胎兒有核紅細胞的檢測的制作方法

胎兒有核紅細胞的檢測的制作方法
【專利摘要】一方面，本發明涉及從樣本中分離胚胎有核紅細胞(FNRBC)的方法，包括：使樣本與特異性識別CD147的試劑接觸，從而制成一種混合物；保持該混合物處于在所述試劑和樣本中的CD147之間形成復合物的狀態下；以及從混合物中分離所述復合物；從而從樣本中分離FNRBC。在其他的實施方式中，本發明涉及檢測樣本中FNRBC的方法，包括：使樣本與特異性結合CD147的抗體或其抗原結合片段接觸，從而制成一種組合；保持該組合處于在所述抗體和樣本中的FNRBC之間形成免疫復合物的狀態下；以及檢測組合中是否形成免疫復合物；其中，如果檢測到免疫復合物，則在樣本中存在FNRBC。另一方面，本發明進一步包括從去核的RBCs中分離FNRBCs的方法、檢測產前異常和/或胎兒性別的方法。
【專利說明】胎兒有核紅細胞的檢測
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞標記物用于從樣本中檢測、離析和/或分離至少一種胎兒有核紅細胞的用途。
【背景技術】
[0002]產前診斷提供了有關尚未出生的胎兒的健康狀況的重要信息并且包括有創傷性檢查法和無創傷性檢查法。Steele和Bregg在1966年利用羊膜穿刺術進行了第一次可靠的基因診斷。此后，孕早期絨膜絨毛取樣(CVS)被證明是安全可靠的早期產前診斷方法。盡管二者均為創傷性技術并潛藏著胎兒流產的潛在風險，但它們仍被認為是產前診斷的金標準。因此，其正在逐漸被無創傷性產前診斷(NIPD)法(其中，將從母體循環中獲得的胎兒細胞/遺傳物質用于進行產前診斷)所取代。特別是，母體循環中的無細胞DNA、mRNA和胎兒細胞的識別，為Niro用于診斷胎兒染色體病和單基因缺陷提供了可能性。然而，從母體循環中獲得的胎兒遺傳物質相當不足以提供關于染色體病的可靠信息。特別是，母體循環中的無細胞DNA相當不足以提供用于診斷的完整的染色體信息(例如，異倍體)，且其還昂貴。另一方面，胎兒細胞是用于檢測染色體異常的有希望的候選者，但其細胞數量很少。特別是，利用在母體血液中循環的胎兒細胞有望用于異倍體的檢測和提供完整的胎兒遺傳信息。在此，主要的限制仍在于其在母體循環中的稀缺性并且缺乏有效的分離技術。此外，這些細胞中的某些可能是從前次妊娠存留下來的，不能作為當前胎兒狀態的指示。
[0003]眾所周知，產前診斷能夠及早識別先天性的出生缺陷及損害胎兒存活的其他危險因素，進而有助于早期介入從而避免并發癥并減輕父母的擔憂。目前可用的各種方法中，對于從母體循環系統中分離的人胎兒成紅血球細胞OiFEs)和/或胎兒有核紅細胞(FNRBCs)的診斷，會成為最可靠并且無創傷性的對策。這是由于FNRBCs具有獨特的識別標志，并且其存在是當前妊娠的確切指示，因此被視為用于早期孕早期Niro的潛在候選者。
[0004]特別是，目前的方法常規地遵循獲取用于染色體和單基因病的產前診斷(例如羊膜穿刺術、絨膜絨毛取樣和臍穿刺)的胎兒細胞，帶有雖小而固有的流產的危險(0.5-4%)。來自孕早期母體血液中的胎兒DNA有望成為目前的產前診斷方法的無創傷性替代方案。
[0005]由于胎兒成紅血球細胞的稀缺，迄今尚無法成功地識別和/或分離胎兒成紅血球細胞。對于胎兒成紅血球細胞的研究僅僅依靠細胞的異源培養，考慮到母體細胞和其他雜質的影響，其可能不能提供準確的信息。胎兒成紅血球細胞在體外的成活率差也嚴重制約了對該類細胞進行進一步分析和研究的可能性。
[0006]迄今，尚無對于原始胎兒有核紅細胞具有特異性的抗體。因此，需要提供胎兒有核紅細胞的新的標記物。

【發明內容】

[0007]本發明限定在所附的獨立權利要求中。本發明的一些可選擇的特征限定在所附的從屬權利要求中。[0008]本發明涉及一種從樣本中檢測、分離和/或離析至少一種胎兒有核紅細胞(FNRBC)的方法，包括:
[0009]a)用離心法在包含選自1.077-1.120g/ml的密度的密度梯度介質中處理樣本；
[0010]b)使所述樣本與在至少20，000的濃度下的特異性結合⑶147的抗體或其抗原結合片段接觸，從而制成一種混合物；
[0011]c)保持該混合物處于在試劑和樣本中的CD147之間形成復合物的狀態下；以及
[0012]d)從混合物中分離所述復合物；
[0013]從而從樣本中檢測、分離和/或離析FNRBC。
[0014]此處所展現的是，⑶147可以是用于從樣本中檢測、分離和/或富集胎兒有核紅細胞(FNRBC)的表面標記物。該FNRBC可以進一步分析其產前異常。因此，此處還提供用于檢測FNRBC和/或獲得產前診斷的無創傷性方法。
[0015]在其他的【具體實施方式】中，本發明涉及檢測樣本中FNRBC的方法，包括使樣本與特異性結合CD147的抗體或其抗原結合片段接觸，從而制成一種組合；保持該組合處于在所述抗體和樣本中的FNRBC之間形成免疫復合物的狀態下；以及檢測其中是否形成免疫復合物；其中，如果檢測到免疫復合物，則在樣本中存在FNRBC。
[0016]本發明還在另一方面進一步包括檢測產前異常和/或胎兒性別的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1A-D為⑶147在FNRBCs和成人去核紅細胞(AARBCs)上的差速免疫細胞化學染色(differential immunocytochemical staining)的圖像。(A)陰性對照(省略第一抗體)；(B)抗CD 147在AARBCs上弱的/不能檢測的免疫染色；(C-D)抗CD 147在FNRBCs和AARBCs的混合物上的免疫染色；可見，與在AARBCs上的染色相反，在FNRBCs上的染色強。
[0018]圖1E為顯示用Adobe Photoshop制圖軟件和光度柱狀圖計算的FNRBCs (n=450)和AARBC (n=358)的平均強度值(任意單位亮度)的盒形圖，其具有顯著差異(p〈0.001曼-懷二氏檢驗(Mann-Whitney test)。
[0019]圖2A是顯示利用DynabeacUMACS或FACS的來自模型混合物的使用抗CD147抗體的FNRBC的平均(％土SEM)回收率和純度的條形圖，以Bonferroni校正AN0VA，*P〈0.01和**Ρ〈0.001。
[0020]圖2Β為用于從標記有與FITC結合的抗⑶147抗體的模型混合物中富集FNRBCs的熒光激活細胞分選(FACS)設門策略(gating strategy)的圖像。(i)標記有與FITC結合的抗⑶147抗體的AARBCs的側向分散(對照)。(ii)標記有與FITC結合的抗⑶147抗體的模型混合物(FNRBCs和AARBCs)的側向分散。門控區(gated area)P2 (FITC-高/SSC-高)和P3 (FITC-高/SSC-低)相當于靶細胞群FNRBCs。Pl門控區相當于AARBCs。P4門控區相當于碎片。
[0021]圖3為利用DynabeacUMACS和FACS分離技術用抗CD147抗體從模型混合物中富集FNRBCs的離心涂片細胞的圖像。(A)Dynabea分離-陽性部分，(B)Dynabead分離-陰性部分，(C)MACS分離-陽性部分，(D)MACS分離-陰性部分，(E)FACS分離-門控區P2，(F)FACS分離門控區P3。FNRBC(虛線箭頭)和AARBC(實線箭頭)。賴特(Wright)染色(200x)。(Olympus BX61, Pennsylvania, USA)。[0022]圖4為來自TOP前母血(pre-TOP maternal blood)的e_球蛋白陽性FNRBCs的免疫細胞化學鑒定的圖像(x400) (Olympus BX61, Pennsylvania, USA)。
