Hcv基因型3復制子的制作方法
【專利摘要】本發明提供了基因型3的丙型肝炎病毒（HCV）的復制子。這些復制子包括產生HCV的體外復制能力的適應性變異。還提供了基因型3復制子的制備方法和利用這些復制子篩選抗病毒藥劑的方法。
【專利說明】HCV基因型3復制子
[0001]相關申請的相互引用
[0002]根據美國法典第35篇第119 (e)節，本申請要求享有2011年7月6日提交的美國臨時申請序列號61/504，853及2011年7月20日提交的序列號61/509，989的權益，其中的每一個的內容均通過引用以其整體并入本公開。
【技術領域】
[0003]本公開涉及基因型3的丙型肝炎復制子(replicon)，以及制備和使用該復制子的方法。 【背景技術】
[0004]慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染仍然是全世界約1.6億感染者的巨大全球健康負擔。目前的護理標準是聚乙二醇干擾素加利巴韋林(ribavirin)的24-48周療程。由于此治療方案的局部療效及較差的耐藥性，新的抗病毒藥劑的開發和研制一直在緊張的進行中。最近，這些努力以FDA審核批準兩種NS3蛋白酶抑制劑(波普瑞偉和特拉匹韋)與聚乙二醇干擾素和利巴韋林聯合使用以用于治療慢性基因型1HCV感染而告終。許多其它抑制劑正處于進一步臨床開發中，然而，大多數還是被研制用于治療基因型1感染。
[0005]HCV是一種正鏈RNA病毒，顯示極大的遺傳多樣性。已報道有6種主要基因型(SP基因型1-6)以及多種亞型(如基因型la、lb、lc等)。基因型1、2和3具有世界范圍的分布。基因型la或lb通常主要在北美、南美、歐洲和亞洲。然而，基因型2和3在這些地區也是常見的，并且可構成20-50%的感染。基因型4a主要在中東和許多非洲國家；高達15%的埃及人口感染有HCV，并且93%的感染是基因型4。基因型5在南非很普遍，而基因型6在亞洲更常見。盡管多數大陸和國家具有一種“主要”基因型，但感染的人群幾乎普遍是多種基因型的混合感染。此外，由于大規模移民和普遍的靜脈用藥，HCV感染的地理分布和多樣性(流行病學)在不斷演變。例如，基因型4a已明顯傳播到歐洲中部和北部。這就帶來了臨床挑戰，因為對于直接抗病毒藥物和包括當前護理標準的免疫調節療法兩者，各種基因型的響應不同，這是有據可查的。
[0006]HCV復制子是來源于HCV基因組的自復制RNA序列，并且一直是作為分子病毒學研究和藥物研發的主要工具(workhorse)。迄今為止，已由兩種基因型和三種亞型(基因型la、lb和2a)建立了復制子。這些復制子在藥物開發和研制的多個方面都是極其重要的，包括新型抑制劑類型的識別、臨床候選藥物的優化和臨床耐藥性的表征。最近，研發對所有主要HCV基因型有效的新一代藥物的興趣正在持續增長。理想的是，對“泛基因型(pan-genotypic)”藥物和治療方案的審批將極大地簡化HCV的治療。
[0007]尋求泛基因型治療方案的一個關鍵步驟將是研制使得能夠研究所有主要基因型和亞型的體外工具。然而，來源于其它主要基因型(即除基因型la、lb或2a以外的那些基因型)序列的復制子至今還未產生。尤其是，盡管基因型3HCV在中東、北非和歐洲的世界范圍內流行，然而基因型3復制子至今未被描述。
【發明內容】
[0008]出乎意料地發現，通過將亞基因組基因型3cDNA轉錄和電穿孔至HCV允許細胞系(受納細胞系，permissive cell line)可得到穩定復制基因型3復制子的克隆細胞系。與野生型病毒對比，已從這些克隆物中識別了適應性變異(adaptive mutation)。當通過定點誘變改造(engineer)這些變異并引入到細胞系中，隨之而來的是HCV基因型3的復制。一種此類適應性變異是在NS3中的N607S，另一種此類適應性變異是在NS3中的P89L。強健(穩健，robust)基因型3復制子體系的建立為促進藥物開發和研制工作提供了有力工具。
