冠狀動脈疾病的生物標志物的制作方法

冠狀動脈疾病的生物標志物的制作方法
【專利摘要】在多個實施方案中，提供了鑒定哺乳動物具有提高的不利心血管事件風險(例如MI)和/或確定哺乳動物的預后的方法。在某些實施方案中，該方法包括確定與來自哺乳動物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平或導致其得到確定，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，抗MAA加合物抗體的提高的水平指示所述哺乳動物患有一種或多種動脈粥樣硬化病變和/或存在心肌梗死的提高的風險。
【專利說明】泡狀動脈疾病的生物標志物
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年3月11日申請的USSN61/451729的優先權和利益，其通過引用被整體并入本文，用于所有目的。
[0003]政府支持申明
[0004][不適用]
[0005]發明背景
[0006]動脈粥樣硬化后遺癥，諸如外周動脈閉塞性疾病、冠狀動脈疾病以及中風性腦發作，仍然是美國、歐洲和大部分亞洲地區的主要死亡原因之一。具體來說，冠狀動脈疾病(CAD)是美國的死亡率的首要原因和2.7個美國人中的一個人的死亡的原因。
[0007]動脈粥樣硬化的發展被認為是動脈血管壁的慢性進行性炎癥，其以生長因子、細胞因子和細胞相互作用的復雜的相互作用為特征。一般來說，LDL和其他的蛋白質成為氧化態、結合并激活內皮細胞，隨后移入環繞脈管系統的組織內。巨噬細胞結合到激活的內皮細胞上并滲入該區域內。巨噬細胞和內皮細胞上的清道夫受體(SR)結合并內在化這些材料形成“泡沫細胞”。發生脂質過氧化且更多結合到內皮巨噬細胞上的LDL和蛋白質被氧化。諸如選擇蛋白、整合素、ICMA-1、VCAM-1和血小板-內皮-細胞粘附分子_1等的內皮粘附分子的表達，介導內腔中單核細胞和T淋巴細胞的粘附且炎癥細胞因子/趨化因子(例如，IL-6、CRP、TNF、IL-1等)得到釋放。最后發生大量的細胞凋亡/壞死。斑塊變得不穩定且最終帽被破壞。
[0008]重要的是，70%的40歲及更年長的個體患有CAD，然而，其為亞臨床的，沒有體征。同樣，目前還不存在可用的能鑒定這些CAD個體的非侵害性測試。對這些患者進行侵害性測試(例如，心臟導管插入)以確定非阻塞性和亞臨床的CAD的存在是禁忌的。包括計算機斷層掃描(CT)和磁共振(MR)冠狀動脈造影(CTA和MRA)的非侵害性成像在檢測這些CAD病灶中是不可靠的。
[0009]發明概述
[0010]在多個實施方案中，提供了鑒定哺乳動物具有不利心血管事件(例如，心肌梗死)的提高的風險和/或確定哺乳動物的預后的方法。在某些實施方案中，方法通常包括確定與來自哺乳動物的生物樣品中丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，抗體的提高的水平指示哺乳動物患有一種或多種動脈粥樣硬化病變。在某些實施方案中，方法包括確定與加合物結合的IgG抗體，和/或與加合物結合的IgM抗體，和/或與加合物結合的IgA抗體的存在和/或水平，或使其得到確定。在某些實施方案中，IgG抗體和/或IgM抗體的提高的水平(相比正常健康的哺乳動物中發現的水平)指示哺乳動物具有一個或多個動脈粥樣硬化斑塊且存在心臟動脈疾病的風險。在多個實施方案中，IgG和/或IgM抗體越高，疾病嚴重度和/或不利的事件(例如，心肌梗死)的風險越大。在某些實施方案中，相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，IgA抗體提高的水平指示哺乳動物患有穩定型心絞痛。在某些實施方案中，與提高的IgG和/或IgM相關的正常健康的哺乳動物中發現的水平可比擬的IgA抗體的水平指示哺乳動物患有不穩定型心絞痛，且存在明顯的心肌梗死風險。在多個實施方案中(例如，高IgG和/或IgM和高IgA)，哺乳動物作為具有提高的不利心血管事件風險的個體和/或作為患有穩定型心絞痛的個體接受治療。在某些實施方案中(例如，高IgG和/或IgM和低IgA)，哺乳動物作為具有不穩定型心絞痛且存在明顯的心肌梗死風險的個體接受處理。在某些實施方案中，哺乳動物被開出補充測試的處方和/或需進行補充測試。在某些實施方案中，補充測試不為與MAA加合物結合的抗體的測量。在某些實施方案中，補充測試包括選自以下的一種或多種測試:心臟組織損傷或高心臟病發作風險的血液檢查、心電圖、壓力測試、冠脈MRI和冠狀動脈造影。在某些實施方案中，血液檢查包括選自以下的一種或多種測試:肌鈣蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌紅蛋白。在某些實施方案中，壓力測試包括選自以下的一種或多種測試:運動耐量測試、核壓力測試和壓力超聲波心動圖。在某些實施方案中，作為對分析數據的響應，哺乳動物被開出治療的處方和/或需治療需改變治療方案。在某些實施方案中，治療包括改變飲食和/或運動。在某些實施方案中，治療包括給予一種或多種藥物(例如，選自以下的一種或多種藥物:他汀類、β_受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、血管緊張素受體受體阻滯劑(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、鈣通道阻滯劑以及雷諾嗪)。在某些實施方案中，治療為選自以下的治療:血管成形術、支架植入和冠狀動脈搭橋手術。在某些實施方案中，在患者病歷中記錄了抗MAA加合物IgG抗體或抗MAA-1gM抗體水平和/或基于，至少部分基于水平的診斷。在某些實施方案中，在患者病歷中記錄了抗MAA加合物IgA抗體水平和/或基于，至少部分基于水平的診斷。在某些實施方案中，患者病歷由實驗室、醫師診所、醫院、健康維護組織、保險公司或私人病歷網站維護。在某些實施方案中，在選自以下的醫師警示物品上/內記錄了至少部分基于抗MAA加合物IgG抗體水平,和/或IgM抗體水平,和/或IgA抗體水平的診斷:卡、穿戴物或射頻識別(RFID)標記。在某些實施方案中，在非暫時性的計算機可讀媒介上記錄了抗體水平和/或基于抗體水平的診斷。在某些實施方案中，方法還包括告知個體抗MAA加合物抗體和/或至少部分基于抗MAA加合物抗體分析的診斷的結果。在某些實施方案中，與MAA加合物結合的抗體作為差別診斷的一部分被檢測。在某些實施方案中，哺乳動物為非人的哺乳動物，且生物樣品來自非人的哺乳動物。在某些實施方案中，哺乳動物為人，且生物樣品來自人。在某些實施方案中，生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。在多個實施方案中，在分析中檢測抗MAA加合物抗體，在所述分析中，將生物樣品分開以從至少一種其他的樣品組分中分離包含抗體的部分。在某些實施方案中，哺乳動物為已知患有或懷疑患有動脈粥樣硬化和/或已知具有或懷疑具有心血管疾病的一種或多種風險因子的哺乳動物。在某些實施方案中，哺乳動物具有選自以下的一種或多種風險因子:心臟病家族風險、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結締組織病癥、慢性感染以及炎癥性腸病。在某些實施方案中，在分析中檢測了與MAA加合物結合的IgG抗體和/或IgM抗體，和/或IgA抗體，在所述分析中，抗體和/或抗體和MAA加合物之間形成的復合物變成標記有可檢測標記。在某些實施方案中，在分析中檢測了與MAA加合物結合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體，在所述分析中，抗體通過與另一分析組分形成復合物從未結合狀態變成了結合狀態。在某些實施方案中，在分析中檢測了與MAA加合物結合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗體變成固定在固相上。在某些實施方案中，使用選自以下的分析測量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平:SDS/PAGE、等電點聚焦、2維凝膠電泳、血凝分析和免疫分析。在某些實施方案中，使用ELISA分析測量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平。在某些實施方案中，免疫分析包括:提供固定在固相支持體上的MAA加合物；在這樣的條件下將MAA加合物與生物樣品接觸，其中樣品中的抗MAA加合物抗體結合MAA加合物，形成加合物/抗體復合物；及將復合物與特異性結合IgG抗體或IgA抗體，或IgM抗體的檢測抗體接觸，或將復合物與結合任一抗體的檢測試劑接觸；及檢測和/或定量結合的檢測抗體或結合的檢測試劑。在某些實施方案中，檢測抗體被連接到可檢測標記上或被連接到可檢測標記上的另一抗體結合；和/或檢測試劑被連接到可檢測標記上和/或檢測試劑被連接到可檢測標記上的抗體結合；且檢測和/或定量包括檢測和/或定量可檢測標記。
[0011]在多個實施方案中，提供了監測哺乳動物中動脈粥樣硬化和/或冠狀動脈疾病的進展的方法。該方法通常包括:確定與來自哺乳動物的生物樣品中丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定；和將抗體的水平與在先前的時間點測得的哺乳動物的水平比較，其中相比先前的測定，與生物樣品中的MAA加合物結合的抗體的總水平的增加指示哺乳動物中動脈粥樣硬化病變已經惡化；且相比先前的測定，與生物樣品中的MAA加合物結合的抗體的總水平的減少指示哺乳動物中動脈粥樣硬化病變得到減少。在某些實施方案中，在先前的時間點與確定或導致得到確定的時間之間的時期，哺乳動物接受了動脈粥樣硬化，和/或冠狀動脈疾病的治療，且相比先前的測定，與生物樣品中的MAA加合物結合的抗體的總水平增加指示治療具有有限的或沒有功效且哺乳動物中斑塊已經惡化；且相比先前的測定，與生物樣品中的MAA加合物結合的抗體的總水平的減少指示治療至少具有一些功效且哺乳動物中斑塊得到減少。在某些實施方案中，方法包括確定與加合物結合的IgG抗體的存在和/或水平或使其得到確定。在某些實施方案中，方法包括確定與加合物結合的IgM抗體的存在和/或水平或使其得到確定。在某些實施方案中，方法包括確定與加合物結合的IgA抗體的存在和/或水平或使其得到確定。在某些實施方案中，相比先前的測定，與生物樣品中的MAA加合物結合的抗體和/或從IgM至IJ IgG抗體的類別轉換的總水平的增加指示哺乳動物中動脈粥樣硬化病變(斑塊)已經惡化；且相比先前的測定，與生物樣品中的MAA加合物結合的抗體的總水平和/或從IgG到IgM抗體的類別轉換的減少指示哺乳動物中動脈粥樣硬化病變(斑塊)得到減少。在某些實施方案中，相比先前的測定，IgA抗體的增加指示哺乳動物中動脈粥樣硬化病變變得更穩定，和/或治療至少部分地增加哺乳動物中動脈粥樣硬化病變的穩定性。在某些實施方案中，治療包括選自以下的哺乳動物的一種或多種形式:改變飲食、增加運動、開/給予他汀類處方、開/給予β_受體阻滯劑處方、開/給予鈣通道阻滯劑處方。在某些實施方案中，如果測量提供治療具有有限的或沒有功效和/或哺乳動物中病變已經惡化的指示，則對哺乳動物開出補充測試的處方和/或對其進行補充測試。在某些實施方案中，補充測試不為與MAA加合物結合的抗體的測量。在某些實施方案中，補充測試包括選自以下的一種或多種測試:心臟組織損傷或高心臟病發作風險的血液檢查、心電圖、壓力測試、冠脈MRI和冠狀動脈造影。在某些實施方案中，血液檢查包括選自以下的一種或多種測試:肌鈣蛋白1、Τ-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌紅蛋白。在某些實施方案中，壓力測試包括選自以下的一種或多種測試:運動耐量測試、核壓力測試和壓力超聲波心動圖。在某些實施方案中，如果測量提供治療具有有限的或沒有功效和/或哺乳動物中病變已經惡化的指示，則給哺乳動物開出需使用新的治療、不同的治療或補充治療的處方和/或使用新的治療、不同的治療或補充治療對其治療。在某些實施方案中，治療包括給予藥物(例如，選自以下的一種或多種藥物:他汀類、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、血管緊張素受體受體阻滯劑(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、鈣通道阻滯劑以及雷諾嗪)。在某些實施方案中，治療為選自以下的治療:血管成形術、支架植入和冠狀動脈搭橋手術。在某些實施方案中，哺乳動物為非人的哺乳動物，且生物樣品來自非人的哺乳動物，或者哺乳動物為人，且生物樣品來自人。在某些實施方案中，生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、血漿、血清、組織液、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。在某些實施方案中，在分析中檢測抗MAA加合物抗體，在所述分析中，將生物樣品分開以從至少一種其他的樣品組分中分離包含抗體的部分。在某些實施方案中，哺乳動物為已知患有或懷疑患有動脈粥樣硬化的哺乳動物。在某些實施方案中，哺乳動物具有選自以下的一種或多種風險因子:心臟病家族風險、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結締組織病癥、慢性感染以及炎癥性腸病、
