利用單個發光粒子檢測的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計算機程序的制作方法

利用單個發光粒子檢測的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計算機程序的制作方法
【專利摘要】提供了在利用使用了共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光測量的掃描分子計數法中將光測量時的測量單位時間設定為合適的值以能夠可靠地檢測發光粒子的信號的大致吊鐘狀的輪廓且能夠避免時序光強度數據的數據量的過度增大的光分析技術。本發明的對樣本溶液中的發光粒子的光進行檢測的光分析技術一邊使顯微鏡的光檢測區域的位置在樣本溶液內移動一邊生成所檢測出的來自光檢測區域的光的時序光強度數據，在該數據中逐個檢測各個表示來自各個發光粒子的光的信號。根據光檢測區域的大小和位置的移動速度來決定來自光檢測區域的光的檢測中的測量單位時間。
【專利說明】利用單個發光粒子檢測的光分析裝置、光分析方法以及光
分析用計算機程序
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種光分析技術，能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統等能夠檢測來自溶液中的微小區域的光的光學系統，檢測來自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為“粒子”)、例如蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞等粒子狀的對象物、或非生物學粒子的光，來獲取在分析或解析它們的狀態(相互作用、結合/離解狀態等)時有用的信息，更詳細地說，涉及一種能夠使用如上所述的光學系統逐個檢測來自單個的發光粒子的光并進行各種光分析的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計算機程序。此外，在本說明書中，發光的粒子(以下稱為“發光粒子”)可以是其自身發光的粒子、或附加了任意的發光標識或發光探針的粒子，從發光粒子發出的光可以是熒光、磷光、化學發光、生物發光、散射光等。
【背景技術】
[0002]由于近年來的光測量技術的發展，使用共焦顯微鏡的光學系統和還能夠進行光子計數(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術，能夠檢測/測量單光子或熒光單分子水平的微弱光。因此，提出了各種使用這樣的微弱光的測量技術對生物體分子等的特性、分子間相互作用、或結合/離解反應進行檢測的裝置或方法。例如，在熒光相關光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻 1-3、非專利文獻 1-3)中，利用激光共焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術，測量來自出入樣本溶液中的微小區域(被稱為顯微鏡的激光會聚到的焦點區域-共焦區組織)內的熒光分子或被熒光標識的分子(熒光分子等)的熒光強度，根據由測量得到的該熒光強度的自相關函數的值所確定的在微小區域內的熒光分子等的平均滯留時間(平移擴散時間)和滯留分子的個數的平均值，獲取熒光分子等的運動的速度或大小、濃度之類的信息，或檢測分子的構造或大小的變化、分子的結合/離解反應或分散/聚合之類的各種現象。另外，在熒光強度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如專利文獻 4、非專利文獻4)、光子計數直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如專利文獻5)中，生成與FCS同樣地測量出的出入共焦區組織內的熒光分子等的熒光強度的直方圖，使統計性的模型公式擬合該直方圖的分布，由此估算熒光分子等的固有的亮度的平均值和滯留在共焦區組織內的分子的個數的平均值，根據這些信息估計分子的構造或大小的變化、結合/離解狀態、分散/聚合狀態等。另外，除此以外，在專利文獻6、7中，提出了根據利用共焦顯微鏡的光學系統測量出的樣本溶液的熒光信號的時間經過來檢測熒光性物質的方法。專利文獻8提出了一種信號運算處理技術，其用于使用光子計數技術測量來自流通于流式細胞儀的熒光微粒子或固定在基板上的熒光微粒子的微弱光，來檢測流體中或基板上的熒光微粒子的存在。
[0003]特別是，根據FCS、FIDA等使用了利用共焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術進行微小區域的熒光測量的技術的方法，進行測量所需要的樣本與以前相比可以是極低濃度且極微量(在一次測量中使用的量至多為幾十yL左右)，測量時間也大幅縮短(在一次測量中反復多次進行秒級時間的測量。)。因而，期待這些技術特別是在對醫學、生物學的研究開發領域中經常使用的稀少或昂貴的樣本進行分析的情況下，或在疾病的臨床診斷、生理活性物質的篩選等檢測體數多的情況下，成為與以前的生物化學方法相比能夠廉價或迅速地執行實驗或檢查的強力工具。
[0004]專利文獻1:日本特開2005-098876
[0005]專利文獻2:日本特開2008-292371
[0006]專利文獻3:日本特開2009-281831
[0007]專利文獻4:日本專利第4023523號
[0008]專利文獻5:國際公開2008-080417
[0009]專利文獻6:日本特開2007-20565
[0010]專利文獻7:日本特開2008-116440
[0011]專利文獻8:日本特開平4-337446號公報
[0012]非專利文獻1:金城政孝，蛋白質核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438頁1999年
[0013]非專利文獻2:F.J.Meyer-Alms,突光相關譜(Fluorescence CorrelationSpectroscopy), R.Rigler 編,Springer,柏林,2000 年,204-224 頁
[0014]非專利文獻3:加藤則子及其他4名，遺傳醫學，Vol.6，N0.2，271-277頁
[0015]非專利文獻4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美國科學學院紀要，1999年，96卷，13756-13761 頁(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

【發明內容】

[0016]發明要解決的問題
[0017]在上述的FCS、FIDA等使用了共焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術的光學分析技術中，所測量的光是從熒光單分子或多分子發出的光，但在該光的分析中，執行時序地測量出的熒光強度數據的自相關函數的運算或對直方圖擬合之類的熒光強度的波動的計算等統計性的處理，并非逐個參照或分析來自各個熒光分子等的光的信號。即，在這些光分析技術中，對來自多個熒光分子等的光的信號統計性地進行處理，針對熒光分子等檢測統計平均性的特性。因而，為了在這些光分析技術中得到統計上有意義的結果，需要樣本溶液中的作為觀測對象的熒光分子等的濃度或數密度在平衡狀態下為在一次的秒級長度的測量時間內能夠進行統計性處理的個數的熒光分子等出入微小區域內的水平，優選的是在微小區域內始終存在一個左右的熒光分子等的水平。實際上，共焦區組織的體積為IfL左右，因此，在上述的光分析技術中使用的樣本溶液中的熒光分子等的濃度典型地是InM左右或其以上，在大幅低于InM時，產生在共焦區組織內不存在熒光分子等的時間而無法得到統計上有意義的分析結果。另一方面，在專利文獻6?8所記載的熒光分子等的檢測方法中，不包括熒光強度的波動的統計性的運算處理，即使樣本溶液中的熒光分子等小于InM也能夠檢測熒光分子等，但無法定量地計算在溶液中隨機運動的熒光分子等的濃度或數密度。
[0018]因此，本申請的 申請人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中提出了基于新原理的光分析技術，能夠定量地觀測作為觀測對象的發光粒子的濃度或數密度低于利用FCS、FIDA等包含統計性處理的光分析技術進行處理的水平的樣本溶液中的發光粒子的狀態或特性。在所述新的光分析技術中，如果清楚地進行描述，則與FCS、FIDA等同樣地，在使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統等能夠檢測來自溶液中的微小區域的光的光學系統的情況下，一邊使作為光的檢測區域的微小區域(以下稱為“光檢測區域”。)的位置在樣本溶液內移動、即一邊通過光檢測區域對樣本溶液內進行掃描，一邊在光檢測區域包含在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子時檢測從該發光粒子發出的光，由此，能夠對樣本溶液中的發光粒子一個一個地逐個進行檢測來獲取與發光粒子的計數、樣本溶液中的發光粒子的濃度或數密度有關的信息。根據該新的光分析技術(以下稱為“掃描分子計數法”。)，與FCS、FIDA等光分析技術同樣地，進行測量所需要的樣本可以是微量的(例如幾十μ L左右)，另外，測量時間短，并且與FCS、FIDA等光分析技術的情況相比，能夠檢測更低的濃度或數密度的發光粒子的存在，并定量地檢測其濃度、數密度或其它特性。
