細胞組學血管健康概況分析的系統和方法

細胞組學血管健康概況分析的系統和方法
【專利摘要】本發明涉及確定對象中血管健康的方法。該方法包括以下步驟：從對象獲得生物樣品；基于生物樣品中至少一組微粒的水平獲得微粒數據；基于生物樣品至少一組祖細胞的水平獲得祖細胞數據；基于微粒和祖細胞數據產生生物樣品的流式細胞術指紋；和基于產生的流式細胞術指紋確定對象的血管健康。
【專利說明】細胞組學血管健康概況分析的系統和方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年6月10提交的美國臨時申請序列號61/495，955和2012年5月22日提交的美國臨時申請序列號61/650，353的優先權權益，其全部公開內容通過引用被并入本文，如同每個以其全部在本文中列出。
[0003]發明背景
[0004]心血管疾病(CVD)在美國是最主要的死亡原因；每39秒一個成人死于心臟病發作、中風或其它心血管疾病(“在美國，高血壓和膽固醇失去控制”。疾病控制中心網站。http://www.cdc.gov/Features/Vitalsigns/Card1vascularDisease/。2011年I月 31 日更新，2012年2月6日訪問)。美國CVD患病率已經非常高(36.9%的成人或約8千I百萬人)并預測在接下來的20年里增加約10%，到2030年估計超過40%的成人(大約I億I千
6百萬人)將患有一種或多種形式的 CVD (Heidenreich et al., 2011, Circulat 1n 123:933-944)。很早以前癥狀在臨床上是明顯的，新生血管疾病開始于內皮細胞機能異常。當動脈粥樣硬化進展到阻塞的血流引起缺血的點時，或當由于破裂或侵蝕，血栓從存在的斑塊形成時，有癥狀的、臨床 CVD 事件通常發生(Heidenreich et al.，2011，Circulat1nl23:933-944)。
[0005]令人遺憾地，目前不存在有成本效益的和準確的可確定患者心血管健康的血液測試。相反，心血管風險通常由若干循環生物標記，如高靈敏度C-反應蛋白(hsCRP)和纖維蛋白原進行評估(Ridker, 2003, Circulat1nl07:363-369)。由于這些生物標記通常是急性期反應物，因此對于動 脈粥樣硬化不是特異性的，它們只被推薦給具有心血管事件的中等風險的患者(Greenland et al.，2010，Circulat1nl22:e584_e636)。同樣，在臨床實踐中沒有可用的生物標記來靈敏地和準確地評價對醫學治療的反應。心血管風險分層的基于弗雷明漢(Framingham)的方法沒有結合生物標記或遺傳異常，因此預測值受限。
[0006]一個公開的心血管風險算法，雷諾爾德(Reynolds)評分，包括hsCRP，但是，如同弗雷明漢，遺傳背景不包括在方案中。實踐和預防工作組中基因組應用的評價(Evaluat1nof Genomic Applicat1ns in Practice and Prevent1n Working Group (EffG))發現推薦測試28個基因中219p21遺傳變體或57個其它變體以在一般人群中評估CVD特別是心臟病和中風風險的證據不充分。EWG提出來自單獨或組合使用這些基因組標記中任何一個的凈健康益處的量是可以忽略的(Evaluat1nofGenomicApplicat1ns inPractice Prevent1n Working Group.2010.Recommendat1ns from the EGAPP WorkingGroup:Genomic profiling to assess card1vascular risk to improve card1vascularhealth.Journal12:839-843810.1097/GIM.1090bl013e3181f1872cl090)。
[0007]因此，存在對早期診斷測試未滿足的臨床需要，該早期診斷測試提供在明顯的CVD之前心血管健康的測量和治療干預的評估。本發明通過細胞基試驗滿足該需要，該細胞基試驗基于血管健康概況(Vascular Health Profile) (VHP)的建立中祖細胞(PCs),如內皮祖細胞(EPCs)和微粒(MPs)的測量而評估心血管狀態。
[0008]發明概述[0009]本發明涉及確定對象中的血管健康的方法。該方法包括以下步驟:從對象獲得生物樣品；基于生物樣品中至少一組微粒的水平獲得微粒數據；基于生物樣品中至少一組祖細胞的水平獲得祖細胞數據；基于微粒和祖細胞數據產生生物樣品的流式細胞術指紋(cytometric fingerprint);和基于產生的流式細胞術指紋確定對象的血管健康。
[0010]在一個實施方式中，至少一組微粒的水平通過流式細胞術測量。在另一個實施方式中，生物樣品是全血液樣品品。在另一個實施方式中，生物樣品是血漿樣品。在另一個實施方式中，對象是具有銀屑病的對象。在另一個實施方式中，對象是具有狼瘡的對象。在另一個實施方式中，對象是具有已知CVD風險因素的對象。在另一個實施方式中，對象是沒有已知CVD風險因素的對象。在另一個實施方式中，對象是糖尿病對象。在另一個實施方式中，對象是I型糖尿病對象。在另一個實施方式中，對象是2型糖尿病對象。在另一個實施方式中，祖細胞是內皮祖細胞(EPCs)。在另一個實施方式中，當至少一個微粒組的水平上調時，對象處于心血管疾病或血管機能異常的風險，或使心血管疾病或血管機能異常進展的風險。在另一個實施方式中，當至少一個祖細胞組的水平下調時，對象處于心血管疾病或血管機能異常的風險，或使心血管疾病或血管機能異常進展的風險。在另一個實施方式中，當至少一個微粒組的水平上調和至少一個祖細胞組的水平下調時，對象處于心血管疾病或血管機能異常的風險，或使心血管疾病或血管機能異常進展的風險。
[0011]本發明還涉及確定對象中與心血管疾病或血管機能異常相關的風險的方法。所述方法包括以下步驟:從對象獲得生物樣品；基于生物樣品中至少一組微粒的水平獲得微粒數據；基于生物樣品中至少一組祖細胞的水平獲得祖細胞數據；基于微粒和祖細胞數據產生生物樣品的流式細胞術指紋；和基于產生的流式細胞術指紋，確定與對象的心血管疾病或血管機能異常相關的風險。
[0012]在一個實施方 式中，至少一組微粒的水平通過流式細胞術測量。在另一個實施方式中，生物樣品是血漿樣品。在另一個實施方式中，生物樣品是全血液樣品品。在另一個實施方式中，對象是具有銀屑病的對象。在另一個實施方式中，對象是具有狼瘡的對象。在另一個實施方式中，對象是具有已知CVD風險因素的對象。在另一個實施方式中，對象是沒有已知CVD風險因素的對象。在另一個實施方式中，對象是糖尿病對象。在另一個實施方式中，對象是I型糖尿病對象。在另一個實施方式中，對象是2型糖尿病對象。在另一個實施方式中，祖細胞是內皮祖細胞(EPCs)。在另一個實施方式中，產生的流式細胞術指紋指示細胞損傷。在另一個實施方式中,產生的流式細胞術指紋指示內皮完整性、內皮修復能力喪失或其組合。在另一個實施方式中，所述方法進一步包括產生源自一個或多個個體的健康對照樣品的流式細胞術指紋和比較對象的生物樣品的產生的流式細胞術指紋與健康對照樣品的流式細胞術指紋。