[0012]在多個實施方案中，提供了治療哺乳動物的方法，其中該方法包括接受與來自哺乳動物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平的測量，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，抗體的提高的水平指示哺乳動物患有一種或多種動脈粥樣硬化病變；且當抗體顯示提高的水平中，需提供或導致與動脈粥樣硬化相關的補充測試被提供和/或需提供或導致與動脈粥樣硬化相關的補充治療被提供給哺乳動物。在某些實施方案中，方法包括接受與加合物結合的IgG抗體的存在和/或水平的測量。在某些實施方案中，方法包括接受與加合物結合的IgM抗體的存在和/或水平的測量。在某些實施方案中，方法包括接受與加合物結合的IgA抗體的存在和/或水平的測量。在某些實施方案中，接受測量包括取回和/或查看患者病歷中的測量。在某些實施方案中，接受測量包括取回和/或查看來自診斷實驗室的報告中的測量。在某些實施方案中，接受測量包括訂購分析和接收分析結果。在多個實施方案中，相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，IgA抗體提高的水平(例如至少95%置信水平的統計上顯著的提高，優選至少98%的置信水平，更優選至少99%的置信水平，使用任何合適的參數或非參數檢驗)指示哺乳動物患有穩定型心絞痛，且被進一步測試哺乳動物和/或將其作為患有或存在穩定型心絞痛的風險的個體治療。在多個實施方案中，相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，IgA抗體的水平指示哺乳動物患有不穩定型心絞痛且存在明顯的心肌梗死風險，且被進一步測試哺乳動物和/或將其作為患有或存在不穩定型心絞痛和/或心肌梗死風險的個體治療。在某些實施方案中，對哺乳動物開出補充測試的處方和/或需進行補充測試。在某些實施方案中，補充測試不為與MAA加合物結合的抗體的測量。在某些實施方案中，補充測試包括選自以下的一種或多種測試:心臟組織損傷或高心臟病發作風險的血液檢查、心電圖、壓力測試、冠脈MRI和冠狀動脈造影。在某些實施方案中，血液檢查包括選自以下的一種或多種測試:肌鈣蛋白1、Τ-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌紅蛋白。在某些實施方案中，壓力測試包括選自以下的一種或多種測試:運動耐量測試、核壓力測試和壓力超聲波心動圖。在某些實施方案中，給哺乳動物開出需治療的處方和/或對其治療。在某些實施方案中，治療包括給予藥物(例如，選自以下的一種或多種藥物:他汀類、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、鈣通道阻滯劑和雷諾嗪)。在某些實施方案中，治療為選自以下的治療:血管成形術、支架植入和冠狀動脈搭橋手術。在某些實施方案中，哺乳動物為非人的哺乳動物，且生物樣品來自非人的哺乳動物，或者哺乳動物為人，且生物樣品來自人。在某些實施方案中，生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、血漿、血清、組織液、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。在某些實施方案中，在分析中檢測抗MAA加合物抗體，在所述分析中，將生物樣品分開以從至少一種其他的樣品組分中分離包含抗體的部分。在某些實施方案中，哺乳動物為已知患有或懷疑患有動脈粥樣硬化(和/或已知具有或懷疑具有一種或多種動脈粥樣硬化風險因子)的哺乳動物。在某些實施方案中，哺乳動物具有選自以下的一種或多種風險因子:心臟病家族風險、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結締組織病癥、慢性感染以及炎癥性腸病。在某些實施方案中，在分析中確定與MAA加合物結合的IgG抗體和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測量，在所述分析中，抗體和/或抗體和MAA加合物之間形成的復合物變得標記有可檢測標記。在某些實施方案中，在分析中確定與MAA加合物結合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測量，在所述分析中，抗體通過與其他的分析組分形成復合物從未結合狀態變成了結合狀態。在某些實施方案中，在分析中確定與MAA加合物結合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測量，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗體變成被固定在固相上的抗體。在某些實施方案中，使用選自以下的分析測量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平:SDS/PAGE、等電點聚焦、2維凝膠電泳、血凝分析和免疫分析。在某些實施方案中，使用ELISA分析測量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體。在多個實施方案中，免疫分析包括:提供被固定在固相支持體上的MAA加合物；在這樣的條件下將MAA加合物與生物樣品接觸，其中樣品中的抗MAA加合物抗體結合MAA加合物，形成加合物/抗體復合物；和將復合物與特異性結合IgG抗體或IgA抗體，或IgM抗體的檢測抗體接觸，或將復合物與結合任一抗體的檢測試劑接觸；和檢測和/或定量結合的檢測抗體或結合的檢測試劑。在某些實施方案中，檢測抗體被連接在可檢測標記上或被連接在可檢測標記上的其他的抗體結合；和/或檢測試劑被連接在可檢測標記上和/或檢測試劑被連接在可檢測標記上的抗體結合；且檢測和/或定量包括檢測和/或定量可檢測標記。
[0013]在某些實施方案中，提供了用于評估(和/或冠狀動脈疾病)哺乳動物中動脈粥樣硬化的存在和/或預后的試劑盒。在某些實施方案中，試劑盒包含含有MAA蛋白質加合物的包裝；和與結合在MAA蛋白質加合物上的IgG抗體特異性結合的第一試劑和/或與結合在MAA蛋白質加合物上的IgM抗體特異性結合的第二試劑。在某些實施方案中，試劑盒還包含與結合在MAA蛋白質加合物上的IgA抗體特異性結合的第三試劑。在某些實施方案中，第一試劑包含與結合在MAA蛋白質加合物上的IgG抗體結合的抗體。在某些實施方案中，第二試劑包含與結合在MAA蛋白質加合物上的IgM抗體結合的抗體。在某些實施方案中，第三試劑包含與結合在MAA蛋白質加合物上的IgA抗體結合的抗體。在某些實施方案中，MAA蛋白質加合物以被固定在固相支持體上的形式提供。在某些實施方案中，固相支持體包括選自以下的材料:塑料、玻璃、石英、凝膠和金屬。在某些實施方案中，固相支持體選自以下:顆粒、測試條、微量滴定板、ELISA板和微流通道或室。在某些實施方案中，試劑盒還包含教會使用MAA加合物的抗體的測量來評估不利心臟事件風險，和/或來確定哺乳動物的預后，和/或來評估哺乳動物中動脈粥樣硬化的進展，和/或來評估治療方案的指導材料。在某些實施方案中，將試劑盒用于評估不利心臟事件風險，和/或確定哺乳動物的預后，和/或用來評估哺乳動物中動脈粥樣硬化的進展，和/或用來評估治療方案。
[0014]在多個實施方案中，提供了治療哺乳動物的方法，其中該方法包括:給予(或導致得到給予)哺乳動物包含特異性結合到連接在可檢測標記上或能被可檢測標記選擇性結合的MAA加合物上的抗體的組合物；和檢測位于哺乳動物的脈管系統內的標記的位置，其中該位置指示潛在的不穩定斑塊。在某些實施方案中，方法還包括治療該潛在的不穩定斑塊。在某些實施方案中，治療包括對斑塊位于的區域進行血管成形術和/或在斑塊位于的區域內插入支架。
[0015]定義
[0016]術語“生物樣品”或“測試樣品”是指樣品為處于健康和/或病理狀態的生物組織、細胞或液體的樣品，包括待檢測的分析物，例如，對MAA蛋白質加合物(例如，抗MAA加合物IgG、IgA、IgM等)起反應的抗體。此類樣品包括,但不限于--痰/ 口腔液體、羊水、血液、血液部分或細針活檢樣品(例如，手術活檢、細針活檢等)、尿、腹膜液、胸膜液等。盡管樣品通常取自受試人(例如，患者)，但可以將該分析用來檢測來自任何哺乳動物的樣品中的抗MAA加合物抗體，諸如狗、貓、馬、山羊、綿羊、牛、豬等。可以在從生物來源獲得時直接使用樣品或在用來修改樣品的特征的預處理后使用。例如，此類預處理可以包括從血液制備血漿、稀釋粘性流體等。預處理的方法還可以包括，但不限于:過濾、沉淀、稀釋、蒸餾、混合、離心、冷凍、凍干、濃縮、失活干擾組分、添加試劑、溶解等。如果關于樣品采用此類預處理方法，此類預處理方法通常使得目標分析物(例如，抗MAA加合物抗體)保留在測試樣品中，優選以與未處理的測試樣品(例如，即，未經過任何此類預處理方法的樣品)中的濃度成比例的濃度。此類“處理過的”或“加工過的”樣品仍然被認為是關于本文中描述的方法的生物樣品。
[0017]術語“血液”包括全血或諸如血清或血漿的血液部分。
[0018]通過“診斷測試”是指進行的有助于疾病和/或病理的診斷或檢測的任何種類的
醫學檢驗。
[0019]當關于將在如本文中描述的診斷/預后分析中檢測的分析物(例如，抗MAA蛋白質加合物抗體)使用抗體時，指的是內源性的(內在產生的抗體)。抗體通常包含大體上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的一種或多種多肽。公認的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定區基因，以及大量免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被歸類為K或λ。重鏈被歸類為Y、μ、α、δ或ε ,它們反過來定義免疫球蛋白級別,分別為IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE。
[0020]當關于用于檢測特定抗原(例如，MAA加合物)的靶向部分使用抗體時，指的是完全的(完整的免疫球蛋白)或許多通過用不同的肽酶消化產生的得到良好表征的片段的任何一個。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區內的二硫鍵下消化抗體來制造F(ab)’2——Fab的二聚物，其自身為通過二硫鍵連接到Vh-ChI上的輕鏈。可以在溫和條件下減少？(&13)’2來破壞鉸鏈區內的二硫鍵連接，從而將(Fab’)2 二聚物轉化為Fab’單體。Fab’單體本質上為帶有部分絞鏈區的 Fab (見，Fundamental Immunology, ff.E.Paul, ed., Raven Press, N.Y.(1993)，其為其他的抗體片段的更為詳盡的描述)。雖然不同的抗體片段以消化完整抗體的形式定義，但技術人員應當理解可以化學或通過利用重組DNA方法重新合成此類Fab’片段。因此，術語抗體，如本文中所使用，還包括通過修改整個抗體或使用重組DNA方法重新合成制得的抗體片段。抗體還包括單鏈抗體(作為單個多肽鏈存在的抗體)，例如，單鏈Fv抗體(sFv或scFv),在該抗體中可變重鏈和可變輕鏈被連接在一起(直接或通過連接肽)來形成連續的多肽。單鏈Fv抗體通常為共價連接的VH-VL異質二聚體，其可能由包含直接連接或通過肽編碼性連接物連接在一起的VH和VL編碼序列的核酸表達而來(見，例如，Huston, et al.(1988) Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 85:5879-5883) ?