[0019]在上述掃描分子計數法中，更具體地說，將與光檢測區域的位置在樣本溶液內移動的同時逐次測量出的光強度值(或者光子計數值)記錄為按時間序列的光強度數據，在該數據上檢測表示從發光粒子發出的光的光強度值的增大(表示發光粒子的光的信號)。關于該點，一般來說，在實施掃描分子計數法的光分析裝置中，從單個發光粒子釋放并到達光檢測器的光的強度根據光檢測區域中的發光粒子的位置而不同，典型地是，在發光粒子的位置位于光檢測區域的大致中心區域時光強度最大(以下將光檢測區域內的發光粒子的光強度最大的位置稱為“最大強度點”。)，發光粒子的位置越靠近光檢測區域的周緣，光強度越是逐漸降低。即，從光檢測區域內的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布(以下僅稱為“光檢測區域內的光強度分布”。)具有強度從最大強度點向周緣降低的大致吊鐘狀的輪廓。因而，如果發光粒子大致直線狀地通過光檢測區域內，則時序光強度數據上的表不從發光粒子發出的光的光強度值增大的輪廓為與光檢測區域內的光強度分布對應的大致吊鐘狀的輪廓，因此通過判斷某光強度值的增大的輪廓是否為針對發光粒子在光檢測區域內通過時設想的大致吊鐘狀的輪廓，能夠檢測表示從發光粒子發出的光的光強度值的增大、即發光粒子的信號。
[0020]另一方面，在時序光強度數據上出現的發光粒子的信號的輪廓也受時序光強度數據生成時的時間分辨率影響。典型地是，在實施掃描分子計數法的光分析裝置中，根據按每個規定的測量單位時間由光檢測器接收到的光量來檢測光強度。例如，在光的測量通過光子計數進行的情況下，光強度通常用在以亞微秒?毫秒的等級任意設定的每個測量單位時間(BIN TIME)內到達光檢測器并被檢測出的光子的個數表示。因而，根據每個所述測量單位時間的光量逐次測量光強度值，在生成時序光強度數據的情況下，測量單位時間越短，即，使時間分辨率越高，越能夠高精度地獲取大致吊鐘狀的光強度值的增大的輪廓，如果測量單位時間過長，即，使時間分辨率過低，則導致無法得到大致吊鐘狀的輪廓。也就是說，為了高精度地檢測發光粒子的信號，測量單位時間短是理想的，但是測量單位時間越短，時序光強度數據的數據量越大，成本越大。另外，在時序光強度數據上能夠得到的發光粒子的信號的輪廓還依賴于光檢測區域的移動速度。即，光檢測區域的移動速度越高，發光粒子被包含在光檢測區域內的時間越短，單個發光粒子的信號出現的時間越短。
[0021]這樣，本發明的主要課題在于提供如下一種方法:將掃描分子計數法中的光測量時的測量單位時間設定為合適的值以能夠可靠地檢測發光粒子的信號的大致吊鐘狀的輪廓且能夠避免時序光強度數據的數據量的過度增大。[0022]用于解決問題的方案
[0023]根據本發明的一個方式，通過光分析裝置達成上述課題，該光分析裝置使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析裝置的特征在于，包括:光檢測區域移動部，其使顯微鏡的光學系統的光檢測區域的位置在樣本溶液內移動；光檢測部，其按每個測量單位時間檢測從光檢測區域到來的光量；以及信號處理部，其生成一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動一邊由光檢測部按每個測量單位時間檢測出的來自光檢測區域的光的按時間序列的光強度數據，在按時間序列的光強度數據中逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號，其中，測量單位時間根據光檢測區域的大小和位置的移動速度來決定。
[0024]在所述結構中，“在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子”是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等發出光的粒子，如果是不固定在基板等上而在溶液中自由地進行布朗運動的粒子，則可以是任意的粒子。所述發光粒子典型地是熒光性粒子，但也可以是通過磷光、化學發光、生物發光、光散射等來發出光的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統的“光檢測區域”是指這些顯微鏡中檢測光的微小區域，在從物鏡提供照明光的情況下，相當于該照明光會聚到的區域(在共焦顯微鏡中，特別地由物鏡和針孔之間的位置關系來確定。在發光粒子沒有照明光而發光的情況下，例如是通過化學發光或生物發光來發光的粒子的情況下，在顯微鏡中不需要照明光。)。另外，典型地是，光檢測部通過按每個規定的測量單位時間(ΒΙΝ--ΜΕ)對到來的光子數進行計數的光子計數來檢測來自光檢測區域的光，在這種情況下，按時間序列的光強度數據為按時間序列的光子計數數據。此外，在本說明書中，在稱為“發光粒子的信號”的情況下，只要沒有特別限定，是指表示來自發光粒子的光的信號。
[0025]如從上述理解的那樣，在作為本發明的基本結構的掃描分子計數法中，首先，一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動、即一邊通過光檢測區域對樣本溶液內進行掃描，一邊逐次進行光的檢測。這樣，可以期待在樣本溶液內移動的光檢測區域包含了隨機運動的發光粒子時檢測到來自發光粒子的光，由此檢測一個發光粒子的存在。因而，在逐次檢測出的光中逐個檢測來自發光粒子的光的信號，由此一個一個地逐個且逐次檢測粒子的存在，能夠獲取與粒子在溶液內的狀態有關的各種信息。在所述結構中，如已經記述的那樣，在進行光的檢測時，光檢測部按每個測量單位時間檢測從光檢測區域到來的光量，將在每個測量單位時間檢測出的光量的大小或光強度變換為電信號并發送到信號處理部，構成時序光強度數據。在這種情況下，如果測量單位時間過長，則發光粒子的信號的特征性輪廓消失，如果測量單位時間過短，則數據量龐大。關于該點，發光粒子的信號的輪廓的特征是否在時序光強度數據上消失由出現在時序光強度數據上的發光粒子的信號的長度與測量單位時間的長度之間的關系決定，發光粒子的信號的長度依賴于光檢測區域的大小和位置的移動速度。因此，在本發明中，根據光檢測區域的大小和位置的移動速度設定測量單位時間的長度以能夠捕捉發光粒子的信號的特征性輪廓且抑制數據量。
[0026]關于上述的測量單位時間的設定，更詳細地說，為了捕捉發光粒子的信號的特征性輪廓，應該將測量單位時間的長度設定得相對于時序光強度數據上的發光粒子的信號的長度相對較短。光檢測區域的大小越大，發光粒子的信號的長度越長，移動速度越高，發光粒子的信號的長度越短，因此結果可以是，光檢測區域的大小越大，將測量單位時間設定得越長，移動速度越高，將測量單位時間設定得越短。另外，發光粒子的信號的長度相當于一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間，所述通過時間通過[光檢測區域的大小]/[光檢測區域的移動速度]給出(在此，[光檢測區域的大小]是指與光檢測區域的行進方向平行的方向的尺寸或直徑。)。因而，可以是發光粒子的通過時間越長，將測量單位時間設定得越長。
[0027]另外，關于測量單位時間的設定，更詳細地說，為了從時序光強度數據上的發光粒子的信號中捕捉該信號的輪廓的特征，在時間方向上需要至少兩個數據點(如果數據點是一個，則僅能夠辨別有無信號的存在，信號的輪廓的信息完全消失。)。因而，優選將測量單位時間設定為小于一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間的一半。關于該點，作為發光粒子的通過時間，可以使用理論上的估計值。如上述那樣，發光粒子的通過時間通過[光檢測區域的大小]/[光檢測區域的移動速度]給出。在此，光檢測區域的移動速度如后面詳細記述的那樣由光學系統內的反射鏡的朝向的變更或樣本容器的移動的速度決定，能夠比較高精度地估算其值。然而，關于光檢測區域的大小，作為光檢測區域中的激勵光的強度為其中心的強度的Ι/e2的球面體或橢圓球體的外徑，使用光的波長和物鏡的數值孔徑進行估計，但是難以準確地劃定激勵光的強度實質為O的面區域。因此，作為[光檢測區域的大小]的估計值，可以使用激勵光的強度為其中心的強度的Ι/e2的球面體或橢圓球體的、與光檢測區域的行進方向平行的方向的最大尺寸或最大直徑(光檢測區域的估計直徑)，作為發光粒子的通過時間，可以采用通過[光檢測區域的估計直徑]/[光檢測區域的移動速度]給出的值(估計通過時間)。
[0028]并且，根據后面所示的實施例的實驗結果，示出了當在一個發光粒子通過光檢測區域的期間包含至少三個數據點、更優選包含四個以上的數據點時，在時序光強度數據上能夠更高精度地檢測發光粒子的信號。在此，在一個測量單位時間內提供一個數據點。因而，在上述裝置中，優選的是，可以將測量單位時間設定成一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間與至少三個測量單位時間相重疊。此外，一個發光粒子通過時的通過時間可以是上述的估計通過時間，也可以是預先通過實驗得到的時間值。(估計通過時間通常比通過實驗得到的通過時間短。)。
