代謝活性的快速檢測的制作方法

代謝活性的快速檢測的制作方法
【專利摘要】本發明一些方面通過獲得樣品、在多個時間點照射樣品、在多個時間點測量來自樣品中的代謝活性標記物的透射光、以及由多個時間點處的透射光變化檢測代謝活性的存在或缺失從而提供了檢測樣品中的代謝活性的方法。本發明另一些方面通過提供其中具有反映樣品中的代謝活性的可檢測的標記物的樣品、由標記物產生放大信號、在多個時間點測量放大信號、以及由信號變化檢測代謝活性從而提供了檢測樣品中的代謝活性的方法。其他方面提供了檢測樣品中的代謝活性的系統。
【專利說明】代謝活性的快速檢測
[0001]關于聯邦政府資助的R&D的聲明
[0002]本發明的一部分在美國政府的支持下完成。由此，美國政府可以享有本發明的某些權利。
[0003]背景
_4] 相關申請的交叉引用
[0005]本申請要求2011年8月22日提交的美國臨時申請第61/526，160號的優先權權益，該臨時申請通過引用以其整體特別并入本文。
發明領域
[0006]用于檢測樣品中的代謝活性，尤其是通過檢測代謝活性而檢測和/或表征樣品中的病原體和毒素的方法和系統。
_7] 相關技術的描述
[0008]表現出感染(細菌的、病毒的或真菌的)癥狀的患者通常被給予抗微生物藥物。最近增長的耐藥的細菌性病原體(一些是目前無法醫治的)的發展使其更加重要，正確鑒定病原體并開出準確針對于該病原體的藥方是至關重要的。然而，利用目前的技術，鑒定引起傳染性疾病的病原體耗費較長的時間，通常為48-72小時。這種延遲通常需要憑經驗給予廣譜的抗菌藥物療法，這必然不是由實驗室關于病原體鑒定或其對具體療法敏感性的具體信息指導的。這種盲目的經驗療法可能會導致重要的繼發性并發癥，例如藥物反應、發展耐藥性以及進行不必要的診斷測試。正是出于這些考慮，已驅使大量的努力來開發更快速診斷和表征此類感染的工具。
[0009]在已建立的快速診斷方法中，基于聚合酶鏈式反應(“PCR”)的方法(其檢測核酸材料)作為潛在的快速診斷工具是開發最多的。然而，該方法是病原體特異性的，并且需要首先鑒定和開發病原體的分子靶。此外，這些基于PCR的方法并沒有提供關于病原體的抗菌藥物敏感性的任何信息，除非該信息在以前就已經被開發。有幾種其它記錄的方法用于開發關于病原體對特定藥物敏感性(或抗性)的信息。然而，這些方法需要預先增加之前獲得的臨床樣品，因此并未及時提供彳目息。
[0010]例如，U.S.3，772，154描述了用于細菌樣品的自動化抗生素敏感性分析的方法和裝置，其中將臨床樣品分成幾個等分試樣，并將其注入一個或多個含有不同抗生素的容器中，并且其中將所述等分試樣孵育幾個小時，然后將其殺死，通過不同方法來測定細菌計數。由于該方法依賴于計數細菌細胞，在可得到準確的敏感性信息之前，必須存在大量的細胞。這一要求使得該方法對于臨床樣品而言不現實，尤其是遇到低水平的病原體負荷時。
[0011]U.S.3，983，006描述了測定抗生素的最小抑菌濃度(“MIC”)的方法，其通過連續測量響應于抗生素不存在和存在時細菌懸液的細菌生長速率的光學性質變化來測定。U.S.4，132，599描述了無需分離細菌而測定受感染的尿液樣品中的細菌的抗菌藥物敏感性的方法。這些方法基于細菌ATP分析，并且需要消除非細菌ATP。
[0012]U.S.4，146，433描述了通過瓊脂稀釋法可獲得抑菌活性的方法。準備含有稀釋抗生素的瓊脂板，將測試細菌接種到瓊脂板并獲得MIC值。隨后，將滅活抗生素的酶液散布到平板噴布上，以使抗生素失活。進一步孵育之后，測定平板上沒有可見的生長出現的最小濃度，將其定義為最小殺菌濃度(“MBC”)。該方法是現今得到MIC和MBC值的標準。然而，為提供相關信息，該方法通常耗費超過24小時。
[0013]U.S.4，209，586描述了以下方法:監測生長期期間具有和不具有所測試的生長抑制劑時微生物培養物的氧化還原電勢變化，其中氧化還原電勢通常是正的且電勢變化的速率近似于線性。有效的生長抑制劑在不超過I小時之內產生可測量的氧化還原電勢變化降低至更小的負值。指示所測試試劑的生長抑制作用的敏感信號可由比較器獲得，具體通過存儲第一時間指示氧化還原電勢的放大信號，并將所存儲的信號連同在此后不超過I小時獲得的其它放大信號一起輸入比較器。
[0014]U.S.4，236，211描述了以下方法:開發了表格或方程式形式的在預先確定的抗生素幾種(如一種或兩種)濃度存在下不同微生物的生長與至少抑制這種樣品活性所必需的該抗生素的最小濃度之間的固定函數關系。對抗生素和常規類別的微生物的每一種預期組合建立這種關系，在預定時間或生長水平時測定生長程度，優選在“生長”或“不生長”極端條件處出現飽和之前。通過標準公認的定量技術來測定得到這些固定關系所使用的最小濃度。之后，可通過以下方法快速且準確地測定至少抑制任何指定致病性微生物的活性所必需的預先確定的抗生素的最小濃度，其中致病性微生物來自同一預先確定的常規類別的生物體:(1)在相同的預定時間之后，相同的少量(如，一種或兩種)預定濃度的抗生素存在下，測定所取樣的致病性生物體的生長；以及(2)利用所得到的測量結果和之前建立的固定函數關系來鑒定微生物和抗生素的特定組合所需的最小濃度。還公開了半自動和自動實施該方法的裝置。
[0015]U.S.4，252，897描述了用于細菌測試的方法和裝置，其中多針接種頭獲得區室化樣品盤中的細菌樣品，并將其轉移至區室化培養板中孵育。培養板包含推測的測試培養基和一些細菌對其敏感的抗生素。還包括指示劑材料，其隨著由細菌生長引起的pH變化而變色。該結果是彩色的幾何圖案，其被輸入計算機存儲器。還以同樣的方式接種另外的培養板，每個培養板含有不同的測試培養基和指示劑。將所有培養板孵育之后，將數據輸入存儲器，計算機設備將未知細菌的敏感性圖案與已知細菌已知的敏感性圖案進行比較，以確定對每一種未知細菌樣品最有可能的鑒定。
[0016]U.S.4，132，599描述了測定細菌敏感性的方法，其中將培養基中細菌懸液的等分試樣，抗微生物藥物和氚化胸腺嘧啶存放在聚乙烯管中，該管具有由細過濾器隔開的兩個區室。將沉淀劑(如三氯乙酸)放入聚乙烯管中以沉淀細菌。這之后，使用真空系統通過過濾器抽出液體，然后計數所過濾的細菌。與U.S.3，772，154—樣，該方法依賴于細菌細胞計數，其需要存在大量的細胞。
[0017]U.S.4，448，534描述了用于抗生素敏感性測試的裝置，其中通過光密度法測定了多等分盤中的細菌計數。該方法也需要存在大量的細菌細胞。U.S.4，604351描述了類似的裝置，但是其中將攝取標記的核苷酸用于測定不同化學藥劑存在下的細菌生長。該方法局限于攝取標記核苷酸的細菌細胞。
[0018]U.S.6，750，038描述了測定細菌對已知抑制細菌內特定酶途徑的抗菌藥物敏感性的設備。在這種情況下，抗性通過對應于抗性機制的特定酶的抑制或表達來表征。這種方法局限于僅具有特定抗性機制的細菌。U.S.6，861，230描述了用于細菌細胞生長的外部條件的腺苷酸激酶體外測試的試驗。
[0019]U.S.7，081，353描述了用于藥物敏感性測試的設備，所述藥物敏感性測試基于樣品中伴隨不同細菌和抗菌藥物濃度的氧氣消耗速率。通過用氧電極檢測溶氧濃度來測量藥物敏感性是眾所周知的，但是一般耗費較長的時間(幾天)。Machida等描述了改進方法，可將時間周期縮短至幾小時。但是即便如此，由于臨床樣品中存在的宿主細胞代謝的耗氧量損害了氧氣測量結果。因而，這些方法沒有一種能應用于直接從臨床樣品及時得到敏感性信息。
[0020]直接在臨床樣品中開發病原體鑒定和敏感性信息的困難可用拉曼散射法來說明。當從臨床樣品開始時，常規拉曼法為鑒定病原體需要較多的樣品制備時間(大約24小時)，以及額外的幾小時用于敏感性測試。拉曼法涉及照射感興趣的樣品(在這種情況下，含有臨床樣品和疑似病原體的樣品瓶)O 一些入射光以不同于入射光波長的波長非相干散射，散射光強度對波長的光譜成為病原體的信號。
[0021]然而，問題出現于可能是臨床相關的低濃度的病原體。例如，每毫升血液的單個集落形成單位(CFU/mL)將與人體中的“細菌血癥/真菌血癥”病癥一致。更常見的數目是10-100CFU/mL，在罕見情況下，數目可高達100，000-1，000，000CFU/mL。甚至在1，000, 000CFU/mL時，臨床樣品主要是其他成分。例如，全血中，紅血細胞和白血細胞都會超出細菌細胞數目。即使從血液中去除紅血細胞和白血細胞(例如通過離心)，病原體還是以固有血清蛋白質為主，其拉曼光譜與病原體的拉曼光譜類似。
[0022]具體地，大約10，000, 000CFU/mL時，血清樣品將具有與固有血清成分含量相當的病原體含量。100CFU/mL時，血清樣品具有的病原體含量小于固有血清成分100，000倍。
[0023]因而，臨床樣品的拉曼光譜以臨床樣品的固有成分為主。這是以前的方法為何要求在從病原體獲得有用的拉曼光譜之前，必須分離和培養病原體的根本原因。這種實施拉曼法的難度同樣適用于其他方法。
[0024]盡管有這些限制，仍然提出了用于病原體鑒定和敏感性測定的幾種基于拉曼的方法。在所有這些方法中，利用不同的機制來克服病原體臨床濃度低。
[0025]例如，U.S.5，866，430描述了檢測和鑒定化學和微生物分析物的方法。該方法包括四個基本步驟，其中第一步是試圖濃縮微生物細胞的生物濃縮器。U.S.5，573，927描述了以下方法:將原始培養的細菌大腸桿菌的第一組靶細胞的拉曼光譜與抗生素存在下培養的相同細胞的拉曼光譜進行比較，利用比較結果得到關于細菌對抗生素抗性的信息。在這種情況下，樣品由分離和培養的大腸桿菌細胞組成，因而該方法不能應用于臨床樣品，但是將差異光譜法用于開發其他敏感性。U.S.6，040，906描述了將共振拉曼光譜法用于鑒定生物物質(biomatter)的多種有機和無機成分的方法。之前，U.S.4，847，198已表明細菌純培養物的共振拉曼光譜顯示分類標示符。通過收集共振拉曼光譜作為激光激發頻率函數，這些發明人要求保護利用所討論物種的拉曼光譜的激發行為來分類鑒定的方法。U.S.6，379，920描述的方法將來自未受感染患者的臨床樣品的拉曼光譜用作參比，從未知臨床樣品的拉曼光譜中減去該參比。利用該方法，發明人聲稱特定細菌能夠快速鑒定而無需培養。然而，該方法不需要顯著的細菌細胞計數，這樣具有病原體的樣品的拉曼光譜不同于沒有病原體的樣品的拉曼光譜。[0026]U.S.7，256，875和U.S.7，262，840描述了通過拉曼成像檢測和鑒定致病性微生物的方法。雖然可將這些方法用于檢測正常透明樣品中的病原體(如市政供水中的隱孢子蟲，如U.S.7，428，045所述)，但是這些方法不能應用于其中預期存在具有類似拉曼信號的大量細胞的臨床樣品。
[0027]考慮到現有技術中的這些局限性，開發能快速鑒定和表征臨床樣品中存在的未知病原體對抗菌劑的敏感性而無需任何分離步驟的方法和系統是理想的。我們現在發現了檢測樣品中的代謝活性的方法和系統，特別是通過檢測代謝活性來檢測和/或表征樣品中的病原體和相關物質。
[0028]發明概述