[0009]因此，本發明的一個實施方式提供了能夠在真核細胞中復制的基因型3丙型肝炎病毒(HCV)RNA構建體，其中RNA序列包括5’ NTR,內部核糖體進入位點(IRES)，編碼NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B中的一種或多種的序列，以及3’ NTR。
[0010]一方面，構建體包括在NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B中的適應性變異。另一方面，變異包括在2204位置上的異亮氨酸。又一方面，在NS3中的變異包括607殘基上的絲氨酸。
[0011]又一方面，在NS3中的變異包括89殘基上的亮氨酸。在某些方面，變異還包括41殘基上的一個或多個精氨酸、166殘基上的蘇氨酸、379殘基上的蘇氨酸、534殘基上的甘氨酸、583殘基上的谷氨酸、和/或1殘基上的半胱氨酸。又一方面，變異還包括表7-表9中提供的更多種中的一種。
[0012]此外，還提供了轉錄為RNA構建體的DNA、包括RNA構建體的病毒顆粒、以及含有這種DNA或RNA的細胞。
[0013]在另一個實施方式中，還提供了 HCV基因型3的NS3蛋白質，包括607殘基上的絲氨酸和/或89殘基上的亮氨酸。在另一個實施方式中，提供了還包括2204位置上的異亮氨酸的NS3蛋白。還提供了編碼這些蛋白質的多核苷酸和特異性識別蛋白質的抗體。
[0014]在本發明的另一個實施方式中，提供了一種包括基因型3丙型肝炎病毒(HCV)RNA的分離細胞，其中基因型3丙型肝炎病毒(HCV) RNA是在細胞中復制的。一方面，在細胞中不存在編碼RNA的DNA構建體。另`一方面，細胞包括至少10個拷貝的RNA，或者可替換地至少約 100、500、1000、2000、5000、10，000、lxlO5、lxlO6、lxlO7、lxlO8 或 lxlO9個拷貝的 RNA。在這些方面中的任一個中，RNA可以是亞基因組HCV序列或全長HCV序列，并且可以包括如上所述的一個或多個適應性變異。
[0015]還提供了提高基因型4HCV病毒RNA在真核細胞中的復制能力的方法，包括用絲氨酸取代NS3的607殘基和/或用亮氨酸取代NS3的89殘基。進一步的變異可以包括41殘基上的一個或多個精氨酸、166殘基上的蘇氨酸、379殘基上的蘇氨酸、534殘基上的甘氨酸、583殘基上的谷氨酸、和/或1殘基上的半胱氨酸或表7-表9中提供的那些。
[0016]在一個實施方式中，還提供了一種識別抑制基因型3HCV的復制或活性的藥劑的方法，包括將任何以上實施方式中的細胞與候選藥劑接觸，其中，由RNA編碼的蛋白質的復制減少或活性降低表明該藥劑抑制HCV的復制或活性。可替換地，該方法包括將以上實施方式的任一個中的細胞裂解液與候選藥劑接觸，其中，由RNA編碼的蛋白質的活性降低表明該藥劑抑制HCV的活性。
【專利附圖】
【附圖說明】[0017]與附圖一起閱讀以下詳細描述，可以對本發明有最好的理解。附圖包括以下各圖:
[0018]圖1是基因型3a復制子構建體的示意圖。S523a鏈(登錄號:⑶814264)復制子編碼新霉素(A)或海腎熒光素酶(Rluc)-新霉素融合報告子(reporter) (B)。合成的復制子并入以下要素，從5’至3’:S525’ UTR ;新霉素磷酸轉移酶II基因(neo)或Rluc-Neo基因；腦心肌炎病毒(EMCY) IRES ；S52的NS3-NS5B多聚蛋白區，包括NS5A適應性變異(S2204I);和S52的3’UTR ;實心方框表示HCV核心序列。圓點陰影方框表示HCV多聚蛋白序列。“ + ”表示S2204I適應性變異。5，和3，非翻譯區(NTR)和EMCV IRES也有表示。