[0029]在上述本發明的裝置的信號處理部的處理中，如已經記述的那樣，可以根據由光檢測部檢測出的按時間序列的表示光的信號的輪廓，來進行基于逐次的來自光檢測部的檢測值的信號判斷是否一個發光粒子進入了光檢測區域的判斷。關于該點，在實施方式中，典型地是，可以在檢測出具有大于規定閾值的強度的信號時，檢測為一個發光粒子進入了光檢測區域。更具體地說，如后述的實施方式一欄中說明的那樣，通常表示來自發光粒子的光的信號的輪廓在光檢測部的按時間序列的檢測值、即光強度數據上為具有某種程度以上的強度的吊鐘型的脈沖狀，噪聲的輪廓不是吊鐘型的脈沖狀、或者其強度小。因此，本發明的裝置的信號處理部可以構成為將在按時間序列的光強度數據上具有超過規定閾值的強度的脈沖狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號。“規定閾值”能夠通過實驗設定為合適的值。
[0030]并且，本發明的裝置的檢測對象是來自單個發光粒子的光，因此光強度非常微弱，在一個發光粒子是熒光單分子或多分子等的情況下，發光粒子所發出的光是概率性地釋放的，在微小的時間內可能產生信號值的缺失。而且，當產生這樣的缺失時，難以確定與一個發光粒子的存在對應的信號。因此，信號處理部可以構成為使按時間序列的光強度數據平滑化，在對數據進行加工以能夠忽略微小時間內的信號值的缺失之后，將平滑化后的按時間序列的光強度數據中具有超過規定閾值的強度的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號。
[0031]可以根據發光粒子的特性或者樣本溶液中的數密度或濃度適當變更上述本發明的裝置中的光檢測區域的位置在樣本溶液內的移動速度。從發光粒子檢測出的光的方式有可能根據發光粒子的特性或者樣本溶液中的數密度或濃度不同而發生變化。特別是當光檢測區域的移動速度變快時，從一個發光粒子獲得的光量減少，因此優選的是，能夠適當地變更光檢測區域的移動速度以能夠高精度地或高靈敏度地測量來自一個發光粒子的光。
[0032]另外，優選的是，將光檢測區域的位置在樣本溶液內的移動速度設定得比作為檢測對象的發光粒子的擴散移動速度(由布朗運動所造成的粒子的平均移動速度)高。如上述說明的那樣，本發明的裝置對光檢測區域通過發光粒子的存在位置時從該發光粒子發出的光進行檢測，來逐個檢測發光粒子。然而，發光粒子由于在溶液中進行布朗運動而隨機地移動，在多次出入光檢測區域的情況下，導致從一個發光粒子多次檢測到(表示發光粒子的存在的)信號，難以使檢測出的信號與一個發光粒子的存在對應起來。因此，如上述那樣，將光檢測區域的移動速度設定得比發光粒子的擴散移動速度高，由此能夠使一個發光粒子對應一個(表示發光粒子的存在的)信號。此外，擴散移動速度因發光粒子的不同而變化，因此，如上所述，優選的是本發明的裝置構成為能夠根據發光粒子的特性(特別是擴散常數)適當地變更光檢測區域的移動速度。
[0033]可以通過任意的方式進行樣本溶液內的光檢測區域的位置的移動。例如可以使用在激光掃描型光學顯微鏡中所采用的檢電鏡(Galvano-miiror)等變更顯微鏡的光學系統的光路來變更光檢測區域的位置，或者使樣本溶液的位置移動(例如移動顯微鏡的臺等)來移動光檢測區域在樣本溶液內的位置。可以任意地設定光檢測區域的位置的移動軌跡，例如能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。特別是在變更顯微鏡的光學系統的光路來變更光檢測區域的位置的情況下，光檢測區域的移動迅速，并且在樣本溶液中實質上不發生機械振動、流體力學作用，因此作為檢測對象的發光粒子不會受到力學作用的影響而能夠在穩定的狀態下進行光的測量，在這點上是有利的。
[0034]在上述的本發明的一個實施方式中，可以對信號的個數進行計數來對包含在光檢測區域中的發光粒子的個數進行計數(粒子的計數)。在這種情況下，通過將檢測出的發光粒子的個數和光檢測區域的位置的移動量組合，能夠獲得與樣本溶液中的被同定的發光粒子的數密度或濃度有關的信息。具體地說，例如可以計算多個樣本溶液的數密度或濃度之比，或者計算相對于作為濃度或數密度的基準的標準樣本溶液的相對的數密度或濃度之t匕，或者使用相對于作為濃度或數密度的基準的標準樣本溶液的相對的數密度或濃度之比來決定絕對的數密度值或濃度值。或者，如果通過任意的方法、例如以規定的速度移動光檢測區域的位置等而能夠確定出光檢測區域的位置的移動軌跡的總體積，則能夠具體估算發光粒子的數密度或濃度。
[0035]通過通用的計算機也能夠實現在上述本發明的裝置中一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動一邊進行光檢測來逐個檢測來自各個發光粒子的信號且考慮光檢測區域的大小和位置的移動速度來設定光檢測的測量單位時間的光分析技術的處理。因而，根據本發明的另一個方式，提供一種光分析用計算機程序，用于使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該計算機程序的特征在于，使計算機執行以下步驟:使顯微鏡的光學系統的光檢測區域的位置在樣本溶液內移動；在樣本溶液內的光檢測區域的位置的移動過程中按根據光檢測區域的大小和位置的移動速度決定的每個測量單位時間檢測從光檢測區域到來的光量，生成按時間序列的光強度數據；以及逐個檢測按時間序列的光強度數據中的各個表示來自各個發光粒子的光的信號。此外，典型地是，在檢測來自光檢測區域的光并生成按時間序列的光強度數據的步驟中，通過對在每個測量單位時間(BIN TIME)內到來的光子數進行計數的光子計數來檢測來自光檢測區域的光，在這種情況下，按時間序列的光強度數據是按時間序列的光子計數數據。
[0036]在所述結構中，更詳細地說，可以是，光檢測區域的大小越大，將測量單位時間設定得越長，移動速度越高，將測量單位時間設定得越短，或者發光粒子的通過時間越長，將測量單位時間設定得越長。另外，優選的是，測量單位時間小于一個發光粒子通過光檢測區域時的估計通過時間的一半，更為優選的是，可以將測量單位時間設定為一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間與至少三個測量單位時間相重疊。
[0037]另外，在上述的計算機程序中也同樣，可以根據按時間序列的信號的輪廓來進行表示來自各個發光粒子的光的信號的逐個檢測。在實施方式中，典型地是，可以在檢測出具有大于規定閾值的強度的信號時，檢測為一個發光粒子進入了光檢測區域。具體地說，可以將光強度數據上具有超過規定閾值的強度的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號，優選的是可以使按時間序列的光強度數據平滑化，將平滑化后的按時間序列的光強度數據上具有超過規定閾值的強度的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號。
[0038]并且，可以根據發光粒子的特性、樣本溶液中的數密度或濃度適當變更樣本溶液內的光檢測區域的位置的移動速度，優選的是，將樣本溶液內的光檢測區域的位置的移動速度設定得比作為檢測對象的發光粒子的擴散移動速度高。可以通過任意的方式進行樣本溶液內的光檢測區域的位置的移動，優選的是，可以變更顯微鏡的光學系統的光路或使樣本溶液的位置移動來變更光檢測區域的位置。可以任意地設定光檢測區域的位置的移動軌跡，例如能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。
[0039]并且，在上述的計算機程序中也同樣，可以包括以下步驟:對逐個檢測出的來自發光粒子的信號的個數進行計數來對在光檢測區域的位置的移動過程中檢測出的發光粒子的個數進行計數；和/或根據檢測出的發光粒子的個數來確定樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
[0040]根據上述本發明的裝置或計算機程序，實現一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動一邊進行各個發光粒子的光的檢測且考慮光檢測區域的大小和位置的移動速度來設定光檢測的測量單位時間的新的光分析方法。這樣，根據本發明，還提供一種光分析方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析方法的特征在于，包括以下過程:使顯微鏡的光學系統的光檢測區域的位置在樣本溶液內移動；一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動一邊按每個測量單位時間檢測從光檢測區域到來的光量，生成按時間序列的光強度數據；以及逐個檢測按時間序列的光強度數據中的各個表來自各個發光粒子的光的信號，其中，根據光檢測區域的大小和位置的移動速度來決定測量單位時間。
