獲得針對前加壓素原或其片段的結合物的方法
【專利摘要】獲得和/或驗證針對的前加壓素原(SEQ?ID?NO.1)或其至少6個氨基酸長度的片段(包括和肽素(SEQ?ID?NO.2))的結合物的方法，包括至少一個以下步驟：a)使用開發物產生所述結合物，所述開發物包含與前加壓素原(SEQ?ID?NO.1)的C端部分相對應、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少6個氨基酸長度的氨基酸序列；b)確定所述結合物是否能夠結合與前加壓素原(SEQ?ID?NO.1)的C端部分相對應、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少4個氨基酸長度的氨基酸序列；c)從多種結合物選擇并且任選地分離能夠結合與前加壓素原(SEQ?ID?NO.1)的C端部分相對應、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的氨基酸序列的結合物；d)采用所述結合物實施結合測定，以確定生物樣品中前加壓素原或其至少6個氨基酸長度的包括和肽素在內的片段的離體穩定性；e)采用所述結合物和另一種用于比較目的的結合物實施結合測定，以確定生物樣品中前加壓素原或其至少6個氨基酸長度的包括和肽素在內的片段的濃度；其中C端部分由前加壓素原(SEQ?ID?NO.1)的第138至164位氨基酸組成，以獲得能夠結合與前加壓素原(SEQ?ID?NO.1)的第138至163位氨基酸相對應、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的表位的結合物或結合物的混合物。
【專利說明】獲得針對前加壓素原或其片段的結合物的方法
[0001]本發明涉及獲得和/或驗證針對前加壓素原(prepro-Vasopressin)或其包括和肽素(Copeptin)在內的片段的結合物的方法、結合物和試劑盒，所述試劑盒包含用于定性或定量檢測生物樣品中前加壓素原或其包括和肽素在內的片段的結合物，和用于產生前加壓素原或其包括和肽素在內的片段的肽。
[0002]發明背景
[0003]前加壓素原可以借助信號肽切割加工成加壓素原，所述加壓素原可以進一步加工成加壓素、神經垂體素運載蛋白-2及和肽素，后者代表前體肽的C端部分。加壓素，也稱作抗利尿激素(ADH)，是水和電解質平衡的關鍵調節物。測量生物樣品中的加壓素在臨床工作中是幾乎不可能，原因是與其從循環快速清除、與血清中的血小板相互作用和小尺寸相關的巨大技術難題，見“文獻”，第[0039]段，[1-3]。已經成功地建立以化學計量方式用加壓素一起形成的和肽素作為加壓素的替代標記。這種成功的主要原因是考慮到其極高的離體穩定性，這使得它適合于例行使用[4-6]。
[0004]臨床研究已經揭示出眾多適應癥，其中和肽素的測量提供高度有用的診斷信息，包括心臟疾病、肺病、傳染病、腎臟疾病，水和電解質平衡的病理紊亂及其他[5]。用于檢測和肽素的公布方法是免疫測定法[4，6]。
[0005]前加壓素原和其片段也可以在某些類型的癌癥中異位表達，抗和肽素抗體可以用來檢測組織樣品中的表達(EP1539818A2)。
[0006]盡管已經描述了用于產生抗和肽素抗體的免疫原，關于這些抗體的實際表位知之甚少(如果有的話)。表I中列出已描述的抗人和肽素抗體。在現有技術中，未曾注意到以下問題:抗和肽素抗體的表位特異性是否或怎樣可能影響使用這類抗體檢測生物樣品中前加壓素原或其包括和肽素在內的片段的準確度和穩健性。反而總體上認為和肽素本身是非常穩定的。用于檢測成熟和肽素的抗體，其表位以相當非特定方式限定為定位于“和肽素C-末端附近”，由德國海德堡Santa Cruz Biotechnology, Inc.提供并推薦用于ELISA和其他應用中。
[0007]表I
[0008]
【權利要求】
1.獲得和/或驗證針對前加壓素原(SEQID N0.1)或其至少6個氨基酸長度的片段的結合物的方法，所述片段包括和肽素(SEQ ID N0.2)，所述方法包括至少一個下述步驟: a)使用開發物產生所述結合物，所述開發物包含與前加壓素原(SEQID N0.1)的C端部分相對應、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少6個氨基酸長度的氨基酸序列； b)確定所述結合物是否能夠結合與前加壓素原(SEQID N0.1)的C端部分相對應、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少4個氨基酸長度的氨基酸序列； c)從多種結合物中選擇并且任選地分離能夠結合與前加壓素原(SEQID N0.1)的C端部分相對應、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的氨基酸序列的結合物； d)以所述結合物進行結合測定，以確定生物樣品中前加壓素原或其至少6個氨基酸長度的片段的離體穩定性，所述片段包括和肽素； e)以所述結合物和另一種用于比較目的的結合物進行結合測定，以確定生物樣品中前加壓素原或其至少6個氨基酸長度的片段的濃度，所述片段包括和肽素； 其中C端部分由前加壓素原(SEQ ID N0.1)的第138至164位氨基酸組成， 以獲得能夠結合與前加壓素原(SEQ ID N0.1)的第138至163位氨基酸相對應、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的表位的結合物或結合物的混合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中第163-164位氨基酸、優選地第162-164位氨基酸和最優選地第161-164位氨基酸從與前加壓素原(SEQ ID N0.1)的C端部分相對應的氨基酸序列中缺失。