[0013]附圖簡述
[0014]為了說明本發明的目的，在附圖中描述本發明的某些實施方式。然而，本發明不限于附圖中描述的實施方式的精確安排和手段。
[0015]圖1是顯示用于確定血管健康概況的高通量流式細胞術試驗的示意圖。血液樣品分成外周血單核細胞(PBMCs)和血漿。祖細胞在PBMCs中鑒定，而微粒在血漿中鑒定。
[0016]圖2是Canto A上FSC/SSC閾值優化的圖解。如圖2所描述的，FSC和SSC閾值由具有不同FSC或SSC閾值的以中等速度通過機器的0.3μπι小球(Α排)或0.3、1和3μπι小球(在FFC/SSC等值線圖上的B排和在SSC-W直方圖上的C排)確定。D和E列顯示在具有設為5000的FSC閾值或設為200的SSC閾值(D列)以及只有設為200的SSC閾值和沒有FSC閾值(E列)的FFC/SSC等值線圖和SSC-W直方圖上3個小球的更好的分辨率。設為200的FSC閾值或設為200的SSC閾值(F列)獲得更多的背景噪聲。設為200的FSC閾值和沒有SSC(G列)，0.3 μ m小球缺失。對于小顆粒，側向散射較前向散射是更好的參數。在該研究中為了在FSC/SSC等值線和SSC-W直方圖上的3個混合物小球的更好的分辨率，將FSC和SSC閾值設為5000和200 (D列)。
[0017]圖3是Canto A上FSC/SSC PMT確定的圖解。如圖3所描述的，雙重過濾的PBS和0.3um小球用于建立FSC、SSC PMT。當雙重過濾的PBS以中等流速通過機器時，接受每秒小于10個事件。分別將FSC和SSC的閾值設為5000和200。利用不同SSC電壓通過機器上運行的相同樣品來確定FSC和SSC PMT。利用SSC300和325，更多的MPs喪失，并且SSC375和400上獲得更多的背景噪聲。在該研究中，接受350的SSC電壓。由于大量背景噪聲，這里未顯示400的SSC電壓數據。
[0018]圖4是窗口延伸確定的圖解。如圖4所描述的，FACS Canto A WindowExtens1n (WE)通過以WEO至7的中等速度運行的0.3、I和3 μ m小球來確定。為了 SSC-W直方圖上3個小球的更好的分辨率和低背景噪聲，選擇WE0.2。
[0019]圖5是Canto A上樣品檢測中窗口延伸0.2和7的比較。如圖5所描述的，將PFP用 FITC-Annexin (或 CD31)、Percp_Cy5.5-CD41、PE_CD105 (或 CD144)、APC_CD64 染色和在WE0.2或7上運行。當固定數目的3 μ m小球(100，000)被計數時停止捕獲。將A排在點圖上用設為0.2的WE門控(gated)在小于約I μ m上。將B排在點圖上用設為7的WE門控在小于約I μ m上。在SSC-W直方圖上用WE0.2將C排門控在小于約I μ m上和用WE7將D排門控在小于約Iym上。利用WE7采集更多的背景噪聲和更少的陽性顆粒(B排和D排)。 [0020]圖6是門控策略的圖解。如圖6所描述的，0.3、1和3μπι小球用于估計MPs大小(Canto A上的A和B以及Gall1s上的C)。將MPs門控在小于約Iymi (Canto上在SSC-W直方圖上門控的D和在FSC/SSC點圖上的E以及Gall1s上的F)。對于Canto A設置，分別將前向和側向散射閾值設為5000和200，和將窗口延伸設為0.2。對于Gall1s設置，將FS的鑒別器值設為1，前向散射采集角是W2。
[0021]圖7是抗體優化的圖解。如圖7所描述的，500 μ I雙重過濾的PBS中用于MP檢測的相同體積的抗體在Canto A上運行。未過濾的抗體(Α排)較雙重過濾的抗體(B排)顯示更多的假陽性事件。用于MPs檢測的所有試劑應當通過0.1-0.22μπι低蛋白結合過濾器進行雙重過濾以從運行緩沖液去除抗體聚集物和背景噪聲。
[0022]圖8是抗體優化的進一步圖解。如圖8所描述的，將50 μ I PFP用未過濾的抗體(Α和C排)和雙重過濾的抗體(B和D排)標記。將A和B排在SSC-W直方圖上門控在小于I μ m上。將C和D排在FSC和SSC點圖上門控在小于I μ m上。預先過濾抗體有助于通過去除抗體聚集而減少假陽性顆粒。
[0023]圖9是Canto A和GalI1s上MP檢測的圖示。如圖9所描述的，在Canto和GalI1s上檢測MPs。在Canto (A排)和Gall1s (B排)上將MPs門控在小于I μ m上。基于熒光扣除對照(fluorescence minutes one) (FMO)管確定陽性 MPs。
[0024]圖10是BD Canto A和BC Gall1s的比較。如圖10所描述的，計算的斯皮爾曼等級相關用于在兩個平臺之間比較MP計數，大多數相關超過0.8，除了顯示0.6相關的CD105(+) (P〈0.05)。Gall1s上MPs計數大于Canto A上兩倍。A排顯示兩個平臺的相關，而B排顯示兩個平臺上MPs數目的比較。
[0025]圖11是用于MP分析的門控策略的圖解。MPs通過小于約I μ m的校準器小球限定的FSC/SSC圖上的Pl區上第一門控進行鑒定(A和B)。微粒的來源通過針對源自內皮的MPs (C)的Annexin-V和CD144、針對源自血小板的MPs (D)的Annexin-V和CD41、針對源自單核細胞的MPs (E)的Annexin-V和⑶14的共表達而鑒定。
[0026]圖12是顯示與抑制素應用相比低密度脂蛋白水平(圖A)和EPO水平(圖B)的散布圖(具有中線)圖解。LDL，低密度脂蛋白膽固醇；ΕΡ0，促紅細胞生成素；H，健康的；ES，早期糖尿病；LT，長期糖尿病。
[0027]圖13是CD34+PCs、板基試驗的nM PS+MPs以及nM PS+MPs /CD34+PCs比的散布圖(具有中線)和顯著性的圖解。KW計算的P。H，健康 的；ES，早期糖尿病；LT，長期糖尿病；MP，微粒；PC，祖細胞。
[0028]圖14是ELISA板MPs、流式細胞術測量的⑶34細胞和比的中間水平的圖解。插入表顯示與〃非細胞〃動脈粥樣硬化生物標記的比較。
[0029]圖15是用于EPC分析的門控策略的圖解。用于EPCs的連續門控策略由門控以下組成:(a)活力(viable)事件(上面的左圖)，在紅色虛線下面；(b)與淋巴細胞一致的大小區域中的細胞(下面的右圖)，紅色橢圓形內；(C)單峰事件(下面的左圖)，黑色多邊形內；和最后(d)對譜系標記⑶3、⑶19或⑶33陰性和對⑶45暗至陰性的事件(下面的右圖)，彩色顯示的左下象限內。使用的活力標記是碘化丙唳(Propidium 1dide),在PE-A通道上檢測的(上面的左圖)。門控是完全自動的，并且無需操作員干預而單獨地應用于每個樣品。
[0030]圖16是原始的(未門控的)微粒分布的圖解。顯示未門控的、任意選擇的樣品中的微粒分布。顯示7個熒光參數加側向散射寬度的所有配對組合。
[0031]圖17也是原始的(未門控的)微粒分布的圖解。針對I μ m以下的顆粒門控之后，顯示圖16中描述的相同樣品。