[0021]“MAA加合物”指的是按先前所述用MAA部分修飾的任何大分子(見，例如，Hill etal.(1998) Atherosclerosis, 141:107-116，美國專利 5939535 等)。“MAA 蛋白質加合物”指的是用MAA部分修飾的蛋白質。
[0022]“抗MAA加合物抗體”或“抗MAA蛋白質加合物抗體”指的是與MAA蛋白質加合物特異性結合(例如，與之反應)的抗體。MAA蛋白質加合物可以為哺乳動物中天然存在的加合物，或經過合成制得的加合物。
[0023]“心血管疾病”為心血管障礙，如本文中所定義，其以臨床事件為特征，包括臨床癥狀和臨床跡象。臨床癥狀為可指示臨床醫師病理存在的由患者匯報的那些經歷。臨床跡象為通過可指示臨床醫師病理存在的身體或實驗室檢查發現的那些客觀發現。心血管疾病的臨床癥狀包括胸痛、呼吸淺短、虛弱、短時間意識喪失、意識變化、劇痛、陣發性夜間呼吸困難、短暫性腦缺血發作和其他的患者經歷的此類現象。心血管疾病的臨床跡象包括如EKG異常、改變的外周脈沖、動脈雜音、不正常心聲、羅音和喘氣聲、頸靜脈擴張、神經病變的此類發現以及臨床醫師識別的其他的此類發現。臨床癥狀和臨床跡象可以在諸如心肌梗死(MI)或中風(也被稱為“腦血管意外”或“CVA”)的心血管疾病中聯合在一起，其中患者會匯報某些現象(癥狀)且臨床醫 師會識別其他的現象(跡象)，它們都能指示潛在的病理。心血管疾病包括與易碎斑塊病癥 、閉塞性病癥和狹窄的心血管障礙相關的那些疾病。例如，由易碎斑塊病癥引起的心血管疾病，由于以下定義了那一術語，可以將其稱為“易碎斑塊疾病”。與易碎斑塊疾病相關的臨床事件包括那些跡象和癥狀，其中伴隨隨后的急性血栓形成或伴隨末梢栓塞的易碎斑塊的破裂為標志。易碎斑塊疾病的實例包括某些中風和心肌梗死。另一個實例，由閉塞性病癥引起的心血管疾病可以被稱為“閉塞性疾病”。與閉塞性疾病相關的臨床事件包括那些跡象和癥狀，其中動脈的漸進性閉塞可影響到達目標組織的流通的量。漸進性動脈閉塞可以引起漸進性局部缺血，其中如果流通的量不足以維持組織，漸進性局部缺血可能最終發展為組織壞死。閉塞性疾病的跡象和癥狀包括:跛、靜息痛、心絞痛和壞疽，以及指示血管狹窄和減少的末梢灌注的身體和實驗室發現。另一個實例，由再狹窄引起的心血管疾病可以被稱為支架內狹窄疾病。支架內狹窄疾病包括由作為如同經皮經腔的血管成形術的程序的一部分放置的動脈支架的漸進性堵塞引起的跡象和癥狀，其中支架的存在試圖幫助血管保持其新的擴大的構型。伴隨支架內狹窄疾病的臨床事件為由經過改造的動脈的再狹窄引起的事件。
[0024]“冠狀動脈疾病”(“CAD”)指的是與服務心臟的動脈的堵塞相關的血管病癥。堵塞可以通過諸如斑塊破裂或栓塞的機制突然發生。堵塞可以漸進式地發生，通過肌內膜增生和斑塊形成使動脈變窄。由服務心臟的動脈的堵塞引起的那些臨床跡象和癥狀為冠狀動脈疾病或動脈粥樣硬化的臨床表現。冠狀動脈疾病的臨床表現包括:心絞痛、局部缺血、心肌梗死、心肌癥、充血性心力衰竭、心律失常和動脈瘤形成。應當理解冠脈循環中的易碎斑塊疾病與顯現為心肌梗死的動脈血栓形成或末梢栓塞相關。應當理解冠脈循環中的閉塞性疾病與心絞痛癥狀伴隨發生的動脈狹窄一通常需用藥物干預和用血管成形術治療的病癥相關。
[0025]“風險因子”為鑒定與增加的風險相關的因子。心血管障礙或心血管疾病的風險因子為鑒定與增加的可發展那些病癥或惡化那些病癥的風險相關的任何因子。風險因子還可能與患有心血管障礙的患者中不利的臨床事件或不利的臨床結果的增加的風險相關。心血管疾病的風險因子包括，但不限于:吸煙、不利的脂質譜、提升的脂肪或膽固醇、糖尿病、高血壓、聞血壓狀態、提聞的聞半I光氣酸水平以及缺少運動。攜帶特定的多態等位基因可能為特定心血管障礙的風險因子，且可能與特定病癥的增加的風險相關。
[0026]如本文中所使用，術語“治療”試圖包括治愈以及改善疾病的至少一種癥狀或者與病癥相關的至少一種異常情況。治療心血管障礙可以被給予心血管障礙治療替換。治療心血管障礙還可以被修改與心血管障礙相關的風險因子替換。
[0027]如本文中所使用，術語“個體”和“患者”可以可交換地使用，不論個體是否具有或當前正經歷任何形式的治療。如本文中所使用，術語“個體”指的是任何的脊椎動物，包括，但不限于:哺乳動物(例如，奶牛、豬、駱騎、美洲騎、馬、山羊、兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、貓、狗、大鼠和小鼠、非人的靈長類(例如，猴子，如獼猴、黑猩猩等)以及人)。優選地，個體為人。
[0028]當提及特定標志物(例如，MAA加合物和/或抗MAA加合物抗體)的存在或水平“指示”特定病理或預后時，沒有試圖暗示該標志物的存在或水平為那一病理或預后的決定性因素。事實上該指示試圖在其他的背景下使用(例如，在差別診斷的背景下)，來告知被進一步測試和/或評估，和/或生活方式/行為變化，和/或來告知需進一步治療或改變治療方案。
[0029]短語“接受測量”(例如，與丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平的)表明接受此類測量的人獲得了由另一來源提供的測量，例如，通過查閱病歷，由來自測試實驗室的報告提供、由患者/患者史提供等。在某些實施方案中，將測量接收為由接受者(例如，內科醫師)訂購的測試的結果。在某些實施方案中，測量可以由接受者進行。
[0030]短語“導致被給予”是指通常由醫學專業人員(例如，內科醫師)或控制個體的醫療護理的人采取的行動，這些行動控制和/或允許將處于爭議中的藥劑給予到個體。導致被給予可以包括合適的治療或預防方案的診斷和/或測定，和/或為個體開具體藥劑的處方。此類開處方可以包括，例如，起草藥方形式、注解病歷等。
[0031]當關于參數(例如，抗體水平)使用術語“提高的”是指該參數落入這樣的范圍內，使得本領域普通技術人員認為關于參考值其為提高的。在某些實施方案中，參考值可以為在先前的時間點測得的個體的值。在某些實施方案中，參考值可以為已知的或確定的具體群體或亞群體(例如，以選自以下的一種或多種因子為特征的亞群體:性別、年齡、種族、體重、健康狀況等)的值。在某些實施方案中，如果其落入具體參考群體的值的最高的25個百分位數，或最高的10個百分位數，或最高的5個百分位數，或最高的2個百分位數，或最高的I個百分位數內，參數被認為是提高的。在某些實施方案中，當在> 95%置信水平，優選在> 98%置信水平，更優選在> 99%置信水平使用任何合適的參數檢驗(例如，ANOVA, t檢驗等)或非參數檢驗，測得水平為統計學上顯著的提高時，參數被認為是提高的。
[0032]附圖的簡要說明
[0033]圖1闡述了形成丙二醛/乙醛加合物(MAA)的機制。
[0034]圖2闡述了形成丙二醛/乙醛加合物(MAA)的第二種機制。
[0035]圖3闡述了抗MAA抗體的一種分析形式的示意圖。
[0036]圖4闡述了相比患有已知的冠狀動脈疾病(CAD)的個體，正常對照中MAA的血清濃度。
[0037]圖5闡述了由患有急性MI的患者中循環性MAA抗體的MAA白蛋白抑制的百分比。這提供了分析特異性的測量。
[0038]圖6闡述了該事件發生時和時間發生后24小時的患有急性心肌梗死的患者中MAA的抗體的血清濃度。
[0039]圖7闡述了來自冠狀動脈旁路移植(CABG)患者的主動脈鉆取活組織檢查中的MAA的存在。
[0040]圖8顯示了易損斑塊的示意圖。
[0041 ] 圖9闡述了 JCR大鼠中抗經MAA修飾的大鼠白蛋白的血清抗體的濃度。數據以6個動物實驗的均值土SEM表示。*P ( 0.004，相比Sprague對照血清的顯著增加。#P ( 0.001，將主動脈與主動脈MAA包被抗原比較的顯著不同。
[0042]圖10闡述了來自JCR大鼠的主動脈組織的經MAA修飾的蛋白質的免疫沉淀反應。數據表示染色88帶的88-kDa的強度，表示為3個動物實驗的均值土SEM，*P=0.005，與Sprague對照大鼠顯著不同。
[0043]圖11顯示了相比患有已知的冠狀動脈疾病(CAD)的個體，正常對照中MAA的IgG抗體的血清濃度。
[0044]圖12顯示了相比患有已知的冠狀動脈疾病(CAD)的個體，正常對照中MAA的IgM抗體的血清濃度。
[0045]圖13顯示了相比患有已知的冠狀動脈疾病(CAD)的個體，正常對照中MAA的IgA抗體的血清濃度。
[0046]發明的詳細描述
[0047]本文中證明了經修飾的蛋白質(具體來說，丙二醛/乙醛加合物(MAA加合物))與冠狀動脈疾病(CAD)相關，且更普遍地相信其與動脈粥樣硬化的進展相關。不受具體理論的束縛，據信MAA加合物通過至少兩種機制在氧化壓力下形成。在圖1中以示意圖模式闡述的一種機制中，丙二醛(MDA)處于高濃度。一些丙二醛降解形成乙醛(AA)。兩個分子結合到可能可接近的蛋白質基質(例如，LDL)上的氨基上，且一個分子的乙醛“粘緊”形成的產物。在圖2中以示意圖模式闡述的第二種機制中，一個分子的MDA結合到蛋白質基質(在圖中闡述為N-乙酰賴氨酸)的氨基上，形成Na-乙酰-N1-(2-丙烯醛)賴氨酸(a)。(a)中的兩分子的產物通過分子(b)的經MDA修飾的末端結合，形成Na-乙酰-N1-賴胺酰-3，5- 二甲酰-2，6-二氫吡啶-4-基-吡啶衍生物。縮合反應發生，導致MAA加合物(c)形成，在這種情形下，為Na-乙酰-N1-賴氨酰-4-甲基-2，6- 二氫吡啶_3，5- 二甲醛衍生物。