[0023]圖5的圖像為:(A)來自胎盤絨毛的FNRBCs，經賴特氏染色(Wright’ s stained)(x400) (Olympus BX61, Pennsylvania, USA) ； (B)來自胎盤絨毛的未染色的 FNRBCs ； (C)來自母血的煙酸己可堿(Hoechst)染色的FNRBCs ； (D)煙酸己可堿和⑶45-AF488染色的母體白細胞。B-D 倒置顯微鏡(x400) (Olympus 1X70，USA)。
[0024]圖6是全基因組擴增的DNA產物的凝膠電泳圖。樣本1_3:從TOP前母血(MB)中手工挑選的8-10個FNRBC和從胎盤絨毛中手工挑選的8-10個FNRBC (對照)的全基因組擴增(WGA)的DNA產物在1%瓊脂糖凝膠電泳上分離。
[0025]圖7是β -球蛋白(HBB)和男性性別決定區Y(SRY)的實時PCR擴增曲線。樣本1-3:母體gDNA、胎兒gDNA及從TOP前母血中分離的FNRBC的β -球蛋白(HBB)和男性性別決定區Y(SRY)的實時PCR。
[0026]圖8為顯示在MACS中使用不同稀釋的抗⑶147抗體的細胞回收率的比較的圖表。以 Bonferroni 校正的單向 AN0VA, p>0.05。
[0027]圖9為染色的圖像，顯示在賴特氏染色后通過形態學外觀識別的FNRBCs。標記物=20 μ m。
[0028]圖10為通過賴特氏染色識別、脫色和進行免疫細胞化學染色之后的差速免疫細胞化學染色ε -球蛋白陽性FNRBCs (e+FNRBCs)的圖像。標記物=20 μ m。
[0029]圖11為顯示從TOP前母血中富集的ε -球蛋白陽性FNRBC (e+FNRBC)的aCGH的圖表。A:WGA擴增的從母體單核細胞獲得的母體基因組DNA，顯示輪廓女性(46XX)，對照。B:未擴增的胎兒基因組DNA(胎兒滋養層細胞)顯示輪廓男性(46XY)。C:來自胎盤絨毛的I個e+FNRBC，經激光顯微切割(LCM)和WGA，顯示輪廓男性(46XY)，對照。D:來自母血的I個e+FNRBC，經激光顯微切割(LCM)和WGA，顯示輪廓男性(46XY) oE:來自母血的3個e+FNRBC，經激光顯微切割(LCM)和WGA，顯示輪廓男性(46XY)。F:來自母血的5個e+FNRBC，經激光顯微切割(LCM)和WGA，顯示輪廓男性(46X)。
[0030]圖12為顯示從母血中富集FNRBCs、顯微操作及下游的分子分析的工作流程示意圖。Α:Τ0Ρ 前母血(10-20ml ；n=8) ;B:用 Percoll?l.118 密度梯度離心；C:CD45_WBC 損耗；D =FNRBCs的⑶147-陽性選擇；E:用于手工揀選FNRBCs的顯微操作器；F =Hoechst+/CD45AF488染色的FNRBCs (白色箭頭；標記物=10 μ m)。
[0031]圖13為用于顯微操作的FNRBCs的染色圖像。A:來自胎盤絨毛的FNRBCs，經賴特氏染色:來自胎盤絨毛的未染色FNRBCs ；C:來自母血的煙酸己可堿染色的FNRBCs ；D:煙酸己可堿和⑶45-AF488染色的母體白細胞。標記物=10 μ m。
[0032]圖14為顯不以picogreen檢測的來自絨毛和母血的10-FNRBCs經過全基因組擴增后DNA產量的圖表。曼-惠特尼檢驗(Mann Whitney), p>0.05 觸須線(Whiskers)表示95%置信區間(Cl)。
[0033]圖15是顯示相較于理論上的10個細胞中基因組DNA，10-FNRBCs的WGA產物的DNA水平及其倍增的圖表(*)。
[0034]圖16是顯示從男性和女性妊娠的母血中分離的10-FNRBCs的實時PCR的DNA擴增結果的一系列圖表。[0035]圖17是用于來自各個絨毛細胞和作為對照的母細胞的包含DNA的男性和女性FNRBCs的釉原蛋白(AMXY)的19QF-PCR結果。
[0036]圖18是來自MB1-MB8的FNRBCs的實時和熒光定量PCR的結果和染色體組型結果。MB1-MB4:來自懷有男性胎兒的妊娠期母血的FNRBCs ；MB5-MB8:來自懷有女性胎兒的妊娠期母血的FNRBCs。
[0037]圖19是從母血和絨毛樣本中分離的FNRBCs的熒光原位雜交(FISH)圖像。a和b:顯示分別從來自妊娠終止后母血樣本中的母血和絨毛中分離出的FNRBCs中的男性XY (箭頭)信號；c和d:顯示分別從來自妊娠終止后母血樣本中的母血和絨毛中分離出的FNRBCs中的女性XX (箭頭)信號^和卜顯示從分別來自妊娠終止前母血樣本中的母血和絨毛中分尚出的
[0038]FNRBCs中的女性XX (箭頭)信號；g:以LSI13/21探針FISH雜交，來自妊娠終止后的母血的FNRBC中的13號染色體(箭頭)和21號染色體(箭頭)的正常數目；h:在以LSI13/21探針雜交后顯示3個21號染色體的信號的對照T21細胞系。
【具體實施方式】
[0039]為了方便，本說明書提及的書目參考文獻以參考文獻表的形式列出并附加在實施例之后。這些書目參考文獻的全部內容通過引用的方式并入本文中。
[0040]通過不定冠詞“一個(a或an)”提及一種成分，并不能排除多于一種成分存在的可能性，除非上下文中 清楚地要求為一種并僅有一種成分。因此，此處使用不定冠詞“一個(a或an)”通常意為“至少一種”。
[0041]術語“包含(comprising) ”和其變形以其非限制性意義使用時，意為在該術語之后的各項被包括在其中，但不排除沒有特別提及的項目。因此，術語“包含”包括更多限定性用詞〃基本由…組成(consisting essentially of) 〃和〃由…組成(consisting of)"。
[0042]此處所使用的術語“⑶45陰性”指的是不表達信號或是對⑶45分子/標記物的自然、重組體或合成形式呈陰性的任何細胞。可以使用本領域所知的任何免疫染色法和利用任何抗CD45試劑來確定在樣本中細胞上CD45表達的存在。用抗CD45試劑染色呈陽性的任何細胞可以被排除在外，因為這些細胞可能包括CD45陽性的白細胞。
[0043]此處使用的術語“成紅血球細胞(erythroblast)”指的是具有核的紅細胞。特別地，成紅血球細胞指的是這樣一種有核前體細胞(nucleated precursor cell),網織紅細胞從該有核前體細胞發育成為紅細胞。“成紅血球細胞”可以與“幼紅細胞(normoblast)”互換使用，并且指的是有核紅細胞，紅細胞的直接前體。例如，成紅血球細胞可以是哺乳動物起源的。特別地，成紅血球細胞可以是原始或人胎兒的成紅血球細胞。“成紅血球細胞”或“紅細胞”或“RBC”包括無核成體和胎兒紅細胞。成紅血球細胞的實例可以是胎兒有核紅細胞(FNRBCs)。這些細胞與胎兒成紅血球細胞(hFEs)相同或相似。
[0044]術語“哺乳動物”在此被定義為哺乳動物個體，特別是靈長類動物，例如人類。為了研究的目的，被試者可以是非人類。例如，被試者可以是適合在動物模型中使用的動物，比如豬、馬、小鼠、大鼠、奶牛、狗、貓、牛、非人類的靈長類動物(例如黑猩猩)等等。