[0019]圖2示出了在暴露于NS3蛋白酶抑制劑化合物C時GT3a復制子NS3蛋白酶活性對其響應的數據。將lxlO5個GT3a復制子細胞分離，并使其于室溫下在2.4ml用150mM的NaCl增補的lx Promega熒光素酶裂解緩沖液中裂解15分鐘。然后，將細胞裂解液分布于每孔體積為80 μ 1的96孔板上。抗病毒藥物稀釋液是在DMS0中配制的，濃度為最終所需濃度(5ηΜ或50ηΜ)的10倍。然后，在每孔細胞裂解液中加入部分(10 μ 1)稀釋的化合物C，并且將板放在平板振蕩器(搖床，shaker)上，在室溫下溫育10分鐘。之后，將10 μ 1的
1μ Μ用銪標記的NS3底物(substrate)加入每個孔中。收集蛋白酶活性數據，數據表示為相對于DMS0對照組的抑制百分數。
[0020]圖3示出了在基因型3a復制子細胞系中的強健NS5A表達。將各自0.5xl06個穩定的GT3a、GTla、GTlb和GT2a復制子細胞和1C細胞分離，并在100 μ 1的SDS加載緩沖液(loading buffer)中完全裂解。取12微升的裂解液，進行SDS-PAGE和蛋白印跡(Westernblot)分析。印跡用一級抗-NS5A抗體(Apath ；1:3000稀釋液)和二級抗-小鼠抗體染色(來自 L1-C0R 的 IRDye800CW 山羊抗-小鼠 IgG (H+L)，1:10000 稀釋液)。然后，用 Odyssey成像系統(L1-C0R, Lincoln,Nebraska)分析染色。印跡還需用抗-BiP抗體(Abeam, 1:1000稀釋液)和二級抗-兔抗體(來自`L1-C0R的IRDye800CW Goat抗-兔子IgG(H+L)，1:10000稀釋液)共同染色，作為加載對照組。包括的1C細胞作為陰性對照組。在基因型3a復制子細胞克隆中檢測到NS5A的強表達，證實這些細胞穩定且強健地復制該復制子。
[0021]圖4A-C示出了實施例3中的基因型3a復制子構建體的示意圖。基因型3a S52鏈復制子編碼新霉素磷酸轉移酶II基因(neo) (A)、海腎熒光素酶(Rluc)-ne0融合報告子(B)或Pi海腎熒光素酶(PiRluc)融合報告子(C)。合成的復制子并入以下要素，從5’至3，:S525/ UTR ；Neo, Rluc-neo 或 P1-Rluc 報告基因；EMCV IRES ；S52 的 NS3-NS5B 多聚蛋白區，包括NS5A適應性變異(S2210I)和S52的3' UTR。表示HCV S52核心序列(coresequence)。Ο表示HCV多聚蛋白序列。“ + ?表示S2210I適應性變異。5'和3'非翻譯區(NTR)和EMCV IRES也有表示。
[0022]圖5A-B示出了在選定的基因型3a復制子細胞中的NS5A表達。(A)在選定的復制子細胞中的NS5A表達。將兩種穩定的基因型3a復制子克隆以及基因型lb復制子細胞分離，并在SDS加載緩沖液中完全裂解。然后將裂解液進行SDS-PAGE和蛋白印跡分析。印跡用一級抗-NS5A抗體(Apath ； 1:3000稀釋液)和二級抗-小鼠抗體染色(來自L1-C0R的IRDye800CW山羊抗-小鼠IgG (H+L)，1:10000稀釋液)。印跡還需用抗-BiP抗體(Abcam，1:1000稀釋液)和二級抗-兔子抗體(來自L1-C0R的IRDye800CW山羊抗-兔IgG (H+L),1:10，000稀釋液)共同染色，作為加載對照組。用Odyssey成像系統(L1-C0R)分析染色。(B)選定的復制子細胞的NS5A免疫染色。用抗-NS5A抗體(紅色)和Hoechst33342 (藍色，指示核)對基因型3a復制子克隆#1染色。將1C細胞染色作為陰性對照組。
[0023]圖6示出了選定的基因型3a復制子克隆獲得的適應性變異。從基因型3a復制子細胞克隆#1中提取全部細胞的RNA，然后按指定量電穿孔到Huh7-Lunet細胞中。轉染的細胞再次懸浮于DMEM培養基中，鋪板在直徑為100毫米的盤(皿，dish)中，并用0.5mg/ml的G418 (也被稱作Geneiiun見，一種氨基糖苷類抗生素)培養。三周以后，菌落盤用4%的甲醛固定，并用0.05%的結晶紫染色。平行轉染體外轉錄的GT3a復制子RNA，用作對照組。