[0048]被氧化的蛋白質涉及動脈粥樣硬化的發展的進展。丙二醛/乙醛(MAA)修飾的LDL為高度氧化的，且在用丙二醛修飾蛋白質后形成了優勢表位。[0049]MAA修飾的蛋白質還可與內皮細胞和巨噬細胞上的清道夫受體結合，并提升前炎癥細胞因子的釋放，從而看起來涉及動脈粥樣硬化，且具體來說，斑塊形成的進展。
[0050]重要的是，MAA修飾看起來可引起與抗體制造的免疫反應，其中的抗體制造，如本文中所描述，還與疾病(例如，動脈粥樣硬化，更具體來說，心臟動脈疾病)的進展和惡化相關。MAA修飾和/或抗體制造通過其使疾病惡化的機制還未完全理解。然而，經MAA修飾的蛋白質的抗體的存在不僅詳細說明了 CAD的存在，還詳細說明了 CAD進展的性質。
[0051]具體來說，抗MAA加合物抗體滴定提供了心臟動脈疾病的嚴重性/風險的測量是一個令人吃驚的發現，其中抗MAA加合物抗體的增加的水平指示斑塊負荷和/或斑塊嚴重性的增加的水平。
[0052]不受具體理論束縛，據信在動脈粥樣硬化和心臟動脈疾病的進展中，建立了炎癥位點，其中被氧化的蛋白質和LDL結合、內在化和起始前炎癥反應。一些oxLDL和經MAA修飾的蛋白質被從該位點釋放，并遷移到免疫系統來以負荷依賴性方法啟動免疫反應。起始了與動脈粥樣硬化斑塊的發展以及其進展相關的抗體。MAA的抗體越多，斑塊不穩定的幾率越大。隨著oxLDL和加合的蛋白質積聚，更多的炎癥細胞滲入且斑塊增長，引起心絞痛。最終，炎癥變得具有壓倒性，造成纖維斑塊帽變薄(由于細胞因子和免疫反應)，且由于漏膜和對泄露的經修飾的大分子的響應，抗體濃度增加。最終斑塊破裂導致大量的oxLDL和與循環性抗體結合的經MAA修飾的蛋白質的釋放，引起減少的抗體濃度。
[0053]抗MAA加合物抗體同種型可提供另外的診斷/預后信息為另一令人吃驚的發現。具體來說，抗體的同種型模式可區分動脈粥樣硬化病變性質并允許鑒定以下的患者:1)預期具有急性心肌梗死或心臟病發作(高IgG、低IgA)，和2)以穩定型進展而不會心臟病發作(低 IgG、高 IgA) ο
[0054]不受具體理論束縛，據信在被氧化的蛋白質和LDL結合、內在化和起始如上所述的前炎癥反應的位點建立炎癥。一些oxLDL和經MAA修飾的蛋白質被從該位點釋放，并遷移到免疫系統來以負荷依賴性方法啟動免疫反應，引起IgM抗體的產生。隨著oxLDL和加合的蛋白質積聚，更多的炎癥細胞滲入且斑塊增長，造成心絞痛。最終，炎癥變得具有壓倒性，IgM抗體被類別轉換為更具治病性的IgG抗體，其有助于纖維斑塊帽的變薄(由于細胞因子和免疫反應)，且由于漏膜和對泄露的經修飾的大分子的增加的水平做出的響應，抗體濃度增加。最終斑塊破裂造成大量的oxLDL和經MAA修飾的蛋白質的釋放和急性心肌梗死。
[0055]作為選擇，在患有穩定性CAD的患者體內，oxLDL和加合的蛋白質在帽的外膜邊上(不在脈管系統的內腔內)積聚，且炎癥反應得到減少。釋放的細胞因子引起IgA響應，其具有更少的致病性，且纖維斑塊帽保持完整，引起穩定性CAD。
[0056]因此，個體中抗MAA加合物抗體的抗體同種型的分析提供了病理的嚴重性/預后的指示。
[0057]另外，因為動脈粥樣硬化代表了病理的漸進性連續統，據信抗MAA加合物抗體更普遍地可提供動脈粥樣硬化過程和心血管疾病的嚴重性/進展的指示。
[0058]預測CAD的存在和進展的性質(例如，穩定對不穩定)的能力允許在疾病的典型臨床表現(例如，心肌梗死)前鑒定患者。這一洞察允許鑒定需要用藥物諸如膽固醇降低藥物(例如他汀類)、非侵害性心臟壓力檢查(例如，核研究、壓力超聲波心動圖、CTA、MRA)和/或侵害性心臟檢查(例如，心臟導管插入)治療的患者。使用該工具，在疾病過程的更早的時間點確定存在CAD的發展和/或進展風險的患者是可能的。掌握該知識，可以將患者挑選用于治療，其中的治療對阻止進展具有恰當的侵害性，并阻止或延遲心臟病發作和冠心病的相關的發病和死亡。總之，更恰當改善的醫學檢驗和治療策略有望不僅能允許恰當的更早的治療，還可減少其他的非侵害性和侵害性測試的利用和過度利用。
[0059]診斷/預后分析
[0060]因此，在某些實施方案中，提供了使用抗MAA加合物抗體的檢測/定量的分析，用于鑒定哺乳動物具有提高的不利心血管事件風險和/或確定哺乳動物的預后。該方法通常包括確定與來自所述哺乳動物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，抗MAA加合物的抗體提高的水平指示哺乳動物具有一個或多個動脈粥樣硬化斑塊。在某些實施方案中，測定了抗MAA加合物抗體的總水平，且較高的抗體水平指示較大的斑塊負荷和/或相關的心絞痛和/或較大的不穩定斑塊的風險，因此以及不利心血管事件(例如，心肌梗死、心臟局部缺血等)的風險。
[0061]在某些實施方案中，鑒定了不同的抗MAA加合物抗體同種型的水平。在此類情況下，增加的總抗體滴定量指示較大的疾病嚴重性，如以上所解釋。然而，從IgM到IgG的抗體類別轉換(例如，如由IgG對IgM抗體的增加所證明)指示不穩定斑塊的增加的風險。然而，高IgG和低IgA指示個體預期患有急性心肌梗死或心臟病發作，而低IgG和高IgA指示斑塊形成可能以穩定型取得進展，而不會心臟病發作。
[0062]還可以將這些方法用來監測個體中疾病進展和/或用來評估治療方案。此類方法可以包括:確定與來自哺乳動物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定；和將抗MAA加合物抗體的水平與在先前的時間點測得的所述哺乳動物的水平比較，其中相比先前的測定，與生物樣品中的MAA加合物結合的抗體的總水平的增加指示所述哺乳動物中動脈粥樣硬化斑塊已經惡化；且相比先前的測定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結合的抗體的總水平的減少指示哺乳動物中動脈粥樣硬化斑塊得到減少。如本文中所述，減少的抗體水平可以指示急性心血管事件(例如，斑塊破裂)，其可以引起經修飾的蛋白質的釋放，從而以及抗體水平的減少。當與指示組織損害的其他的生物標志物(例如，提聞的肌I丐蛋白1、CPK、LDL或AST)有關系時，可以通過考慮差別診斷中的其他的因子區別結果。
[0063]再次地，在某些實施方案中，鑒定了不同抗MAA加合物抗體同種型的水平。在此類情況下，從IgM到IgG的抗體類別轉換(例如，如由IgG對IgM抗體的增加所證明)指示增加的風險，而IgG對IgM的減少可以指示個體在改善。類似地，IgG的增加和/或IgA的減少可以指示個體的風險在增加，而IgG的減少和/或IgA的增加可以指示個體以更穩定的方式在取得進展。
[0064]在抗MAA加合物抗體的第一和第二測量之間治療個體時，如上所述的抗體水平的變化提供了治療功效的測量。如果治療顯示具有很少功效的效果，則可以實施不同的治療方案(例如，更為積極的治療方案)。
[0065]在某些實施方案中，可以將本文中描述的診斷/預后方法整合到治療方法中。例如，在某些實施方案中，該方法可以包括接受與來自哺乳動物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平的測量，其中相比常健康的哺乳動物中發現的水平，抗體的提高的水平指示哺乳動物具有一個或多個動脈粥樣硬化斑塊；且當抗體顯示提高的水平時，需提供或導致與動脈粥樣硬化相關的補充測試被提供和/或需提供或導致與動脈粥樣硬化相關的補充治療被提供給哺乳動物。
[0066]再次地，在某些實施方案中，鑒定了不同抗MAA加合物抗體同種型的水平。在此類情況下，從IgM到IgG的抗體類別轉換(例如，如由IgG對IgM抗體的增加所證明)指示增加的風險，且可能需要補充測試和/或更積極的治療方案，而IgG對IgM的減少可以指示個體在改善，且可保證更少積極性的治療方案或應當維持已存在的治療方案。類似地，IgG的增加和/或IgA的減少可是指示個體的風險在增加，需保證更多的測試和/或更具積極性的治療，而IgG的減少和/或IgA的增加可以指示個體在以更穩定的方式取得進展，且可能可以簡單地維持已存在的治療方案或可以減少治療。
[0067]如上面所指出，本文中描述的不同分析的陽性結果可以提供潛在的病理(例如，動脈粥樣硬化/心血管疾病)的存在、嚴重性或增加的嚴重性的指示。在某些實施方案中，陽性結果的存在可以指示/保證進一步的測試。補充測試可以包括，但不限于選自以下的一種或多種測試:HDL/LDL比、總膽固醇、甘油三酯水平、脂蛋白相關的磷脂酶A2 (LpPLA2)、同型半胱氨酸、C-反應性蛋白質(CRP)、HSP70、高密度脂蛋白(HDL)、TNF a、HSP60、肌鈣蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌紅蛋白、壓力測試(例如，運動耐量測試、核壓力測試、壓力超聲波心動圖等)、影像學研究(例如，心臟NMR、血管造影等)等。