[0041]在所述方法中也同樣，典型地是，在檢測來自光檢測區域的光并生成按時間序列的光強度數據的過程中，通過對在每個測量單位時間(BIN TIME)內到來的光子數進行計數的光子計數來檢測來自光檢測區域的光，在這種情況下，按時間序列的光強度數據是按時間序列的光子計數數據。而且，更詳細地說，可以是，光檢測區域的大小越大，將測量單位時間設定得越長，移動速度越高，將測量單位時間設定得越短，或者發光粒子的通過時間越長，將測量單位時間設定得越長。另外，優選的是，測量單位時間小于一個發光粒子通過光檢測區域時的估計通過時間的一半，更為優選的是，可以將測量單位時間設定為一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間與至少三個測量單位時間相重疊。
[0042]并且，在上述方法中也同樣，可以根據按時間序列的信號的輪廓來進行表示來自各個發光粒子的光的信號的逐個檢測。在實施方式中，典型地是，可以在檢測出具有大于規定閾值的強度的信號時，檢測為一個發光粒子進入了光檢測區域。具體地說，可以將光強度數據上具有超過規定閾值的強度的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號，優選的是可以使按時間序列的光強度數據平滑化，將平滑化后的按時間序列的光強度數據中具有超過規定閾值的強度的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號。
[0043]另外，可以根據發光粒子的特性、樣本溶液中的數密度或濃度適當變更樣本溶液內的光檢測區域的位置的移動速度，優選的是，將樣本溶液內的光檢測區域的位置的移動速度設定得比作為檢測對象的發光粒子的擴散移動速度高。可以通過任意的方式進行樣本溶液內的光檢測區域的位置的移動，優選的是，可以變更顯微鏡的光學系統的光路或使樣本溶液的位置移動來變更光檢測區域的位置。可以任意地設定光檢測區域的位置的移動軌跡，例如能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。
[0044]并且，在上述的方法中也同樣，可以包括以下過程:對逐個檢測出的來自發光粒子的信號的個數進行計數來對在光檢測區域的位置的移動過程中檢測出的發光粒子的個數進行計數；和/或根據檢測出的發光粒子的個數來確定樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
[0045]上述本發明的光分析技術典型地用于分析或解析蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞等粒子狀的生物學對象物在溶液中的狀態的用途，但是也可以用于分析或解析非生物學粒子(例如原子、分子、膠束(micelles)、金屬膠體等)在溶液中的狀態，應該理解為這種情況也屬于本發明的范圍。
[0046]發明的效果
[0047]這樣，根據本發明，根據光檢測區域的大小和位置的移動速度來設定光檢測時的測量單位時間以能夠捕捉光強度數據上的發光粒子的信號的特征性輪廓且能夠抑制數據量。根據所述結構，在檢測發光粒子的信號的基礎上，能夠避免無用地提高數據的時間分辨率而致使數據量增加，從而節約成本。另外，在嘗試節省數據量時，也能夠掌握更可靠地捕捉發光粒子的信號的輪廓特征的界限而設定測量單位時間，能夠維持發光粒子的信號與噪聲的分離精度。并且，能夠在維持發光粒子的信號與噪聲的分離精度的同時節省數據量，因此能夠降低發光粒子的信號的檢測處理中的信號處理的負荷。[0048]通過本發明的以下優選實施方式的說明可清楚本發明的其它目的和優點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1的(A)是執行本發明的掃描分子計數法的光分析裝置的內部結構的示意圖。圖1的(B)是共焦區組織(共焦顯微鏡的觀察區域)的示意圖。圖1的(C)是變更反射鏡7的朝向使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動的機構的示意圖。圖1的(D)是移動微板的水平方向位置來使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動的機構的示意圖。
[0050]圖2的(A)、(B)分別是說明應用本發明的掃描分子計數法中的光檢測原理的示意圖以及所測量的光強度的時間變化的示意圖。圖2的(C)是說明來自發光粒子的光的強度變化與測量單位時間的關系的圖。圖2的(D)是光檢測區域的示意圖，示意性地示出了發光粒子的通過時間根據通過位置的不同而不同。
[0051]圖3是以流程圖的形式表示依照本發明執行的掃描分子計數法的處理步驟的圖。
[0052]圖4的(A)、(B)分別是表示在發光粒子一邊進行布朗運動一邊橫穿光檢測區域時以及在通過以比發光粒子的擴散移動速度快的速度使樣本溶液內的光檢測區域的位置移動而發光粒子橫穿光檢測區域時的粒子的運動方式的模型圖。圖4的(C)是說明用于依照掃描分子計數法根據所測量的時序光強度數據(光子計數的時間變化)檢測發光粒子的存在的處理步驟中的檢測信號的信號處理過程的例子的圖。
[0053]圖5示出了所測量的光子計數數據的實測例子(直方圖表)、對數據進行平滑處理而得到的曲線(虛線)以及在脈沖存在區域擬合的高斯函數(實線)。在圖中，附加為“噪聲”的信號作為由噪聲或異物造成的信號而被忽略。
[0054]圖6示出了被檢測為發光粒子信號的脈沖信號所包含的數據點的個數的分布。
(A)是將BINTIME設定為20 μ s的情況，⑶是將BIN TIME設定為30 μ s的情況。
[0055]圖7是在以往的計算熒光強度的波動的光分析技術中得到的光子計數(光強度)的時間變化的例子，(A)是樣本內的粒子的濃度為能夠提供足夠的測量精度的程度的情況，
(B)是樣本內的粒子的濃度相比于(A)的情況大幅降低的情況。
[0056]附圖標記說明
[0057]1:光分析裝置(共焦顯微鏡)；2:光源；3:單模光纖(single-mode opticalfiber) ；4:準直透鏡；5:分色鏡；6、7、11:反射鏡；8:物鏡；9:微板；10:皿(樣本溶液容器)；12:聚光鏡(condenser lens) ；13:針孔；14:屏蔽濾波器；14a:分色鏡或偏振分束器；15:多模光纖(mult1-mode optical fiber) ；16:光檢測器；17:反射鏡偏轉器；17a:臺位置變更裝置；18:計算機。
【具體實施方式】
[0058]下面，詳細說明本發明的優選實施方式。
[0059]光分析裝置的結構
[0060]實現本發明的光分析技術的光分析裝置可以是如下的裝置:在基本結構中，如圖1的(A)示意性地例示那樣，組合能夠執行FCS、FIDA等的共焦顯微鏡的光學系統和光檢測器而成。參照該圖，光分析裝置I由光學系統2?17以及用于控制光學系統的各部分的動作并且獲取并解析數據的計算機18構成。光分析裝置I的光學系統可以與普通的共焦顯微鏡的光學系統相同，在此，使從光源2發射并在單模光纖3內傳播的激光(Ex)在光纖的出射端成為以由固有的NA決定的角度發散的光而被發射，通過準直器4成為平行光，被分色鏡5、反射鏡6、7反射，入射到物鏡8。典型地是在物鏡8的上方配置有微板9，該微板9排列有注入了 I μ L?幾十μ L的樣本溶液的樣本容器或皿10，從物鏡8射出的激光在樣本容器或皿10內的樣本溶液中聚焦，形成光強度強的區域(激勵區域)。在樣本溶液中分散或溶解有作為觀測對象物的發光粒子、典型地是熒光性粒子或附加有熒光色素等發光標識的粒子，當所述發光粒子進入到激勵區域時，在其間發光粒子被激勵而釋放出光。所釋放的光(Em)通過物鏡8、分色鏡5，被反射鏡11反射而在聚光鏡12聚光，通過針孔13，透過屏蔽濾波器14 (在此，只選擇特定波長頻帶的光成分。)，被導入到多模光纖15，到達光檢測器16，在被變換為按時間序列的電信號之后輸入到計算機18，以后面說明的方式進行用于光分析的處理。此外，如本領域技術人員所了解的那樣，針孔13配置在與物鏡8的焦點位置共軛的位置，由此僅從如圖1的(B)示意性地表示的激光的焦點區域、即激勵區域內發出的光通過針孔13，來自激勵區域以外的光被遮斷。圖1的(B)所例示的激光的焦點區域通常是具有IfL?IOfL左右的有效體積的本光分析裝置中的光檢測區域(典型地是光強度以區域中心為頂點的高斯型分布。有效體積是以光強度為中心光強度的Ι/e2的面為邊界的大致橢圓球體的體積。)，被稱為共焦區組織。另外，在本發明中，檢測來自一個發光粒子的光、例如來自一個熒光色素分子的微弱光，因此作為光檢測器16，優選的是使用能夠在光子計數中使用的超高靈敏度的光檢測器。在光的檢測是通過光子計數進行的情況下，以在規定時間內按每個測量單位時間(BIN TIME)逐次測量來到光檢測器的光子的個數的方式執行光強度的測量。因而，在這種情況下，按時間序列的光強度的數據是按時間序列的光子計數數據。另外，可以在顯微鏡的臺(未圖示)設置用于移動微板9的水平方向位置以變更要觀察的皿10的臺位置變更裝置17a。可以由計算機18控制臺位置變更裝置17a的動作。根據所述結構，在存在多個檢體的情況下也能夠達成迅速的測量。