[0024]圖7示出了穩定且強健GT3a Rluc-Neo復制子細胞系的建立。通過定點誘變，將NS3中的P89L變異引入到GT3a S52Rluc_Neo構建體中。將GT3a-P89L-Rluc_Neo變異復制子RNA和親本GT3a-Rluc-Neo復制子RNA (各10微克)轉染到1C或Huh7_Lunet細胞中。分別對每次選擇的存活菌落數量進行計數。[0025]圖8A-B表示在基因型3a熒光素酶細胞克隆中的熒光素酶表達。(A)來源于1C細胞的選定基因型3a復制子細胞克隆。(B)來源于Huh7-Lunet細胞的選定基因型3a復制子細胞克隆。基因型la和基因型lb的穩定復制子細胞也包括在內，用作參考。未轉染的1C或Huh7-Lunet細胞也包括在內，用作陰性對照組。60，000個細胞用于海腎熒光素酶的活性檢測。
[0026]圖9示出了 NS3中的P89L和NS5A中的S232I (S2210I)的組合變異增強基因型3a復制子的復制。通過定點誘變，分別將NS3中的P89L變異、以及NS3中的P89L和NS5A中的S232I (S2210I)的雙重變異引入到基因型3a S52PiRluc構建體中。單獨地將所有復制子RNA轉染到1C細胞中，并且將IX 104個轉染細胞鋪板于96-孔板的孔中。在轉染后的4小時和第1天到第7天，分析細胞的海腎熒光素酶活性。
[0027]圖10A-B中示出的曲線表示基因型3a治愈細胞系(cured cell line)對基因型3a 的復制是高度允許的。將 P1-Rluc-GT3a-P89L (A)、P1-Rluc_GTla 和 P1-Rluc-GTlb (B)復制子RNA轉染至1C細胞或基因型3a治愈細胞中。轉染后的四天內，每天測定熒光素酶活性。兩種治愈復制子細胞系，3a_C2和3a_C3，顯示了對基因型3a復制的最高允許度。
[0028]圖11A-B示出了 NS3或NS4A中的次級變異增強基因型3a復制子的復制。通過定點誘變，在 GT3a-P89L PiRluc 構建體中引入 NS3 中的 Q41R、A166T、A379T、S534G、K583E 次級變異，或者NS4A中的S1C次級變異。單獨將復制子RNA (以P1-Rluc-GTlb為對照)轉染到1C (A)或3a-C3 (B)治愈細胞中，且將1 X 104個轉染細胞鋪板于96-孔板中的每個孔中。在轉染后的4小時及7天中的每天，分析細胞的海腎熒光素酶活性。圖中顯示的數據是來自至少兩次獨立實驗的典型實驗。
【具體實施方式】
[0029]在更詳細地描述本發明之前，將首先定義以下術語。
[0030]應當理解，本發明并不限于所描述的特定實施方式，當然，可以有所變化。還應理解，在本文中使用的術語僅用于描述特定實施方式的目的，而非意圖限制，因為本公開內容的范圍將僅由所附的權利要求來限定。
[0031]需注意，除非在上下文中另有明確規定，在本文中及在所附權利要求中使用的單數形式“一”、“一種”和“該”包括復數對象。因此，舉例來說，提及“該絲線”包括多個絲線。[0032]1、定義
[0033]除非另有規定，在本文中使用的所有技術或科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。在本文中使用的以下術語具有以下含義。
[0034]在本文使用的術語“包括”或“包含”意在表示組分和方法包括所列舉的要素，但不排除其它。當“基本由…組成”用于限定組分和方法時，應表示排除對于為了所述目的而引用的組合具有任何實質意義的其它要素。因此，基本由在本文中限定的要素組成的組合物不排除其它對所要求保護的公開的基本或新特征不具有實質影響的材料或步驟。“由…組成”表示排出超過微量要素的其它成分和基本方法步驟。由所有這些過渡術語中的每一個限定的實施方式在本公開的范圍之內。