[0068]如上面所指出，本文中描述的不同分析的陽性結果可以提供潛在的病理(例如，動脈粥樣硬化/心血管疾病)的存在、嚴重性或增加的嚴重性的指示。在某些實施方案中，陽性結果的存在可以進一步指示/保證治療方案的改變、實施或增加。在某些實施方案中，治療方案可以包括:行為矯正(例如，改變飲食和運動)、給予一種或多種藥物(例如，選自以下的一種或多種藥劑:他汀類、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、鈣通道阻滯劑、雷諾嗪等)，和/或一種或多種程序(例如，血管成形術、支架植入、冠狀動脈搭橋手術、血管移植等)。
[0069]所上面所指出，在多個實施方案中，測量對MAA蛋白質加合物起反應的抗體(例如，抗MAA加合物IgG、IgM、IgA等)，來提供個體中斑塊形成的存在和/或嚴重性和/或此類斑塊的預后的指示。在某些實施方案中，參照正常健康的個體內發現的可比較的抗體水平評估了抗體水平。在某些實施方案中，參照在先前的時間點測得的個體中抗體水平評估了抗體水平。
[0070]在任何給定的群體中，具有對MAA加合物的反應性的抗體的水平可能存在差異。在某些實施方案中，可以通過參考較廣的群體中觀察的范圍，將測得的任何給定個體的具有對MAA加合物偶聯物的反應性的抗體的水平歸類為高或低。例如，可以將參照較廣種群測得的此類抗體的低于特定百分位值的水平歸類為低水平。在某些實施方案中，低水平可能對應于低于第25百分位數，或低于第20、第10或第5百分位數的值。在某些實施方案中，高水平可能對應于，例如超過第5、第10、第20或第25百分位數的值。
[0071]顯然，本發明提供的診斷和預后方法需要一定程度的定量來確定診斷性抗MAA加合物抗體的量或病理的預后。在某些實施方案中，可以通過包含恰當的參考樣品在本文描述的分析中確定此類定量，其中所述參考樣品為合成樣品(例如，通過提供溶于緩沖液中的已知量的抗MAA加合物抗體)，和/或來源于健康的或正常的個體。[0072]在一個實施方案中，參考樣品包括來源于個體沒有經歷或顯現任何臨床癥狀和/或風險因子時的相同個體的生物樣品(例如血漿、血清、全血、痰、唾液等)。在另一實施方案中，參考樣品包括來源于正常健康的個體的生物樣品。
[0073]因此，對參考樣品和測試(例如，患者)樣品處理、分析或化驗，并比較獲得的參考樣品和測試樣品的數據。在一個實施方案中，在同一時間對參考樣品和測試樣品加工、分析或化驗。在另一實施方案中，在不同時間參考樣品和測試樣品加工、分析或化驗。
[0074]作為選擇，或此外，將測試樣品的數據與參考樣品的來源于先前產生的已確定的數據集的數據比較。因此，在一個實施方案中，參考樣品包括先前使用標準分析方案確定的值或范圍(例如，確定的群體或特定亞群體(例如，根據種族、性別、年齡等挑選的)的)。隨后將來源于加工、分析或化驗測試樣品的數據與獲得的樣品群體的數據比較。
[0075]來源于足夠多的參考樣品以便能代表群體(或亞群體)的數據允許產生可測定特定參數的平均水平的數據集。因此，可以測定個體的任何群體和來源于所述個體的任何樣品的斑塊存在、穩定斑塊的形成、不穩定斑塊的形成等的抗MAA抗體診斷或預后的量，用于隨后的與測定的被分析樣品的表達產物的水平的比較。
[0076]應當認識到本文中描述的分析的陽性或陰性結果不是病理狀態(例如，不穩定斑塊)的特定存在或不存在的決定因素，而通常被用于其他診斷標準的環境中來幫助缺血性心血管疾病的發展或進展的增加的風險的診斷或預后。此類其他的診斷標準包括，例如，但不限于:個體病史、疾病家族風險、生活方式、體重/肥胖/BM1、其他分析的結果，如血壓，HDL/LDL比、總膽固醇、甘油三酯水平、脂蛋白相關的磷脂酶A2(LpPLA2)、同型半胱氨酸、C反應性蛋白質(CRP)、HSP70、高密度脂蛋白(HDL)、TNFa、HSP60、壓力測試、影像學研究等。臨床醫師還可以考慮其他的因素以達到診斷或預后。在某些實施方案中，本文中描述的分析的陽性結果可以指導處方醫師制定其他的測試或程序。
[0077]如果個體被認為具有發展缺血性心血管疾病(例如，心肌梗死)的增加的風險，則可以推薦采取預防性治療和/或生活方式改變。如果個體被診斷為患有漸進性缺血性心血管疾病，他或她的臨床醫師可以建議采取適合該個體的治療和/或生活方式改變。
[0078]生物樣品中的抗MAA加合物抗體的檢測/定暈。
[0079]如上所述，個體(例如，人或非人的哺乳動物)中抗MAA抗體的水平可提供量/嚴重性和/或個體中斑塊形成和/或此類斑塊的預后的指示。不同類型的抗體的水平可提供不利心血管事件(例如，心肌梗死、心肌局部缺血等)的風險的指示。因此，例如，高抗MAA加合物IgG和低抗MAA加合物IgA指示個體預期具有急性心肌梗死或心臟病發作，而高抗MAA加合物IgA、低IgG指示個體其體內的斑塊形成更可能以穩定型進展而不會有心臟病發作。
[0080]可以以多種形式中的任何一種進行檢測來自個體的樣品中抗MAA加合物抗體的分析方法。在某些實施方案中，可以使用免疫分析評估個體的抗體水平，例如，對MAA加合物具有反應性的IgM、IgG或IgA抗體。免疫分析形式優選為,例如,選自以下的:免疫印跡、免疫印跡、斑點雜交、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析。利用熒光共振能量轉移(FRET)、生物傳感技術、衰減光導纖維技術、蛋白質芯片工藝等的改進的免疫分析也是有用的。優選地，分析為半定量分析或定量分析。
[0081]合適的免疫分析的實例被描述如下，且考慮到本文中提供的教義，其對本領域技術人員顯而易見。關于免疫分析的一般性綜述，見Cell Biology Volume37:Antibodiesin Cell Biology, Asai, ed.Academic Press, Inc.New York(1993) ；Basic and ClinicalImmunology7th Edition, Stites&Terr, eds.(1991)中的方法，其通過完整引用被并入。
[0082]在多個實施方案中，分析可以包括分析對MAA蛋白質偶聯物具有反應性的所有抗體，或僅僅分析特定同種型的抗體，如IgM、IgG或IgA，或分析兩種或更多種抗體同種型的組合物。在某些實施方案中，至少測定了 IgG和/或IgM的水平。
[0083]免疫分析可以為競爭性的或非競爭性的。在典型的競爭性免疫分析中，樣品中的抗體與有標記的抗體競爭來與MAA蛋白質加合物結合。隨后測量結合在MAA蛋白質偶聯物上的有標記的抗體的量。樣品中的內源性抗MAA加合物抗體的濃度和檢測到的有標記的抗體的量之間存在相反關系。
[0084]在非競爭性免疫分析中，將樣品中的抗體結合在PAF偶聯物上，隨后將有標記的檢測試劑，通常為抗免疫球蛋白抗體，結合在抗體上。隨后測量結合在抗體上的有標記的檢測試劑的量。與競爭型方法不同，非競爭性方法的結果直接與抗體的濃度成比例。
[0085]在非競爭性免疫分析或免疫印跡中，將有標記的檢測試劑，通常為抗免疫球蛋白抗體，用來檢測結合在MAA蛋白質加合物上的抗體(例如，抗MAA加合物抗體)。選擇了物種的特異性結合到免疫球蛋白上的合適的抗免疫球蛋白抗體，其中樣品從該物種中獲得。在某些實施方案中，其可以結合到那一物種的所有的免疫球蛋白同種型上，或僅僅結合到同種型的一個亞集上。例如，其可以僅結合到IgA、IgD、IgE、IgG或IgM上，或這些同種型的兩種或更多種的組合上。在某些實施方案中，抗免疫球蛋白抗體可以僅特異性結合到任何給定的同種型的某些亞型上。人IgA的亞型包括IgAl和IgA2。在某些實施方案中，抗免疫球蛋白抗體可以結合到這些亞型的一種或兩種上。人IgG的亞型包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在某些實施方案中，抗免疫球蛋白可以結合到這些人IgG亞型的一種或多種上。應當理解不同的脊椎動物物種存在不同的同種型和亞型。
[0086]在放射免疫分析中，用諸如131I或125I的放射性同位素標記了抗體或檢測試劑。在酶免疫分析中，用酶標記了抗體或檢測試劑。在某些實施方案中，使用顯色底物能檢測出合適的酶。顯色底物為這樣的物質，由于與酶的反應，其可產生有色產物，從而能用分光光度計檢測。廣泛采用了來自大腸桿菌(E.coli)的諸如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β_半乳糖苷酶和焦磷酸酶的酶。還可以使用基于諸如熒光素酶的酶的化學發光系統。其他的標記包括熒光標記，如Alexa系列的熒光團、量子點、電子自旋標記物、磁性標記等。在某些實施方案中，經常使用抗體或檢測試劑與生物素的結合，因為這可以通過其與酶或熒光團連接的親和素或鏈霉親和素的反應被容易地檢測到，其中其可與親和素或鏈霉親和素以很大的特異性和親和力結合。作為選擇，在某些實施方案中，將抗體/檢測試劑與結合檢測試劑連接的生物素的鏈霉親和素或親和素結合在一起。