[0045]此處所用的術語“有核的”是指具有細胞核的細胞。可以基于本領域已知的任何核染色技術來區分有核細胞與不具有細胞核的紅細胞。[0046]此處所使用術語的“產前異常”指的是出生前的胎兒或胚胎的疾病或狀態。所述的產前異常可以選自染色體病、基因病或其結合。特別地，產前異常可以非限定性地選自唐氏綜合征(Down Syndrome)、愛德華茲綜合征(Edwards Syndrome)、帕塔綜合征(PatauSyndrome)、神經管缺陷、脊柱裂、顎裂、泰-薩克斯病(Tay Sachs Disease)、鐮刀形紅細胞貧血病(sickle-cell anemia)、地中海貧血病(，thalassemia)、囊性纖維病(cysticfibrosis)、脆性X染色體綜合征、脊髓性肌萎縮、強直性肌營養不良、杭廷頓氏舞蹈病(Huntington，s Disease)、夏-馬-圖三氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、血友病、杜克(Duchenne)肌營養不良、線粒體異常(mitochondrial disorder)、遺傳性多發性外生骨疣、成骨不全及其結合等等。
[0047]此處所用的術語“樣本”指的是組織、細胞或組成部分(例如液體)的集合，可以包括，但不限于，母體組織、母血、臍帶血、羊膜穿刺術、絨膜絨毛取樣、胎兒血和/或胎兒組織/液體。特別地，胎兒組織可以是滋養層組織、胎盤組織及其結合。本發明所使用的樣本可以是預先經過密度梯度純化的，其包括，但不限于，Ficoll梯度和Percoll?梯度。
[0048]ε -球蛋白陽性(e+)胎兒有核紅細胞(FNRBCs)是母血中用于孕早期無創產前診斷的理想胎兒細胞。此處描述的是e+FNRBCs上的表面抗原，其通過免疫篩選法識別，并測試其用于在模型混合物中分離這些細胞和從母血中富集e+FNRBCs的適合性。除了 CD147夕卜，大多數被測試的抗原免疫定位在FNRBCs和成體去核紅細胞(AARBCs)上，其具有統計學上顯著差異的表達:在FNRBCs上較強(122.46 ±22.21AU)，而在AARBCs上弱/不能檢測到(205.11±7.08AU) (Ρ〈0.05)。與 Dynal 系統(56.7±2.8% ;Ρ〈0.01)、FACS-P2 (高 FITC/高SSC, 12.1 ±4.0% ;Ρ〈0.001)和 FACS-P3 (高 FITC/低 SSC, 45.5 ±4.6% ;Ρ〈0.001)相比，從模型混合物中使用MACS法，FNRBCs的平均回收率(79.7±0.7%)明顯更高。使用抗⑶147抗體從TOP后母血中富集的e+FNRBCs的數目比使用抗GPA抗體更高(18個細胞/15ml對12個細胞/15ml);前者用于分析的載玻片的數目減少了 55%。使用抗CD147抗體，每個經分析的載玻片上孕早期e+FNRBCs的中位值回收率比使用抗GPA抗體高300% (0.53對0.18)。使用抗⑶147抗體，從TOP前母血中富集的e+FNRBC的平均數(± SEM)為20.3 ±2.8個細胞(范圍:6-46)。可以從三位懷有男性胎兒母親的TOP前母血中分離出FNRBCs，通過用于判定胎兒性別的性別決定區Y(SRY)的聚合酶鏈式反應(PCR)，該FNRBC確實為男性胎兒細胞。此處需要說明的是，⑶147可以在FNRBCs上強表達，并且是用于非創傷性產前診斷的從母血中富集FNRBCs的標記物。
[0049]胎兒DNA的兩種來源，無細胞的胎兒DNA和胎兒細胞，可以在孕早期母血中獲得。前者限于檢測父系遺傳的疾病和21三體性，而后者更適于檢測單基因疾病。在進入孕早期母體循環的胎兒細胞中，胎兒有核紅細胞(FNRBC)是優選的靶細胞，因為其壽命短，從而不太可能從前次妊娠存留下來，這不同于胎兒淋巴細胞的情況(其中這種現象可能會成為誤診的基礎)。孕早期FNRBC包括ε-球蛋白(e)，ε-球蛋白(e)是一種理想的胎兒細胞識別符，其可為高度特異的，因為在孕早期后表達減弱。
[0050]目前，靶向細胞內的胎兒血紅蛋白(HbF)的抗體被用于富集FNRBCs。然而，在某些妊娠中，HbF可以在母體AARBCs中升高。胎兒血紅蛋白ζ，雖然更為特異，但具有窄的暫時性表達窗口。在富集期間，需要額外的透化作用步驟以使抗體進入脆性FNRBCs，這樣會引起稀有細胞消失。[0051 ] 細胞表面抗原⑶71、⑶35、⑶36、⑶45、⑶47和GPA最常用于從母血中富集FNRBCs。CD71是一種在所有結合鐵的細胞中表達的鐵傳遞蛋白受體，例如，活化淋巴細胞、胎兒滋養層細胞和從爆式紅系集落形成單位(burst forming units-erythroid, BFU-e)到網織紅細胞期的紅系細胞以及母血中的定形成胎兒NRBCs (definitive foetal NRBCs)。雖然CD71在100%的胎兒定形成紅血球細胞(foetal definitive erythroblasts)上和96%的母體NRBCs上呈現強陽性，但是其僅在孕前期的?68%的胎兒原始NRBCs上表達。同樣地，使用⑶71來富集孕前期的FNRBCs可能導致靶細胞損失。⑶36在FNRBCs上不表達，而⑶35和⑶47在FNRBCs和AARBCs上均表達。GPA存在于所有的紅細胞中而⑶45不存在。
[0052]正如本文所述，利用對細胞表面抗原和商業上可得的抗體進行免疫篩選，CD 147在FNRBCs上的強烈并可重復的免疫細胞化學染色，表明表面抗原CD147是一種可以用于FNRBC的免疫細胞分選(immunocell sorting)的表面抗原。⑶147在整個紅細胞系統發展中在紅血球譜系上都有表達。表面抗原⑶147顯示出統計學上顯著差異的表達，在FNRBCs上較強(122.46±22.21AU)，而在 AARBCs 上弱 / 不能檢測到(205.11±7.08AU) (Ρ〈0.05)。正如本文中所示，利用具有抗⑶147的MACS作為主要的分選技術，這是因為相較于其他的技術(FACS12.1%和Dynal56.7%)，其顯示出從模型混合物中最有效的FNRBCs的回收率(79.7%)，。
[0053]使用抗⑶147抗體從TOP后母血中富集的e+FNRBCs的數目高于使用抗GPA抗體的數目(18個細胞/15ml對12個細胞/15ml);并且前者中分析用載玻片的數量大幅度減少了 55%(p〈0.05)。相較于抗GPA抗體，使用抗⑶147抗體，每個分析載玻片的孕早期e+FNRBC的中位值回收率高出300%(0.53對0.18)
[0054]使用抗⑶147抗體從TOP后母血中富集的e+FNRBCs的平均數(土 SEM)為
20.3±2.8個細胞(范圍:6-46個細胞)，每毫升母血中大約富集有1.11個e+FNRBC。
[0055]人工采集的FNRBC的胎兒DNA使用全基因擴增(WGA)技術進行擴增，證實了使用懷有男性胎兒的母體的TOP后母血的男性FNRBC的富集(n=3)。
[0056]ε -球蛋白陽性(e+)胎兒有核紅細胞(FNRBCs)可以被認為是用于孕早期無創傷性產前診斷的理想胎兒細胞。然而，其在母血中稀少和缺乏特異性表面標記阻礙了其從成體去核紅細胞(MRBCs)的壓倒性的環境中的富集。在此描述的是，通過免疫細胞化學篩選法進行表面抗原的選擇，其分離FNRBCs和AARBCs，允許從母血中富集FNRBCs用于非創傷性產前診斷。
[0057]相應地，在本發明的一個方面，提供了從(一種或多種)樣本中分離FNRBCs (例如胎兒原始NRBCs (FPNRBCs);胎兒定形成NRBCs (FDNRBCs))的方法，包括:使所述樣本與(一種或多種)特異性識別CD147的試劑接觸，從而制成一種混合物；保持該混合物處于在所述試劑和樣本中的CD147之間形成復合物的狀態下；以及從混合物中分離該復合物；從而從樣本中分離FNRBCs。
[0058]例如，所述的試劑可以是抗體、納米粒子、量子點。在一個具體的方面，所述試劑為特異性結合CD147的抗體。所述抗體的實例包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、它們的部分(例如抗原片段)或它們的結合。