[0061]并且，在上述的光分析裝置的光學系統中，設置有用于通過光檢測區域掃描樣本溶液內的、即用于使焦點區域即光檢測區域的位置在樣本溶液內移動的機構。作為所述的用于使光檢測區域的位置移動的機構，例如圖1的(C)示意性地例示的那樣，可以采用變更反射鏡7的朝向的反射鏡偏轉器17 (移動光檢測區域的絕對位置的方式)。所述反射鏡偏轉器17可以與在通常的激光掃描型顯微鏡中裝備的檢電鏡裝置相同。或者，作為其它的方式，如圖1的(D)所例示的那樣，也可以使臺位置變更裝置17a進行動作以移動注入了樣本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置來使樣本溶液內的光檢測區域的相對位置移動(使樣本溶液的絕對位置移動的方式)。無論在哪種方式的情況下，都在計算機18的控制下，與光檢測器16的光檢測協調地驅動反射鏡偏轉器17或臺位置變更裝置17a以達成所期望的光檢測區域的位置的移動圖案。可以從圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合中任意地選擇光檢測區域的位置的移動軌跡(可以設為在計算機18中的程序中能夠選擇各種移動圖案。)。此外，雖然沒有圖示，但也可以通過使物鏡8或臺上下移動來使光檢測區域的位置在上下方向上移動。
[0062]在作為觀測對象物的發光粒子通過多光子吸收而發光的情況下，上述光學系統被用作多光子顯微鏡。在這種情況下，只在激勵光的焦點區域(光檢測區域)釋放光，因此可以去除針孔13。另外，在作為觀測對象物的發光粒子不通過激勵光而通過化學發光、生物發光現象發光的情況下，可以省略用于生成激勵光的光學系統2?5。在發光粒子通過磷光或散射而發光的情況下，能夠直接使用上述的共焦顯微鏡的光學系統。并且，在光分析裝置I中，可以如圖示那樣設置多個激勵光源2，可以設為能夠根據發光粒子的激勵波長而適當地選擇激勵光的波長。同樣地，也可以具備多個光檢測器16,在樣本中包含有波長不同的多種發光粒子的情況下，可以設為能夠根據其波長分別檢測來自它們的光。并且，關于光的檢測，可以使用向規定的方向偏振的光作為激勵光，選擇與激勵光的偏振方向垂直的方向的成分作為檢測光。在這種情況下，在激勵光光路中插入偏振片(未圖示)，在檢測光光路中插入偏振分束器14a。根據所述結構，能夠大幅地降低檢測光中的背景光。
[0063]本發明的光分析技術的原理
[0064]如“
【發明內容】
” 一欄所記載的那樣，如果清楚地進行描述，則在本發明的光分析技術中，在掃描分子計數法中，設定光檢測處理的測量單位時間(光子計數的BIN TIME)使得在時序光強度數據上發光粒子的信號的大致吊鐘狀的輪廓的特征不會消失而能夠高精度地檢測發光粒子的信號，并且不會使數據量過大。下面，說明本發明的掃描分子計數法和測量單位時間的設定的原理。
[0065]1.掃描分子計數法的原理
[0066]FCS、FIDA等光譜分析技術與現有的生物化學的分析技術相比，其優點在于所需要的樣本量極少且能夠迅速地執行檢查。然而，在FCS、FIDA等光譜分析技術中，在原理上，根據熒光強度的波動來估算發光粒子的濃度、特性，因此為了得到高精度的測量結果，要求如圖11的(A)示意性地描繪的那樣樣本溶液中的發光粒子的濃度或數密度為在熒光強度的測量過程中在光檢測區域CV內始終存在一個左右的發光粒子的水平，如該圖的右側所示那樣在測量時間中始終檢測到有意義的光強度(光子計數)。如果發光粒子的濃度或數密度低于此水平，則例如圖11的(B)所描繪的那樣，在發光粒子為只是偶爾進入到光檢測區域CV內的水平的情況下，如該圖的右側所例示的那樣，只在測量時間的一部分出現有意義的光強度的信號(光子計數)，難以估算高精度的光強度的波動。另外，與在測量中在光檢測區域內始終存在一個左右的發光粒子的水平相比發光粒子的濃度大幅降低的情況下，在光強度的波動的運算中容易受到背景的影響，為了得到足夠進行運算的量的有意義的光強度數據而測量時間變長。
[0067]因此，本申請的 申請人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的“掃描分子計數法”，即使發光粒子的濃度低于如上所述的在FCS、FIDA等光譜分析技術中要求的水平的情況下，也能夠檢測發光粒子的數密度或濃度等特性。
[0068]作為在掃描分子計數法中執行的處理，如果清楚地描述，則驅動用于使光檢測區域的位置移動的機構(反射鏡偏轉器17)來變更光路，或者移動注入了樣本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，來如圖2的(A)示意性地描述的那樣，一邊使光檢測區域CV的位置在樣本溶液內移動、即一邊通過光檢測區域CV掃描樣本溶液內，一邊執行光檢測。這樣，例如在光檢測區域CV移動的期間(圖中為時間t0?t2)，在通過存在一個發光粒子的區域時(tl)，從發光粒子釋放出光，如在圖2的(B)中所描繪的那樣，在按時間序列的光強度數據上出現有意義的光強度(Em)的脈沖狀的信號。這樣，執行上述的光檢測區域CV的位置的移動和光檢測，一個一個地檢測其間出現的如圖2的(B)所例示的脈沖狀的信號(有意義的光強度)，由此逐個檢測發光粒子并對其個數進行計數，從而能夠獲取在所測量的區域內存在的發光粒子的個數、或者與濃度或數密度有關的信息。在所述的掃描分子計數法的原理中，不進行如熒光強度的波動的計算那樣的統計性的運算處理，而是一個一個地檢測發光粒子，因此即使在要觀測的粒子的濃度低至通過FCS、FIDA等無法以足夠的精度進行分析的程度的樣本溶液中，也能夠獲取與粒子的濃度或數密度有關的信息。
[0069]2.測量單位時間設定的原理
[0070]在通過上述的掃描分子計數法由光檢測器16經時獲取到的光強度的數據(時序光強度數據)中，除了來自發光粒子的光的脈沖狀的信號以外，還混入了由光檢測器的熱噪聲、背景光等引起的噪聲。因此，在基于時序光強度數據檢測發光粒子的信號時，典型地是，參照在時序光強度數據中發現的脈沖狀的信號的形狀特征、例如峰值強度、寬度相對于高斯函數等吊鐘型函數的形狀的近似程度(擬合高斯函數時的相關系數)。而且，將具有針對發光粒子的脈沖信號設想的范圍的形狀特征的脈沖信號辨別為發光粒子的信號，將除此以外的脈沖信號辨別為噪聲信號。
[0071]另外，在如上述那樣的掃描分子計數法中的逐次執行的光測量中，光強度值是按每個規定的測量單位時間由光檢測器接收到的光量。在光的測量通過光子計數進行的情況下，光強度用在以亞微秒~毫秒的等級任意設定的每個測量單位時間(BIN TIME)內到達光檢測器并被檢測出的光子的個數表示。因而，時序光強度數據實際上是將表示每個測量單位時間的光量或光子數的數據點按時間序列排列而得到的，因此在此處出現的發光粒子的信號的輪廓根據測量單位時間或BIN TIME的長度而變化。即，測量單位時間或BIN TIME的長度越長，發光粒子的脈 沖信號的形狀特征越消失而難以高精度地執行發光粒子的信號與噪聲信號之間的辨別。這樣，為了進行高精度的發光粒子的信號與噪聲信號之間的辨別，只要使測量單位時間或BIN TIME的長度與發光粒子的信號的長度相比足夠短以能夠捕捉發光粒子的信號的形狀特征即可。然而，測量單位時間或BIN TIME的長度越短，數據點數越多，數據量越龐大，會導致數據處理負荷、成本的增大。
[0072]因此，在本發明中，將光測量時的測量單位時間或BIN --ΜΕ的長度設定成能夠根據發光粒子的信號的形狀特征執行發光粒子的信號與噪聲信號之間的辨別且不會使數據點數無用地增大。圖2的(C)示出了發光粒子的脈沖信號的輪廓Ik和長度Tp與測量單位時間△ τ的關系。參照該圖，首先，在測量單位時間比發光粒子的脈沖信號的長度Tp長的情況下，即
[0073][i]Tp < Δ τ I
[0074]的情況下，針對發光粒子的脈沖信號的輪廓Ik，數據點Dp僅為一點。在這種情況下，發光粒子的脈沖信號的輪廓的大致吊鐘狀的特征消失，信息僅為強度值的大小，因此根據發光粒子的脈沖信號的形狀特征檢測發光粒子的脈沖信號是非常難的。另外，在測量單位時間為
[0075][ii]Tp > Δ τ 2 ^ 1/2Τρ
[0076]時，針對發光粒子的脈沖信號的輪廓Ik，數據點Dp為兩點，但是在這種情況下，在數據點Dp的值中大致吊鐘狀的特征、即值沿著時間方向按照小、大、小的順序變化的特征消失，因此也難以根據發光粒子的脈沖信號的形狀特征來檢測發光粒子的脈沖信號。另一方面，在測量單位時間比發光粒子的脈沖信號的長度Tp的1/2還短的情況下，即在測量單位時間為[0077][iii] l/2Tp > Δ τ 3 ≥1/3Τρ、
[0078][?ν] 1/3Τρ > Δ τ 4 ≥ 1/4Τρ、
[0079][V] 1/4Τρ > Δ τ 5 ≥ 1/5Τρ、
[0080]…以下相同。
[0081]時，數據點Dp至少為三點，保存值沿著時間方向按照小、大、小的順序變化的大致吊鐘狀的特征，能夠根據發光粒子的脈沖信號的形狀特征檢測發光粒子的脈沖信號。