[0087]在一個示例性的和典型的非競爭性酶免疫分析中，放置將要分析的樣品(例如，血清)，用吸附在(或化學連接到)固體(或大體上為固體)基質上的MAA蛋白質加合物(例如，MAA/白蛋白加合物)與其接觸并對其孵育。因此可能存在于樣品中的任何抗MAA加合物抗體被貼附在固體基質上的MAA加合物特異性結合，制造出MAA加合物/抗MAA加合物抗體復合物。隨后將樣品從固體基質上分離，以便清除為結合的物質，例如，通過洗脫。將能結合以MAA加合物/抗MAA加合物抗體復合物形式存在于基質上的抗MAA加合物抗體的指示劑抗體加入到固定基質上，從而制造出MAA加合物/抗MAA加合物抗體/指示劑抗體復合物。指示劑抗體可以，例如，為在非人的動物物種內培養出的抗人IgG免疫球蛋白(或抗人IgM免疫球蛋白，或抗人IgA免疫球蛋白等)。最后，檢測和/或定量了固體基質上MAA加合物/抗MAA加合物抗體/指示劑抗體復合物的存在，其中固體基質上所述復合物的存在指示樣品中的抗MAA蛋白質加合物抗體的存在，且所述復合物的量指示樣品中的抗MAA蛋白質加合物抗體的量。
[0088]在某些實施方案中，優選獲得與MAA加合物結合的抗體的定量評估。在典型的非競爭性分析中，假定測得的變量，不論其為光密度或為一些其他的讀出，與抗體濃度間存在線性關系。例如，如果分析中樣品A使樣品B的光密度加倍(已經從兩者中減去了背景)，則假定相比B，A中的抗體濃度加倍。然而，優選構建陽性樣品(例如，血清樣品)的連續稀釋的標準曲線。在某些實施方案中，在與測試樣品相同的時間分析此類稀釋。通過這樣做，可以將在測定樣品中的抗體的量中產生的來自線性關系的任何變化都考慮在內。
[0089]在某些實施方案中，固體基質為微量滴定盤，例如，通常用于進行ELISA免疫測定的類型。在某些實施方案中，微量滴定盤優選為聚苯乙烯盤。有用的固相支持體還包括，但不限于:天然聚合性糖類和它們的經合成性修改、交叉連接或替換的衍生物，如瓊脂、瓊脂糖、交聯海藻酸、替換的和交聯的瓜爾豆膠、纖維素酯，尤其是硝酸和羧酸的纖維素酯、混合性纖維素酯和纖維素醚；含氮的天然聚合物，如蛋白質和衍生物，包括交聯的或修飾的明膠；天然碳水化合物聚合物，如乳膠和橡膠；合成聚合物，如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯和其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、以上縮聚物的共聚物和三元共聚物，如多元酯、聚酰胺和其他的聚合物，如聚氨酯或聚環氧化合物；無機材料，如堿土金屬和鎂的硫酸鹽或碳酸鹽，包括硫酸鋇、硫酸鈣、碳酸鈣、堿土金屬、鋁和鎂的硅酸鹽；以及鋁或硅氧化物或水合物，如粘土、氧化鋁、滑石、高嶺土、沸石、硅膠或玻璃(可以將這些材料與上述聚合材料一起用作過濾器)；以及以上類型的混合物或共聚物，如通過在先已存在的天然聚合物上引發合成聚合物的聚合獲得的接枝共聚物。可以以合適的形狀使用所有的這些材料，如薄膜、薄片、管狀、微粒或盤狀，或者可以將它們鍍在、結合到或層壓到合適的惰性載體上，如紙、玻璃、塑料膜、纖維等。
[0090]良好適合直流分析裝置的示例性的固相材料包括，但不限于濾紙，如多孔玻璃纖維材料或其他的纖維基質材料。此類材料的厚度不是決定性的且是選擇的關鍵，這很大程度上取決于接受分析的樣品或分析物的性質，如生物樣品的流動性。
[0091]在某些實施方案中，固相可以構成微粒(或納米粒子)。本領域技術人員可以從任何合適類型的微粒材料中挑選在本文中描述的方法中有用的合適的微粒，且這些微粒包括，但不限于:由聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯、乳膠、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚碳酸酯或類似的材料組成的微粒。此外,微粒可以為有磁性的或順磁性的微粒，以便促進磁場內的微粒操作。
[0092]可以將微粒懸浮在可溶試劑和生物樣品的混合物中，或者可以通過支架材料對其保存和固定。在后者中，支撐材料上或內的微粒通常或優選不能大幅移動位置到支撐材料內的其他地方。作為選擇，可以通過沉淀或離心從可溶試劑和生物樣品的混合物中的懸浮物中分離微粒。當微粒為有磁性的或順磁性的時,可以通過磁場從可溶試劑和生物樣品的緩和物中的懸浮物中分離微粒。[0093]可以調整本發明的方法用于可利用包括自動化的和半自動化的系統的微粒技術的體統，其中固相包括微粒。此類系統包括第425651號待定美國申請和第5089424號美國專利以及第5006309號美國專利中描述的系統，其中第425651號待定美國申請和第5089424號美國專利分別對應于已公開的第EP0425633號和第EP0424634號EPO申請。
[0094]因此，例如，應當理解還可以在流體相中進行上述的示例性分析。可以以被連接到與懸浮物中的樣品接觸的微粒或納米粒子上的形式提供MAA蛋白質加合物。存在于樣品中的抗MAA加合物抗體可與微粒上的MAA蛋白質加合物結合，在微粒表面上形成MAA加合物/抗MAA加合物抗體復合物。隨后將該復合物與能結合存在于MAA加合物/抗MAA加合物抗體復合物中的抗MAA加合物抗體的指示劑抗體接觸，從而產生連接在微粒上的MAA加合物/抗MAA加合物抗體/指示劑抗體復合物。隨后可以使用，例如細胞分選儀或磁性分離系統，分離微粒和檢測/定量標記。
[0095]在某些實施方案中，固體基質可以包含一個或多個電極。可以將MAA蛋白質加合物(捕獲劑)直接或間接地粘附到電極上。在一個實施方案中，例如，可以將MAA蛋白質加合物粘附到有磁性的或順磁性的微粒上，隨后使用磁鐵將微粒放置在電極表面附近。其中一種或多種電極充當固相的系統在檢測基于電化學相互作用的情況下是有用的。描述了該類型的示例性系統，例如，在第6887714號美國專利中。以下關于電化學檢測進一步描述了基本方法。
[0096]如上面所指出，在多個實施方案中，可以通過多種方法中的任何一種將MAA-蛋白質加合物連接到固相支持體上(例如ELSA孔、微粒、測試條等)。連接可以為簡單的吸附、離子鍵或共價交聯(直接地或通過連接物)。在一個示例性的實施方案中，通過在緩沖液中使用固體基質孵育MAA加合物將MAA加合物吸附到固體基質上。合適的緩沖液包括,但不限于碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖鹽水。通常，在MAA加合物吸附或共價連接到固體基質上后，用阻滯劑孵育固體基質來減少來自樣品的物質到固體基質的非特異性結合。合適的阻滯劑包括，但不限于牛血清白蛋白。
[0097]在某些實施方案中，改變了固體基質的固有電荷來促進MAA加合物的連接，和/或來增加抗體結合，和/或來增加可濕性等。在某些實施方案中，為了改變或增加固體基質的固有電荷，可以將帶電的物質直接涂層在基質上。例如，可以采用用于使用帶負電荷的聚合物固定可固定反應復合物的離子捕獲程序(描述于第0326100號EP專利公開和第0406473號EP公開中)來影響快速溶解相免疫化學反應。在這些程序中，通過帶負電的聚陰離子/免疫復合物和先前處理過的、帶正電的基質之間的離子相互作用從余下的反應混合物中分離了可固定免疫復合物，并通過使用多種信號生成系統的任何一種，包括，例如，如第0273115號EPO公開中所描述的化學發光系統檢測該復合物。
[0098]如果固體基質為硅或玻璃，經常在連接捕獲劑(例如，MAA蛋白質加合物)前活化表面。可以將諸如三乙氧基氨基丙基娃燒(可從Sigma Chemical C0., St.Louis, M0.獲得)、三乙氧基乙烯基娃燒(Aldrich Chemical C0., Milwaukee, ffis.)和(3_疏基-丙基)-三甲氧基娃燒(Sigma Chemical C0.，St.Louis, M0.)的活化的娃燒化合物分別用來引入諸如氨基、乙烯基和巰基的反應基。可以將此類活化的表面用來直接連接捕獲物(在氨基或巰基的情形下)，或者可以將活化的表面進一步與諸如戊二醛、二(琥珀酰亞基)辛二酸鹽、SPPD9琥珀酰亞基3-[2-吡啶基二硫]丙酸鹽)、SMCC (琥珀酰亞基-4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸鹽)、SIAB (琥珀酰亞基[4-碘代乙酰氨基]氨基苯甲酸酯)和SMPB (琥珀酰亞基-4-[1-馬來酰亞胺基苯基]丁酸鹽)的連接物反應，來從表面分離捕獲劑。可以將乙烯基氧化來提供共價結合的方式。還可以將乙烯基用作諸如聚丙烯酸的不同的聚合物的聚合的錨定物，其可以為特定捕獲劑提供多個附著點。可以將氨基與不同分子量的被氧化的葡聚糖反應來提供不同大小和能力的親水連接。可氧化的葡聚糖的實例包括:葡聚糖T-40(分子量40000道爾頓)、葡聚糖Τ-110 (分子量110000道爾頓)、葡聚糖Τ-500(分子量500000道爾頓)、葡聚糖Τ-2Μ(分子量2000000道爾頓)(所有這些都可從Pharmacia, Piscataway, N.J.獲得)或聚鹿糖(分子量 70000 道爾頓；可從 Sigma ChemicalC0.，St.Louis, M0.獲得)。因此，可以使用第5459080號、第5459078號美國專利等中描述的技術和化學品，將聚合電解質相互作用用來將MAA蛋白質加合物固定在固體基質上。
[0099]影響固相的選擇的其他的考慮因素包括將有標記的實體的非特異性結合降到最少的能力以及與采用的標記系統的兼容性。例如，使用的帶有熒光標記的固相應當具有足夠低的背景熒光來允許信號檢測。