[0032]圖18是單變量微粒分布的圖解。聚集個體微粒數據組。相對于側向散射(y軸)繪制(X軸)關于每個熒光參數的事件分布。這些分布上重疊的是單變量分布的核心密度估計(黑色曲線)。代表陽性標記表達的閾值通過這些分布的檢查來選擇(垂直的黑線)。
[0033]圖19是另一個原始的(未門控的)微粒分布的圖解。在針對I μ m以下的顆粒和針對以在陽性表達閾值以上的水平表達至少一個標記的顆粒門控之后，顯示圖16和17中描述的相同樣品(如圖18所示)。
[0034]圖20是通過與HC相比以顯著低的濃度存在于DM的流式細胞術指紋確定的EPCs亞型的圖解。將個體HC數據集聚集并利用雙指數變換在三個二變量圖中顯示為彩色分布。將CF發現的指紋面元(bin)中與DM相比在HC中更強地表達的事件(P〈0.001)顯示為黑點。利用熒光扣除對照(FMO)對每個個體樣品確定每個顯示的標記(⑶31、⑶24和⑶133)的陽性表達閾值，并顯示它們的平均值(實黑線)和標準差(包圍灰色區域的點虛線)。
[0035]圖21是與HC相比以不同濃度存在于DM中的MP亞型的圖解。MP分布的CF分析導致在HC和DM之間差別表達的8個群體的發現。差別表達的面元(bin)中的事件顯示為所有個體DM數據組的聚集(顯示為彩色分布)上重疊的黑點。黑線代表對每個參數個別確定的陽性表達閾值(參見圖18)。在每個圖上面，給出差別表達的亞型的表型。在每個圖內顯示更高表達的亞型(DM或HC)的群。
[0036]圖22是組合EPC和MP測量的圖解。在上面的圖中，垂直軸線代表MP亞型⑶31胃/⑶41胃與⑶31?/⑶41?的比。水平軸線代表EPCKe1，如文本中所描述的。將測量除以HC組之中的中值而標準化和對數轉換。將DM對象繪制為紅點，而將HC對象繪制為藍點。下面的兩個圖獨立地將兩個測量描繪為箱式圖，其中中值由水平棒指示，箱從第一四分位數延伸到第三四分位數，須(whiskers)延伸不超過1.5倍四分間距。
[0037]圖23是VEGF-R2試劑的熒光扣除對照(Fluorescence Minus One) (FMO)分析的圖解。FMO對照管通過用圖中除一個之外的所有標記染色而制備。顯示任意選擇的3個樣品的VEGF-R2FM0分布。FMO閾值通過以下來確定:首先找到針對VEGF-R2分布與側向散射區域(紅色橢圓形)的2D核心密度估計的主要陰性簇邊界，然后找到與該邊界的水平切線(紅色虛線)。注意，在這些樣品中存在顯著數目的超過FMO閾值的事件。而且，這些事件經常出現以形成從陰性群體去除的叢式孔(clusters well)。這些代表“假陽性”事件，因為這些對照管中沒有VEFG-R2試劑，所以陽性表達是由于除外這些細胞上VEFG-R2受體實際表達的一些原因。因此，VEGF-R2的實際表達不能被可靠地查明，尤其當靶事件不常發生時，如在EPCs的情況中。
[0038]圖24是微粒表型差異表達的圖解。顯示表7中描述的微粒亞型的糖尿病和健康對照之間差異表達的箱式圖。每個箱式圖顯示等級特定的分布的中值以及第一和第三四分位數。
[0039]詳細描述
[0040]本發明涉及對血管健康概況分析的系統和方法。本發明的系統和方法包括基于多種PCs(如EPCs)和MPs測量的用于評估心血管狀態的細胞基試驗。該“細胞組學(cytomic)”方法——利用系統生物學的力量結合高度靈敏的高維流式細胞術——是對心血管健康的遺傳和環境影響的反映，在細胞水平整合和靶向在內皮功能中起積極作用的細胞(和亞細胞顆粒)。
[0041]在本發明的一個方面，所述系統和方法利用具有無偏分析方案的廣泛的細胞表面標記圖，該方案利用流式細胞術指紋來評價具有糖尿病(DM)的患者和健康對照(HC)之間的差異。與先前的研究——其通過獲得MP和EPC樣品只單獨觀察MPs或EPCs的水平——不同，血管機能異常(通過MP水平)和修復能力(通過EPC水平)如何相互作用的平衡可被觀察和提供顯著提高的診斷和/或風險確定。
[0042]定義
[0043]除非另外限定，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的相同的意思。雖然與本文描述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料可在本發明的實施或測試中使用，但是描述優選的方法和材料。
[0044]如本文所用，以下術語中每個具有與在該部分中與其相關的意思。
[0045]冠詞“一個(a) ”和“一個(an) ”在本文用于指一個或指超過一個(即，指至少一個)的冠詞語法對象。作為實例，“要素(an element)”指一個要素或超過一個要素。
[0046] “約”如本文所用當指可測量的值如量、短暫的持續時間等時意思包括從特定值的±20%或土 10%，更優選±5%，甚至更優選土 1%和仍然更優選±0.1%的變化，因為這樣的變化對進行公開的方法是適當的。
[0047]術語“異常的”當用于對象、生物體、組織、細胞或其組分的上下文中時，指在至少一個可觀察的或可檢測的特性(例如，年齡、治療、天的時間等)方面與顯示“正常的”(期望的)各自特性的那些對象、生物體、組織、細胞或其組分不同的那些對象、生物體、組織、細胞或其組分。對一個細胞或組織類型來說是正常或期望的特性可能對不同細胞或組織類型來說是異常的。
[0048]術語“評估(assessing)”包括任何形式的測量，并且包括確定是否存在要素。術語“確定”、“測量”、“評價”、“評估”和“試驗(assaying)”可互換地使用并包括定量和定性確定。評估可以是相對的或絕對的。“評估……的存在”包括確定存在的事物的量，和/或確定它是否存在或不存在。
[0049]如本文所用，術語“生物標記”是生物實體如細胞或細胞組或其一個或多個片段、蛋白質或其片段，包括可從生物樣品分離或在生物樣品中或在生物樣品上測量的多肽或肽，與取自不具有CVD的表面上正常的對象的可比較樣品相比，其差別地存在于取自具有確定的或可能臨床上顯著的CVD的對象的樣品中。生物標記可以是完整的細胞或分子，或它可以是其部分——其可以部分有功能或例如通過特定的結合蛋白或其它檢測方法被識另O。如果與預定值或對照群體的參考概況比較，生物標記的可測量方面與對象中CVD的存在或風險相關，則認為該生物標記是提供信息的。這樣的可測量方面可包括例如生物樣品中生物標記或其部分的存在、不存在、量或濃度，和/或其作為超過一個生物標記的部分概況的存在。生物標記的可測量方面還被稱作特征。特征可以是比或生物標記的兩個或多個可測量方面的其它這樣的數學上定義的關系。生物標記概況包括至少一個可測量特征，并可包括兩個、三個、 四個、五個、10個、20個、30個或任何數目的特征。生物標記概況還可包括相對于至少一個外部或內部標準的至少一個特征的至少一個可測量方面。
[0050]如本文所用，術語“流式細胞術指紋”指多個細胞、微粒或流式細胞儀中所測量的其它對象的多變量概率分布的表示。在流式細胞術方法中，每個細胞或微粒通常由不小于兩個被測變量來表征，并常常由多至二十或更多個被測變量表征。多個細胞的流式細胞測量因此可以由與測量變量數目一樣多的維限定的超空間中的分布表征。流式細胞術指紋是該多變量概率分布以數字載體(vector)形式的緊湊表示，每個數字代表多變量空間的特定亞區域中分布函數的密度。