[0059]在【具體實施方式】中，FNRBCs為哺乳動物FNRBCs，例如靈長類(例如人類)、犬科、貓科、馬科、牛科、羊屬、鼠科FNRBCs等等。[0060]在另一方面，提供了一種從樣本中檢測、分離和/或離析至少一種胎兒有核紅細胞(FNRBC)的方法，包括:
[0061]a)用離心法在包含選自1.077-1.120g/ml的密度的密度梯度介質中處理樣本；
[0062]b)使所述樣本與特異性結合CD147的抗體或其抗原結合片段接觸；
[0063]c)保持該混合物處于在所述試劑和樣本中的CD147之間形成復合物的狀態下；以及
[0064]d)從混合物中分離所述復合物；
[0065]從而從樣本中檢測、分離和/或離析FNRBC。
[0066]所述抗體或其抗原結合片段的濃度可以至少為1:20，000或1:100。特別地，濃度可為至少大于1:10，000，或者至少小于或等于1:100。通過用至少一種緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)等)來稀釋原料來達到所述的抗體濃度。抗體的濃度可以從1:10,000-1:100范圍中選擇。
[0067]根據本發明的任何一個方面的方法可以包括在(b)步驟之前預處理樣本的步驟。特別地，樣本的處理可以包括在密度梯度介質中離心分離樣本。在本發明中使用的密度梯度介質可以包括分散在可熔性凝膠中的膠體。該膠體可以賦予梯度介質所要求的密度。因此，通過改變膠體的濃度，介質的密度會相應改變。膠體的微粒性質能夠使密度分離的各層固定化，當處于凝膠狀態時避免一層擴散進另一層。更進一步地，膠體能夠保持血細胞處于實質上非凝結的狀態。賦予介質密度以用在本發明方法的任一方面中的膠體的非限定性實例可以是聚乙烯-卩比咯燒酮包被的二氧化娃，例如Pharmacia制造的Percoll?,可從Sigma化學公司得到。
[0068]根據本發明的用于富集胎兒有核紅細胞的密度梯度介質是高滲性的。在高滲性條件下，紅細胞收縮從而變得更加密集。在此條件下，白細胞保持了不變的密度。因此，通過在高滲性介質中有選擇地收縮紅細胞，所述細胞的密度增加并且其在不同于白細胞的密度的梯度中保持平衡。
[0069]通過在離心混合物中加入鹽，所述介質可被制作成高滲性的。用于本發明的適合的鹽包括氯化鈉、氯化鉀、或氯化鋰、或其任意混合。也可以使用商業上可得的平衡鹽溶液混合物，例如，杜伯科氏(Dulbecco)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，漢克斯氏(Hanks)平衡鹽溶液，Earl氏平衡鹽溶液等等。
[0070]Percoll?溶液具有選自1.000-1.200g/ml范圍的密度梯度。特別地，梯度可以選自 1.050-1.150,1.100-1120,1.080-1.119,1.078-1.119,1.079-1.119,1.100-1.119g/ml等的范圍。特別地，密度梯度可為1.118g/ml。
[0071]FNRBCs可以與樣本中存在的去核紅細胞(ARBCs)中分離。如果需要，可以利用例如免疫磁性分離法、流式細胞計量術或其結合，從混合物中分離免疫復合物。
[0072]正如本領域的技術人員將理解的，利用此處所描述的方法分離和/或離析的FNRBCs可以經過進一步的檢測，該檢測的舉例包括熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(PCR)、多重配體依賴性探針擴增(multiple ligand-dependent probe amplification,mpla)、短腱重復分析(short tendon repeat analysis)、比較基因組雜交(comparativegenomic hybridization, CGH)、基因分型、單重序列測定(single plex sequencing)、大規模平行序列測定(massively parallel sequencing)等,或其結合。一方面，FNRBCs的進一步檢測用于性別辨別。另一方面，FNRBCs的進一步檢測用于一種或多種產前異常。所述的一種或多種產前異常包括染色體病、基因病(例如，單基因病；多因子基因病)，或其結合。正如本領域的技術人員將理解的，所述的異常可以在Online Mendelian Inheritance in
Man (OMIM*)數據庫(www.ncb1.nlm.nih.gov/omim)中找到。所述的異常的實例包括唐
氏綜合征、愛德華茲綜合征、帕塔綜合征、神經管缺陷、脊柱裂、顎裂、泰-薩克斯病、鐮刀形紅細胞貧血病、地中海貧血病、囊性纖維病、脆性X染色體綜合征、脊髓性肌萎縮、強直性肌營養不良、杭廷頓氏舞蹈病、夏-馬-圖三氏病、血友病、杜克肌營養不良、線粒體異常、遺傳性多發性外生骨疣、成骨不全癥及其結合等等。
[0073]在具體的方面，本發明涉及一種確定胎兒性別的方法，該方法包括使包含FNRBCs的母體樣本與特異性結合CD147的抗體或其抗原結合片段接觸，從而產生一種混合物；保持該混合物處于在所述抗體或其抗原結合片段和存在于樣本中的CD147之間形成免疫復合物的狀態下，從而從樣本中分離FNRBCs ;以及檢測FNRBCs中SRY基因的存在，其中，如果存在SRY基因，則胎兒為男性，而如果不存在SRY基因，則胎兒為女性。
[0074]另一的方面，本發明涉及檢測樣本中的FNRBCs的方法，該方法包括使樣本與特異性結合CD147的抗體或其抗原結合片段接觸，從而制成一種組合；保持該組合處于在所述抗體和存在于樣本中的FNRBC之間形成免疫復合物的狀態下；以及檢測組合中是否形成免疫復合物；其中，如果檢測到免疫復合物，則在樣本中存在FNRBCs。本發明還在另一方面進一步包括檢測產前異常和/或胎兒性別的方法。
[0075]所述方法可以進一步包含一個或多個消耗步驟，其中，使樣本進一步與一種或多種去除(例如結合)除了 FNRBCs之外的分子的試劑(例如抗體)接觸。因此，該消耗步驟可以用于去除背景噪聲(例如除FNRBCs之外的細胞)。正如本領域的技術人員將理解的那樣，這些分子可以然后通過被所述試劑識別而被檢測到，并將其從樣本中去除。例如，可以使樣本與結合白細胞(WBCs)的針對CD45和/或CD14的抗體接觸，從而形成免疫復合物，并且該免疫復合物可以被檢測到和/或從樣本中去除。去除它們的其他分子和方法對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。
[0076]此外，所述方法可以進一步包括使樣本與一種或多種檢測細胞中的細胞核的試劑(例如，核染劑)接觸。正如本領域的技術人員將理解的那樣，所述的試劑包括Hoescht染劑、DAPI染劑及吖啶橙。
[0077]任何適合的生物學樣本可以用于所述方法，并且包括生物流體(例如，血液、臍帶血)和組織(滋養層組織、肝臟組織、胎盤)。在特定的方面，所述的樣本為母體樣本(從妊娠母親獲得的樣本)，在另一方面，所述樣本為胎兒樣本。在又一方面，所述的樣本從孕早期、孕中期或孕晚期的母親獲得。
[0078]本發明所屬【技術領域】的技術人員將理解，根據此處給出的方法，不需要經過過度的實驗，本發明就可以實施。所述的方法、技術和化學試劑在給出的參考文獻中或者來自標準生物技術和分子生物學教科書中的方案中有描述。
[0079]實施例
[0080]本領域中已知的和未特別描述的標準分子生物學技術一般遵循Sambrook和Green的分子克隆:實驗指南，冷泉港實驗室(第四版)，紐約(2012)。
[0081]實施例1[0082]材料和方法