[0035]當術語“約”用在數值標號，例如，溫度、時間、數量和濃度(包括范圍)之前時，是指可以相差(+ )或(_) 10%、5%或1%的近似值。
[0036]術語“蛋白質”和“多肽”可交換使用，且其最廣泛的含義是指兩個或更多個亞單元氨基酸、氨基酸類似物或擬肽的化合物。亞單元可由肽鍵連接。在另一個實施方式中，亞基可以由其它鍵連接，例如酯、醚等。蛋白質或肽必須包括至少兩個氨基酸，且不限制氨基酸的最大數量，可以包括蛋白質或肽的序列。在本文使用的術語“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和其D及L光學異構體，氨基酸類似物或擬肽。下面列出了天然產生的氨基酸的一個字母及三個字母的縮寫。如果肽鏈較短，則三個或更多個氨基酸的肽通常被稱作寡肽。如果肽鏈較長，肽通常被稱作多肽或蛋白質。
[0037]
【權利要求】
1.一種能夠在真核細胞中復制的基因型3丙型肝炎病毒(HCV)RNA構建體，其中，所述RNA的序列包括5’NTR，內部核糖體進入位點(IRES)，編碼NS3、NS4A、NS4B、NS5A、或NS5B中的一種或多種的序列，以及3’ NTR。
2.根據權利要求1所述的RNA構建體，其中，與野生型相比，所述構建體包括在NS3、NS4A、NS4B、NS5A、*NS5B中的適應性變異。
3.根據權利要求2所述的RNA構建體，其中，所述變異包括在NS3中的殘基607上的絲氨酸。
4.根據前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述變異包括在NS3中的殘基89上的亮氨酸。
5.根據權利要求4所述的RNA構建體，其中，所述變異還包括在殘基41上的精氨酸、在殘基166上的蘇氨酸、在殘基379上的蘇氨酸、在殘基534上的甘氨酸、在殘基583上的谷氨酸、和/或在殘基1上的半胱氨酸。
6.根據前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述變異包括在2204位上的異亮氨酸。
7.根據前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述基因型3HCV是基因型3aHCV。
8.根據前述權利要求中任 一項所述的RNA構建體，還包括用于選擇的標記基因。
9.根據權利要求8所述的RNA構建體，其中，所述標記基因是新霉素磷酸轉移酶基因。
10.根據前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，還包括報告基因。
11.根據權利要求8所述的RNA構建體，其中，所述報告基因是熒光素酶。
12.根據前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述構建體包括，從5’到3’:所述 5’ NTR,所述 IRES,編碼 NS3、NS4A、NS4B、NS5A、和 NS5B 的序列，以及所述 3’ NTR。
13.根據前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，還包括編碼C、E1、或E2中的一種或多種的序列。
14.一種單鏈或雙鏈DNA，可以轉錄為權利要求1至13中任一項所述的RNA構建體。
15.一種病毒顆粒，包含權利要求1至13中任一項所述的RNA構建體。
16.—種分離細胞,包含權利要求1至13中任一項所述的RNA構建體或權利要求14所述的DNA。
17.一種HCV基因型3的NS3蛋白，包括在殘基607上的絲氨酸。
18.根據權利要求17所述的NS3蛋白，還包括在2204位上的異亮氨酸。
19.一種HCV基因型3的NS3蛋白，包括在殘基89上的亮氨酸。
20.根據權利要求19所述的NS3蛋白，還包括在殘基41上的精氨酸、在殘基166上的蘇氨酸、在殘基379上的蘇氨酸、在殘基534上的甘氨酸、在殘基583上的谷氨酸、和/或在殘基1上的半胱氨酸。