[0082]實際上，根據后面說明的實施例1中的實驗結果，在被檢測為發光粒子的信號的脈沖信號中，在各信號的產生期間內包含至少三點以上的數據點Dp。這樣，基于上述的考察和實施例1的實驗結果，只要將測量單位時間的長度設定為在發光粒子的脈沖信號的產生時間內包含三點以上的數據點Dp即可。在此，發光粒子的脈沖信號的產生時間相當于發光粒子通過光檢測區域內的時間。另外，一個數據點對應一個測量單位時間。因而，結果是只要將測量單位時間的長度設定為一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間與至少三個測量單位時間相重疊即可。此外，對于所述條件，應該理解發光粒子的通過時間也可以不是三個測量單位時間的和以上。在上述條件中，重要的是在發光粒子的通過時間內存在三個以上的數據點，因此只要滿足該條件，三個測量單位時間之和也可以超過發光粒子的通過時間，這種情況也屬于本發明的范圍。并且，根據后面說明的實施例1中的實驗結果，在發光粒子的脈沖信號的產生時間內包含四點以上的數據點Dp的情況下能夠更高精度地進行檢測。因而，可以將測量單位時間的長度設定為在一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間內包含四點以上的數據點Dp。(即，可以將測量單位時間的長度設定為一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間與至少四個測量單位時間相重疊。)。
[0083]可以根據光檢測區域的大小和光檢測區域的移動速度來進行測量單位時間或BINTIME的具體設定。如“
【發明內容】
”一欄所記載的那樣，在理論上，作為適當的測量單位時間或BIN --ΜΕ的基準的發光粒子的信號的長度、即一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間通過下式給出，
[0084][光檢測區域的大小]/[光檢測區域的移動速度]…(I)
[0085]因此可以參照所述理論值適當地決定測量單位時間或BIN --ΜΕ。如從上述的式(I)理解的那樣，光檢測區域的大小越大，發光粒子的通過時間越長，光檢測區域的移動速度越高，發光粒子的通過時間越短，因此可以與其相應地增加和減少測量單位時間或BINTIME0
[0086]此外，關于上述的式(I)，能夠根據光檢測區域的軌跡和周期高精度且唯一地估算光檢測區域的移動速度，但是光檢測區域的大小需要是發光粒子在光檢測區域內的軌跡的距離，即是與光檢測區域的移動方向(掃描方向)平行的方向上的長度，根據光檢測區域內的發光粒子的通過位置而不同。如圖2的(D)所示那樣，光檢測區域是球體或橢圓體，因此與橫穿球體或橢圓體的距離相當的式(I)中的[光檢測區域的大小]根據光檢測區域的與掃描方向垂直的方向上的位置而不同。例如，在圖2的(D)中，發光粒子α、β、Y的通過距離依次變短。另外，還難以嚴格地定義光檢測區域的邊界。即，在以激勵光的聚光狀態(以及針孔的直徑)劃定光檢測區域時，在理論上不容易高精度地確定激勵光強度(或檢測光強度)實質為O的邊界。因此，作為光檢測區域的邊界，可以采用光檢測區域內的光強度為中心強度的Ι/e2的球面或橢圓面CVn。而且，光檢測區域的光強度為中心強度的Ι/e2的球面或橢圓面的直徑2Wo大致通過下式給出，
[0087]2ffo = 1.22.λ /(D/2f)…(2)
[0088](在此，λ是激勵波長，D是入射光束直徑，f是物鏡的焦距。)。因而，可以將使用通過式(2)計算出的值作為光檢測區域的大小的估計值而根據式(I)計算出的值作為一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間(即，發光粒子的脈沖信號的長度Tp)的估計值(估計通過時間)進行參照，來決定測量單位時間或BIN --ΜΕ。在根據估計通過時間決定測量單位時間或BIN TIME時，如已經記述的那樣，一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間應該包含至少三個數據點，因此可以將測量單位時間或BIN --ΜΕ設定為例如小于估計通過時間的一半，優選的是1/3左右。或者，也可以將測量單位時間或BIN --ΜΕ決定成在估計通過時間內包含至少三個數據點。另外，考慮到發光粒子的通過位置越靠近光檢測區域的周緣則通過時間越短，從而為了更可靠地檢測通過光檢測區域的周緣的發光粒子的信號，可以參考估計通過時間，將測量單位時間或BIN --ΜΕ設定為與估計通過時間的1/3相比充分短的時間、例如其1/6左右的時間等使得在通過光檢測區域的周緣的發光粒子的通過時間內包含至少三個數據點。當然，一個發光粒子通過光檢測區域時的通過時間也能夠預先通過實驗來決定，因此也可以決定測量單位時間或BIN --ΜΕ使得在通過實驗獲得的發光粒子的通過時間內包含至少三個數據點。
[0089]掃描分子計數法的處理操作過程
[0090]在依照使用了圖1的(A)所例示的光分析裝置I的本發明的掃描分子計數法的實施方式中，具體地說 ，執行以下的處理，(1)包含發光粒子的樣本溶液的調制，(2)樣本溶液的光強度的測量處理以及(3)測量出的光強度的分析處理。圖3示出了以流程圖的形式表示的本實施方式中的處理。
[0091](1)樣本溶液的調制
[0092]作為本發明的光分析技術的觀測對象物的粒子，如果是溶解的分子等在樣本溶液中分散并在溶液中隨機運動的粒子，則可以是任意的，例如可以是蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞、或金屬膠體、其它非生物學分子等。在作為觀測對象物的粒子不是發光的粒子的情況下，使用以任意的方式對作為觀測對象物的粒子附加了發光標識(熒光分子、磷光分子、化學、生物發光分子)的粒子。樣本溶液典型地是水溶液，但是不限定于此，可以是有機溶劑及其它任意的液體。
[0093](2)樣本溶液的光強度的測量(圖3-步驟100)
[0094]本實施方式的利用掃描分子計數法的光分析中的光強度的測量除了在測量過程中驅動反射鏡偏轉器17或臺位置變更裝置17a來進行光檢測區域的位置在樣本溶液內的移動(樣本溶液內的掃描)以外，可以通過與FCS或FIDA中的光強度的測量過程相同的方式執行。在操作處理中，典型地是，在向微板9的皿10注入樣本溶液并載置在顯微鏡的臺上后，在使用者向計算機18輸入開始測量的指示時，計算機18依照存儲在存儲裝置(未圖示)中的程序(使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動的過程和在光檢測區域的位置的移動過程中檢測來自光檢測區域的光并生成按時間序列的光強度數據的過程)，開始樣本溶液內的光檢測區域中的激勵光的照射以及光強度的測量。在所述測量中，在依照計算機18的程序的處理動作的控制下，反射鏡偏轉器17或臺位置變更裝置17a驅動反射鏡7 (檢電鏡)或顯微鏡的臺上的微板9，來執行皿10內光檢測區域的位置的移動，與此同時地，光檢測器16將逐次檢測出的光變換為電信號并發送到計算機18，在計算機18中，通過任意的方式，根據所發送的信號生成按時間序列的光強度數據并保存。此外，典型地是，光檢測器16是能夠檢測單光子的到來的超高靈敏度光檢測器，因此在通過光子計數進行光的檢測的情況下，時序光強度數據可以是按時間序列的光子計數數據。如上述那樣適當地設定光子計數中的BIN TIME使得在估計通過時間或通過實驗得到的粒子的通過時間內包含至少三個數據點。
[0095]光強度的測量中的光檢測區域的位置的移動速度可以是任意地、例如通過實驗或為了符合分析的目的而設定的規定的速度。在根據檢測出的發光粒子的個數獲取與其數密度或濃度有關的信息的情況下，需要光檢測區域通過的區域的大小或體積，因此以掌握移動距離的方式執行光檢測區域的位置的移動。此外，由于測量中的經過時間與光檢測區域的位置的移動距離具有比例關系更容易解釋測量結果，因此優選的是移動速度基本上是固定速度，但是不限定于此。
[0096]另外，關于光檢測區域的位置的移動速度，為了定量地高精度地執行基于測量出的按時間序列的光強度數據的發光粒子的逐個檢測、或者發光粒子的個數的計數，而優選將所述移動速度設定為比發光粒子的隨機運動、即布朗運動所引起的移動速度快的值。發明的光分析技術的觀測對象粒子是在溶液中分散或溶解并自由且隨機運動的粒子，因此由于布朗運動，位置隨著時間而移動。因而，在光檢測區域的位置的移動速度比粒子的布朗運動所引起的移動慢的情況下，如圖4的(A)示意性地描繪的那樣，粒子在區域內隨機地移動，由此光強度隨機地變化(如已經提及的那樣，光檢測區域的激勵光強度以區域的中心為頂點向外方降低。)，難以確定與各個發光粒子對應的有意義的光強度的變化。因此，優選的是將光檢測區域的位置的移動速度設定得比粒子的因布朗運動引起的平均移動速度(擴散移動速度)快，使得如圖4的(B)所描繪的那樣粒子大致直線地橫穿光檢測區域，由此在按時間序列的光強度數據中，如圖4的(C)最上部所例示的那樣與各個發光粒子對應的光強度的變化的輪廓大致一致(在發光粒子大致直線地通過光檢測區域的情況下，光強度的變化的輪廓與激勵光強度分布大致相同。)，而能夠容易地確定各個發光粒子與光強度之間的對應。
[0097]具體地說，具有擴散系數D的發光粒子由于布朗運動而通過半徑Wo的光檢測區域(共焦區組織)時所需要的時間根據以下的平均平方位移的關系式，
[0098](2Wo)2 = 6D.At...(3)
[0099]成為
[0100]At = (2Wo)2/6D…⑷，
[0101]因此，發光粒子因布朗運動而移動的速度(擴散移動速度)Vdif大致為
[0102]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo…(5)。
[0103]因此，光檢測區域的位置的移動速度可以參照所述Vdif設定為與其相比充分快的值。例如在預想觀測對象粒子的擴散系數是D=2.0X IO^1V/s左右的情況下，在設Wo為