[0083]從接受選擇性外科終止妊娠手術(TOP)的婦女采集胎盤組織和血液樣本是經過科學研究倫理審查委員會(Institutional Review Board)批準的。將血液樣本收集到EDTA涂布真空米集管(EDTA coated vacutainer,Becton,Dickinson and Company,USA)中。遵循Ponnusamy等人，2008的實驗方案，將FNRBCs從胎盤組織中提取出來。
[0084]用市售抗體進行FNRBCs的抗原全貌分析
[0085]在FNRBCs和AARBCs上檢測針對所選定的AARBCs、其他血細胞及其前身的表面抗原的抗體的免疫反應。遵循在Ponnusamy等人,2008中描述的實驗方案,使用針對下列表面抗原的抗體(在鼠中培養，除非另有說明)進行這些抗原在靶細胞上的免疫細胞化學定位:CD34、CD46、CD55、CD100、CD175s、HLA-DR、CDl 17 (在兔中培養)(Neomarkers, Lab Vision,California, USA) ;CD29、CD31、CD35、CD36、CD44、CD45、CD45RB、CD47、CD59、CD81、CD99、CD108、CD147、CD164、CD222、CD235a、E-鈣粘蛋白(BD Pharmingen, California, USA)；CD14、CD90、CD105、CD133、單羧酸轉運體 I (MCT1，在兔中培養)(Chemicon, California,USA);及 CD233(Sigma-Aldrich，Missouri, USA) ； HLA-ABC (DAK0, California, USA)。簡言之，在室溫下將細胞離心涂片載玻片在甲醇/丙酮(v/v，1:1)中固定2分鐘，用PBS漂洗并風干。在PBST(lxPBS，吐溫20 ；Sigma, Missouri, USA)中再水化后，進行以下各處理:依次用I)在PBS中按照1:10稀釋的山羊血清(Sigma)孵育2小時；用2)在PBS中按照1:100稀釋的抗-人的鼠或兔IgG類抗體孵育I小時；用3)生物素化的山羊-抗-小鼠抗體或山羊-抗-兔抗體(Vector Laboratories, California, USA)孵育I小時;用4)與堿性磷酸酯酶結合的抗生物素蛋白鏈菌素(Vector Laboratories)孵育30分鐘。所有的孵育均在室溫條件下的加濕室中。孵育之間的所有洗滌均在PBST中進行5分鐘。將新制成的Vector藍底物(Vector Laboratories)加入到載玻片上并在黑暗條件下孵育10分鐘。將載玻片在蒸懼水中沖洗30秒；在100%乙醇中脫水30秒；最后風干并在光學顯微鏡下觀察(OlympusBX61, Pennsylvania, USA)。
[0086]免疫染色強度的測量
[0087]細胞表面上的各種抗體的免疫反應由其染色強度來評分。FNRBCs上強烈的免疫反應情況下，利用繪圖軟件Adobe Photoshop ( (Adobe系統)上的光度矩形圖程序,計算AARBCs和FNRBCS上的染色強度。將免疫染色細胞的照片以每英寸300點通過反射掃描而數字化。確定陽性細胞中的平均像素強度(從最高至陽性細胞的五個小方格)(n=350-450個細胞)，并且確定針對256灰度(任意單位，AU)的光度(亮度)水平。分析數據得到染色強度的統計學顯著性(Choolani等，2003)。
[0088]摻入AARBCs的FNRBCs的模型混合物
[0089]由IXIO5個FNRBCs和49x IO5個AARBCs組成的模型混合物用于測試方案的富集效率。AARBCs由采集在EDTA涂布真空采集管(EDTA coated vaaitainers:思，Becton,Dickinson and Company, USA)中的外周小靜脈血制備。使用I XPBS (1:1)稀釋血樣，在等體積的 Ficoll - Paque (Sigma, Missouri, USA)上分層，并進行離心(B Braun BiotechInternational B5, Pennsylvania, USA ；224x g, 30 分鐘)。將等分試樣的 RBC 沉淀物使用IXPBS沖洗三次，用血細胞計數器計數，以制備模型混合物。FNRBCs從胎盤組織中分離出來。[0090]從模型混合物中的富集FNRBCs
[0091]對于從模型混合物中富集的FNRBCs的回收率和純度，評價了三種細胞分選方案。
[0092]a.Dyna Beads 法
[0093]使用Dynabead(Invitrogen公司，California, USA)分離系統從模型混合物(n=5)中富集FNRBCs，根據制造商的說明，同時進行一些修改，進行操作:簡言之，細胞在50 μ I分選緩沖液(分選緩沖液:0.5%BSA/PBS ；0.5M EDTA)中混懸并用I μ g抗-CD147抗體(BD Pharmingen, California, USA)在4°C條件下孵育30分鐘。將經過I XPBS沖洗兩次的細胞再次在500 μ I分選緩沖液中混懸并用5μ I經過預先沖洗的結合有DynabeadsΜ-450 (Invitrogen公司)的山羊抗小鼠IgG在4°C條件下在緩慢上下翻滾(end-over-end)旋轉下孵育30分鐘。使用Dynal磁性微粒濃縮器(MPC, Invitrogen公司)來收集磁性結合細胞(magnetically bound cell)。未結合原料通過抽吸除去并轉移到新管中作為陰性部分。將磁性結合細胞沖洗兩次并在室溫下用釋放緩沖液(Flow-Comp釋放緩沖液，Invitrogen公司)孵育15分鐘來將細胞從磁珠上釋放，并在500 μ I分選緩沖液中混懸。將該管再次置于MPC中2分鐘，上清液作為陽性部分轉移到新管中。使陽性部分和陰性部分沉淀，重懸在IXPBS中來進行細胞計數以及接著細胞離心到載玻片上(Shandon3, ThermoScientific, Massachusetts, USA)。將載玻片染色用于進一步的分析。
[0094]b.磁性活化細胞分選(MACS):
[0095]通過MACS的間接磁性標記方法(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)從模型混合物(n=5)中進行FNRBCs的陽性選擇。簡言之，將細胞用抗⑶147 (在100 μ I的最終孵育體積中為1:10，000，BD Pharmingen)在4°C條件下孵育30分鐘，用MACS緩沖液(0.5%BSA/PBS ；0.5M EDTA ;500xgl0分鐘)沖洗，用結合有大鼠抗小鼠IgG抗體(在100 μ I的最終孵育體積中每IO7個細胞20 μ L，Miltenyi Biotec.)的磁性微珠在4°C條件下孵育30分鐘。孵育后的樣本沖洗后經過Miltenyi miniMACS磁性柱。從柱中收集陽性部分，沖洗，混懸來進行細胞計數以及接著細胞離心到載玻片上。將載玻片染色用于進一步的分析。
[0096]c.熒光激活細胞分選(FACS):
[0097]根據制造商的說明，同時進行一些修改，使用FACS Aria(Becton, Dickinson andCompany,New Jersey,USA)進行從模型混合物中(n=5)富集FNRBCs的FACS:簡言之,在每5分鐘輕拍的情況下，用FITC結合抗人CD147抗體(10 μ I抗體/IO6個細胞；BD Pharmingen,USA)在4°C黑暗環境下孵育細胞30分鐘；在FACS緩沖液(0.5%BSA/PBS ；0.5M EDTA)中沖洗并分選。同種型對照染色用于消除假陽性事件。細胞在前向(FITC-高或FITC-低)和側向分散(FITC-高/SCC-高或FITC-高/SCC-低)上被設門，使用純AARBC樣本及染色的和未染色的模型混合物建立分選門。細胞被分選到4個涂覆有5%BSA(Sigma,Missouri，USA)的 15ml Eppendorf (Eppendorf, Germany)管中，并標記為 P1-P4 (P 1-AARBC, P2-FITC-高 /SCC-高，P3-FITC-高/SCC-低，P4-碎片)(附圖3)。將細胞成顆粒沉淀，再次混懸到適合的容積來進行細胞計數，然后細胞離心涂片到載玻片上來確定純度。