[0029]一些實施方案是檢測樣品中的代謝活性的方法，其包括:獲得樣品；用基本上單色的光在多個時間點照射樣品；在多個時間點測量來自樣品中的代謝活性的化學標記物的拉曼散射光；以及由多個時間點處的拉曼散射光的變化檢測代謝活性。另一些實施方案是檢測樣品中的代謝活性的方法，其包括:提供其中具有可檢測的標記物的樣品，所述可檢測的標記物反映樣品中的代謝活性；由標記物產生放大信號；在多個時間點測量放大信號；以及由多個時間點處放大信號的變化檢測代謝活性。一些實施方案是檢測樣品中的代謝活性的系統，其包括:光源；控制器，用于用光源定期照射樣品，其中所述樣品含有響應于樣品中的代謝活性的化學標記物；檢測器，其被配置用于測定來自標記物的光信號；以及計算機，其被配置用于接收來自檢測器的光測量結果并確定標記物隨時間的變化，所述標記物隨時間的變化指示樣品中的代謝活性。
[0030]在一些實施方案中，拉曼散射光是共振增強的。在一些實施方案中，拉曼散射光的變化是累積的。在其他實施方案中，標記物是抗氧化劑、自由基清除劑、類胡蘿卜素和/或番茄紅素。在一些實施方案中，標記物是螯合元素的蛋白復合物和/或螯合鐵的蛋白復合物。在一些實施方案中，標記物由于代謝活性而增加。在其他實施方案中，標記物由于代謝活性而減少。
[0031]在一些實施方案中，代謝活性是產生自由基、產生類胡蘿卜素和/或螯合鐵。在一些實施方案中，代謝活性的存在指示存在諸如細菌、真菌、寄生蟲或病毒的病原體。在另一些實施方案中，代謝活性指示樣品中存在由病原體釋放的毒素或其他疾病調節物質。
[0032]在一些實施方案中，樣品含有抗病原性物質。抗病原性物質任選配置用于允許從所檢測的代謝活性進行病原體鑒定和/或分類。在一些實施方案中，樣品含有配置用于允許從代謝活性的存在進行病原體鑒定和/或分類的培養液。任選地，抗病原性物質選自抗生素的、抗真菌的和抗病毒的物質。所測量的代謝活性指示抗病原性物質有效或無效。
[0033]在一些實施方案中，樣品包括體液，如血液、腦脊液和/或尿液。任選地，樣品被培養并能夠包括所培養的細胞系。在一些實施方案中，標記物天然存在于樣品中。在另一些實施方案中，標記物在照射之前被添加到樣品中。在一些實施方案中，樣品在樣品中或樣品容器上包括校準的拉曼標記物。任選地，樣品或樣品容器被詢問校準的拉曼標記物的存在或強度。
[0034]在一些實施方案中，完成檢測不超過約6小時。在另一些實施方案中，完成檢測不超過約30分鐘。
[0035]在一些實施方案中，來自標記物的光信號來自斯托克斯-拉曼散射。在另一些實施方案中，來自標記物的光信號來自反斯托克斯-拉曼散射。
[0036]在一些實施方案中，樣品中的標記物的量隨時間累積指示樣品中的代謝活性。在另一些實施方案中，樣品中的標記物隨時間減少指示樣品中的代謝活性。在一些實施方案中，由標記物透射的光是共振增強的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1描述檢測樣品中的代謝活性的一種方法的流程圖。
[0038]圖2描述檢測樣品中的代謝活性的另一種方法的流程圖。
[0039]圖3描述檢測樣品中的代謝活性的一種實施方案的系統。
[0040]圖4描述利用螯合鐵作為代謝活性指示劑的檢測樣品中的代謝活性的方法的一種實施方案的簡圖。
[0041]圖5檢測樣品中的代謝活性的方法的一種實施方案獲得的代表性光譜。
[0042]圖6說明檢測樣品中的代謝活性的一種方法的歸一化峰強度對時間的圖。
[0043]圖7說明通過病原體蛋白質螯合鐵的簡圖。
[0044]圖8描述利 用番茄紅素的變化作為代謝活性指示劑檢測樣品中的代謝活性的方法的又一實施方案的簡圖。
[0045]圖9說明不同檢測方法信噪比的表。
[0046]圖10說明鐵-轉鐵蛋白激發曲線的圖。
[0047]圖11顯示細菌分類的拉曼光譜。
[0048]圖12說明細菌分類實驗中恒峰強度的數據圖。
[0049]圖13說明細菌分類實驗中峰強度變化的數據圖。
[0050]圖14含有MRSA的血液樣品的拉曼光譜覆蓋圖。
[0051]圖15說明不同病原體濃度的峰強度變化的圖。
[0052]圖16說明作為病原體濃度函數的生物標記物斜率的圖。
[0053]圖17說明利用一實施方案來檢測抗生素的MIC的圖。該圖說明進行測量來估算MIC。
[0054]圖18說明利用一實施方案來檢測抗生素的MIC的圖。該圖顯示通過一種特定方法可估算MIC。
[0055]圖19描述利用標記物來區分含有多種病原體的樣品的圖。
[0056]圖20說明利用一實施方案來檢測具有多種病原體的樣品的MIC的圖。
[0057]圖21表明由牛分枝桿菌(M.bovis)產生番爺紅素的圖。
[0058]圖22顯不由牛分枝桿菌產生番爺紅素的另一圖。
[0059]圖23表明由偶發分枝桿菌(M.fortuitum)產生番爺紅素的圖。
[0060]圖24顯示檢測樣品中的毒素的圖。
[0061]圖25顯示由于樣品中存在的毒素而隨時間可檢測的變化的另一圖。
[0062]發明的詳細描述
[0063]如本文所使用，縮寫詞定義如下:
[0064]ATP三磷酸腺苷
[0065]CBC 全血球計數[0066]CFU 集落形成單位
[0067]cnT1厘米倒數或波數
[0068]EDTA 乙二胺四乙酸
[0069]Fe-Tr 鐵-轉鐵蛋白
[0070]MBC 最小殺菌濃度
[0071]MIC 最小抑菌濃度
[0072]MDR 多藥物抗性 [0073]nm納米
[0074]PCR 聚合酶鏈式反應
[0075]apo-Tr 缺乏結合鐵的轉鐵蛋白
[0076]ROS 活性氧類
[0077]RNS活性氮類
[0078]UV紫外光
[0079]並直
[0080]本領域的需要通過監測樣品中響應于入侵病原體的代謝活性的變化的設備來解決。現有技術中的難點可歸結于試圖測定臨床樣品中病原體的濃度或生物負荷的一般方法。由于與臨床樣品中的固有成分相比，病原體的濃度低，很難測定。相比之下，所公開的某些實施方案測量響應于入侵病原體的化合物的變化，包括隨時間的累積的變化和包括名義上更小的基線水平的變化。因而，這些實施方案能夠表征臨床樣品中存在的低水平的病原體。
[0081]本發明的另一實施方案測量了臨床樣品中易于檢測的化合物的形成。在所有情況下(標記物的產生、消耗或修飾)，測量的靈敏度可通過合理使用固有放大標記物產生的信號的測量技術來提高。
[0082]一些實施方案開發利用鐵螯合過程。每種入侵病原體都需要鐵來生長，而脊椎動物宿主在專門的含鐵蛋白如血液中存在的鐵-轉鐵蛋白復合物中螯合鐵。因此，病原體必須從宿主蛋白質中提取鐵。不同的病原體采用不同的機制從宿主蛋白質中螯合鐵。如果血液(對于病原體而言，除了缺乏游離鐵之外，其恰巧是在各方面通常有利的生長介質)中存在活的病原體，轉鐵蛋白中的鐵含量被快速耗減。相比之下，當血液樣品中不存在活的病原體時，轉鐵蛋白中的鐵含量保持不變。
[0083]鐵-轉鐵蛋白(Fe-Tr)復合物中存在的鐵產生強的拉曼譜帶。這些拉曼譜帶可作為轉鐵蛋白中鐵含量的標記物，用可商購的拉曼光譜儀來監測。例如，Fe-Tr譜帶在1510，1280，1160和1605?11_1處具有強的拉曼峰。鐵-轉鐵蛋白(Fe-Tr)復合物中存在的鐵還在以大約470nm為中心處產生光吸收峰。該光吸收峰可作為轉鐵蛋白中鐵含量的標記物，用可商購的顏色傳感器來監測。
[0084]因此，一種實施方案是可商購的拉曼光譜儀監測臨床樣品中1510cm—1處的拉曼峰作為時間的函數。除了最低可利用的游離鐵之外，臨床樣品需要進行一些處理以將其轉化成各方面合適的生長介質，并且唯一可利用的鐵來源是鐵-蛋白復合物。對于血液樣品，這通過離心步驟或利用未凝結血液的重力分離含有病原體和鐵-轉鐵蛋白復合物的血清或血漿來完成。對于尿液樣品，這可通過將少量尿液樣品添加至更大量的貯存血清中來完成。如果存在活的病原體，Fe-Tr的鐵含量將被快速耗減。在另一些實施方案中，抗菌藥物敏感性通過添加抗菌藥物重復測量來表征。
[0085]在另一實施方案中，監測番茄紅素產生的共振拉曼峰。當使用532nm波長的激光時，番爺紅素在 1510 至 1520cm 1 (即 1516cm O，1150 至 1160cm 1 (即 1156cm:)以及 1005cm 1處具有共振增強的拉曼峰。此外，番茄紅素是有效的自由基清除劑，并且自由基通常由細菌和真菌細胞在正常代謝過程中產生以及由人細胞產生。這樣的自由基產生是在細胞呼吸過程中的化學滲透和形成ATP的結果。因此，血清樣品中存在活的積極復制的細菌和真菌細胞，將導致自由基產生(這與來自晚期分化的人細胞的自由基相比被放大更多)，其反過來將由血清番茄紅素清除。由番茄紅素清除這些自由基將改變番茄紅素分子的光學性質，包括其共振拉曼光學性質。可監測這些光學性質上的變化，如番茄紅素峰強度的降低，以檢測病原體活力。
[0086]在另一實施方案中，將選擇性培養基添加到臨床樣品中時，監測病原體活力(通過以上所列的任一方法)。添加利于病原體生長的選擇性培養基將導致活力信號增強，這可用于病原體分類。添加阻止某些病原體生長的選擇性培養基將導致活力信號降低，這也可用于鑒定病原體。
[0087]在又一實施方案中，在外來物質的疑似存在下，監測人細胞產生的自由基(通過標記物，如以上所述的番茄紅素標記物)。如果存在某些外來物質如病原體，人細胞將產生自由基，其可由拉曼儀檢測。
[0088]定義
[0089]出于本論述的目的，拉曼散射是將樣品上固定波長的入射光通過由于吸收入射光子的非相干處理而以其它波長散射的任何方法，具體通過將結構由初始較低(基態)激發至較高振動水平，隨后松弛下來至另一不同的基態水平。
[0090]出于本論述的目的，拉曼譜帶是對應于來自分子內特定化學鍵的拉曼散射的光譜分布(強度對頻率)。可理解的是，每一種化學鍵以不同頻率顯示拉曼譜帶，并且在某些情況下，這些拉曼譜帶可重疊，使它們很難區分。另外，可理解的是，化學鍵的拉曼截面是定義相應拉曼峰強度的常數。此外，可理解的是，該截面可隨波長和/或隨共振變化。在共振拉曼增強期間發生這樣的共振變化。
[0091]出于本論述的目的，可理解的是，樣品的拉曼光譜是所有拉曼譜帶的總和，拉曼光譜中單獨的拉曼譜帶的相對高度與相應化學鍵的相對豐度乘以其拉曼截面成比例。
[0092]出于本論述的目的，吸收是其中入射光被感興趣的樣品吸收，并且入射光子可通過任意數量的機制與結構相互作用的任何方法，所述機制包括激發外層電子(相當于吸收UV或可見輻射)，或激發分子成更高振動/轉動能態。
[0093]共振拉曼散射法應當被理解為特殊類型的拉曼散射過程，其包括將分子從初始基態激發成對應于真正振動態的真正激發態。因而，出于本論述的目的，共振拉曼增強(或共振拉曼)是通過強的光吸收增強特定譜帶的拉曼截面的任何方法。
[0094]出于本論述的目的，鐵載體(siderophore)是由病原體釋放的蛋白質,其從宿主鐵-蛋白質復合物中奪取鐵并將鐵轉運至病原體。
