僅有一個結合成員的結合被觀察到時，HT-29腫瘤細胞不能容易地從非特異性事件中檢測（圖6，圖A-B ;圖7，圖A-B)。要求檢測第一和第二結合成員導致窄對角下行的點圖，并且導致容易鑒定HT-29細胞（圖6，圖C)，同時還清除了假陽性事件（圖7，圖C)。
[0152]成像進一步揭示：許多假陽性事件可以通過測量僅一個結合成員而觀察到。例如，圖8圖A-C顯示了在不同起始濃度下的HT-29腫瘤細胞的圖像。將包含WBC和HT-29腫瘤細胞的樣品用CK-FITC和CK-PE進行染色。HT-29細胞是以5，000細胞/mL (圖A)、500細胞/mL (圖B)、或O. O細胞/mL (圖C)的濃度存在。在PE通道中甚至在O. O細胞/mL (圖C)的HT-29細胞濃度下，觀察到事件。
[0153]還使用蔡司顯微鏡和汞弧燈，對單獨的細胞進行成像（圖9，圖A-B)。如上所述對樣品進行制備，并且使用蔡司顯微鏡使用汞弧燈對單獨的細胞進行成像。從FITC通道獲得的圖像揭示了在單獨細胞中CK-FITC的存在，從APC通道獲得的圖像揭示了在單獨細胞中CK-Alexa647的存在，并且疊加圖像顯示存在于細胞中的CK-FITC和CK_Alexa647兩者(右圖，圖B)。對每個樣品進行100倍圖像。
[0154]雖然前述發明已經出于清楚理解的意圖通過說明和實例的方式，在某些細節上得以描述，但鑒于本披露的傳授，對于本領域的普通技術人員容易清楚的是可以在不偏離所附權利要求書的精神或范圍的情況下對其作出某些改變和修飾。
[0155]因此，前述內容僅說明本發明的原理。將理解的是本領域的技術人員將能夠設計不同的安排，這些不同的安排雖然沒有在此明確地描述或顯示，但實施本發明的原理并且被包括在其精神和范圍之內。此外，在此引用的所有實例和有條件的語言原則上旨在幫助讀者理解本發明的原理而不受此類具體引用的實例和條件的限制。并且，引用本發明的原理、方面、以及實施例的所有在此的陳述連同其具體實例旨在涵蓋其結構和功能等效物兩者。另外，預期此類等效物包括當前已知的等效物以及有朝一日發展的等效物，即不論結構而執行相同功能的發展的任何要素。因此，本發明的范圍不是旨在限制于在此顯示和描述的示例性實施例。而本發明的范圍和精神是通過所附權利要求書來實施。
【權利要求】
1.一種用于對一個樣品中的一種稀少目標細胞進行檢測的方法，該方法包括: 使該樣品與第一和第二結合成員接觸，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物，并且 針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對該樣品進行細胞計數測定以檢測該樣品中的該稀少目標細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其中這些第一和第二結合成員是抗體、或其抗原結合片段。
3.根據權利要求2所述的方法，其中這些抗體或其抗原結合片段結合至該標志物的相同的表位。
4.根據權利要求1所述的方法，其中這些第一和第二結合成員被進行了標記。
5.根據權利要求4所述的方法，其中這些第一和第二結合成員被直接進行了標記。
6.根據權利要求1所述的方法，其中該樣品中的非稀少細胞沒有被標記。
7.根據權利要求1所述的方法，包括用一種透化試劑將該樣品中的有核細胞進行透化。
8.根據權利要求1所述的方法，其中該標志物是一種細胞角蛋白。
9.根據權利要求1所述的方法，其中該標志物是選自⑶la、⑶2、⑶3、⑶4、⑶7、⑶8、CD10、CDllb、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD45、CD56、CD57、CD61、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD103、CD117、CD133、CD138、CD271、CD303、CD304、bcl_2、TdT、FMC7、血型糖蛋白 A、細胞角蛋白、EpCAM, EphB4、EGFR、CEA, HER2以及MUC-1。
10.根據權利要求1所述的方法，其中該樣品是全血。
11.根據權利要求1所述的方法，其中該樣品是獲得自人類。
12.—種細胞樣品,包括: 一種稀少目標細胞，該稀少目標細胞包括一種標志物；以及 第一和第二結合成員，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的該標志物。
13.一種細胞計數系統，包括: 一種細胞計數樣品流體子系統，該子系統被配置為使一個包含一種稀少目標細胞的樣品與第一和第二結合成員接觸，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物，其中該樣品的非稀少細胞沒有被標記；以及 一種細胞計數器，該細胞計數器流體地連接至該細胞計數樣品流體子系統。
14.一種細胞計數系統，包括: 一種細胞計數樣品流體子系統，該子系統被配置為使一個包含一種稀少目標細胞的樣品與第一和第二結合成員接觸，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物；以及 一種細胞計數器，該細胞計數器流體地連接至該細胞計數樣品流體子系統，該細胞計數器被配置為針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對該樣品進行測定以檢測該樣品中的該稀少目標細胞。
15.一種用于對一個樣品中的一種稀少目標細胞進行鑒定的試劑盒，該試劑盒包括:第一和第二結合成員，這些第一和第二結合成員特異性地結合至該稀少目標細胞的一種標志物； 說明書，用于指導使用這些第一和第二結合成員來針對包括結合的第一和第二結合成員的細胞的存在對該生物樣品進行細胞計數測定以檢測該樣品中的該稀少目標細胞。
【文檔編號】G01N33/48GK103842813SQ201280043030
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年9月6日 優先權日:2011年9月6日
【發明者】赫爾·基拉科相, 愛德華·戈爾德貝格, 迪特爾·雷克滕瓦爾德 申請人:貝克頓·迪金森公司