[0098]賴特氏染色法
[0099]將細胞離心涂片的載玻片風干并通過依次浸入含有添加劑(Aerofix添加劑，ffescor, Utah, USA)的 100% 甲醇(3 分鐘)、喔嚷藍染色液(Wescor, Utah, USA) (3 分鐘)、伊紅染色液(Wescor，Utah, USA) (3分鐘)，在蒸餾水中沖洗并風干來進行染色。[0100]用于識別ε -球蛋白陽性FNRBCs的堿性磷酸酶免疫細胞化學
[0101]對細胞離心涂片的載玻片進行賴特氏染色以用于FNRBCs的形態識別。記錄這些細胞的位置。通過將其置于100%、90%和70%的乙醇中各5分鐘而使含有FNRBCs的載玻片脫色。按照Ponnusamy等人,2008中描述的方案,通過堿性磷酸酶免疫細胞化學識別ε -球蛋白陽性FNRBCs。
[0102]從母血中富集FNRBCs來比較抗⑶147與抗血型糖蛋白A(anti_GPA)的效率
[0103]簡言之，在妊娠終止手術操作(n=5)的5分鐘內采集30ml的外周小靜脈血，并將其分為兩等分來檢測兩種MACS方案:在FNRBCs的CD45+細胞的陰性消耗/GPA陽性選擇以及⑶45+細胞的陰性消耗/⑶147陽性選擇之后，富集FNRBCs。⑶45+白細胞(WBCs)的消耗在兩種方案中類似:將15ml血液稀釋在PBS(1:1)中，在Percoll?( P =1.118g/ml ；GE-Healthcare, Uppsala, Sweden)上分層并進行離心分離(3000rpm, 30分鐘，制動停止)。收集中間層細胞，用含有0.5%BSA的IXPBS沖洗并用結合抗人⑶45的微珠(20 μ I微珠/IO7個細胞；Miltenyi Biotec)在4°C下孵育30分鐘，沖洗除去過量的小珠。使標記的細胞通過LD型MACS柱(Miltenyi Biotec.)。對陰性部分的細胞進行沖洗、計數和處理以在抗GPA或抗CD147MACS操作之后選擇FNRBCs:對于使用抗GPA的選擇，在4°C用結合抗GPA的磁珠(20 μ I微珠/IO7個細胞；Miltenyi Biotec.)孵育細胞30分鐘。沖洗所孵育的細胞并用MS柱(Miltenyi Biotec.)分選。沖洗被洗脫的陽性部分(例如⑶45-/GPA+)并離心涂片到載玻片上。所有的沖洗均用MACS緩沖液(0.5%BSA/PBS ；0.5M EDTA)離心分離10分鐘。
[0104]對于使用抗CD147的選擇，使來自陰性部分的細胞經歷兩次連續的孵育(在4°C條件下各30分鐘，每6分鐘輕拍)并在分選前兩次孵育之間沖洗:第一次孵育用抗CD147抗體(在Ix PBS中1:1000稀釋原料抗體；從每IO7個細胞加入稀釋抗體10 μ I ;在100 μ I最終孵育體積中，BD Pharmingen)，以及第二次孵育用結合大鼠的抗小鼠IgG抗體(在100 μ I的最終孵育體積中每IO7個細胞40μ L，Miltenyi Biotec.)的磁珠。沖洗被洗脫的陽性部分(例如⑶45-/⑶147+)，并細胞離心涂片到載玻片上。通過賴特氏染色對FNRBCs進行形態學上的識別，并通過ε-球蛋白免疫細胞化學確認其身份。
[0105]從TOP前母血中富集FNRBCs
[0106]在手術操作前采集兩批母血樣本(TOP前母血樣本):第一批樣本(各10-20ml ；n=14)在進行本文其他部分描述的FNRBCs的⑶45+/⑶147陽性選擇的陰性消耗之后進行處理來計算載玻片上各樣本的免疫染色e+FNRBCs的數目。第二批樣本(各20ml ;n=3)，進行同樣的處理來富集FNRBCs，該FNRBCs未進行細胞離心涂片但用抗⑶45-AF488和煙酸己可堿染劑染色以進行手工細胞挑選。
[0107]用于手工細胞挑選的細胞染色
[0108]從母血(含有FNRBCs和AARBCs)中富集的⑶147+細胞在Iml的培養基中再懸浮，并用5 μ I的結合熒光基團AF488(Invitrogen，USA)的抗CD45孵育I小時，并加入標記DNA的煙酸己可堿染劑(I μ I原料/Iml細胞懸液,原料濃度10mg/ml ；Invitrogen, USA),孵育15分鐘。細胞在3000rpm條件下旋轉5分鐘，在培養基中再懸浮。在熒光顯微鏡(Olympus1X70，USA)下檢查染色的細胞，所有的孵育均在37°C條件下進行。人外周血單核細胞用作染色對照，該細胞對CD45和煙酸己可堿均為陽性。[0109]用顯微操作器手工挑選煙酸己可堿染色的細胞
[0110]在顯微操作器(Narishige, Japan)和倒置顯微鏡(Olympus 1X70, USA)的幫助下，手工挑選對煙酸己可堿呈陽性和對⑶45-AF488呈陰性的單個FNRBCs。染色的細胞在培養基中進行再懸浮(1-31106個細胞/10(^1的培養基)。在60mm培養皿中，100 μ I的抗00454?488/煙酸己可堿染色細胞懸液、5(^1的培養基(用于收集挑選出的細胞)及50μ1的Ix PBS(用于沖洗細胞)作為單獨的小滴裝載。內徑為20μπι的微量移液管(Origio，USA)置于染色細胞懸液小滴中。識別出煙酸己可堿陽性和⑶45-AF488陰性的FNRBCs,將其手工挑選出來，并在轉移到PCR管之前，將其連續轉移到含有培養基和IxPBS的小滴中，在-20°C條件下忙藏以用于進一步分析。培養基包含Iscove氏改良的Dulbecco氏培養基(IMDM, Invitrogen Gibco, USA)+30% 胎牛血清(FBS, Biochrom AG, Germany) +1%牛血清白蛋白(BSA, Invitrogen Gibco,USA)+lCT4mol/l β -疏基乙醇(Invitrogen Gibco,USA)+100 μ g/ml 鐵飽和轉鐵蛋白(Sigma-Aldrich, USA)+1% 抗生素抗霉菌素(InvitrogenGibco, USA)。
[0111]全基因組擴增(WGA)
[0112]使用Picoplex?WGA試劑盒(Rubicon Genomics,MI,USA)中的 7μ I 細胞提取緩沖液將手工挑選的細胞溶解。使用試劑盒中提供的Extraction Cocktail通過75°C孵育10分鐘，接著95°C孵育4分鐘，將DNA提取出來。使用Picoplex?WGA試劑盒(Rubicon Genomics)進行WGA，根據廠商建議擴增16個循環。全部的擴增DNA的樣本的質量和數量在進行PCR之前通過凝膠電泳進行 評價。來自母體和胎盤細胞的CD45+細胞中的DNA也被提取出來。
[0113]用于胎兒性別確定的實時PCR