[0095]出于本論述的目的，鐵螯合是入侵病原體從宿主的鐵-蛋白質復合物中獲取鐵的過程。反過來，鐵獲取涉及宿主通過形成蛋白質-鐵復合物而減少自由鐵的量的過程。[0096]出于本論述的目的，可理解的是，鐵載體介導的鐵螯合是可被病原體利用從宿主鐵-蛋白質復合物中螯合鐵的幾種可能的機制中的一種。此外，可理解的是，無論哪種機制，最終結果是從宿主中的鐵-蛋白質復合物中奪取鐵。
[0097]出于本論述的目的，可理解的是，可螯合宿主中的鐵的不同宿主-蛋白質復合物包括轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、亞鐵血紅素和鐵蛋白。
[0098]出于本論述的目的，可理解的是，鐵-蛋白質復合物能夠以包括鐵的形式或不包括鐵的形式存在。將這兩種形式描述為含鐵和缺乏結合鐵(apo)_狀態。以轉鐵蛋白為例，可將這兩種形式描述為Fe-Tr和apo-Tr。
[0099]出于本論述的目的，可理解的是，類胡蘿卜素是清除自由基的化合物，番茄紅素是非常有效的自由基清除劑。
[0100]出于本論述的目的，夕卜分枝菌素(exomycobactin)是由致病性分枝桿菌利用的細胞外鐵載體(有時被稱為羧基分枝菌素)，和細胞內的分枝菌素鐵載體一起來獲取鐵。
[0101]出于本論述的目的，最小抑菌濃度(MIC)定義為抗菌藥物抑制病原體生長的最小濃度，其中病原體具有標準濃度(通常限定為100，000CFU/mL)。
[0102]出于本論述的目的，可理解的是，任何測量系統中的噪音與所測量的量的平方根成比例。
[0103]檢測方法圖解
[0104]圖1和圖2示出說明檢測樣品中的代謝活性的方法的流程圖實例。參見圖1，方法由方框I獲得樣品開始。本領域已知獲得樣品的多種方法。在一些實施方案中，樣品以準備好分析的方式提供。在另一些實施方案中，樣品在分析之前需要額外準備。在方框I提供樣品之后，方法繼續至方框2，其中在多個時間點照射樣品。然后方法繼續至方框3，其中在多個時間點測量來自樣品中的標記物的拉曼散射光。然后方法繼續至方框4，其中由多個時間點處的透射光變化來檢測代謝活性。
[0105]參見圖2，方法由方框5獲得具有可檢測標記物的樣品開始。這樣的標記物直接或間接反映代謝活性。本領域已知獲得樣品的多種方法。在一些實施方案中，樣品以準備好分析的方式提供。在另一些實施方案中，樣品在分析之前需要額外準備。在方框5提供樣品之后，方法繼續至方框6，其中由標記物產生放大信號。放大的一個非限制性實例是共振拉曼增強。然后方法繼續至方框7，其中測量放大信號。這樣的測量可在一個或更多時間點進行，包括多個時間點。然后方法繼續至方框8，其中由一個或更多時間點包括多個時間點處的放大信號的變化來檢測代謝活性。
_6] 檢測系統圖解
[0107]圖3顯示檢測樣品中的代謝活性的系統實例。參見圖3，系統具有控制器301，光源302，樣品303，檢測器304，以及計算機305。雖然圖3以不同的方框代表這些系統組件，應當理解的是，在一些實施方案中，一種或多種系統組件可作為多組件起作用。例如，計算機和控制器可以是同一組件。
[0108]參見圖3，控制器指導光源照射樣品。在一些實施方案中，控制器允許定期照射。在另一些實施方案中，控制器允許連續照射。樣品303含有響應于樣品中的代謝活性的標記物。樣品303中的標記物將信號如光傳輸至檢測器304。檢測器304被配置用于測量來自標記物的信號。計算機305被配置用于接收來自檢測器的測量結果并確定標記物隨時間的變化。這樣的變化指示樣品中的代謝活性。
[0109]鐵螯合方法的描述
[0110]如圖4所不,一實施方案包括米集臨床樣品11，之后樣品制備12。樣品制備12將樣品轉化為分析物14。監測分析物14的代謝活性，在該實施方案中，其表示為鐵隨時間的螯合(15)。利用拉曼光譜儀來測定代謝活性13。
[0111]如前所述，樣品制備12將樣品轉化為測試的分析物。除了限制利用的自由鐵之夕卜，測試的分析物包含病原體生長的全部必需元素。將全部鐵螯合至專門的鐵-蛋白質復合物中，并且病原體必須從該復合物中螯合鐵。
[0112]在圖4中，除了不可利用的自由鐵之外，樣品制備步驟12包括將臨床樣品轉化成有利于病原體代謝的樣品，并且全部鐵被螯合至宿主蛋白(如轉鐵蛋白)。如果初始臨床樣品是血液，那么樣品制備步驟任選包括重力沉降和/或離心血液樣品以分離出血清。血清將包括血液中存在的任何病原體，以及支持病原體代謝所必需的除自由鐵之外的全部生長介質。如果臨床樣品是尿液，那么樣品制備步驟任選包括將少量尿液樣品添加至適當制備的貯存血清中。
[0113]病原體濃度可由病原體螯合鐵的速率得到。在更高的病原體濃度時,軌跡Fe-Tr峰高對時間的斜率更大。因而，在一些實施方案中，鐵螯合的速率用一組不同病原體濃度的已知標準樣品來預先表征，并且在一些實施方案中，臨床樣品的鐵螯合速率與這些速率相匹配。
[0114]如本文進一步所述，抗菌藥物敏感性可通過度量最小抑菌濃度(“MIC”)來表征。由同一臨床樣品制備一系列漸增抗菌藥物濃度的分析物。在一些實施方案中，將漸增濃度的抗病原性物質添加至樣品中。監測這些樣品的代謝活性提供關于抗病原性物質有效或無效的信息。此外，監測這些樣品提供關于有效抗病原性物質的MIC的信息。作為這種實施方案的一個非限制性實例，鐵螯合標記物的軌跡不隨時間變化的分析是臨床樣品中病原體濃度的最小抑菌濃度。
[0115]如上所述，如果通過拉曼光譜儀監測鐵螯合過程，那么測試涉及隨時間收集一系列拉曼光譜。非鐵標記物的這種收集的假定描述顯示在圖5中。單獨的拉曼光譜包括一個或多個峰如22、22和23，在鐵螯合的情況下，這些峰是由Fe-Tr (21和22)或由apo-Tr和/或血清脂蛋白(23)產生。隨時間監測Fe-Tr峰中的一個(例如22)的峰高，如圖5所示。如果存在活的病原體并且螯合鐵以提供Fe-Tr，那么鐵-轉鐵蛋白峰隨時間降低，如圖6中的軌跡33和34所示。另一方面，如果不存在活的病原體，或者如果分析物中存在活的病原體以及有效的抗菌藥物，那么峰高幾乎不隨時間變化。圖6中描繪的四條軌跡代表來自未受感染患者的血清(軌跡31),具有高劑量耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) (MRSA)的血清(軌跡33)，具有MRSA和有效劑量的萬古霉素的血清(軌跡32)，以及具有MRSA和無效劑量的氨芐青霉素的血清(軌跡34)。
[0116]在一些實施方案中，信號質量作為時間的函數增強。例如，由于病原體代謝和消耗鐵，鐵水平穩步耗減。雖然由于病原體濃度低，鐵耗減速率可能較小，但是這種耗減可隨時間積累達到顯著水平。因而，在約20-30分鐘的合理時間間隔之內，能夠表征非常低濃度的病原體。
[0117]通過鐵載體鑒定病原體[0118]可由上述的基本構想得到幾個其他實施方案。標記物可由圖7中的方案總結。基線標記物是鐵-蛋白質復合物(圖7描述了鐵-轉鐵蛋白質復合物，但是還可使用其他蛋白)，并且由圖7中的方案I描述。如果存在活的病原體并且從鐵-蛋白質復合物中螯合鐵，那么鐵-蛋白質復合物的相應水平降低。該降低通過多種分析方法來監測。在一些實施方案中，分析方法是光譜學的，如拉曼光譜法。在另一些實施方案中，分析方法是光學的。
[0119]在某些情況下，活的病原體不能從鐵-蛋白質復合物中螯合鐵。這樣的一個具體實例是致病性分枝桿菌的活病原體。在這種情況下，可在診斷臨床樣品中存在(或不存在)致病性分枝桿菌的裝置中利用標記物。所修飾的標記物由方案2描述。為了從宿主蛋白質復合物中獲取鐵，致病性分枝桿菌需要必須協同工作的兩種鐵載體蛋白。這兩種鐵載體包括細胞內分枝菌素鐵載體和細胞外外分枝菌素鐵載體。其中，致病性分枝桿菌可根據需要產生分枝菌素鐵載體，但是其只在經歷非常長時間的鐵不足的情況下才產生外分枝菌素鐵載體。
[0120]因此，當體液如血清中存在致病性分枝桿菌時，通常不能從鐵-蛋白質復合物中螯合鐵，因而不能生長。血清被認為針對致病性分枝桿菌是抑菌的。然而，如果將外分枝菌素添加到分析樣品中，那么將滿足鐵螯合的所有條件，致病性分枝桿菌開始螯合鐵。因此，一些實施方案涉及將促進病原體代謝活性的物質如所述的外分枝菌素鐵載體添加至樣品中，將所得到的代謝活性(即鐵螯合速率)與任選的對照分析(未添加外分枝菌素的分析物)中的代謝活性(即鐵螯合速率)進行比較。如果測試的分析物(添加外分枝菌素的分析物)中的鐵螯合速率大于對照分析(未添加外分枝菌素的分析物)中的鐵螯合速率，那么其是存在致病性分枝桿菌的陽性指示。在一些實施方案中，與對照分析的比較是任選的。在另一些實施方案中，將促進病原體代謝活性的物質添加至樣品中，可用于鑒定和/或分類樣品中的病原體。
[0121]通過自由基和質子的產生檢測病原體
[0122]在一些實施方案中，病原體的存在通過病原體相關的代謝活性來確定，而病原體相關的代謝活性通過與標記物氧化還原活性相關的共振拉曼光譜的變化確定。測試的分析物中病原體的存在導致產生自由基和質子。根據Mitchell假說(參見Mitchell P.etal., Biochemical Journal1961;81:24;MitchelI P., Naturel961Jul;191:144-148),自由基/質子的產生是保證細胞代謝的結果，這在微生物中得到了驗證(Mitchell P.，Fed.Proc.1967Sep ;26(5):1370 - 1379)。該“假說”現在已被證明且被公認為是微生物細胞產生能量的機制。因而，響應于自由基和/或質子的產生的標記物對于檢測代謝活性和病原體存在是有用的。這樣的標記物包括但不限于，抗氧化劑、自由基清除劑、ROS和RNS敏感性染料，以及質子敏感性化學物質如酸堿指示。此外，類胡蘿卜素包括番茄紅素(其是人血清/血漿的成分)是非常有效的自由基清除劑——被認為是人血漿中存在的最有效的自由基清除劑(參見 Wassermann A., Molecular Physicsl959Apr; 2 (2): 226 -228; Content and isomeric ratio of lycopene in food and human bloodplasmal0.1016/S0308-8146(96)00177_X:Food Chemistry;Ermakov IV et al.，J.Biomed.0pt.2005; 10(6):064028 - 064028)。接觸由細菌/真菌代謝產生的自由基和質子時，生物體中的番茄紅素被質子化形成碳正離子并最終反應產生β-胡蘿卜素和視黃醛。
[0123]番茄紅素具有的光吸收譜包括集中于約532nm處的可重現的最大吸收譜。質子化(伴隨著其他化學反應)時，番茄紅素的光吸收譜紅移，并且約532nm處的吸收峰消失。當采用約532nm波長的入射激光收集拉曼光譜時，相應的番茄紅素拉曼光譜共振增強。相比之下，當番茄紅素被質子化時，約532nm處的最大吸收紅移，共振拉曼增強也減少。這些性質導致以下關于人血清或血漿的光學性質的觀測結果:(I)采用約532nm波長的激光收集拉曼光譜時，人血清(或血漿)的拉曼光譜主要是番茄紅素的拉曼光譜(主要峰在1516CHT1和156CHT1處)，即使番茄紅素名義上并不是人血清的主要成分。(2)如果存在活的病原體，并且如果那些病原體正在經歷代謝活性，那么拉曼光譜中的番茄紅素峰的強度隨時間降低。