[0100]在連接上特定的捕獲劑后，可以使用諸如血清、蛋白質或其他的阻滯劑的材料進一步處理固相支持體的表面來將非特異性結合降到最少。
[0101]MAA蛋白質加合物
[0102]在多個實施方案中，MAA蛋白質加合物被用來捕獲/結合存在于生物樣品中的抗MAA加合物抗體。產生MAA蛋白質加合物的方法為本領域技術人員已知且被描述于，例如，美國專利 5939535 和 Tuma et al.(1996) !fepatology, 23 (4): 872-880。基本上，乙醛和丙二醛(MDA)在蛋白質(帶有氨基的基質)存在下一起反應，來形成包含MDA和乙醛的雜種加合物的獨特的產物，其被指定為丙二醛、乙醛-加合物(MAA)。
[0103]如美國專利5939535中所描述，通過處理目標蛋白質(例如，白蛋白)可以容易地產生加合物，例如，以lmg/ml的濃度，在37°C下用ImM乙醛加ImM MDA處理3天。在對0.1M磷酸鹽緩沖液過夜透析(pH7.4和4°C )后，可以如期望的那樣進一步處理溶液(例如，吸附或共價結合到ELISA孔、微粒等上)。
[0104]然而，取決于微粒的類型的類型，可能需要提高或降低AA和MDA的濃度來取得可使得MAA具有反應性的相同量的熒光。
[0105]產生MAA蛋白質加合物的方法是示例性的和非限制性的。使用本文中提供的教義，可以使用其他的方法容易地產生MAA加合物。
[0106]teiP,系統
[0107]適合用于本文中描述的分析中的檢測劑的可檢測標記(例如，與抗MAA加合物抗體結合并形成抗MAA加合物/抗MAA加合物抗體復合物的抗體)包括可通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電的、光的或化學的方式檢測的任何組合物。有用的標記包括，但不限于:磁珠(例如，DYNABEADS? )、熒光染料(例如，熒光素、德克薩斯紅、若丹明、綠色突光蛋白等，見，例如，Molecular Probes (分子探針),Eugene, Oregon, USA)、諸如口丫啶(例如，吖啶-9-甲酰胺)、菲啶、二氧雜環丁烷、魯米諾等的化學發光化合物、放射性標記(例如，3H、1251、35S、14C或32P)、諸如酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β_半乳糖苷酶和ELISA中常使用的其他酶)的催化劑，以及測度標記，如膠體金(例如，40-80nm直徑大小范圍、高效散布綠光的金顆粒)或有色玻璃或有色塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠。教會使用此類標記的專利包括第3817837號、第3850752號、第3939350號、第3996345號、第4277437號、第4275149號和第4366241號美國專利。
[0108]可以在與生物樣品接觸之前、期間或之后，將標記連接到檢測劑上。所謂的“直接標記”為在用于分析前被直接連接或并入到檢測劑上的可檢測標記(例如，抗IgG抗體、抗IgM抗體、抗IgA抗體等)。可以通過本領域技術人員熟知的多種方式中的任何一種將直接標記連接到或并入到檢測劑上。
[0109]相反，所謂的“間接標記”通常在分析期間的某一時刻結合到檢測劑上。通常，間接標記在使用前結合到被連接到或并入到檢測劑上的部分上。因此，例如，在用于分析前可以將被用作檢測劑的抗體(“檢測抗體”)生物素化。在分析期間，親和素-偶聯的熒光團可以結合具有生物素的檢測劑，來提供可被容易檢測到的標記。
[0110]在間接標記的另一實例中，還可以將能特異性結合免疫球蛋白恒定區的多肽，如多肽A或多肽G用作檢測抗體的標記。這些多肽為鏈球菌的細胞壁的正常成分。它們展現強的與來自多種物種的免疫球蛋白恒定區的非免疫原性反應(見，一般是KronVal，etal.(1973)J.1mmunol., 111:1401-1406 和 Akerstrom(1985)J.1mmunol., 135:2589-2542)。因此,可以將此類多肽標記并加入到分析混合物中，其中它們結合到檢測抗體上，以及物種特異性抗體上，標記二者并提供復合信號，這歸因于存在于樣品中的分析物和自抗體。
[0111]本文中描述的方法中有用的一些標記需要使用指示劑來提供可檢測的信號。在ELISA中，例如，酶標記(例如，半乳糖苷酶)可能需要加入基質(例如，X-gal)來提供可檢測的信號。
[0112]示例性形式
[0113]化學發光性微粒免疫分析(CMIA)
[0114]在一個示例性的實施方案中，根據本發明在化學發光性微粒分析(CMIA)中采用了化學發光性標記。一般來說，化學發光性微粒分析技術基于這一原理——當通過引發試劑處理時，化學發光標記以特征波長發光(即，化學發光)。
[0115]CMIA所必須的反應物可以包括涂有被測量的分析物的特異性捕獲劑、化學發光檢測劑和引發劑(例如，化學的或電化學的)的微粒。進行CMIA的反應順序可以包括:在反應容器內用樣品混合涂有分析物特異性捕獲劑的微粒來形成免疫復合物；清洗捕獲的免疫復合物來去除未結合的物質；用化學發光檢測劑混合捕獲的免疫復合物；清洗捕獲的免疫復合物——化學發光檢測劑；和用引發劑混合捕獲的免疫復合物——化學發光檢測劑來起始光發射。
[0116]CMIA中有用的化學發光體包括吖啶(例如吖啶-9-甲酰胺)、魯米諾、二氧雜環丁烷、釕絡合物和類似的化學發光衍生物。CMIA中有用的微粒包括反磁性的、磁性的和順磁性的微粒。可商購的可以用來進行化學發光性微粒分析的自動化儀器的實例包括Architect1-Systems 和 Abbott Prism(都可從 Abbott Laboratories, Abbott Park, 111.獲得)。
[0117]電化學檢測系統
[0118]在其他的實施方案中，使用電化學檢測進行了免疫分析。Heineman和合作人已經描述過了電化學檢測的基本程序。這需要:第一抗體(Ab，大鼠-抗小鼠IgG)的固定，隨后暴露到含有抗原(Ag，大鼠IgG)的一系列的溶液下，將第二抗體偶聯到酶標記(AP-Ab，大鼠抗小鼠IgG和堿性磷酸酶)和對氨基苯磷酸鹽(PAPP)上。AP轉化PAPP為對氨基苯酚(PAPR，“R”試圖從氧化型，PAPO，醌亞胺中區別簡化型)，ρΗ9.0下(此時AP展現最優活力)，其在不干擾氧和水的還原的電位處為電化學可逆的。PAPR不會造成電極污染，這與苯酚不同，其中苯酚的前體一磷酸單苯酯常常被用作酶底物。盡管PAPR可經歷空氣和光氧化，可容易地將這些氧化阻止在小規模和短時間框架內。先前已經報導過在微電化學免疫分析中使用20 μ L至360 μ L體積的PAPP獲得的PAPR的皮摩爾檢測極限和IgG的毫微微克檢測極限。在使用電化學檢測的毛細管免疫分析中，現今為止報導的最低檢測極限為3000分子的小鼠IgG，其中使用了 70 μ L的體積和30分鐘或25分鐘的分析時間。
[0119]在一種示例性方法中，測試盒(類似于Abbott Point of Care (1-STAT?)電化學免疫分析系統)在裝配于硅片內的電化學傳感器上提供了 MAA蛋白質加合物。被放置在芯片上的另一位置的為抗體/堿性磷酸酶偶聯物(例如，偶聯到堿性磷酸酶上的抗IgG)。將生物樣品(例如，全血、血漿等)與傳感器接觸，允許酶偶聯物溶入到樣品中。樣品內的抗MAA加合物抗體變得標記有偶聯物，且通過將抗MAA加合物抗體結合到被固定的MAA加合物上，該復合物被捕獲到電化學傳感器的表面上。將樣品，以及過量的酶偶聯物從傳感器上洗脫掉。洗脫液內為堿性磷酸酶的基質。結合到抗體/抗原/抗體三明治上的酶切割基質，釋放出可通過電化學檢測產物。電化學(例如，安培的、伏安的等)傳感器可測量該酶產物，其與樣品中的抗MAA加合物抗體的濃度成比例。
[0120]該電化學檢測方案試圖為示例性的且不為限制性的。應當注意其他的電化學檢測方法為本領域技術人員已知，且不同的電化學檢測系統被描述于，例如，第7045364號、第7045310號、第6887714號、第6682648號、第6670115號美國專利等。
[0121]橫向流分析
[0122]在某些實施方案中，將分析形式化為橫向流分析，也成為橫向流免疫層析分析。常常以測試條/量油尺形式產生這些分析。在橫向流分析中，測試樣品通過毛細管作用沿固體基質流動。在將樣品應用到測試后，其遭遇與樣品混合并經過基質遭遇線或區域的有色試劑，其中的基質遭遇線或區域已經用(例如，用諸如MAA加合物的抗原)和/或檢測試劑(例如，有標記的抗體)預處理過。取決于存在于樣品中的分析物，有色試劑可以在測試線或區域處成為結合狀態，且可以通過與參考值，或如本文中所述的電化學讀取的讀數，或使用，例如，讀取器光學讀取的讀數比較得到定量。橫向流測試可以運作為競爭性或三明治式分析。
[0123]微流體分析