[0051]如本文所用，術語“心血管疾病”或“CVD”通常指心臟和血管疾病，包括動脈粥樣硬化、冠心病、腦血管疾病和外周血管疾病。心血管病癥是CVD的急性現象并且包括心肌梗塞、中風、心絞痛、短暫性缺血發作和充血性心力衰竭。心血管疾病,包括動脈粥樣硬化,通常由脂肪物質、炎性細胞、細胞外基質和斑塊的積累產生。
[0052]如本文所用，術語與一個或多個生物標記有關的“數據”，或術語“生物標記數據”通常指反應樣品中生物標記的產物的絕對和/或相對豐度(水平)的數據。如本文所用，術語與一個或多個生物標記有關的“數據集”指代表對象的參考群體中一組生物標記的一個或多個生物標記產物中每個水平的數據集合。數據集可用于產生本發明的式/分類器。根據一個實施方式，數據集不需要包括參考群體每個個體的組的每個生物標記產物的數據。例如，“數據集”當用于將應用于式的數據集的上下文中時可指代表一個或多個參考群體中每個個體的每個生物標記產物水平的數據，但是如將被理解的，也可指代表所述一個或多個參考群體中每個的99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%或更少個體的每個生物標記產物水平的數據，并可仍然用于應用到式的目的。
[0053]糖尿病(DM)是由胰島素不充分產生引起并導致碳水化合物、脂肪和蛋白質異常代謝的一種嚴重的慢性形式的糖尿病。該疾病以血液和尿中增加的糖水平、過度口渴、頻繁排尿、酸中毒和消耗為特征。該狀況由肥胖和不活動的生活方式惡化。該疾病常常沒有癥狀，通常通過指示葡糖耐受不良的試驗診斷，并用飲食改變和鍛煉計劃來治療。糖尿病與包括冠狀、外周和頸動脈疾病的心血管并發癥的高風險相關。如本文所顯示的，將DM用作血管疾病的模型系統，并且將來自糖尿病群的本發明的血管健康概況結果與年齡和性別相似的健康對照(HC)進行比較以發現生物學上提供信息的標記以輔助血管并發癥的檢測和治療。
[0054]“疾病”是一種動物的健康狀態，其中動物不能保持內穩態，并且其中如果疾病沒有改善，那么動物的健康持續惡化。
[0055]相比之下，動物中的“病癥”是一種健康狀態，其中動物能保持內穩態，但是其中動物的健康狀態較缺少病癥的情況不好。如果不治療，病癥不會必然引起動物健康狀態的進
一步下降。
[0056]“式”、“算法”或“模型”是任何數學方程、算法、分析或編程的過程，或采取一個或多個連續或范疇的輸入(或“參數”)和計算輸出值的統計學技術，有時稱作“指數”或“指數值”。“式” 的非限制實例包括和、比和回歸運算符，如系數或指數，生物標記值轉換和標準化(沒有限制地包括基于臨床參數，如性別、年齡或種族性的那些標準化方案)、規則和指導方針、統計分類模型以及在歷史的群體上培養的神經網絡。在組合CVD標記和其它生物標記中具有特別用途的是線性和非線性方程和統計分類分析以確定對象樣品中檢測的CVD標記的水平之間的關系。在組和組合構建中，具有特別意義的是結構統計分類算法，以及風險指數構建的方法，利用模式識別特征，包括建立的技術如交互相關、主成分分析(Principal Components Analysis) (PCA)、因子旋轉、邏輯回歸(LogisticRegress1n) (LogReg)、線性判別分析(Linear Discriminant Analysis) (LDA)、SupportVector Machines (SVM)、隨機森林(Random Forest) (RF)、偏最小二乘法(Partial LeastSquares)、稀疏偏最小二乘法(Sparse Partial Least Squares)、柔性判別分析(FlexibleDiscriminant Analysis)、遞歸分類樹(Recursive Partit1ning Tree) (RPART)、以及其它相關的決策樹分類技術、最接近收縮質心(Nearest Shrunken Centroids (SC))、分步模型選擇程序、Kth-最近相鄰(Kth-Nearest Neighbor)、提升樹(Boosting 或 Boosted Tree)、決策樹(Decis1n Trees)、神經網絡(Neural Networks)、貝葉斯網絡(Bayesian Networks)、支持向量機(Support Vector Machines)和隱馬爾科夫模型(Hidden Markov Models)以及其它。其它技術可用于存活和事件發生時間危害分析，包括本領域技術人員熟知的Cox、Weibul1、Kaplan-Meier 和 Greenwood 模型。
[0057]“增加的發展(developing)CVD的風險”在本文用于指對象發展CVD的可能性或概率的增加。該風險可相對于個體的自身風險，或相對于不具有CVD臨床證據的參考群體而被評估。參考群體可以代表關于近似的年齡、年齡組和/或性別的個體。
[0058]“增加的進展(progressing) CVD的風險”在本文用于指具有CVD的對象具有進展CVD的可能性或概率的增加。該風險可相對于個體的自身風險，或相對于不具有CVD臨床證據的參考群體而被評估。參考群體可以代表關于近似的年齡、年齡組和/或性別的個體。
[0059]如本文所用，“指導材料”包括出版物、記錄、圖表或任何其它表達介質，其可用于在實現本文描述的多種疾病或病癥的確定或評價風險的試劑盒中傳達本發明的化合物、組合物、載體、生物標記或遞送系統的有用性。本發明的試劑盒的指導材料可例如附于含有本發明的鑒定的化合物、組合物、載體、生物標記或遞送系統的容器或與含有鑒定的化合物、組合物、載體、生物標記或遞送系統的容器一起運送。可選地，指導材料可以與發明容器分開運送，目的是指導材料和化合物、組合物、載體、生物標記或遞送系統被接收者合作地使用。
[0060]一個或多個生物標記的“水平”指樣品中生物標記的絕對或相對量或濃度。
[0061]“測量(Measuring)” 或“測量(measurement)”，或可選地“檢測(detecting)” 或
“檢測(detect 1n ) ”指評估來自臨床或對象的樣品內給定物質-包括這樣的物質的定性
或定量濃度水平的衍生化——的存在、不存在、數量或量(其可以是有效量)，或另外評價對象臨床參數的值或分類。
[0062]“微粒”(MPs)如本文所用是由于激活或凋亡通過胞吐出芽(exocytic budding)形成的從真核細胞脫落的0.1-1 μ m血漿顆粒，并指示細胞損傷。如本文所考慮的，MPs可以是內皮MPs (EMPs)、血小板MPs (PMPs)和/或單核細胞MPs (MMPs)。MPs含有來自它們的母細胞的miRNA、蛋白質和其它抗原，并常常是促凝結和促炎的。
[0063]術語“患者”、“對象”、“個體”等在本文可互換地使用，并指任何動物或其體外或原位細胞，順從本文描述的方法。在某些非限制的實施方式中，患者、對象或個體是人。