[0124]圖8描述了這樣的實施方案。參見圖8，獲得臨床樣品16并任選地進行樣品制備
17,以提供進行分析19的樣品。分析19包括用拉曼光譜儀18照射分析的樣品，以及檢測番茄紅素的量隨時間的變化，如框20所示。這樣的變化指示代謝活性，由通過來自分析的信號測定。代謝活性反過來是存在病原體的指示。在一實施方案中，病原體的存在通過它們在代謝期間產生的自由基來檢測。雖然所有活的生物體的代謝導致自由基集中于細胞壁，但是細菌和真菌病原體具有單一的細胞壁。因而，真菌和細菌病原體中的代謝產生在它們的細胞壁處集中的自由基，其中這些自由基可由血清中存在的自由基清除劑清除。一些自由基清除劑具有共振增強的拉曼光譜。例如，如上所述，番茄紅素是與β_胡蘿卜素類似的紅色類胡蘿卜素；其在532nm處具有強的吸收光譜。因而，當使用532nm激光時，番茄紅素具有共振增強的拉曼光譜，其相比血清其他固有成分占主導地位。此外，番茄紅素是非常有效的自由基清除劑，并且與由病原體代謝產生的自由基反應。所得到的番茄紅素結構變化可通過拉曼光譜法，利用約532nm波長的激光容易地監測。本領域技術人員將認識到，該基本方法可擴展至其他類似的方法。例如，當利用具有480-510nm的稍微更低的激光波長的拉曼散射裝置時，可將該基本原理應用于檢測β_胡蘿卜素(其由一些病原體在其代謝過程中產生)。本領域技術人員還將認識到，可將激光的組合用于開發病原體的生化特征譜。例如，可以使用具有488nm激光波長的拉曼儀表征β -胡蘿卜素的產生，以及將其與具有532nm激光波長的拉曼儀相結合表征番茄紅素-自由基清除。所得到的生化特征譜表征代謝循環期間β_胡蘿卜素的產生，并且可用于鑒定病原體。
[0125]在一些實施方案中，標記物消耗的速率與樣品中病原體的量成比例。例如，在一些實施方案中，番茄紅素峰強度隨時間降低的速率與樣品中存在的病原體的量成比例，并且那些病原體以該速率代謝。因此，在一些實施方案中，將標記物消耗的速率用于測定樣品中的病原體濃度。
[0126]參見圖5和圖6，如果通過拉曼光譜法監測番茄紅素消耗作為代謝活性的指示劑，那么測試涉及隨時間收集一系列拉曼光譜。這種收集的代表性描述顯示于圖5中。獨立的拉曼光譜包括一個或多個峰，如22、22和23，對于番茄紅素消耗的情況，這些峰歸因于樣品中的番茄紅素或其他成分。如果存在活的病原體，番茄紅素濃度將減小且番茄紅素峰將隨時間降低，如圖6中的軌跡33和34所示。另一方面，如果不存在活的病原體，或者分析中存在活的病原體以及有效的抗菌藥物，那么峰高幾乎不隨時間變化，如圖6所示。如前所述，圖6中的四條軌跡代表來自未受感染患者的血清(軌跡31)，具有高劑量耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(“MRSA”)的血清(軌跡33)，具有MRSA和有效劑量的萬古霉素的血清(軌跡32)，以及具有MRSA和無效劑量的氨芐青霉素的血清(軌跡34)。
[0127]此外，某些病原體產生類胡蘿卜素作為代謝活性的標記。在這種情況下，由于樣品中標記物的濃度隨病原體代謝活性而增加，利用類胡蘿卜素作為標記物(即番茄紅素)表明存在病原體的軌跡隨時間將具有正斜率。然而，表明不存在病原體的軌跡仍將相對保持恒定，因為峰強度幾乎保持不變。因而，是代表樣品中的代謝活性的標記物峰強度隨時間的變化指示代謝活性和病原體的存在。這樣的變化可以是標記物消耗或標記物產生，以下將更詳細地論述。
[0128]通過產生的標記物檢測代謝活性
[0129]在一些實施方案中，樣品中的代謝活性通過產生的標記物來檢測。樣品中標記物產生的實例包括元素-致病性蛋白質復合物(即，Fe-Tr)，減少的抗氧化劑，減少的自由基清除劑，減少的類胡蘿卜素，或甚至減少的番茄紅素。因而，樣品中的代謝活性可由標記物量的減少(如標記物的消耗)來檢測，或者代謝活性可由標記物量的增加來檢測。作為這些概念的非限制性實例，番茄紅素可以是標記物，并且其在樣品中的消耗指示代謝活性。相反地，作為抗氧化劑起作用的番茄紅素產物可以是標記物，并且其產生將指示代謝活性。
[0130]在一些實施方案中,病原體產生標記物。例如，一些病原體產生類胡蘿卜素，特別是番茄紅素，并且可以檢測這種產生來指示樣品中的代謝活性、樣品中病原體的存在，甚至有利于樣品中的病原體分類。實際上，類胡蘿卜素和番茄紅素的產生在幾種分枝桿菌中已有記錄，包括但不限于草分枝桿菌(M.phlei),堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)和金色分枝桿菌(Eaurum)。此外，本文所述的某些實施方案已用于檢測牛分枝桿菌(參見圖19和圖20)和偶發分枝桿菌(參見圖21)中的番爺紅素產生。此外，已知海分枝桿菌(M.marinum)和其它分枝桿菌種類中的胡蘿卜形成作用，并且被認為是光依賴性的。最后，已知結核分枝桿菌(M.tb)介導類胡蘿卜素加氧酶；并且不同的分枝桿菌種類可基于它們產生的類胡蘿
卜素分型。因而，在一些實施方案中，由樣品中類胡蘿卜素的產生來檢測病原體，特別是分枝桿菌。在另一些實施方案中，由樣品中番茄紅素的產生來檢測病原體，特別是分枝桿菌。
[0131]抗菌藥物敏感性和/或通過抗菌藥物敏感性鑒定病原體
[0132]在一些實施方案中，測定了病原體對抗病原性物質的敏感性。例如，測定了特定細菌對特定抗菌和/或抗菌混合物的敏感性。還易于測定特定真菌和病毒關于抗真菌和抗病毒的類似敏感性。此外，在一些實施方案中，樣品中的病原體是未知的，測定的敏感性不依賴于知曉病原體身份。因而，在一些實施方案中，易于測定特定治療可能的有效性或無效性。此外，一些實施方案提供了快速測定最小抑菌濃度(MIC)度量值。
[0133]MIC是藥物在體內有效抑制靶生物體生長的最小濃度。采用標準MIC測試，測試要求所研究的生物體純生長，并且臨床醫生通常在樣品采集之后至少48-72小時可得到。然而，在一些實施方案中，由于諸如番茄紅素的標記物反映代謝活性，并且當有效的抗病原性藥物作用于病原體時預期代謝速率降低，能夠比標準測試時間更快地表征MIC度量值。在一些實施方案中，MIC度量值在測試約30分鐘內產生。
[0134]一些實施方案測定了樣品中特定抗病原性物質的有效/無效性，所述樣品感染了未知(病原體)和/或一種或多種已知病原體。在另一些實施方案中，測定了樣品中多于一種的抗病原性物質的組合物的有效/無效性，所述樣品具有未知病原體和/或一種或多種已知病原體。
[0135]檢測樣品中的毒素
[0136]毒素對哺乳動物細胞系的一種影響是誘導代謝應激。由于代謝應激而產生自由基，因而哺乳動物細胞在接觸毒素時應當產生自由基。類胡蘿卜素，特別是番茄紅素，是有效的自由基清除劑。因而，哺乳動物細胞接觸毒素應當導致番茄紅素濃度可測量的變化。這樣的變化可利用本文所述的不同方法檢測。
[0137]在一些實施方案中，將標記物用于檢測樣品中化學或生物毒素的存在，所述樣品如血液、尿液或其他臨床樣品。其他臨床樣品包括但不限于，為測試物質以確定其是否有毒和/或毒素濃度而特別制備的樣品。在一些實施方案中，標記物是抗氧化劑、自由基清除齊U、類胡蘿卜素和/或番茄紅素。
[0138]以血液樣品為例，化學或生物毒素是小分子或細胞，它在常規處理方法如離心或重力沉降下將集中于血清中。將哺乳動物細胞與血清或其部分相混合以提供樣品。樣品中可任選包括營養液。如果樣品中存在化學或生物毒素，其將誘導哺乳動物細胞產生自由基。作為對自由基的響應，標記物將經歷可測量的變化并提供樣品中的毒素檢測。
[0139]在另一些實施方案中，標記物是番茄紅素，并且使用人細胞如HL60細胞。如果樣品中存在對人細胞有毒的物質，人細胞將產生自由基。由番茄紅素標記物清除自由基將導致番茄紅素標記物可測量的變化或產生代表變化的信號。在一些實施方案中，用拉曼儀檢測所測量的變化。
[0140]在一些實施方案中，測試一種或多種物質來確定它們對人細胞是否有毒。事實上，可將這樣的物質與人細胞連同任選的營養液相混合，以及可以檢測物質對人細胞的影響。因而，物質的毒性(或樣品中存在的毒素)通過自由基的產生或對自由基敏感的標記物變化來檢測。在一些實施方案中，測試樣品存在一種或多種細菌毒素、真菌毒素和/或化學物質(即有機、無機和有機金屬化合物，包括合成這樣的化合物中使用的溶劑和試劑)。在另一些實施方案中，一種或多種物質如化學物質(即有機和無機化合物，包括合成化合物所使用的溶劑和試劑)包括于樣品中以確定物質是否有毒。在一些實施方案中，測試不同濃度的物質來確定可能的毒性閾值。例如，殺蟲劑、藥物、藥物成分、活性藥物成分、載體、填充齊U、合成中間體、以及藥物中鑒定的雜質代表物質，其毒性或缺少毒性是特別關注的。
[0141]在一些實施方案中，所測定的變化和/或信號隨時間積累，并且能夠檢測非常低的毒性水平。在一些實施方案中，檢測限是I μ M、5 μ M、10 μ M、20 μ M、30 μ Μ、40 μ Μ、50 μ Μ、60 μ Μ、70 μ Μ、80 μ Μ、90 μ M和/或100 μ Μ，和/或由前述任意兩個數值限定的范圍，和/或大約前述任意數值。在另一些實施方案中，檢測限是約4μΜ。在另一些實施方案中，檢測限小于 1μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ、30μΜ、40μΜ、50μΜ、60μΜ、70μΜ、80μΜ、90μΜ 和 / 或100 μ Μ，和/或小于由前述任意兩個數值限定的范圍，和/或大約前述任意數值。
[0142]提高靈敏度和分辨率的測暈
[0143]從測量系統的角度而言，噪音與所測量的量的平方根成比例。以前的抗菌劑敏感性測試已經測量了與樣品中存在的病原體的量成正比的變量，這種方法引起較大的測量誤差。例如，U.S.4，448，534描述了用于抗生素敏感性測試的裝置，其中在多等分試樣盤中的細菌計數通過光密度法來測定。由于基線測量涉及大量的病原性細胞，測量中的誤差與病原性細胞數量的平方根成比例，只有當抗菌藥物減少大量細胞的活力時，才能識別抗菌藥物的作用。該方法導致測試需要大量時間。
[0144]如圖9所示，大致上任何測量系統中的噪音與所測定噪音的平方根成比例。方案51和52顯示有或無背景值B時測量信號S的測量系統的信噪比。方案53總結了以前測量抗生素敏感性的方法，其中N代表與細菌細胞計數成比例的變量，并且△1<是該變量中的變化。在這種情況下，所測定的量是Ν± ΛΝ，并且測量中的噪音變成Ν± ΛΝ的平方根。因而，僅當△1<變得可與N相比時，所測定的信號才高于噪音閾值。這一要求通常轉化成從臨床樣品分離細菌細胞，這樣20分鐘的倍增時間將形成足夠強的信號。可選擇地，如果該設備直接操作臨床樣品，那么所述方法必須等待數個倍增時間，以使細菌細胞計數超過固有的臨床樣品成分計數。