0.62μπι左右時，Vdif為1.0X 10_3m/s，因此，可以將光檢測區域的位置的移動速度設定為其10倍以上的15mm/s等。此外，在觀測對象粒子的擴散系數未知的情況下，可以設定各種光檢測區域的位置的移動速度，反復執行用于找到使光強度的變化的輪廓為預想的輪廓(典型地是與激勵光強度分布大致相同)的條件的預備實驗，來決定適合的光檢測區域的位置的移動速度。
[0104](3)光強度的分析
[0105]當通過上述處理得到時序光強度數據時，在計算機18中，通過依照存儲在存儲裝置中的程序的處理，執行發光粒子的信號的檢測、發光粒子的計數、濃度計算等各種分析。
[0106](i)發光粒子的信號的逐個檢測(步驟110~160)
[0107]當生成時序光強度數據時，執行在所述光強度數據上逐個檢測發光粒子的信號的處理。如已經提及的那樣，在一個發光粒子通過光檢測區域時的軌跡如圖4的(B)所示那樣是大致直線狀的情況下，與該粒子對應的信號中的、在光強度數據上的光強度的變化具有反映由光學系統決定的光檢測區域內的光強度分布的大致吊鐘狀的輪廓。因而，在掃描分子計數法中，基本上可以在光強度數據上超過適當設定的閾值Ith的光強度值所持續的時間寬度△ τ處于規定的范圍時，判斷為具有該光強度的輪廓的信號與一個粒子通過光檢測區域的情況對應，進行一個發光粒子的檢測。而且，光強度不超過閾值Ith、或者時間寬度Λ τ不在規定的范圍內的信號被判斷為噪聲或異物的信號。另外，在能夠將光檢測區域的光強度分布假定為高斯分布，即
[0108]I = A.eXp (_2t2/a2)...(6)時，
[0109]在使式(6)擬合有意義的光強度的輪廓(能夠明確地判斷為不是背景的輪廓)而計算出的強度A和寬度a處于規定的范圍內時，可以將該光強度的輪廓判斷為與一個粒子通過光檢測區域的情況對應，進行一個發光粒子的檢測。(強度A和寬度a處于規定的范圍外的信號被判斷為噪聲或異物的信號，在其后的分析等中可以忽略。)
[0110]在光強度數據上的信號的檢測處理的一個例子中，首先，對光強度數據(圖4的
(C)、最上部“檢測結果(未處理)”)`進行平滑(平滑化)處理(圖3-步驟110、圖4的(C)的中上部“平滑”)。發光粒子所發出的光是概率性地釋放的，在微小的時間內可能產生數據值的缺失，因此通過所述平滑處理，能夠忽略如上所述的數據值的缺失。例如可以通過移動平均法進行平滑處理。此外，可以根據獲取光強度數據時的光檢測區域的位置的移動速度(掃描速度)、ΒΙΝ--ΜΕ，適當地設定執行平滑處理時的參數、例如在移動平均法中進行一次平均的數據個數、移動平均的次數等。
[0111]接著，在平滑處理后的時序光強度數據中，為了檢測有意義的脈沖狀的信號(以下稱為“脈沖信號”)所存在的時間區域(脈沖存在區域)，對平滑處理后的光強度數據的時間計算一次微分值(步驟120)。光強度數據的時間微分值如圖4的(C)的中下部“時間微分”所例示的那樣，在信號值變化的時刻值的變化大，因此通過參照所述時間微分值，能夠有利地決定有意義的信號的起點和終點。
[0112]然后，在光強度數據上逐次檢測有意義的脈沖信號(步驟130~160)。具體地說，首先在光強度數據的時間微分值數據上，參照時間微分值逐次搜索并決定一個脈沖信號的起點和終點，確定脈沖存在區域(步驟130)。當確定了一個脈沖存在區域時，針對該脈沖存在區域中的平滑后的光強度數據進行吊鐘型函數的擬合(圖4的(C)的下部“吊鐘型函數擬合”)，計算吊鐘型函數的脈沖的峰值(最大值)的強度Ipeak、脈沖寬度(半峰全寬)Wpeak、擬合時的(最小二乘法的)相關系數等參數(步驟140)。此外，擬合的吊鐘型函數典型地是高斯函數，但也可以是洛侖茲型函數。而且，判斷計算出的吊鐘型函數的參數是否處于對針對一個發光粒子通過光檢測區域時檢測出的脈沖信號所描繪的吊鐘型輪廓的參數所設想的范圍內，即脈沖的峰值強度、脈沖寬度、相關系數是否分別處于規定范圍內等(步驟150)。這樣，如圖5的左邊所示那樣，將被判斷為計算出的吊鐘型函數的參數處于針對與一個發光粒子對應的信號設想的范圍內的信號判斷為是與一個發光粒子對應的信號，由此，檢測出一個發光粒子。另一方面，如圖5的右邊所示那樣，計算出的吊鐘型函數的參數不在設想的范圍內的脈沖信號作為噪聲而被忽略。此外，可以在檢測發光粒子的信號的同時執行信號數的計數、即發光粒子的計數。
[0113]可以在光強度數據的整個區域中反復執行上述步驟130~150的處理中的脈沖信號的搜索和判斷(步驟160)。此外，根據光強度數據逐個檢測發光粒子的信號的處理不限于上述的過程，可以通過任意的方法執行。
[0114](iii)發光粒子濃度的確定
[0115]在對檢測出的發光粒子的信號的個數進行計數來確定了發光粒子的個數的情況下，如果通過任意的方法能夠估算光檢測區域所通過的區域的總體積，則根據其體積值和發光粒子的個數能夠決定樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度(步驟170)。
[0116]光檢測區域所通過的區域的總體積可以根據激勵光或檢測光的波長、透鏡的數值孔徑、光學系統的調整狀態在理論上進行估算，但是也可以根據通過實驗、例如針對發光粒子的濃度已知的溶液(對照溶液)以與要檢查的樣本溶液的測量相同的條件進行上述所說明的光強度的測量、發光粒子的檢測以及計數而檢測出的發光粒子的個數和對照溶液的發光粒子的濃度來決定。具體地說，例如當針對發光粒子的濃度C的對照溶液，將對照溶液的發光粒子的檢測數設為N時，光檢測區域所通過的區域的總體積Vt通過下式給出。
[0117]Vt = N/C— (7) ο
[0118]另外，可以準備發光粒子的濃度不同的多個溶液作為對照溶液，針對多個溶液分別執行測量，采用計算出的Vt的平均值作為光檢測區域所通過的區域的總體積Vt。而且，當給出Vt時，發光粒子的計數`結果為η的樣本溶液的發光粒子的濃度c通過下式給出。
[0119]c = n/Vt …⑶。
[0120]此外，可以不依據上述的方法而通過任意的方法、例如通過利用FCS、FIDA等給出光檢測區域的體積、光檢測區域所通過的區域的總體積。另外，在本實施方式的光分析裝置中，可以針對所設想的光檢測區域的移動圖案，將針對各種標準的發光粒子的濃度C與發光粒子的個數N之間的關系(式(7))的信息預先存儲到計算機18的存儲裝置中，在裝置的使用者實施光分析時能夠適當地利用所存儲的關系的信息。
[0121]為了驗證上述說明的本發明的有效性，如下那樣進行了實驗。此外，應該理解為以下的實施例用于例示本發明的有效性，而并不是限定本發明的范圍。
[0122]實施例1
[0123]在掃描分子計數法中對光檢測處理中的測量單位時間進行各種變更來驗證測量單位時間針對發光粒子信號的檢測的影響。
[0124]作為樣本溶液，調制出在磷酸緩沖液(包含0.l%PluronicF-127)中作為發光粒子包含IOpM的熒光色素ATT0633 (ATTO-TEC)的溶液。在光的測量中，作為光分析裝置，利用具備共焦熒光顯微鏡的光學系統和光子計數系統的單分子熒光測量裝置MF20(奧林巴斯株式會社)，依照在上述的“(2)樣本溶液的光強度的測量”中所說明的方式，針對上述樣本溶液獲取了時序光強度數據(光子計數數據)。此時，激勵光使用633nm的激光，利用帶通濾波器測量660nm-710nm的波長頻帶的光并生成時序光子計數數據。將激勵光的激光功率設為200 μ W。將樣本溶液中的光檢測區域的位置的移動速度設為15mm/s JfBIN --ΜΕ設為lys，進行了 I秒鐘的測量。
[0125]在光測量后的數據處理中，首先，對于所獲取到的時序光子計數數據，以BIN TIME分別為10μ s、20l.! s、30l.! s、50l.! sUOOy s的方式重新構成時序光子計數數據(例如，BINTIME為10 μ s的重構數據是在BIN TIME Slys的數據點處將10點的光子數相加而生成I點的數據點。)。接著，針對重新構成的各個時序光子計數數據進行發光粒子的信號的逐個檢測和信號數的計數。發光粒子的信號的檢測依照“(i)發光粒子的信號的逐個檢測”以及圖3的步驟110~160所記載的要點，對時序光子計數數據實施平滑處理，在平滑后的數據中決定脈沖信號的起點和終點，之后通過最小二乘法使高斯函數擬合各脈沖信號，確定(高斯函數中的)峰值強度、脈沖寬度(半峰全寬)、相關系數。然后，只抽出滿足下述的條件的脈沖信號作為發光粒子的信號，
[0126]20 μ s< 脈沖寬度〈400 μ S
[0127]峰值強度>1 [pc/ΙΟ μ s]...(A)
[0128]相關系數>0.90
[0129]對其信號數進行計數。
[0130]表1示出了在重新構成的各個時序光子計數數據中被檢測為發光粒子信號的信號數和重構數據的數據量。
[0131][表1]
【權利要求】
1.一種光分析裝置，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析裝置的特征在于，包括: 光檢測區域移動部，其使上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動； 光檢測部，其按每個測量單位時間檢測來自上述光檢測區域的光量；以及 信號處理部，其生成一邊使上述光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動一邊由上述光檢測部按每個上述測量單位時間檢測出的來自上述光檢測區域的光的按時間序列的光強度數據，在上述按時間序列的光強度數據中逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號， 其中，上述測量單位時間根據上述光檢測區域的大小和位置的移動速度來決定。