[0064]如本文所用，術語“預定值”指獲自對象的一般群體或選擇的群體的生物樣品中一個或多個生物標記的量。例如，選擇的群體可以由表面上健康的對象，如先前不具有任何指示CVD存在的征兆或癥狀的個體組成。在另一個實例中，預定值可以由具有確定的CVD的對象組成。在另一個實例中，預定值可以由具有DM的對象組成。預定值可以是斷開值或范圍。預定值可基于表面上健康的對象和具有確定的CVD、ES或LT或DM的對象之間的比較測量而確定，如本文所描述的。
[0065]“祖細胞”(PC)如本文所用可包括本領域技術人員理解的任何類型的PC，包括促血管生成細胞(PACs)、內皮祖細胞(EPCs)和循環造血干細胞和祖細胞(CHSPCs)。如本文所顯示的，發現了一群細胞，其表型上與EPCs的通常定義一致，但是也與CHSPCs—致。為了簡潔和清楚的目的，這樣的細胞在本文被簡單稱作PCs。
[0066]“樣品”或“生物樣品”如本文所用指從個體分離的生物材料。生物樣品可含有適合檢測期望的生物標記的任何生物材料，并可包括獲自個體的細胞和/或非細胞材料。
[0067]貫穿本公開，本發明的各個方面可以以范圍形式存在。應當理解，以范圍形式的描述僅僅是為了方便和簡潔，并且不應被解釋為對本發明范圍的固定限制。相應地，范圍的描述應被認為已具體地公開了該范圍內所有可能的亞范圍以及個體數值。例如,諸如I至6的范圍的描述應被認為已具體地公開了該范圍內的亞范圍如I至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等以及個體的數，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3、6和其間的任何全部和部分增量。這適用而不論范圍的寬度。
[0068] 描述[0069]細胞基系統分析，也稱作‘細胞組學’，整合環境和遺傳的心血管風險因素的生物學結果。對發展可常規地用于指導醫學治療和風險評估這樣的試驗存在未滿足的臨床需要。本發明的系統和方法通過利用模式發現計算方法對血管健康提供綜合的見解以分析若干靶，包括血管微粒(最近被鑒定為血管健康的強大生物標記)和內皮祖細胞群體的特性。例如，可評價無癥狀的患者的心血管風險，并可縱向地監測有癥狀的患者。這些能力實現個性化醫療的主要目標。
[0070]如本文所考慮的，本發明的系統和方法包括在明顯的CVD之前提供心血管健康測量的早期診斷測試，以及治療干預的評估。應當理解，本發明可用于心血管健康的任何參數的測量，并可適合本領域技術人員將理解的任何CVD風險的檢測和確定。
[0071]例如，糖尿病(DM)與包括冠狀、外周和頸動脈疾病的心血管并發癥的高風險相關。具有2型DM的患者CAD和PAD的風險增加2至4倍(Beckman etal.，2002, JAMA287:2570-2581)。因此，認為來自具有長期2型DM和具有臨床上明顯的動脈粥樣硬化的患者的血液樣品將具有與非糖尿病對照對象不同的異常血管健康概況。如本文所顯示的,將DM用作血管疾病的模型系統，并將來自糖尿病群的本發明的血管健康概況結果與年齡和性別相似的健康對照(HC)比較以發現生物學上提供信息的標記以輔助血管并發癥的檢測和治療。
[0072]祖細胞和測暈方法
[0073]如本文所考慮的，本發明包括樣品中多種祖細胞(PCs)的鑒定和門控。PCs在本文被限定為包括PACs、EPCs和/或CHSPCs以及與CVD相關的任何其它祖細胞類型。這些細胞是修復能力的介質，并且雖然這樣的細胞的精確表型限定還未確定，但是認為它們通過結構發展或旁分泌作用參與血管發生以支持血管生長。
[0074]EPCs是骨髓衍生細胞，其響應內源的(例如，來自缺血組織、腫瘤細胞)或外源的(例如，抑制素)信號而動員進循環。簡言之，EPCs的生理功能促進血管內穩態，血管內穩態對防止由于血管損傷的多種疾病的發病是重要的(Mdbiiis-Wkkler etal., 2009, Cytometry Part A75A:25-37)。
[0075]常常用于用流式細胞術鑒別EPCs的表面標記包括CD133、CD34和VEGF-R2 (也稱作 KDR) ( Mobius-Winklcr et al., 2009, Cytometry Part A75A: 25-37 ；Hirschi etal.,2008,Arter1scler Thromb Vasc B1l.28:1584-1595 ；Khan et al.,2005,CytometryB Clin Cytom64:1-8)。Estes等的最近研究用體外造血集落形成活性和具有表型CD31+、CD34+、CD133+和CD45?_Mft的N0D/SCID小鼠中的多譜系移植物限定了細胞群體(Estes etal.，2010, Cytometry Part A77A: 831-839)，他們將其稱作循環造血干和祖細胞(CHSPCs)。如本文所考慮的，對用于表征PC或PCs群體的表面標記的數目和類型沒有限制，如本領域技術人員所將理解的。
[0076]PCs可通過本領域技術人員了解的任何合適的方法測量。例如，細胞可通過高通量方法測量。在一個實施方式中，細胞通過流式細胞術測量。在另一個實施方式中，細胞通過ELISA基技術測量。在另一個實施方式中，細胞通過板基捕獲試驗測量。在另一個實施方式中，將通過流式細胞術測量的細胞利用流式細胞術指紋來表示。在一些實施方式中，細胞通過以任何組合的多種方法測量。例如，可使用流式細胞術、ELISA基技術和板基捕獲試驗或其任何組合。[0077]微粒和測暈方法
[0078]微粒(MPs)是由于激活或凋亡通過胞吐出芽形成的從真核細胞脫落的0.1-1ym血漿顆粒，并指示細胞損傷。如本文所考慮的，MPs可以是內皮MPs(EMPs)、血小板MPs (PMPs)和 / 或單核細胞 MPs (MMPs)。
[0079]MPs含有來自它們的母細胞的miRNA、蛋白質和其它抗原，并常常是促凝結和促炎的。MPs在凝結和炎癥中的作用是動脈粥樣硬化病理生理學的重要部分，使作為潛在的血管健康生物標記的MPs特別吸引人。實際上，許多研究已證明在血管機能異常的情況中細胞特異的MPs 升高(Tushuizen et al., 2011, Arter1scler Thromb Vasc B1l31:4-9)。另外，MPs可在它們的母細胞中通過“輸出”促凋亡化合物如胱天蛋白酶3而防止凋亡，由此降低細胞溶質的水平(Hussein et al., 2007, Thromb Haemost98 (5): 1096-107)。然而,與具有穩定的心絞痛癥狀的患者相比，MPs在具有急性冠脈綜合征的患者中顯著提高(Bernal-Mizrachiet al., 2003, American Heart Journal 145:962-970),并且是繼發性心肌梗塞或死亡的強大預測物(Sinning et al., 2011, European Heart Journal32:2034-2041)。它們還在急性缺血性中風/腦血管意外之后升高(Jung et al.2009.Ann Neurol.66 (2): 191-9)。在糖尿病患者的預測觀察性研究中，升高的MPs強烈預示冠狀損害的存在，并被證明是較糖尿病持續時間、脂質濃度或高血壓的存在更重要的獨立風險因素(Koga et al.，2005, JAm Coll Card1l45:1622-1630)。循環白細胞衍生的MPs在216名無癥狀的對象中預不亞臨床動脈粥樣硬化和斑塊數(Chironi et al., 2006, Arter1scler Thromb VascB1l.26:2775-2780)。如本文所考慮的，MP的存在、數目和類型可用作生物標記和/或用作本發明的敏感和特異的血管健康概況試驗的組分，在預測無癥狀的患者動脈粥樣硬化風險中具有臨床實用性。