[0145]相比之下，本文所公開的實施方案測定了宿主-病原體相互作用的存在(存在活的病原體時)或者缺乏(不存在活的病原體，或其活性由有效的抗病原性物質如抗菌劑抑制時)。由于在一些實施方案中的基線測量缺乏相互作用，測量靈敏度更大，即使測量所需時間很少時也是如此。一般而言，某些實施方案測定與病原體存在相關的稀缺資源(即，鐵或番茄紅素)。該益處可通過圖9中的方案54描述。信號是Ask，其是在稀缺資源水平的變化。在相對較小的背景下測量該信號(2*ASK是圖9中引用的例子，其可以是不大于Ask很多的任何其它數值)。因而，在一些實施方案中，噪音與Ask的平方根成比例。
[0146]在不同程度上，所有以前的抗菌藥物敏感性測試方法受描述于U.S.4，448，534中的這種固有缺陷方法影響。例如U.S.6，379，920描述了將來自未受感染患者的臨床樣品的拉曼光譜作為從未知臨床樣品的拉曼光譜中減去的參比的方法。使用該方法，發明人聲稱可以很快鑒定特定細菌而無需培養。然而，基線測量的是未知臨床樣品的拉曼光譜，并且含有臨床樣品的所有固有成分。此外，這些固有成分的拉曼譜帶與細菌病原體的拉曼譜帶重疊；因而在可進行顯著差分測量之前，細菌細胞計數必須非常大。[0147]U.S.3，983，006描述了測定抗生素的最小抑菌濃度(MIC)的方法，其通過缺少或存在抗生素時連續測量響應于細菌懸液的細菌生長速率的光學性質變化來測定。正如U.S.4，448，534，該方法受與大量病原性細胞測量相關的較大測量誤差影響，因此在進行有效測量之前，裝置需要較大的時標讓抗菌劑殺死大量細菌細胞。
[0148]由于拉曼放大的增強
[0149]一些實施方案利用不同的共振處理來放大所測量的信號。該特征用圖10中示意的圖來說明。具體地，Fe-Tr與Tr之間存在重要的光學差異。例如，Fe-Tr具有集中于485nm波長處的寬的光吸收峰。由于該光吸收峰，當拉曼激光波長位于該光吸收帶之內時，不同的Fe-Tr拉曼譜帶顯示強烈的共振拉曼增強。圖10顯示吸收光譜61，1608、1506、1281和1174cm—1處的4個Fe-Tr峰的拉曼截面(分別為62，63，64和65)與波長之間的關系。圖10顯示如果激光波長位于一個或多個Fe-Tr峰被共振放大的值，那么所得到的拉曼光譜主要是Fe-Tr光譜。此外，共振拉曼增強不局限于以上所述的Fe-Tr體系，而是其他標記物也存在放大。例如，共振拉曼增強可用于諸如抗氧化劑、自由基清除劑和/或類胡蘿卜素(即，β_胡蘿卜素和番茄紅素)的標記物。實際上，番茄紅素的拉曼信號通過利用532nm光而被共振增強。這種共振增強可達到約10倍至約1000倍。在一些實施方案中，共振增強可達到約 10 倍，50 倍，100 倍，200 倍，300 倍，400 倍，500 倍，600 倍，700 倍，800 倍，900 倍，和 /或1000倍，和/或由前述任意兩個數值限定的范圍，和/或大約前述任意數值。因而，共振拉曼增強允許測試臨床樣品而無需細菌的任何分離或生長。在一些實施方案中，使用共振拉曼放大所測量的信號。在另一些實施方案中，使用放大而無需分離樣品中的病原體。在一些實施方案中，使用放大而無需增加病原體計數時間。在另一些實施方案中，使用放大而無需在樣品中濃縮病原體。
[0150]在一些實施方案中，標記物隨時間“積分”，以致于所測量信號的變化是累積的。然而，一些標記物是“差分的”。“積分”標記物的一個實例是番茄紅素，而熒光生物標記物是“差分”標記物的一個實例。為理解區別，考慮用番茄紅素拉曼和熒光生物標記物同時研究少量細菌細胞。假定測量期間細胞的數量并未明顯變化，熒光標記物的輸出量與該細胞群的代謝速率成比例，如果條件未變化，其可能是常數。然而，相比之下，番茄紅素標記物的輸出量與總的代謝活性成比例，其是代謝速率的時間積分；因而其隨時間穩步變化。因此，經過足夠長的時間之后，番茄紅素標記物將具有顯著區別于初始值的值，其可以在所測量的噪音上相對容易地讀出。
[0151]利用選擇性培養基進行病原體分類
[0152]在一些實施方案中，樣品中存在抗病原性物質。抗病原性物質的一個實例是選擇性培養基或培養液。在一些實施方案中，將選擇性培養基用于鑒定樣品中的病原體。圖11，圖12和圖13進一步說明了利用選擇性培養基的鑒定。圖11顯示用107cfu/mL金黃色葡萄球菌接種的血清樣品在不同時間點處的拉曼光譜。未添加任何培養液，作為時間函數的峰高并未變化。因而，在該方面，未添加培養液的受感染樣品的行為幾乎與未受感染樣品相同。圖12示出來自未受感染的發熱患者的血清樣品稀釋于80%培養液的時間曲線。兩條軌跡描述了 1516和1156CHT1處的峰高，這都是由番茄紅素產生的。在這種情況下，兩個峰高幾乎保持不隨時間變化。未添加培養液時，受感染的樣品(包括來自受感染患者的樣品)證實了這種行為一峰高不隨時間變化。
[0153]隨著添加有利于生長的培養基，峰高開始降低。這樣的一個實例描述于圖13中，其示出了作為時間函數的來自受感染患者的血清樣品在1516和1156CHT1處的峰高(都由番茄紅素產生)，并且該血清樣品中添加胰酪胨大豆肉湯培養基(TSB)。TSB是使MRSA生長的選擇性培養基。因此，圖13示出拉曼峰在1516和1156CHT1處降低，如圖13所示。該降低表明存在代謝活性，因而存在病原體。
[0154]在一些實施方案中，培養液抑制了某些病原體的生長。在另一些實施方案中，培養液促進某些病原體的生長。在一些實施方案中，利用抗病原性和促病原性培養基的組合。因而，將物質添加至樣品能夠促進病原體鑒定和/或分類。
[0155]雖然沒有一種營養培養基有利于一種特定微生物的代謝而抑制所有其他微生物的代謝，使用選擇性培養基的組合可幫助我們分類生物體。例如，MacConkey培養基含有膽鹽和結晶紫染料，其抑制革蘭氏陽性菌，結果將不支持金黃色葡萄球菌的生長代謝活性，而促進革蘭氏陰性菌的代謝，所述革蘭氏陰性菌如肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)，鮑曼不動桿菌(A.baumannii)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa) (MacConkey瓊脂平板操作流程[互聯網].[數據未知]獲自:http://www.microbelibrary.0rg/index, php/component/resource/laboratory-test/2855-macconkey-agar-plates-protocolso 才目 t匕之下，由于其包括的抗菌劑抑制革蘭氏陰性菌，Columbia CNA培養基(其包括抗菌劑粘菌素和萘啶酸)選擇革蘭氏陽性菌(Biol230實驗室手冊，Lab3[互聯網].[數據未知];獲自:http://faculty, ccbcmd.edu/courses/bio 14l/labmanua/lab3/lab3.html)。此外，使用甘露醇鹽(具有7.5%鹽)有利于金黃色葡萄球菌的代謝，抑制革蘭氏陰性菌的生長，且主要是抑制表皮葡萄球菌(S.epidermidis)(負責污染傷口培養物的最常見的共生體)的生長(Microbiology.Media.Tests.Pictures, pdf [互聯網].[數據未知];獲自:http://www.delta, edu/files/Microbiology/Microbiology.Media.Tests.Pictures.p df)。
[0156]另一實例是抗萬古霉素腸球菌。可通過使用膽鹽七葉苷培養基來篩選這些生物體，由于該培養基中的膽鹽抑制其他革蘭氏陽性生物體包括MRSA的生長，并且該培養基包含抑制革蘭氏陰性菌生長的疊氮化鈉，因而其僅支持腸球菌的生長和代謝，而不支持其余前述多重耐藥性(“MDR”)細菌的生長和代謝(Microbiology Lab:M0LB2210[互聯網].[數據未知];獲自:http://www.uwy0.edu/molb2210—lab/info/biochemical—tests.htm#bile)。革蘭氏陰性MDR生物體之間的區別可通過利用PC培養基進行(CampbellME, Farmer SW, Speert DP.New selective medium for Pseudomonas aeruginosa withphenanthroline and9-chloro-9-[4- (diethylamino)phenyl]-9，10-dihydro-10-phenylacridine hydrochloride (C-390).J.Clin.Microbiol.1988Sep;26(9):1910 - 1912)，其特異性支持銅綠假單胞菌的代謝和生長，不支持另外的兩種革蘭氏陰性桿菌。相比之下，粒子不動桿菌培養基(Leeds Acinetobacter medium，“LAM”)將支持鮑曼不動桿菌的生長和代謝，不支持銅綠假單胞菌或肺炎克雷伯菌的生長(Jawad A，et al.Description of LeedsAcinetobacter Medium， a new selective and differential medium for isolation ofclinically important Acinetobacter spp.， and comparison with Herellea agar andHolton’ s agar.J.Clin.Microbiol.19940ct;32(10):2353 - 2358)。
[0157]因而總之，在一些實施方案中，利用選擇性培養基的多步法再細分病原體。步驟包括以上段落所述的不同選擇性培養基的一種或多種(或組合)。
[0158]用IR吸收光譜法實施
[0159]在一些實施方案中，用紅外(“IR”)吸收光譜法實施檢測代謝活性的方法。IR吸收由與拉曼譜帶相同的振動譜帶產生。因而，分子的IR信號傾向于與其拉曼信號類似。然而，IR吸收法不能像拉曼法一樣采用吸收增強，以最大限度的檢測代謝活性(即，如前所述的apo-Tr和Fe-Tr之間的差異)。因此，IR吸收法在分析期間產生類似的基線光譜。例如，Fe-Tr的紅外光譜基線傾向于與apo-Tr的紅外光譜基線類似。然而，可通過用激光同時照射兩個樣品來檢測和/或區分代謝活性(如apo-Tr和Fe-Tr信號)，所述激光集中于共振吸收增強的波長——這樣做，以其改變拉曼譜帶非常類似的方式，改變了相應的紅外吸收峰。
[0160]其他實施方案
[0161]其他實施方案提供了表征人或病原性細胞的呼吸作用狀態的方法；其中所述方法包括監測呼吸作用期間產生的自由基產量。在一些實施方案中，自由基產量通過其對自由基清除劑的作用來監測。對自由基清除劑的作用通過共振拉曼光譜法來監測。在一些實施方案中，所測定的信號是隨時間累積的量，因而產生具有較低噪音的更大測量值。
[0162]其他實施方案提供了表征人或致病性細胞的呼吸作用狀態的方法；其中所述方法包括監測呼吸作用期間產生的類胡蘿卜素產量。在一些實施方案中，類胡蘿卜素產量通過共振拉曼光譜法來監測。在一些實施方案中，所測定的信號是隨時間累積的量，因而產生具有較低噪音的更大測量值。