21.—種多核苷酸,編碼權利要求17至20中任一項所述的蛋白。
22.根據權利要求21所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是RNA或DNA。
23.—種RNA或DNA構建體，包括權利要求17至20中任一項所述的多核苷酸。
24.一種細胞，包含權利要求21或22所述的多核苷酸或者權利要求23所述的RNA或DNA構建體。
25.一種抗體，特異性地識別權利要求17至20中任一項所述的蛋白。
26.一種分離細胞，包含在所述細胞中復制的基因型3丙型肝炎病毒(HCV) RNA。
27.根據權利要求26所述的細胞，其中，在所述細胞中不存在編碼所述RNA的DNA構建體。
28.根據權利要求26或27所述的細胞，其中，所述細胞包含至少10個拷貝的所述RNA。
29.根據權利要求26至28中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括亞基因組HCV序列。
30.根據權利要求29所述的細胞，其中，所述RNA包括5’NTR，內部核糖體進入位點(11?3)，編碼吧3、吧4六、吧48、吧5六、和NS5B的序列，以及3’NTR。
31.根據權利要求26至30中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括全基因組HCV序列。
32.根據權利要求26至31中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括在2204位上的異亮氨酸。
33.根據權利要求26至32中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括編碼NS3的序列，所述NS3包括在殘基607上的絲氨酸。
34.根據權利要求26至32中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括編碼NS3的序列，所述NS3包括在殘基89上的亮氨酸。
35.根據權利要求26至34中任一項所述的細胞，其中，所述細胞是哺乳動物細胞。
36.根據權利要求35所述的細胞，其中，所述細胞是肝瘤細胞。
37.根據權利要求36所述的細胞，其中，所述細胞是Huh71C細胞。
38.一種提高基因型3HCV病毒RNA在真核細胞中的復制能力的方法，包括用絲氨酸取代NS3的殘基607。
39.一種提高基因型3HCV病毒RNA在真核細胞中的復制能力的方法，包括用亮氨酸取代NS3的殘基89。
40.一種識別抑制基因型3HCV的復制或活性的藥劑的方法，包括使權利要求1至13中任一項所述的細胞與候選藥劑接觸，其中，由RNA編碼的蛋白質的復制減少或活性降低表明所述藥劑抑制所述HCV的復制或活性。
41.根據權利要求40所述的方法，其中， 所述蛋白質是蛋白酶。
42.根據權利要求40或41所述的方法，還包括測定所述RNA的復制或由所述RNA編碼的所述蛋白質的活性。
43.一種識別抑制基因型3HCV的活性的藥劑的方法，包括使權利要求1至13中任一項所述的細胞的裂解液與候選藥劑接觸，其中，由RNA編碼的蛋白質的活性降低表明所述藥劑抑制所述HCV的活性。
44.根據權利要求43所述的方法，其中，所述蛋白質是蛋白酶。
45.根據權利要求43或44所述的方法，還包括測定所述RNA的復制或由所述RNA編碼的所述蛋白質的活性。
【文檔編號】G01N33/569GK103687869SQ201280033320
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年7月5日 優先權日:2011年7月6日
【發明者】威廉四世·E·德拉尼, 程國鋒, 于梅, 莫紅梅, 徐思民, 阿莫爾納·科爾薩 申請人:吉利德科學股份有限公司