[0080]這些亞微米顆粒被釋放進入循環，攜帶大量表面標記，用于鑒定它們的細胞來源。暴露的膜磷脂酰絲氨 酸(PS)和組織因子，連同過多的其它表面分子和細胞質組分，包括核質，使MPs能夠影響許多種生物學功能，包括凝結、血栓形成和血管發生。
[0081]MPs可通過本領域技術人員了解的任何合適的方法測量。例如，MPs可通過高通量方法測量。在一個實施方式中，細胞通過流式細胞術測量，如各個實施例中所顯示的。如本文所考慮的，對用于表征MP或MPs群體的表面標記的數目和類型沒有限制，如本領域技術人員所將理解的。
[0082]流式細胞術指紋
[0083]流式細胞術指紋(Rogerset al.，2008，Cytometry Part A73A: 430-441 ;Rogers&Holyst, 2009, Adv B1informatics: 193947) (CF)提供一種快速分析高維、高容量流式細胞術數據而無需研究者或系統偏倚的方法。CF將多變量分布分解成大量非重疊區域，在本文被稱作“面元(bin)”，其完全地跨越空間，產生的在數據集中記錄的每個事件在面元之一中找到。給定面元組，CF將每個事件分配到面元，計數每個面元中的事件數，以及將樣品的完全多變量分布表示為變平的載體，在本文稱作每個面元事件數的“指紋”。如本文所顯示的，可將指紋當成數據的完全的微門控，每個門控或面元被加以標記。
[0084]還如本文所顯示的，針對多樣品的多變量概率分布函數可利用簡單的統計分析方法比較。例如，可搜索這樣的面元，其與利用與現在常規用于基因表達數據分析相似的方法的另一組樣品相比，在一組樣品中顯著地上調和/或下調(Boscolo et al., 2008, IEEE/ACM Transact1ns on5(l): 15-24)。因此，CF的使用不僅賦予“數據挖掘”方法以流式細胞數據分析，由此多變量分布的疾病相關或治療相關的改變直接從數據中發現，而且建立通向用其它技術綜合分析的橋梁(例如，Doring et.al.( Doring et al., 2012, Arter1sclerThromb Vasc B1l。32:182-195))。這不同于依賴研究者限定的門控的常規分析方法，研究者限定的門控代表由于疾病或治療可改變的多變量空間的特定區域的假設。因此，CF不僅消除研究者偏倚(其可通過門控主觀性而無意地引入)的概率，而且允許所有多變量區域的綜合分析，不僅是研究者的期望所預先限定的那些。
[0085]本發明方法
[0086]如本文所描述的，本發明在對象血管健康確定中利用大量細胞基生物標記。該方法可被如圖1所示概括地描述，其中從對象采集生物樣品如血液。如本文所考慮的，對象的和用于進行本文描述的方法的生物樣品可以是血液、血清、血漿或本領域技術人員所將了解的任何其它合適的流體、組織或細胞樣品。接下來，至少一個PC和至少一個MP通過高通量方法，如流式細胞術測量。接下來，進行流式細胞術數據的流式細胞術指紋以將數據分成多個分類，而沒有研究者或系統偏倚，以便獲得鑒定的生物標記的血管健康概況。利用該概況，與另一組樣品相比，一組樣品中顯著上調和/或下調的生物標記可被鑒定并且在對象中CVD或增加或發展CVD的風險的確定或預測中和使用。
[0087]在另一個實施方式中，本發明涉及確定對象中血管健康的方法。該方法包括以下步驟:從對象獲得生物樣品；基于生物樣品中至少一組微粒的水平獲得微粒數據；基于生物樣品至少一組祖細胞的水平獲得祖細胞數據；基于微粒和祖細胞數據產生生物樣品流式細胞術指紋；以及基于產生的流式細胞術指紋確定對象的血管健康。
[0088]在另一個實施方式中，利用綜合組(comprehensive panel),其中首先基于大小來選擇細胞。然后，屬于成熟 的造血譜系的細胞通過門控掉⑶3+、⑶19+、⑶33+和⑶45胃細胞而去除。然后，利用流式細胞術指紋，將剩下的群體再分和進行統計評價，而沒有任何預定的偏倚，以發現是否存在在DM患者和HC之間差別表達的細胞群體。
[0089]在一個實施方式中，本發明涉及通過測量微粒與祖細胞的關系確定糖尿病對象中心血管疾病發病率或血管機能異常的風險的方法。在一個實施方式中，該方法確定或預示增加的發展CVD的風險。在另一個實施方式中，該方法確定或預示增加的進展CVD的風險。例如，該方法包括以下步驟:從對象獲得生物樣品；基于生物樣品中至少一組微粒的水平獲得微粒數據；基于生物樣品至少一組祖細胞的水平獲得祖細胞數據；基于微粒和祖細胞數據產生生物樣品流式細胞術指紋；以及基于產生的流式細胞術指紋確定對象的與心血管疾病或血管機能異常相關的風險。
[0090]在另一個實施方式中，本發明包括確定對象中血管健康的方法，其中該方法包括以下步驟:從對象獲得生物樣品；和確定樣品中相對于祖細胞水平的微粒的類型和/或水平，其中微粒相對于祖細胞的水平指示對象中與心血管疾病或血管機能異常相關的風險，由此確定所述對象中的血管健康。
[0091 ] 在另一個實施方式中，本發明包括確定糖尿病對象中與心血管疾病或血管機能異常相關的風險的方法，該方法包括以下步驟:從所述對象獲得生物樣品；確定樣品中相對于祖細胞水平的微粒水平，其中微粒相對于祖細胞的水平指示所述對象中與心血管疾病或血管機能異常相關的風險。在一個實施方式中，糖尿病對象是I型糖尿病對象。在另一個實施方式中，糖尿病對象是2型糖尿病對象。
[0092]在另一個實施方式中，本發明包括確定對象中糖尿病相關的風險的方法，該方法包括以下步驟:從對象獲得生物樣品；確定所述樣品中相對于祖細胞水平的微粒水平，其中微粒相對于祖細胞的水平指示對象中與心血管疾病或血管機能異常相關的風險，由此確定對象中糖尿病相關的風險。
[0093]在一些實施方式中，本發明的方法包括確定相對于PACs或EPCs水平的微粒水平的步驟。
[0094]在一個實施方式中，微粒相對于PCs、PACs或EPCs的水平指示細胞損傷。在另一個實施方式中，微粒相對于PCs、PACs或EPCs的水平指示內皮完整性、內皮修復能力的喪失、或其組合。
[0095]在一個實施方式中，微粒和祖細胞水平的比較是微粒與祖細胞的比。在一些實施方式中，該比可直接與主動脈脈搏波速度(aPWV)相關，提供血漿膽固醇水平、MPs、PACs、內皮損傷和動脈硬度之間的函數聯系。
[0096]實驗實施例
[0097]現在參考以下實施例描述本發明。僅為了說明的目的提供這些實施例，并且本發明應決不被解釋為受限于這些實施例，而是應被解釋為包括由于本文提供的教導而變得明顯的任何和所有改變。