[0163]在一些實施方案中，用給出病原體代謝的一種標記物的具有波長I的激光，給出病原體代謝的另一標記物的具有波長2的另一激光，以及結合兩種標記物來形成病原體的生化特征譜來實現所述方法。在另一些實施方案中，將所述方法應用于鑒定病原體。在一些實施方案中，將所述方法應用于檢測、表征和定量臨床樣品中存在的病原體。在另一些實施方案中，將所述方法應用于檢測、表征和定量臨床樣品中存在的化學或生物毒素。
[0164]其他實施方案提供了表征臨床樣品中存在的病原性細胞的方法，其中所述方法包括監測病原體在臨床樣品中消耗、生產和/或改變稀缺資源的速率。在一些實施方案中，稀缺資源的測量通過由稀缺資源產生的信號的固有放大方法來進行。在另一些實施方案中，將稀缺資源的消耗或產生繪制為添加至分析中的不同選擇性培養基的函數，使用該結果來鑒定病原體。在一些實施方案中，將稀缺資源的消耗或產生繪制為所添加抗菌劑的函數，使用該結果開發針對臨床樣品中存在的病原體的抗菌藥物敏感性信息。
[0165]在另一些實施方案中，稀缺資源是番茄紅素，病原體通過產生由番茄紅素清除的自由基來消耗番茄紅素。在一些實施方案中，通過共振拉曼光譜法或通過非共振拉曼光譜法監測番茄紅素的消耗。在一些實施方案中，稀缺資源是β_胡蘿卜素，且病原體產生β_胡蘿卜素。在另一些實施方案中，通過共振拉曼光譜法或通過非共振拉曼光譜法監測β_胡蘿卜素的產生。
[0166]在另一些實施方案中，稀缺資源是已由脊椎動物宿主螯合至專門的含鐵蛋白質的鐵。在一些實施方案中，含鐵的蛋白質是轉鐵蛋白。在另一些實施方案中，含鐵的蛋白質是乳鐵蛋白。在一些實施方案中，含鐵的蛋白質是鐵蛋白。在一些實施方案中，通過拉曼光譜法監測鐵螯合過程。在另一些實施方案中，通過紅外吸收光譜法監測鐵螯合過程。在一些實施方案中，通過顏色滴定法監測鐵螯合過程，包括UV/可見光吸收光譜法。在另一些實施方案中，螯合來自宿主蛋白的鐵是通過添加分析中通常不存在的鐵載體(siderophore)來實現的。在一些實施方案中，添加對特定病原體特異的鐵載體能夠識別和鑒定該病原體。
[0167]在一些實施方案中，拉曼光譜法通過共振處理來放大，因而提供了增強的檢測限和更快的檢測時間。
[0168]—些實施方案提供了表征臨床樣品中的未知(或已知)病原體對抗菌劑的敏感性(或抗性)的方法。在一些實施方案中，病原體是細菌。在另一些實施方案中，病原體是真菌。在一些實施方案中，病原體是病毒。
[0169]在一些實施方案中，臨床樣品是血液。在另一些實施方案中，臨床樣品是尿液。在一些實施方案中，臨床樣品是腦脊液。在另一些實施方案中，臨床樣品是唾液。
[0170]樣品
[0171]在一些實施方案中，樣品獲自處于臨床環境的患者。在一些實施方案中，樣品包括體液。體液包括但不限于以下液體:羊膜液、水狀液、玻璃狀液、膽汁、血液、血清、乳汁、腦脊液、乳糜、淋巴液、前列腺液、胃酸、胃液、黏液(包括鼻引流和痰)、腹膜液、膿、胸膜液、唾液、油脂、精液、汗液、淚液、眼內液、分泌物、嘔吐物、排泄物以及尿液。
[0172]在一些實施方案中，樣品取自動物。這些樣品包括來自動物的體液和/或拭子。在一些實施方案中，樣品通過擦拭物體的表面而取自有生命的或非生命的物體。在另一些實施方案中，獲取物體的部分作為樣品。
[0173]因而，在一些實施方案中，獲得樣品包括從患者、動物或物體采集樣品。然而，在另一些實施方案中，獲得樣品包括接收已采集和任選地處理的樣品。
[0174]在一些實施方案中，在采集之后分析之前處理樣品。這樣的處理包括但不限于添加以下物質:營養素、抗病原性物質(即培養基，選擇性和非選擇性的；抗生素；抗真菌劑；以及抗病毒劑)、性(pro-pathogenic)物質、標記物、哺乳動物細胞、用于毒性測量的物質、和/或標記物起作用所必需的補充物。其他處理包括常規的樣品處理程序，去除樣品成分(即，過濾，離心，以及伴隨或不伴隨過濾或離心的沉淀)，樣品固定，以及改變樣品氣氛(即，操縱氣體水平如氧氣和二氧化碳；以及在惰性氣氛、有氧氣氛和/或無氧氣氛下放置)。處理可發生在樣品分析開始之前，期間或之后。在一些實施方案中，樣品被培養。例如，樣品任選包括培養液和/或培養基。在另一些實施方案中，樣品包括培養的細胞。
[0175]在一些實施方案中，樣品包括血液和/或血液成分。已知米集血液以及將其處理成其成分的常規樣品處理程序。在一些實施方案中，將諸如細胞的血液成分去除。在另一些實施方案中，將諸如紅血細胞的血液成分去除。在一些實施方案中，將紅血細胞和白血細胞都去除。在另一些實施方案中，獲得用于樣品的血漿。本領域內已知去除血液成分的方法。實例包括但不限于，重力沉降和/或紅血細胞沉降率程序。重力沉降任選在抗凝劑的存在下進行。在一些實施方案中，在進行全血細胞計數之后，獲取包含于樣品中的血液成分。在另一些實施方案中，包含于樣品中的血液成分取自全血細胞計數測試。在一些實施方案中，包含于樣品中的血液成分取自紅血細胞沉降率程序之后。在另一些實施方案中，包含于樣品中的血液成分取自紅血細胞沉降率程序期間。
[0176]作為樣品制備的代表性程序，將患者血液采集到涂布有抗凝劑的真空血液收集管(vacutainer)。合適的抗凝劑包括乙二胺四乙酸(“EDTA”)或朽1檬酸,優選EDTA。使真空血液收集管靜置約40分鐘(但是可選更長的時間)，在該時間期間紅血細胞由于重力沉降于瓶中。保持在上面的透明(或淡黃色)液體是血漿。細菌和真菌細胞保留在血漿層。試驗表明，當紅血細胞由基于該重力的方法分離時，血液中的細菌/真菌細胞基本保持了它們的活力。該方法步驟的優點在于與目前的試驗方案一致，不利用任何新的樣品處理步驟。臨床醫生非常熟悉全血細胞計數(“CBC”)試驗，其涉及直接將血液采集至抗凝劑涂布的真空血液收集管。其他實施方案包括利用小離心機的樣品處理步驟，該離心機以足夠低的速度旋轉以使血漿層微生物損失達到最低，但還加速了樣品處理時間(即，由約40分鐘下降至約10分鐘或更短)。
[0177]照射/光源
[0178]并未具體限定照射樣品的光源和來源。在一些實施方案中，光源產生具有UV區波長的光。在另一些實施方案中，光源產生具有IR區波長的光。在一些實施方案中，光源產生的光具有以下波長:300nm, 350nm, 400nm, 450nm, 500nm, 550nm, 600nm, 650nm, 700nm,750nm, 800nm, 850nm, 900nm, 950nm,和IOOOnm,或由前述任意兩個數值限定的范圍，和/或大約前述任意數值。在一些實施方案中，光源產生的光具有以下波長:低于約600nm，低于約575nm，低于約550nm，低于約540nm，低于約530nm，低于約520，或低于由任意兩個前述數值限定的范圍，和/或低于大約前述任意數值。在一些實施方案中，光源是激光。在另一些實施方案中，光源是與單色儀聯用的照射器。在一些實施方案中，光源基本上是單色的。在一些實施方案中，光源是拉曼光譜儀的一部分。
[0179]標記物
[0180]用于實施方案中的合適標記物包括產生作為代謝活性函數的可檢測變化的化合物。在一些實施方案中，合適的標記物是化合物。化合物的實例包括但不限于，抗氧化劑，自由基清除劑，類胡蘿卜素(包括葉黃素類和胡蘿卜素類)，有機色素，以及染料。化合物標記物的具體實例包括番茄紅素和β -胡蘿卜素。其他標記物包括在約1150CHT1至約1165CHT1之間透射光的那些標記物，以及在約1500CHT1至約1550CHT1之間透射光的標記物。在一些實施方案中，使用ROS激活染料作為標記物。
[0181]在另一些實施方案和以上更詳細的描述中，合適的標記物是蛋白質，包括蛋白質復合物。元素-蛋白復合物是標記物的一個實例。一種具體的元素-蛋白質復合物是鐵-蛋白質復合物，更具體是Fe-Tr復合物。
[0182]在一些實施方案中，標記物產生放大信號。共振拉曼是放大信號的一個實例。可理解的是，共振拉曼是標記物吸收光譜的函數(參見，即Ermakov et al., Journal ofBiomedical Optics, 2005，10 (6): 064028，其在此通過引用整體并入)。在一些實施方案中，選擇光源及其波長以由標記物產生共振增強。例如，β_胡蘿卜素在低于約525nm的波長處具有共振拉曼增強。同樣地，番茄紅素在約532nm處具有共振拉曼增強。此外，Fe-Tr復合物在約550nm至約400nm之間具有共振拉曼增強。
[0183]利用在此所概述的原理可以構建聯合多種其他測量技術和建立放大方法的幾種其他實施方案。作為實例，可將介電共振或弛豫光譜學用于激發與產生、清除或修飾代謝產物或副產物中的一種相關的電子極化、原子極化、偶極子弛豫或離子弛豫中的一種。由于介電共振過程可放大與所監測的分析物相關的信號(例如，如果交變電磁波的頻率與所探測的特定模式共振)，可將所得到的分析物信號放大I倍。
[0184]其他可能的一組實施方案包括將測量共振過程的探針與測量另一過程(該第二過程可以是共振的或非共振的)的另一探針以提高診斷效率的方式聯用。作為例子，實施方案可將共振拉曼方法(與我們所概述的方法類似)與交變電磁場聯用，所述交變電磁場的頻率與介電模式中的一種共振。可以用2維關聯分析方法來實施這一聯用，與單獨使用共振拉曼法相比，該方法將信噪比再提高10倍。其他可能的實施方案利用表面增強拉曼光譜(SERS)法來檢測微生物細胞代謝過程中產生的自由基。根據公開的方法，將引起SERS放大的表面(如金納米顆粒涂敷于玻璃表面)與優先吸引所有微生物細胞(這種的例子是脂質層)和自由基清除劑(如番茄紅素脂蛋白復合物)的表面化學相聯用。與未吸附至表面的所有血清成分相比，SERS放大會增強與番茄紅素和吸附至脂質表面的所有其他成分相關的信號。因而，可檢測吸附至表面的自由基清除劑的任何變化，或任何脂質友好代謝的副產物的任何產生/修飾。
[0185]在一些實施方案中，標記物在樣品中自然產生。在另一些實施方案中，標記物被添加到樣品中。在一些實施方案中，標記物自然存在但將額外的標記物添加到樣品中以增加其濃度。可任選在一個或多個數據采集之前、期間或之后添加任意標記物。在一些實施方案中，在用發光/光源照射樣品之前添加標記物。
[0186]此外，在一些實施方案中，將標記物添加至樣品容器的表面，以提供校準系統或信號的方法(通過校準標記物的存在或來自校準標記物的信號強度)。在另一些實施方案中，將校準標記物并入或摻雜至樣品容器材料中。在一些實施方案中，樣品容器涂有金屬氧化物校準標記物。在一些實施方案中，金屬氧化物校準標記物是氧化釩。在另一些實施方案中，金屬氧化物校準標記物是氧化鋁。可通過已知方法涂敷金屬氧化物或可通過已知方法并入金屬氧化物。一種這樣的涂敷方法是濺射涂層技術。樣品容器由玻璃制成時，濺射涂層特別適合于涂敷金屬氧化物。然而，樣品容器可由其他材料制成，如不干擾來自所監測分析物的拉曼光譜的塑料。在一些實施方案中，樣品容器其本身就是校準標記物。由金屬氧化物產生的信號(如拉曼信號)強度是樣品容器上涂層厚度的函數。可通過濺射工藝控制樣品容器上的涂層厚度。在一些實施方案中，厚度為0.5nm, lnm, 1.5nm, 2nm, 2.5nm, 3nm,