2.根據權利要求1所述的光分析裝置，其特征在于， 上述光檢測區域的大小越大，上述測量單位時間被設定得越長，上述移動速度越高，上述測量單位時間被設定得越短。
3.根據權利要求1或2所述的光分析裝置，其特征在于， 上述測量單位時間小于一個發光粒子通過上述光檢測區域時的估計通過時間的一半。
4.根據權利要求1至3中的任一項所述的光分析裝置，其特征在于， 上述測量單位時間被設定成一個發光粒子通過上述光檢測區域時的通過時間與至少三個上述測量單位時間相重疊。
5.根據權利要求1至4中的任一項所述的光分析裝置，其特征在于，` 上述信號處理部對逐個檢測出的表示來自上述發光粒子的光的信號的個數進行計數來對在上述光檢測區域的位置的移動過程中檢測出的上述發光粒子的個數進行計數。
6.根據權利要求1至5中的任一項所述的光分析裝置，其特征在于， 上述光檢測區域移動部使上述光檢測區域的位置以比上述發光粒子的擴散移動速度快的速度移動。
7.根據權利要求1至6中的任一項所述的光分析裝置，其特征在于， 上述光檢測區域移動部通過變更上述光學系統的光路來使上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動。
8.根據權利要求1至7中的任一項所述的光分析裝置，其特征在于， 上述信號處理部在檢測出具有大于規定閾值的強度的表不光的信號時，檢測出一個發光粒子進入了上述光檢測區域。
9.根據權利要求1至8中的任一項所述的光分析裝置，其特征在于， 上述信號處理部使上述按時間序列的光強度數據平滑化，將平滑化后的上述按時間序列的光強度數據中具有超過上述規定閾值的強度的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示來自單個上述發光粒子的光的信號。
10.根據權利要求1至9中的任一項所述的光分析裝置，其特征在于， 上述信號處理部根據檢測出的上述發光粒子的個數來確定上述樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
11.一種光分析方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析方法的特征在于，包括以下過程: 使上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動；一邊使上述光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動一邊按每個測量單位時間檢測來自上述光檢測區域的光量，生成按時間序列的光強度數據；以及 逐個檢測上述按時間序列的光強度數據中的各個表示來自各個發光粒子的光的信號， 其中，根據上述光檢測區域的大小和位置的移動速度來決定上述測量單位時間。
12.根據權利要求11所述的光分析方法，其特征在于， 上述光檢測區域的大小越大，將上述測量單位時間設定得越長，上述移動速度越高，將上述測量單位時間設定得越短。
13.根據權利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于， 上述測量單位時間小于一個發光粒子通過上述光檢測區域時的估計通過時間的一半。
14.根據權利要求11至13中的任一項所述的光分析方法，其特征在于， 將上述測量單位時間設定成一個發光粒子通過上述光檢測區域時的通過時間與至少三個上述測量單位時間相重疊。
15.根據權利要求11至14中的任一項所述的光分析方法，其特征在于， 還包括以下過程:對逐個檢測出的表示來自上述發光粒子的光的信號的個數進行計數來對在上述光檢測區域的位置的移動過程中檢測出的上述發光粒子的個數進行計數。
16.根據權利要求11至15中的任一項所述的光分析方法，其特征在于， 在使上述光檢測區域的位置移動的過程中，使上述光檢測區域的位置以比上述發光粒子的擴散移動速度快的速度移動。
17.根據權利要求11至16中的任一項所述的光分析方法，其特征在于， 在使上述光檢測區域的位置移動的過程中，通過變更上述光學系統的光路來使上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動。
18.根據權利要求11至17中的任一項所述的光分析方法，其特征在于， 在逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號的過程中，在檢測出具有大于規定閾值的強度的表示光的信號時，檢測出一個發光粒子進入了上述光檢測區域。
19.根據權利要求11至18中的任一項所述的光分析方法，其特征在于， 在逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號的過程中，使上述按時間序列的光強度數據平滑化，將平滑化后的上述按時間序列的光強度數據中具有超過上述規定閾值的強度的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示來自單個上述發光粒子的光的信號。
20.根據權利要求11至17中的任一項所述的光分析方法，其特征在于， 還包括以下過程:根據檢測出的上述發光粒子的個數來確定上述樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
21.一種光分析用計算機程序，用于使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析用計算機程序的特征在于，使計算機執行以下步驟: 使上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動； 在上述樣本溶液內的上述光檢測區域的位置的移動過程中，按根據上述光檢測區域的大小和位置的移動速度而決定的每個測量單位時間，檢測來自上述光檢測區域的光量，生成按時間序列的光強度數據；以及 逐個檢測上述按時間序列的光強度數據中的各個表示來自各個發光粒子的光的信號。
22.根據權利要求21所述的光分析用計算機程序，其特征在于， 上述光檢測區域的大小越大，將上述測量單位時間設定得越長，上述移動速度越高，將上述測量單位時間設定得越短。
23.根據權利要求21或22所述的光分析用計算機程序，其特征在于， 上述測量單位時間小于一個發光粒子通過上述光檢測區域時的估計通過時間的一半。
24.根據權利要求21至23中的任一項所述的光分析用計算機程序，其特征在于， 將上述測量單位時間設定成一個發光粒子通過上述光檢測區域時的通過時間與至少三個上述測量單位時間相重疊。
25.根據權利要求21至24中的任一項所述的光分析用計算機程序，其特征在于， 還使計算機執行以下步驟:對逐個檢測出的表示來自上述發光粒子的光的信號的個數進行計數來對在上述光檢測區域的位置的移動過程中檢測出的上述發光粒子的個數進行計數。
26.根據權利要求21至25中的任一項所述的光分析用計算機程序，其特征在于， 在使上述光檢測區域的位置移動的步驟中，使上述光檢測區域的位置以比上述發光粒子的擴散移動速度快的速度移動。
27.根據權利要求21至26中的任一項所述的光分析用計算機程序，其特征在于， 在使上述光檢測區域的位置移動的步驟中，通過變更上述光學系統的光路來使上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動。
28.根據權利要求21至27中的任一項所述的光分析用計算機程序，其特征在于， 在逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號的上述步驟中，在檢測出具有大于規定閾值的強度的表示光的信號時，檢測出一個發光粒子進入了上述光檢測區域。
29.根據權利要求21至28中的任一項所述的光分析用計算機程序，其特征在于， 在逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號的上述步驟中，使上述按時間序列的光強度數據平滑化，將平滑化后的上述按時間序列的光強度數據中具有超過上述規定閾值的強度的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示來自單個上述發光粒子的光的信號。
30.根據權利要求21至29中的任一項所述的光分析用計算機程序，其特征在于， 還使計算機執行以下步驟:根據檢測出的上述發光粒子的個數來確定上述樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
【文檔編號】G01N21/64GK103765197SQ201280042499
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年7月3日 優先權日:2011年8月30日
【發明者】中田秀孝, 田邊哲也 申請人:奧林巴斯株式會社