[0098]無需進一步描 述，據認為，本領域的普通技術人員可利用先前的描述和以下示例的實施例，制造和利用本發明和實施要求保護的方法。以下工作實施例因此具體指出本發明的優選實施方式，并且不被解釋為以任何方式限制本公開的其余部分。
[0099]實施例1:通過流式細胞術的循環MPs的檢測
[0100]如先前所說明的，流式細胞術(FCM)可用于血液中微粒(MPs)的檢測。該技術能夠進行一個樣品中數千MPs的測量，同時確定鑒定多種MP亞型的的多個標記。MPs非常小的尺寸(0.1至1.0 μ m)使它們的檢測在標準流式細胞儀的尺寸分辨率的界限處。因此，精確的檢測需要敏銳地注意樣本制備、樣品獲取和數據分析的細節。如本文所顯示的，利用BDB1sciences FACS Canto A 和 Beckman Coulter Gall1s 優化患者中人血衆的 MPs 的檢測。
[0101]以下材料和方法用于實施例1:
[0102]無血小板的血漿(PFP)通過肝素化血液的兩步離心從37名健康的對象獲得(1500g，15min以及13，000g，2分鐘)。將50 μ I PFP用雙重過濾的 5 μ I FITC-CD31 (555445，BD)、5μ I PE-CD144 (560410，BD)、2.5 μ IAPC-CD64 (CD6405, Invitrogen)和 5μ1 PerCP-Cy5.5-CD41a(340930,BD)或2.5 μ I FITC-Annexin V(556570,BD)、1.25 μ I PE-CD105 (560839，BD)和 5 μ IPercp-Cy5.5-CD3 (340949, BD )標記。FMO管用于建立陰性門控。
[0103]在室溫30分鐘溫育之后，將50 μ I 3 μ m的珠(BCP-30-5，Spherotech)和雙重過濾的PBS或Annexin緩沖液加入管以使總的終體積達500 μ I。然后將樣品在FACS CantoA(BD)和 Gall1s (Beckman Coulter)上運行。
[0104]為了數據獲取和分析,利用0.3、1和3μηι校準珠將前向和側向散射閾值、光電倍增管(PMT)電壓和窗口延伸(WE)優化以檢測0.1-1ym顆粒。將MP在具有前向散射(FSC)和側向散射(SSC)的方案中以對數模式分析。標準珠0.3 (Sigma)、I和3.0 μ m直徑(Spherotech)用于MP大小的估計。將SSW或FSC-SSC圖上具有0.3至1.0 μ m大小的事件門控為MPs。當對于Canto和Gall1s計數固定數目的3μπι珠(200,000)時，停止獲取。用 BD FACS Canto A 上的 DiVa vers1n6.1.2 和 BC Gall1s 上的 Kaluza vers1nl.1 進行分析。
[0105]如圖2所示，FSC和SSC閾值由具有不同FSC或SSC閾值的以適中速度通過機器的
0.3口!11珠(4排)或0.3、1和3 4111珠(FFC/SSC等值線圖上B排和SSC-W直方圖上C排)確定。D和E列顯示在具有設為5000的FSC閾值或設為200的SSC閾值(D列)，以及只有設為200的SSC閾值和沒有FSC閾值(E列)的FFC/SSC等值線圖和SSC-W直方圖上3個珠的更好的分辨率。設為200的FSC閾值或設為200的SSC閾值(F列)獲得更多的背景噪聲。設為200的FSC閾值和沒有SSC(G列)，0.3 μ m珠缺失。對于小顆粒，側向散射較前向散射是更好的參數。在該研究中，為了 FSC/SSC輪廓和SSC-W直方圖上的3個混合物珠的更好的分辨率，將FSC和SSC閾值設為5000和200 (D列)。
[0106]如圖3所示，雙重過濾的PBS和0.3um珠用于建立FSC、SSC PMT。當雙重過濾的PBS以中等速度通過機器時，接受每秒小于10個事件。分別將FSC和SSC的閾值設為5000和200。利用不同SSC電壓通過機器上運行的相同樣品來確定FSC和SSC PMT。利用SSC300和325，更多的MPs喪失，并且SSC 375和400上獲得更多的背景噪聲。在該研究中，接受350的SSC電壓。由于大量背景噪聲，這里未顯示400的SSC電壓數據。
[0107]如圖4所 不，FACS Canto A Window Extens1n(WE)通過以WEO至7的中等速度運行的0.3、1和3 μ m珠來確定。為了 SSC-W直方圖上3個珠的更好的分辨率和低背景噪聲而選擇WE0.2。
[0108]如圖5 所示，將 PFP 用 FITC-Annexin (或 CD31)、Percp_Cy5.5-CD41、PE_CD105 (或⑶144)、APC-⑶64染色和在WE0.2或7上運行。當固定數目的3 μ m珠(100, 000)被計數時停止捕獲。將A排在點圖上用設為0.2的WE門控在小于約I μ m上。將B排在點圖上用設為7的WE門控在小于約I μ m上。在SSC-W直方圖上用WE0.2將C排門控在小于約I μ m上和用WE7將D排門控在小于約I μ m上。利用WE7采集更多的背景噪聲和更少的陽性顆粒(B排和D排)。
[0109]如圖6所示,0.3、I和3 μ m小球用于估計MPs大小(Canto A上的A和B以及Gall1s上的C)。將MPs門控在小于約Iymi (Canto上在SSC-W直方圖上門控的D和在FSC/SSC點圖上的E和Gall1s上的F)。對于Canto A設置，分別將前向和側向散射閾值設為5000和200，和將窗口延伸設為0.2。對于Gall1s設置，將FS的鑒別器值設為1，前向散射采集角是W2。
[0110]如圖7所示，將500 μ I雙重過濾的PBS中用于MP檢測的相同體積的抗體在CantoA上運行。未過濾的抗體(A排)較雙重過濾的抗體(B排)顯示更多的假陽性事件。用于MPs檢測的所有試劑應當通過0.1-0.22 μ m低蛋白結合過濾器雙重過濾以從運行緩沖液去除抗體聚集物和背景噪聲。
[0111]如圖8所示，將50 μ I PFP用未過濾的抗體(Α和C排)和雙重過濾的抗體(B和D排)標記。將A和B排在SSC-W直方圖上門控在小于約I μ m上。將C和D排在FSC和SSC點圖上門控在小于約Iym上。預先過濾抗體有助于通過去除抗體聚集而減少假陽性顆粒。
[0112]如圖9 所不，在 Canto 和 Gall1s 上檢測 MPs。在 Canto (A 排)和 Gall1s (B 排)上將MPs門控在小于約Ιμπι上。基于熒光扣除對照(FMO)管確定陽性的MPs。
[0113]如圖10所示，計算的斯皮爾曼等級相關用于在兩個平臺之間比較MP計數，大多數相關超過0.8，除了顯示0.6的相關的⑶105(+) (P〈0.05)。Gall1s上MPs計數大于CantoA上兩倍。A排顯示兩個平臺的相關，而B排顯示兩個平臺上MPs數目的比較。
[0114]如該實施例所顯示的，流式細胞術儀設置的優化可顯著減少背景噪聲。優選，試劑，包括緩沖液和抗體，應通過0.1-0.2 μ m低蛋白結合過濾器雙重過濾以減少抗體聚集和來自緩沖液的背景噪聲。Gall1s和FACSCanto上獲得的值是相關的，并且Gall1s在目的區域中檢測到大量事件。