3.5nm, 4nm, 4.5nm, 5nm,5.5nm,6nm,6.5nm,7nm,7.5nm,8nm,8.5nm,9nm,9.5nm,IOnm,Ilnm,13nm, 15nm, 20nm, 50nm,以及IOOnm,或由任意兩個前述數值限定的范圍，和/或大約前述任意數值。
[0187]在一些實施方案中，將校準標記物添加到樣品中。校準標記物可以是金屬氧化物或納米顆粒。在一些實施方案中，校準標記物是金屬氧化物納米顆粒。金屬氧化物的例子包括二氧化鈦。金屬氧化物納米顆粒的例子包括銳鈦(anatase titania)。二氧化鈦的銳鈦型在640cm—1處顯示拉曼信號。所期望的校準標記物的強度是樣品中校準標記物濃度的函數。金屬氧化物，納米顆粒和金屬氧化物納米顆粒也同樣適合于摻雜或并入樣品容器材料中。
[0188]代謝活性
[0189]如上所述，通過標記物信號的變化來檢測樣品中的代謝活性。在一些實施方案中，通過標記物透射光的變化來檢測代謝活性。這種變化包括但不限于，透射光一個或多個波長的強度變化。存在這種變化指示樣品中的代謝活性。不存在這種變化指示樣品中沒有代謝活性。代謝活性指示樣品中存在諸如病原體的物質。在一些實施方案中，所檢測的代謝活性是由病原體產生的。在另一些實施方案中，代謝活性是由樣品中的非病原體成分如細胞產生的。在一些實施方案中，代謝活性出現時，透射光強度增加。在另一些實施方案中，代謝活性出現時透射光強度減弱。
[0190]在一些實施方案中，代謝活性是螯合病原體代謝所需的營養素。在一些實施方案中，營養素是諸如鐵的元素，螯合由諸如轉鐵蛋白的酶完成。
[0191]在另一些實施方案中，代謝活性是產生自由基。在一些實施方案中，自由基是活性氧類(“R0S”)。在另一些實施方案中，自由基是活性氮類(“RNS”)。在一些實施方案中，標記物清除自由基并被耗減。
[0192]在一些實施方案中,代謝活性是產生抗氧化劑。因此,在一些實施方案中，代謝活性導致產生標記物，并且標記物的濃度隨時間增加。此外，一些抗氧化劑是自由基清除劑。因而一些實施方案產生自由基清除劑，作為可檢測的代謝活性。在另一些實施方案中，代謝活性是產生一種或多種類胡蘿卜素。
[0193]作為檢測代謝活性并基于此決策的代表性方法，一些實施方案測定“斜率”，其是與微生物活性相關的標記物的時間導數。該估算的斜率任選包括其周圍的置信區間，并且在一些實施方案中，當斜率+/_置信區間在“未受感染”或“受感染”帶時做出診斷決策。在一些實施方案中，受感染/未受感染帶的位置通過用已知樣品校準來設置，所述已知樣品已用已知水平的細菌人工接種。在一些實施方案中，受感染/未受感染帶的位置通過有患者樣品的臨床研究來確認。
[0194]其他的實施方案使用其他算法來估算對應于斜率和置信區間的度量值。這些算法包括但不限于特征值分解和主成分分析。用該算法，可將前面很少的主成分(如前面3種)視為測量信號，并且可使用所有更高的成分作為置信區間或噪音的替代測量。[0195]病原體
[0196]在一些實施方案中，代謝活性的檢測指示樣品中存在外來物質。這些外來物質包括但不限于病原體。在一些實施方案中，病原體是細菌。具體細菌的非限制性實例包括以下種類:金黃色葡萄球菌(S.aureus),鮑曼不動桿菌(A.baumannii),肺炎克雷伯菌(K.pneumonia),以及大腸桿菌(Escherichia coli)。在一些實施方案中,病原體是真菌或霉菌。具體真菌的非限制性實例包括以下:白色念珠菌(Candida albicans)。在一些實施方案中，病原體是寄生蟲。此外，在一些實施方案中，病原體是病毒。在一些實施方案中，存在兩種或更多類型的病原體。
_7] 時間點
[0198]在一實施方案中，并未具體限定照射樣品的時間點。在一些實施方案中，時間點是零至四周之間，零至三周之間，零至二周之間，和/或零至一周之間，和/或大約前述任意數字。在另一些實施方案中，時間點是O至7天之間，O至6天之間，O至5天之間，O至4天之間，O至3天之間，O至2天之間，和/或O至I天之間，和/或大約前述任意數字。在一些實施方案中，時間點是O至24小時之間，O至23小時之間，O至22小時之間，O至21小時之間，O至20小時之間，O至19小時之間，O至18小時之間，O至17小時之間，O至16小時之間，O至15小時之間，O至14小時之間，O至13小時之間，O至12小時之間，O至11小時之間，O至10小時之間，O至9小時之間，O至8小時之間，O至7小時之間，O至6小時之間，O至5小時之間，O至4小時之間，O至3小時之間，O至2小時之間，和/或O至I小時之間，和/或大約前述任意數字。在另一些實施方案中，時間點是O至120分鐘之間，O至110分鐘之間，O至100分鐘之間，O至90分鐘之間，O至80分鐘之間，O至70分鐘之間，O至60分鐘之間，O至50分鐘之間，O至40分鐘之間，O至30分鐘之間，O至20分鐘之間，O至10分鐘之間，O至5分鐘之間，O至4分鐘之間，O至3分鐘之間，O至2分鐘之間，和/或O至I分鐘之間，和/或大約前述任意數字。
[0199]在一實施方案中，完成檢測代謝活性的方法不超過四周，三周，兩周，一周，或由任意兩個前述數字限定的范圍，和/或大約前述任意數字。在一些實施方案中，完成檢測代謝活性的方法不超過7天，6天，5天，4天，3天，2天，I天，或由任意兩個前述數字限定的范圍，和/或大約前述任意數字。在另一些實施方案中，完成檢測代謝活性的方法不超過24小時，23小時，22小時，21小時，20小時，19小時，18小時，17小時，16小時，15小時，14小時，13小時，12小時，11小時，10小時，9小時，8小時，7小時，6小時，5小時，4小時，3小時，2小時，I小時，或由任意兩個前述數字限定的范圍，和/或大約前述任意數字。在一些實施方案中，完成檢測代謝活性的方法不超過120分鐘，110分鐘，100分鐘，90分鐘，80分鐘，70分鐘，60分鐘，50分鐘，40分鐘，30分鐘，20分鐘，10分鐘，5分鐘，4分鐘，3分鐘，2分鐘，I分鐘，或由任意兩個前述數字限定的范圍，和/或大約前述任意數字。
[0200]在一實施方案中，并未具體限定照射樣品的時間點的數目。在一些實施方案中，照射樣品的時間點的數目是I次，2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次，9次，10次，15次，20次，25次，30次，40次，50次，60次，70次，80次，90次，100次，或由任意兩個前述數字限定的范圍，和/或大約前述任意數字。在另一些實施方案中，照射樣品的時間點的數目是至少I次,至少2次，至少3次，至少4次，至少5次，至少6次，至少7次，至少8次，至少9次，至少10次，至少15次，至少20次，至少25次，至少30次，至少40次，至少50次，至少60次，至少70次，至少80次，至少90次，和/或至少100次，和/或大約前述任意數字。在一些實施方案中，照射樣品的時間點的數目少于2次,少于3次,少于4次,少于5次,少于6次，少于7次，少于8次，少于9次，少于10次，少于15次，少于20次，少于25次，少于30次，少于40次，少于50次，少于60次，少于70次，少于80次，少于90次，和/或少于100次，
和/或大約前述任意數字。
[0201]可理解的是，在所述實施方案中可利用多個時間點。在這種情況下，多個時間點包括連續測量和在離散時間點的競爭性測量。
實施例
[0202]用番茄紅素標記物檢測病原體
[0203]用107cfu/mL耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(“MRSA”)接種血清樣品。使用532nm波長測量作為時間函數的拉曼散射譜。1516CHT1處的峰由番茄紅素產生，并且觀測到該峰值隨時間降低，表明番茄紅素由代謝活性的細菌消耗，如對應于0.1分鐘，10分鐘，15分鐘和20分鐘的4條軌跡所示(參見圖14)。雖然圖14中未描述，1156CHT1處的其他番茄紅素峰也顯示出類似的行為。
[0204]圖15示出健康志愿者血清中1516CHT1處的番茄紅素峰的歸一化強度對時間曲線，有4部分添加的培養液以及不同的量(無病原體，lO'cfu/mL, 103cfu/mL, 105cfu/mL和107Cfu/mL)的添加的金黃色葡萄球菌。在所有情況下，對于具有所添加細菌的樣品，作為時間函數的峰高降低。相比之下，對照樣品(未添加病原體)的高度幾乎保持不隨時間變化。此外，隨著添加細菌量的增加，番茄紅素峰的強度以更快的速率降低。圖16示出圖15中描述的所有曲線的斜率(即時間倒數的)，作為所添加病原體濃度的函數。還描述了表示對照樣品斜率的譜帶。在所有情況下，譜帶的寬度和不確定性對應于估算斜率的95%置信區間(95CI)。
[0205]抗菌藥物敏感性和/或通過抗菌藥物敏感性鑒定病原體
[0206]圖17和圖18示出可使用標記物來估算最小抑菌濃度MIC的方法。圖17示出幾種樣品在1516CHT1 (由番茄紅素產生)處作為時間函數的拉曼峰高。如圖例所示，樣品包括人工接種金黃色葡萄球菌至105cfu/mL濃度的血清樣品，以及還含有不同濃度的萬古霉素(1，5和20yg/mL)的其他樣品。如圖中所示，峰強度在所有情況下降低，但是對于未添加萬古霉素的樣品，其以最快的速率降低，并且隨著測試中添加更多的萬古霉素，斜率逐漸減小。
[0207]圖18繪出圖17中所有軌跡的斜率，作為所添加萬古霉素濃度的函數。水平虛線對應于未添加萬古霉素的樣品的斜率，3個數據點對應于1，5和20 μ g/mL濃度的萬古霉素。黑色實線是3個數據點的對數擬合，MIC對應于黑色實線與虛線相交處的點。在本具體實例中，估算的MIC是0.54 μ g/mL,這非常接近由傳統Kirby Bauer測試估算的MIC(0.7 μ g/mL) ο
[0208]圖19和圖20示出針對用多于一種的生物體共感染的樣品表征藥效的方法。圖19示出1516CHT1處作為時間函數的峰高(其由番茄紅素產生)。在本實施例中，樣品用革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌共感染。4條軌跡示出添加了萬古霉素(20 μ g/mL)，添加了頭孢他啶(20 μ g/mL)以及同時添加了萬古霉素和頭孢他啶(都是20 μ g/mL)的樣品的作為時間函數的番茄紅素峰高。由于革蘭氏陰性菌通常耐受萬古霉素，革蘭氏陽性菌通常耐受頭孢他啶，我們預期單獨使用時兩種藥物都具有部分效力。相比之下，兩種藥物聯用時，我們預期具有最大效力。這與觀測結果一致，對于添加萬古霉素和頭孢他啶的樣品，番茄紅素峰高的時間斜率最小。圖20示出作為藥物濃度函數的這些軌跡的斜率，以便以圖18相似的方式描述藥效。
[0209]通過標記物產生檢測代謝活性