[0114]用PE Applied Biosystems7000 型測序儀(Applied Biosystems, CA, US)進行實時PCR分析。分析內源對照球蛋白(HBB)和胎兒性別確定的男性性別決定區Y(SRY)。使用下列 SRY 和 HBB 引物和探針(AIT Biotech, Singapore):SRY 正向，5’ -TGG CGA TTAAGT CAA ATT CGC-3，(SEQ ID NO:1) ;SRY 反向，5，-CCC CCT AGT ACC CTG ACA ATG TATT-3 (SEQ IDNO: 2)，;SRY 探針，5’ _(6_FAM)AGC AGT AGA GCA GTC AGG GAG GCA GA (TAMRA)(SEQ ID NO:3) ;HBB 正向，5，-GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG A_3，(SEQ ID NO:4) ;HBB 反向，5，-CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3，(SEQ ID NO:5) ;HBB探針，5，-(VIC)AAG GTG AACGTG GAT GAA GTT GGT GG(TAMRA)_3，(SEQ ID NO:6) ?將已知起始濃度的商業男性基因組DNA(Promega，Madison，USA)連續稀釋(5倍)來生成HBB和SRY的標準曲線。在同一測定中，樣本和標準品在三份中分離。每一個PCR在三份中包括水空白作為擴增陰性對照。使用 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)在 25 μ I 的反應體積中建立反應。SRY和HBB引物在450ηΜ的終濃度中使用以及探針在225ηΜ的終濃度中使用。3微升的WGA產物和60ng的基因組DNA用于擴增。SRY和HBB的熱循環以在50°C孵育2min開始，以使尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)發生作用，接著進行在95°C 10分鐘的第一次變性步驟，然后是95°C 15秒和60°C I分鐘的55個循環。
[0115]統計數值
[0116]用SPSS 統計軟件(SPSS 公司，USA)和 GraphPad (GraphPad 軟件公司，USA)，以Bonferroni校正后的AN0VA、WiIcoxon符號秩次檢驗或曼-懷二氏檢驗,確定統計學差異。
[0117]結果[0118]從經歷終止妊娠(TOP)的患者獲得的胎盤絨毛中提取FNRBCs。通過免疫細胞化學(ICC)來研究在FNRBCs和AARBCs上的31個選定的表面抗原的免疫定位:⑶147 (Basigin)顯示不同細胞類型之間的差異表達。抗⑶147抗體用于從模型混合物(FNRBC IxlO5個細胞:AARBC49xl05個細胞；n=5)中富集FNRBCs，用免疫磁性(磁激活細胞揀選法(MACS)和Dynal系統)和流式細胞計數(FACS)分離方法對回收率進行評價。用抗CD45抗體和抗⑶147抗體在DGC/MACS之后從15ml的TOP后母血(n=5)中富集FNRBCs ;該方案還與用抗GPA磁珠代替抗CD147作為對比。用形態學和免疫學(e-球蛋白)方法鑒定富集的FNRBCs。計算來自母血的e+FNRBCs的回收率。使用抗⑶147從20ml TOP前母血(n=14)中富集FNRBC，并用形態學和免疫學(e-球蛋白)方法鑒定。作為原理驗證，從懷有男性的母體內獲得20ml TOP前母血(n=3)，正如通過SRY基因的聚合酶鏈反應(PCR)顯示于此的，所富集的FNRBCs確實是胎兒細胞。
[0119]免疫細胞化學篩選顯示表面抗原CD147具有統計學上顯著的差異表達，在FNRBCs (122.46±22.21AU)上強，在 AARBCs (205.11 ±7.08AU)上弱 / 不能檢測到。與其他技術相比(FACS12.1%和Dynal56.7%) ,MACS從模型混合物中回收了 79.7%的FNRBCs，并且相對于其他兩種技術(13%)，所分離混合物的純度最高的是FACS (64.9%)。使用抗⑶147抗體從TOP后母血中富集的e+FNRBCs的數目高于用抗GPA抗體的(16個細胞/15ml對12個細胞/15ml);并且前者用于分析的載玻片的數目大幅度減少55%(p〈0.05)。使用抗CD147抗體，相對于抗GPA抗體，每個分析載玻片，妊娠的前三個月的e+FNRBCs回收率中間值高300%(0.53對0.18)。使用抗⑶147抗體從TOP前母血中富集的e+FNRBCs的數目的中間值(土SD)為20±3個細胞(范圍:6-46個細胞)，并且每毫升母血約富集1.16個e+FNRBC。使用單細胞全基因組擴增(WGA)技術擴增來自FNRBCs的胎兒DNA，并且證實了男性FNRBC從懷有男性胎兒(n=3)的母親的TOP前母血中的富集。
[0120]結論
[0121]不管目前侵入性的胎兒檢測的精確性，唐氏綜合癥的發生率仍然大約為在1000個出生中為I個。這是由于侵入性檢測用于少數妊娠，高齡孕婦(>35歲)。由于在既定胎兒中醫源性并發癥的風險大于唐氏綜合癥的發生率，雖然4/5的唐氏綜合癥嬰兒出生于35歲以下的母親，但是未給他們提供侵入性檢測。非創傷性產前診斷(NIPD)能夠消除對侵入性胎兒檢測的需要。
[0122]使用自動化的顯微操作、激光捕獲顯微鏡檢查系統以及與陣列CGH技術結合的單細胞全基因組擴增的下游分析有可能分離并分析從百萬有核母體細胞中回收的少至I個FNRBC的胎兒DNA。因此，并非不可想象的是，從正在進行的整倍體妊娠的母血中富集的很小數目的胎兒細胞(?20個細胞)可能足夠進行非創傷性的產前診斷。
[0123]目前用于分離FNRBC的方案是耗時耗力的，并且同時分離大量的無核成體紅細胞導致純度低。通過方案中各個步驟的自動操作可以克服上述限制。
[0124]在多個步驟的富集方案中，尤其是在第一步密度梯度離心，FNRBCs常常損失。使用微流體分離裝置，從大量的母體AARBCs背景中分離FNRBCs是可能的。與新加坡生物工程和納米技術研究所(Institute of Bioengineering and Nanotechnology Singapore)合作，已檢測了該分離裝置。基于FNRBCs和AARBCs的物理性質(例如大小和變形性)發展微流體裝置的應用來分離兩種不同類型的細胞，FNRBCs和AARBCs。基于硅的叉流式微過濾設備在0.3mL/分鐘的流速下從模型混合物中回收74%的FNRBC，損耗一半的AARBCs。這表明在剛過一小時的時間內可以處理20ml的母血。然而，該微流體裝置的回收效率可以通過結合納米圖形化的表面和隨后涂覆特定的細胞黏附分子而進一步被提高。在表面上涂覆有特定的細胞黏附分子的新的微流體設計顯示出提升的分離時間和捕獲細胞的比率。
[0125]對FNRBC進行手工載玻片掃描嚴重依賴于觀察者。掃描載玻片的持續時間取決于觀察者的效率，易受觀察者過失的影響。使用如MetaFer (MetaSystems, Altlussheim,Germany)> IMSTAR Pathfinder(Paris, France)和 Ikoniscope(Ikonysis, Connecticut,USA)的平臺，可以實現該過程的自動化。例如MetaFer系統能夠通過結合標記物和熒光染料的形態學自動成像。MetaFer系統平臺是高處理量的，因為其用高清晰度的CCD攝影機和自動載玻片裝載器進行快速掃描(6-15分鐘/載玻片)。自動載玻片裝載器具有讀取80個載玻片的能力，其能夠自動和無監管地將高達十個8片規格的架裝載到掃描臺上。
[0126]使用由加上定制軟件的市售菌落挑選儀組成的自動平臺，可以篩選并分析從母血中獲得的FNRBC。Choi說明了該自動化方法識別和分離靶細胞的效用，達到了 100%的選擇率和專一性。Long和同事們設計并檢驗了一種在亮視野顯微鏡檢查中用于細胞識別的有效算法，其避免了用戶使用昂貴的熒光探針并受到可利用的熒光通道的數量的限制。