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中與前加壓素原(SEQID N0.1)的C端部分相對應的氨基酸序列對應于前加壓素原(`SEQ ID N0.1)的第140至163位氨基酸、優選地第142至163位氨基酸、特別優選地第144至163位氨基酸、最優選地第146至163位氨基酸。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述開發物中所包含的氨基酸序列和/或與前加壓素原(SEQ ID N0.1)的C端部分相對應的氨基酸序列中所含有的氨基酸序列含有至少8個、優選地至少10個和最優選地至少12個與前加壓素原(SEQ ID N0.1)的第146至163位氨基酸相對應的氨基酸序列中所含有的連續氨基酸，并且優選地選自包括以下肽的組:由前加壓素原(SEQ ID N0.1)的第146-163位氨基酸(SEQ ID N0.7)、第146-162位氨基酸(SEQ ID N0.8)、第146-161位氨基酸(SEQ ID N0.9)、第146-160位氨基酸(SEQID N0.10)、第 146-159 位氨基酸(SEQ ID N0.11)、第 146-158 位氨基酸(SEQ ID N0.12)和第146-157位氨基酸(SEQ ID N0.13)組成的肽。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述結合物能夠結合于氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少6個、優選地至少8個、更優選地至少10個和最優選地至少12個與前加壓素原(SEQ ID N0.1)的第146至163位氨基酸相對應的氨基酸序列中所含有的連續氨基酸，優選地結合于選自前加壓素原(SEQ ID N0.1)的第146-163位氨基酸(SEQID N0.7)、第 146-162 位氨基酸(SEQ ID N0.8)、第 146-161 位氨基酸(SEQ ID N0.9)、第146-160 位氨基酸(SEQ ID N0.10)、第 146-159 位氨基酸(SEQ ID N0.11)、第 146-158 位氨基酸(SEQ ID N0.12)和第146-157位氨基酸(SEQ ID N0.13)的氨基酸序列。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中確定步驟b)包括表位定位。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中，尤其在步驟d)和/或e)中，通過以下方式確定所述結合物與所述表位結合的特異性:與用于比較目的的另一種結合物、優選地已知不需要前加壓素原(SEQ ID N0.1)的所述第164位氨基酸來結合所述表位的結合物的表位特異性進行比較。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中選擇步驟包括親和分離。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其 -包括步驟a)，但是不包括步驟b)、c)、d)和e)、或 -包括步驟b),但是不包括步驟a、c)、d)和e)、或 -包括步驟c)，但是不包括步驟a)、b)、d)和e)、或 -包括步驟d)，但是不包括步驟a)、b)、c)和e)、或 -包括步驟e)，但是不包括步驟a)、b)、c)和d)、或 -包括步驟b)和c),但是不包括步驟a)、d)和e)。
10.肽，所述肽除了連接部分之外，由下述部分組成或包含下述部分以作為功能部分:至少6個、優選地至少8個、更優選地至少10個和最優選地至少12個與前加壓素原(SEQID N0.1)的第146至163位氨基酸相對應的氨基酸序列中所含有的連續氨基酸，優選地，選自包括以下肽的組的肽:由前加壓素原(SEQ ID N0.1)的第146-163位氨基酸(SEQID N0.7)、第 146-162 位氨基酸(SEQ ID N0.8)、第 146-161 位氨基酸(SEQ ID N0.9)、第146-160 位氨基酸(SEQ ID N0.10)、第 146-159 位氨基酸(SEQ ID N0.11)、第 146-158 位氨基酸(SEQ ID N0.12)和第146-157位氨基酸(SEQ ID N0.13)組成的肽。
11.根據權利要求10所述的肽在根據權利要求1至9中任一項所述的方法中用作開發物的用途。
12.結合物，其通過根據權利要求1至9中任一項所述的方法或根據權利要求11所述的用途可獲得。
13.根據權利要求12所述的結合物，即抗體，優選地單克隆抗體、多克隆抗血清、富集或純化的多克隆抗體、重組抗體、或其功能衍生物。
14.根據權利要求12或13所述的結合物的用途，用于定性或定量地檢測生物樣品中前加壓素原或其片段，所述片段包括和肽素。
15.根據權利要求14所述的用途，其中所述生物樣品是選自包括血液、血清、血漿、尿、腦脊液和唾液的組的體液。
16.根據權利要求14或15所述的用途，其中使用至少一種額外的結合物，所述額外的結合物能夠結合與前加壓素原(SEQ ID N0.1)的第126至164位氨基酸相對應的氨基酸序列中完全或部分地含有的表位。
17.根據權利要求16所述的用途，其中所述至少一種額外的結合物是抗體，優選地單克隆抗體、多克隆抗血清、富集或純化的多克隆抗體、重組抗體、或其功能衍生物。
18.用于定性或定量檢測生物樣品中前加壓素原或其片段的試劑盒，所述片段包括和肽素，所述試劑盒包含根據權利要求12或13所述的結合物。
【文檔編號】G01N33/68GK103635806SQ201280028825
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年6月26日 優先權日:2011年6月30日
【發明者】J·施特魯克 申請人:B.R.A.H.M.S有限公司