[0210]病原體的存在還可顯示為共振放大的多種標記物的產生。一個具體的例子是由某些微生物產生多種類胡蘿卜素。一些微生物在光照下合成類胡蘿卜素的能力是大自然最微妙的發明之一，目的在于保護細胞免受UV光照和/或其他來源的活性氧類的有害作用。光誘導胡蘿卜素形成作用已在幾種細菌中有記錄，如分枝桿菌種類(KolmanovaA, Hochmannova J, Malek 1.Carotenoids synthesized by UV-1nducedmutants of a non-acid-fast strain of Mycobacterium phle1.Folia Microbiol.(Praha) 1970;15(6):426 - 430;Houssain1-1raqui M,Lazraq MH,Clavel-Seres S，RastogiNiDavid HL.Cloning and expression of Mycobacterium aurum carotenogenesis genesin Mycobacterium smegmatis.FEMS Microbiol.Lett.1992Jan; 69 (3): 239 - 244)。類胡蘿卜素的累積很可能是對抗氧化爆發(oxidative burst)生存需要所必需的。
[0211]圖21示出含有lOcfu/mL濃度的牛結核分枝桿菌(M.bovis)的樣品中番茄紅素的產生。該增加顯示于1516CHT1處拉曼峰的強度中，其由番茄紅素產生。未添加牛結核分枝桿菌的對照樣品并未產生番爺紅素。由于番爺紅素還能夠被病原體代謝消耗，不同條件可弓I起番茄紅素強度開始先增加，之后接著減少，如圖22所示。圖23示出含偶發分枝桿菌(M.fortiutum)的樣品中類似的番爺紅素產生。
[0212]毒素檢測
[0213]圖24示出一種毒素檢測試驗的結果。將包括人血清(從健康志愿者采集的血液離心)的對照樣品與胰酪胨大豆肉湯培養基和HL60人細胞混合。如所預期的，由拉曼光譜儀測量的對照樣品的番茄紅素峰高并未顯示任何變化。該結果與由人細胞系進行正常代謝時產生可以忽略的自由基一致。相比之下，當分析中添加4 μ M的毒素根霉菌素(rhizoxin)時，番茄紅素峰開始先顯著升高，接著穩定下降，與人細胞系的應激代謝一致。圖25繪出含根霉菌素的樣品的作為時間函數的在1516cm—1處的峰的歸一化強度。該圖明確顯示歸一化信號的強度隨時間減弱。
[0214]參考文獻
[0215]除非另外指明，本文引用的所有參考文獻都通過引用整體并入。
[0216]益論
[0217]雖然結合其具體的實施方案描述了本發明，但是本領域技術人員應當理解的是，在不背離本發明精神和范圍的情況下，可以進行各種改變和替換等同物。這包括未提供本文所列出的全部益處和特征的實施方案。此外，可以進行多種變型以使特定的情形、材料、物質組成、方法、處理步驟或步驟適應所述實施方案的目的、精神和范圍。所有這樣的變型意欲在本文所附的權利要求范圍之內。因此，本發明的范圍僅受所附權利要求限制。
【權利要求】
1.檢測樣品中的代謝活性的方法，其包括: 獲得樣品； 用基本上單色的光在多個時間點照射樣品； 在多個時間點處測量來自樣品中的代謝活性的化學標記物的拉曼散射光；以及 由多個時間點處的拉曼散射光的變化檢測代謝活性。
2.檢測樣品中的代謝活性的方法，其包括: 提供其中具有可檢測的標記物的樣品，所述可檢測的標記物反映樣品中的代謝活性； 由標記物產生放大的信號； 在多個時間點測量放大的信號；以及 由多個時間點處放大的信號的變化檢測代謝活性。
3.權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述拉曼散射光是共振增強的。
4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述標記物是抗氧化劑。
5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述標記物是自由基清除劑。
6.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述標記物是類胡蘿卜素。
7.權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述標記物是番茄紅素。
8.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述標記物是螯合元素的蛋白質復合物。
9.權利要求1-3和8中任一項所述的方法，其中所述標記物是螯合鐵的蛋白質復合物。
10.權利要求1-7中任一`項所述的方法，其中所述代謝活性是產生自由基。
11.權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述代謝活性是產生類胡蘿卜素。
12.權利要求1-3和8-9中任一項所述的方法，其中所述代謝活性是螯合鐵。
13.權利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述拉曼散射光的變化是累積的。
14.權利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述代謝活性的存在指示存在病原體。
15.權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述代謝活性的存在指示存在細菌、真菌、寄生蟲或病毒。
16.權利要求1-15中任一項所述的方法，其中所述標記物的量由于代謝活性而增加。
17.權利要求1-15中任一項所述的方法，其中所述標記物的量由于代謝活性而減少。
18.權利要求1-17中任一項所述的方法，其中所述樣品含有抗病原性物質。
19.權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述樣品含有被配置用于允許由所檢測的代謝活性進行病原體分類的抗病原性性物質。
20.權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述樣品含有被配置用于允許由代謝活性的存在進行病原體分類的培養液。
21.權利要求1-20中任一項所述的方法，其中所述樣品含有選自以下的抗病原性物質:抗生素的、抗真菌的和抗病毒的物質；并且其中所檢測的代謝活性指示抗致病性物質的有效性或無效性。
22.權利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述樣品包括體液。
23.權利要求1-22中任一項所述的方法，其中所述樣品包括選自以下的體液:血液、腦脊液和尿液。
24.權利要求1-23中任一項所述的方法，其中所述樣品被培養。
25.權利要求1-24中任一項所述的方法，其中所述樣品包括培養的細胞系。
26.權利要求1-25中任一項所述的方法，其中所述標記物天然存在于樣品中。
27.權利要求1-26中任一項所述的方法，其中所述標記物在照射之前被添加到樣品中。
28.權利要求1-27中任一項所述的方法，其中所述檢測完成不超過約6小時。
29.權利要求1-28中任一項所述的方法，其中所述檢測完成不超過約30分鐘。
30.權利要求1-29中任一項所述的方法，其中所述樣品在樣品中或在樣品容器上包括校準的拉曼標記物。
31.權利要求30所述的方法，其還包括:詢問樣品或樣品容器中校準的拉曼標記物的存在或強度。
32.權利要求1-7、10、13、17-18和22-31中任一項所述的方法，其中所述代謝活性指示樣品中存在有毒物質。
33.檢測樣品中的代謝活性的系統，其包括: 光源； 控制器，用于用光源定期照射樣品，其中所述樣品含有響應于樣品中的代謝活性的化學標記物； 檢測器，其被配置用于測量來自標記物的光信號；以及 計算機，其被配置用于接收來自檢測器的光測量結果并確定標記物隨時間的變化，所述標記物隨時間的變化指示樣品中的代謝活性。
34.權利要求33所述的系統，其中所述標記物是抗氧化劑或螯合鐵的蛋白質復合物。
35.權利要求33-34中任一項所述的系統，其中所述標記物是自由基清除劑。
36.權利要求33-35中任一項所述的系統，其中所述標記物是類胡蘿卜素。
37.權利要求33-36中任一項所述的系統，其中所述標記物是番茄紅素。
38.權利要求33-37中任一項所述的系統，其中所述標記物非天然存在于樣品中。
39.權利要求33-37中任一項所述的系統，其中所述標記物天然存在于樣品中。
40.權利要求33-39中任一項所述的系統，其中所述來自標記物的光信號是來自于斯托克斯-拉曼散射。
41.權利要求33-39中任一項所述的系統，其中所述來自標記物的光信號是來自于反斯托克斯-拉曼散射。
42.權利要求33-41中任一項所述的系統，其中所述樣品中的標記物的量隨時間累積指示樣品中的代謝活性。
43.權利要求33-41中任一項所述的系統，其中所述樣品中的標記物隨時間減少指示樣品中的代謝活性。
44.權利要求33-43中任一項所述的系統，其中由標記物透射的光是共振增強的。
45.權利要求33-44中任一項所述的系統，其中所述代謝活性是產生自由基。
46.權利要求33-44中任一項所述的系統，其中所述代謝活性是螯合鐵。
47.權利要求33-46中任一項所述的系統，其中所述由標記物透射的光是累積的。
48.權利要求33-47中任一項所述的系統，其中所述代謝活性的存在指示存在病原體。
49.權利要求33-48中任一項所述的系統，其中所述代謝活性的存在指示存在細菌、真菌、寄生蟲或病毒。
50.權利要求33-49中任一項所述的系統，其中所述樣品含有抗病原性物質。
51.權利要求33-50中任一項所述的系統，其中所述樣品含有被配置用于允許由代謝活性的存在進行病原體分類的抗病原性物質。
52.權利要求33-51中任一項所述的系統，其中所述樣品含有被配置用于允許由代謝活性的存在進行病原體分類的培養液。
53.權利要求33-52中任一項所述的系統，其中所述樣品含有選自以下的抗病原性物質:抗生素的、抗真菌的和抗病毒的物質；并且其中所檢測的代謝活性指示抗病原性物質的有效性或無效性。
54.權利要求33-53中任一項所述的系統，其中所述樣品包括體液。
55.權利要求33-54中任一項所述的方法，其中所述時間不超過約6小時。
56.權利要求33-55中任一項所述的方法，其中所述時間不超過約30分鐘。
57.權利要求33-56中任一項所述的方法,其中所述信號是共振增強的拉曼光散射。
58.權利要求33-41、43-45、47、50和54-57中任一項所述的方法，其中所述代謝活性指不樣品中存在有毒物質。
59.權利要求33-58 中任一項所述的系統，其中所述樣品在樣品中或樣品容器上包括校準的拉曼標記物。
60.權利要求59所述的系統，其中所述檢測器被配置用于測量樣品或樣品容器中校準的拉曼標記物的存在或強度。
【文檔編號】G01N21/65GK103733050SQ201280032930
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年8月21日 優先權日:2011年8月22日
【發明者】拉維·康德·沃瑪, 阿斯拉夫·薩米爾·伊布拉希姆, 肯尼斯·馬修·贊格威爾 申請人:光譜平臺有限公司