[0115]實施例2:作為糖尿病群體中血管健康測暈的微粒與祖細胞關系
[0116]考查MPs與PCs/PACs的關系以查看是否它可用作改進的和臨床上可行的血管病理學指標。將血漿樣品從具有早期(ES，診斷〈I年)和長期(LT，診斷>5年)2型糖尿病的患者采集并與年齡相關的健康的對象(H)比較。PC和MP亞型通過流式細胞術和ELISA基方法的組合來測量。促凝血的MPs/⑶341 PCs的比證明在對象組之間區分的有價值的指標(P5 0.01)。該受損的血管功能的指標在LT組中是最高的，雖然有加強的抑制素治療，并且較一些可溶蛋白生物標記提供更多的信息。
[0117]意想不到地，發現了 2型糖尿病中MPs和PCs之間的關系。該比提供具有糖尿病的患者中血管機能異常和心血管風險的定量的和臨床上可行的測量。
[0118]以下材料和方法用于實施例2:
[0119]患者招募和研究設計
[0120]將在先前的12個月內診斷有2型糖尿病的患者稱作“早期”(ES)，并將超過五年以前診斷的那些患者稱作“長期”(LT)。在沒有先前或目前的糖尿病-或心血管-相關狀況病史的基礎上將年齡相關的“健康的”(H)對象招募進入研究，并且不采取任何類型的CV相關的藥物治療——包括抑制素或高脂血癥、高血壓或糖尿病的藥物治療。ES組的四個(36%)和LT組的14個(67%)接受抑制素藥物治療，連同一些其它藥物治療以治療糖尿病、高血壓和其它狀況。關于心血管疾病的家族史，健康組中18個(66%)對象中的12個，早期中11(90%)中的10個和長期組中每個參加者(100%)答復存在先前的心血管疾病家族史。LT患者中糖尿病的平均時間長度是20年。所有的研究參加者都是不抽煙者。從所有的研究參加者獲得書面的知情同意，并且研究方案經Institut1nal Review Board(IRB)批準。每個對象在上午8:00左右捐獻約50mL靜脈血，并且所有對象在前一天晚上禁食。將血液采集在肝素化(Baxter)注射器中，用于細胞和可溶蛋白分析(30mL)、檸檬酸納用于微粒(1mL)和EDTA用于脂質分析(1mL)。記錄每個對象的人口統計數據、醫學/藥物治療歷史、體格檢查和生命體征。
[0121]PCs/PACs的流式細胞術
[0122]樣品采集后不到約lh，利用氯化銨溶胞作用將白血細胞從30mL血液分離，如先前所描述的。不確定血小板計數。細胞染色、門控策略、流式細胞術方法以及分析被如下描述。將大約5E6個細胞用6-色抗體組:FITC-抗CD31 (PECAM) (Pharmingen)、PE-抗-CDI33(Miltenyi B1tec.)、PerCP_Cy5.5-抗-CD3,-CDI9,-CD33(BectonDickinson)、APC-H7 抗-CD45 (Becton Dickinson)、PE_Cy7_ 抗-CD34 (Becton Dickinson)和APC-抗-VEGF-R2 (R&D系統)染色。生存能力通過碘化丙啶排除來評估。利用Becton-Dickinson LSRII流式細胞儀，對每個樣品處理2E6個活事件，并且六個熒光標記連同光散射只允許有活力的、低至中的側向散射。對PCs和PACs分析單峰，其是⑶3、19、33-陰性的。將單峰門控為從側向散射寬度對前向散射寬度的圖鑒定的突出的細胞簇以保證將細胞聚集物從分析中排除。將熒光扣除對照(FMO)樣品用作陰性對照。將細胞群體(PCs和PACs)定量為以每ml血液的數目的單核細胞百分數。分析集中于對PCs和PACs的亞型定義(表1)。利用FlowJo分析軟件(Treestar, Ashland, OR)進行數據分析。
[0123]表1
[0124]通過流式細胞術的每個表面標記的細胞或顆粒基因型
[0125]
【權利要求】
1.確定對象中血管健康的方法，包括: 從所述對象獲得生物樣品； 基于所述生物樣品中至少一組微粒的水平獲得微粒數據； 基于所述生物樣品至少一組祖細胞的水平獲得祖細胞數據； 基于所述微粒和祖細胞數據產生所述生物樣品的流式細胞術指紋；和 基于所述產生的流式細胞術指紋確定所述對象的所述血管健康。
2.權利要求1所述的方法，其中所述至少一組微粒的所述水平通過流式細胞術測量。
3.權利要求1所述的方法，其中所述生物樣品是血漿樣品。
4.權利要求1所述的方法，其中所述對象是具有銀屑病的對象。
5.權利要求1所述的方法，其中所述對象是具有狼瘡的對象。
6.權利要求1所述的方法，其中所述對象是具有已知CVD風險因素的對象。
7.權利要求1所述的方法，其中所述對象是沒有已知CVD風險因素的對象。
8.權利要求1所述的方法，其中所述對象是糖尿病對象。
9.權利要求1所述的方法，其中所述對象是糖尿病對象。
10.權利要求9所述的方法，其中所述對象是I型糖尿病對象。
11.權利要求9所述的方法，其中所述對象是2型糖尿病對象。
12.權利要求1所述的方法，其中所述祖細胞是內皮祖細胞(EPCs)。
13.權利要求1所述的方法，其中當至少一個微粒組的水平上調時，所述對象處于心血管疾病或血管機能異常的風險或使心血管疾病或血管機能異常進展的風險。
14.權利要求1所述的方法，其中當至少一個祖細胞組的水平下調時，所述對象處于心血管疾病或血管機能異常的風險或使心血管疾病或血管機能異常進展的風險。
15.權利要求1所述的方法，其中當至少一個微粒組的水平上調和至少一個祖細胞組的水平下調時，所述對象處于心血管疾病或血管機能異常的風險或使心血管疾病或血管機能異常進展的風險。
16.確定對象中與心血管疾病或血管機能異常相關的風險的方法，包括: 從所述對象獲得生物樣品； 基于所述生物樣品中至少一組微粒的水平獲得微粒數據； 基于所述生物樣品中至少一組祖細胞的水平獲得祖細胞數據； 基于所述微粒和祖細胞數據產生所述生物樣品的流式細胞術指紋；和 基于產生的流式細胞術指紋確定與所述對象心血管疾病或血管機能異常相關的風險。
17.權利要求16所述的方法，其中所述至少一組微粒的所述水平通過流式細胞術測量。
18.權利要求16所述的方法，其中所述生物樣品是血漿樣品。
19.權利要求16所述的方法，其中所述對象是糖尿病對象。
20.權利要求19所述的方法，其中所述對象是I型糖尿病對象。
21.權利要求19所述的方法，其中所述對象是2型糖尿病對象。
22.權利要求16所述的方法，其中所述祖細胞是內皮祖細胞(EPCs)。
23.權利要求16所述的方法，其中所述產生的流式細胞術指紋表明細胞損傷。
24.權利要求16所述的方法，其中所述產生的流式細胞術指紋表明內皮完整性、內皮修復能力的喪失、或其組合。
25.權利要求16所述的方法，進一步包括產生健康對照樣品的流式細胞術指紋，和將所述對象的生物樣品的所述產生的流式細胞術指紋與所述健康對照樣品的所述流式細胞術指紋進行 比較。
【文檔編號】G01N31/00GK104039134SQ201280039113
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年6月10日 優先權日:2011年6月10日
【發明者】E·R·莫勒, J·S·摩爾, L·張, W·羅杰斯, A·D·班特雷 申請人:賓夕法尼亞大學董事會