[0127]Huang等人(2008)用結合了用于基于大小的細胞分離的微流體芯片(CSM)和用于基于血紅蛋白的細胞分離的磁性裝置(HE)的微流體系統，從58名孕婦的外周血中富集FNRBCs。該微流體系統能夠富集每毫升母血平均37.44個FNRBC(范圍:
0.37 - 274.36FNRBC/mL)。CSM/HE系統在2_6小時內能夠處理5_20毫升的母體全血。
[0128]Kilpatrick等人(2004)和Seppo等人(2008)利用特別用于胎兒細胞的識別和分析的Ikoniscope機器人顯微鏡檢查平臺。用兩種基本途徑研究母體循環內的胎兒細胞的檢測；基于FISH的掃描和基于抗體的掃描。在前一種情況中，根據在男性胎兒妊娠中存在的Y染色體來識別胎兒細胞，后者則基于胎兒血紅蛋白的表達來識別胎兒細胞。在來自男性妊娠的29個樣本的27個中識別出了胎兒細胞。通過允許每周24小時/7天的無監管處理和操作的自動載玻片/盒輸送器將多達175個載玻片供給到鏡臺。
[0129]FNRBCs和AARBCs表面上的蛋白質糖基化顯示出了差異。通過差示植物凝血素結合選擇(大豆凝集素，SBA),這種差異用于細胞分離。Kitagawa等人(2004)憑借從ImL的母血中回收平均6.57+/-7.12個細胞，論證了 SBA用于胎兒NRBCs富集的有效性。在相似的研究中，Shinya等人(2004)用SBA分離、顯微操作和PCR分析識別了全部七例的胎兒基因。
[0130]在此說明的是，⑶147在原始FNRBCs上表達強，并且是一種用于無創傷性產前診斷的從母血中富集FNRBCs的標記物。相應的，此處提供用于獲取、分選和/或分離FNRBCs的改良的方法
[0131]
【權利要求】
1.一種從樣本中檢測、分離和/或離析至少一種胎兒有核紅細胞(FNRBC)的方法，包括: a)用離心法在包含選自1.077-1.120g/ml的密度的密度梯度介質中處理樣本； b)使樣本與在至少1:20，000的濃度下的特異性結合CD147的抗體或其抗原結合片段接觸，從而制成一種混合物； c)保持該混合物處于在所述試劑和樣本中的CD147之間形成復合物的狀態下；以及 d)從混合物中分離所述復合物； 從而從樣本中檢測、分離和/或離析FNRBC。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其抗原結合片段的濃度選自至少1:10，000、至少 1:1000 和 1:100。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述密度梯度介質包括Percoll?溶液。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述的Percoll?溶液具有1.118g/ml的密度梯度。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述抗體為多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化 抗體或其結合。
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，利用免疫磁性分離法、流式細胞計量術或其結合，從所述混合物中分離免疫復合物。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述樣本是母血、母體組織、臍帶血或其結合。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述的母體組織是滋養層組織、肝臟組織、胎盤組織或其結合。
9.根據權利要求7所述的方法，其中，每毫升母血中分離出大約1.16個e+FNRBCs。
10.根據權利要求7所述的方法，其進一步包括使所述母血與特異性結合至少一種白細胞上的至少一種標記物的抗體或其抗原結合片段接觸。
11.根據權利要求10所述的方法，其中，所述標記物為⑶45、⑶14或其結合。
12.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其進一步包括使所述樣本與核染劑接觸。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，所述核染劑為煙酸己可堿染劑、DAPI染劑、吖啶橙或其結合。
14.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，從免疫復合物中進一步分離所述FNRBC。
15.根據權利要求14所述的方法，其中，從免疫復合物中分離所述FNRBC包括將所述免疫復合物置于低pH。
16.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，進一步檢測所述FNRBC用于性別辨別。
17.根據權利要求16所述的方法，其中，用于性別辨別的檢測是確定SRY基因的存在，其中，如果存在SRY基因，則胎兒為男性，而如果不存在SRY基因，則胎兒為女性。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，使用全基因組擴增和實時聚合酶鏈式反應(PCR)檢測SRY基因。
19.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，進一步檢測所述FNRBC用于至少一種產前異常。
20.根據權利要求19所述的方法，其中，所述的產前異常選自染色體病、基因病或其結合。
21.根據權利要求20所述的方法，其中，所述的產前異常選自唐氏綜合征、愛德華茲綜合征、帕塔綜合征、神經管缺陷、脊柱裂、顎裂、泰-薩克斯病、鐮刀形紅細胞貧血病、地中海貧血病、囊性纖維病、脆性X染色體綜合征、脊髓性肌萎縮、肌強直性營養不良、杭廷頓氏舞蹈病、夏-馬-圖三氏病、血友病、杜克肌營養不良、線粒體異常、遺傳性多發性外生骨疣、成骨不全癥及其結合。
22.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述的FNRBCs用熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(PCR)、多重配體依賴性探針擴增(mpla)、短腱重復分析、陣列比較基因組雜交(CGH)、基因分型、單重序列測定、大規模平行序列測定或其結合進行進一步的檢測。
23.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述的FNRBCs來自孕早期、孕中期或孕晚期的母親。
24.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述FNRBCs為人FNBRCs。
25.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述樣本包含至少一種去核紅細胞(ARBC)。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，所述ARBC為成體去核RBC(AARBC)。
【文檔編號】G01N33/53GK103797368SQ201280032761
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年6月28日 優先權日:2011年6月30日
【發明者】安妮沙·布蒂里·馬幼淋, 速酷馬·頗努薩米, 普里亞·卡當派, 馬海施·楚蘭尼 申請人:新加坡國立大學