[0124]在某些實施方案中，使用微流體裝置進行了分析。微流體分析為本領域技術人員熟知。在一種不例性方法中，可以使用與表面突光顯微鏡交界的冷卻的電荷稱合器件(CCD)照相機檢測全-PDMS[聚(二甲基硅氧烷)]微流體裝置中的異質性三明治式酶聯免疫分析(ELISA)的熒光反應。已經成功地將PDMS芯片微傳感器用來定量模式分析物(綿羊IgM)，其敏感性低至17nM。已經將該混合集成技術擴展至來自PDMS芯片中的生物化學免疫分析的光發射的芯片上成像和定量(見，例如，Eteshola and Balberg(2004)BiomedicalMicrodevices, 6(I):7-9 等)。
[0125]多路傳輸形式
[0126]在特定的實施方案中，例如，為對同時分析一個生物樣品的多種分析物(例如抗MAA IgG、IgM和IgA)有用，分析系統可以包含多種不同的檢測劑(例如，抗IgG、抗IgM、抗IgA等)，且在某些實施方案中，可以將這些不同的檢測劑至于不同的反應位點(例如，ELISA盤中的不同的孔)。因此，可以將分析多路復用。在單個分析運行期間，固相可以在表面上具有多個不同的區域，其中每個區域都具有粘附的具有特定特異性的抗體。
[0127]這還可以在溶液相中完成，其中用不同的標記標記了每種抗體血清型特異性的檢測試劑。反應后可以使用，例如，細胞分選儀分離和/或定量這些試劑。
[0128]多路傳輸形式可以，但不必，采用多種標記，其中每種標記被用于特定分析物和/或那一分析物特異性的自抗體的檢測。例如，可以檢測多種分析物而不需使用多個標記，其中在支持物上的不同位置(例如，在ELISA盤的不同孔中)使用了不同的檢測劑。因為每個位置處的檢測劑的特異性是已知的，特定位置處的信號的檢測可能與結合在那一位置處的特定抗MAA加合物抗體的存在相關。該形式的實例包括在沿著通道的不同的位置含有不同的標記劑的微流體裝置。在某些實施方案中，不同的標記試劑可能與不同的電極系統相關，其中可以將多個電極系統(例如，IgG檢測系統和IgA檢測系統和IgM檢測系統)組裝在單個微芯片/微流體裝置中。
[0129]除了上述的不同的免疫分析(例如，直接ELISA、間接ELIAS等)，還可將其他的分析形式用來檢測抗MAA加合物抗體。此類分析包括，但不限于:RIP分析、BIAcore分析、瞬逝場分析等。
[0130]RIP分析可測量結合到流體相中的同源抗原上的抗體。因此，可以用放射性標記的MAA蛋白質加合物和諸如蛋白質A-瓊脂糖或蛋白質G-瓊脂糖的沉淀劑檢測和定量抗MAA加合物抗體，其中的沉淀劑與抗體的Fe部分結合并通過離心被用來收集抗原-抗體復合物(Bendtzen et al.(2000)Mol.Biotechnol.14:251-261)。Prabhakar andMuhlfelder (1997)Clin.Nephrol.47:331-335 描述了典型 RIP 測試平臺的一個示例性實例，且該實例被用來檢測重組體EPO的人抗體。
[0131]BIAcore免疫分析使用表面等離子體共振來光學測量與固定在專門的葡聚糖包被的玻璃表面上的目標抗原(例如，MAA蛋白質加合物)結合的抗體。隨著大多數抗體積聚在傳感器芯片的表面上，BIAcore分析的信號直接增加。表征/定量抗體的BIAcore免疫分析為本領域技術人員熟知(見，例如，Meager et al.(2003)Clin.Exp.1mmunol.132:128-136 ;VanCott et al.(1992)J.1mmunol.Meth.，146:163-176 ;Takacset al.(1999)J.1nterferon Cytokine Res.19:781-789 ；Swanson(2003)Pp.127-133.1nA.R.Mire-Sluis (ed.)Immunogenicity of therapeutic biological products, vol.112.Karger, Basel, Switzerland ；Swanson (2004)Nephron.Clin Pract.96:c88_c95 等)。
[0132]在某些實施方案中，消逝型生物傳感器也是預期的。這些生物傳感器不需要檢測目標分析物前的生物樣品預處理。消逝型生物傳感器通常依靠預定波長的光，其與諸如，例如，在探針表面附近連接到MAA加合物上的熒光標記的熒光分子相互作用，來通過結合分析物(例如抗MAA加合物抗體)在不同的波長處發出熒光。
[0133]對技術人員顯而易見的是本文中描述的分析形式可接受多種高通量形式中的任何一種。
[0134]牛物樣品
[0135]在多個實施方案中，將抗MAA加合物抗體測量對來源于目標個體的生物樣品進行。此類個體包括，例如，展現一種或多種臨床癥狀的患者、經歷常規檢查的無癥狀患者、展現一種或多種心臟風險因子(例如，肥胖、糖尿病、吸煙者、心臟病家族史等)的患者。
[0136]使用本領域技術人員已知的標準方法獲得樣品，且在某些實施方案中，為用于特定分析方案最終需將其標準化。通常，如果它們都存在于個體內，生物樣品為抗MAA加合物抗體預期可在其中找到的樣品。此類樣品包括，但不限于:唾液/痰、血液或血液部分(例如，血漿、血清)、某些組織活檢等。
[0137]在一個實施方案中，通過選自以下的方法從個體獲得生物樣品:手術方法或其他的切除方法、諸如高滲鹽水或丙二醇的體液吸引術、支氣管腺體灌洗、支氣管鏡檢、使用玻璃管、唾液米集管(Sarstedt AG,瑞士塞沃倫)、Ora-sure (Epitope Technologies PtyLtd,澳大利亞維多利亞州墨爾本市)、omni_sal (Saliva Diagnostic Systems,美國紐約布魯克林)的唾液收集以及使用本領域已知的任何方法的血液采集，如，例如使用注射器。
[0138]在多個實施方案中，可以處理樣品來幫助存儲和/或分析中的處理，和/或分析的標準化。
[0139]體內斑塊成像
[0140]組合物成像及它們的使用
[0141]在某些實施方案中，提供了斑塊，尤其是可導致心肌梗死的不穩定斑塊成像的方法。在多個實施方案中，方法需要:給予目標個體可特異性或優選結合MAA蛋白質加合物的組合物，其中所述組合物包括可檢測標記。因此，靶向組合物通常包含靶向部分(例如，連接到可檢測標記上的抗MAA加合物抗體)。當被給予到個體時,祀向部分特異性或優選結合到MAA蛋白質加合物存在的位點。這導致標記定位/優選分布到此類位點。如果將組合物給予到個體的脈管系統，標記將停留或優選分布到斑塊形成的位點，使得更多的標記被定位在在得到進一步發展和/或不穩定的斑塊處。對個體成像并檢測標記位置。這允許評估斑塊并提供隨后的行動指導(例如，藥物治療、血管成形術、心臟搭橋手術等)。
[0142]可以將標記組合物用于直接靶向方法或用于預靶向策略。在直接靶向中，將可檢測標記連接到了可特異性或優選結合到MAA加合物上的靶向部分(例如抗MAA抗體、抗體片段等)上。因此，抗體到斑塊形成區域內的抗MAA加合物上的結合可將標記定位在那一區域，隨后可以對該區域成像，提供該位置的定位，和/或斑塊的嚴重度。
[0143]在某些實施方案中，可以將標記組合物用于“預靶向”策略。在該方法中，最初沒有將標記連接到MAA加合物靶向部分上。而是將MAA加合物靶向部分(例如，抗MAA加合物抗體)連接到了隨后可以被具有可檢測標記的藥劑結合的第二部分上。合適的第二部分包括，例如，表位標簽、抗體恒定區或框架區、生物素親和素等。
[0144]在某些實施方案中，在此類標記組合物中利用的標記為“不透射線過的”標記，例如，可以使用X射線容易地成像的標記。不透射線的材料為本領域技術人員熟知。最常見的不透射線材料包括碘化物、溴化物或鋇鹽。其他的不透射線材料也是已知的且包括，但不限于:有機鉍衍生物(見，例如，美國專利5939045)、不透射線的聚氨酯(見美國專利5346981)、有機鉍合成材料(見，例如，美國專利5256334)、不透射線的鋇聚合物復合物(見，例如，美國專利4866132)等。
[0145]除了放射標記，其他的可檢測標記也適合使用此類標記組合物。這樣的標記包括，例如，放射性標記和/或MR1、NMR, PET檢測的標記等。
[0146]不同的優選放射性標記包括，但不限于:99TC、2°3Pb、67Ga、68Ga、72As、mIn、113mIn、97Ru、62Cu、641Cu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121 Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb具體的有用的PET標記包括，但不限于:nC、18F、150、13N等。用于MRI的常見標記包括，但不限于:釓螯合物和具有不同的表面修飾的氧化鐵納米粒子或微粒。諸如釓噴酸葡胺的釓螯合物為最廣泛使用的順磁性對比材料。氧化鐵顆粒為一類超順磁MRI對比劑的部分。將通常由磁礦鐵(氧化鐵)核組成的這些化合物用葡聚糖或硅氧烷包被、用聚合物密封或進一步修飾。
[0147]可以將靶向部分(例如，抗MAA加合物抗體等)直接連接到可檢測標記上或可以將其通過一種或多種連接物的方式連接。例如，可以通過一種多功能(例如，雙功能、三功能或四功能)連接劑或成對的互補連接劑偶聯靶向部分和可檢測標記部分。在另一實施方案中，通過兩種、三種或更多種連接劑偶聯靶向部分和標記。
[0148]如本文中所使用的“連接物”或“連接劑”為被用來連接兩個或更多個分子的分子。在某些實施方案中，連接物通常能對兩個分子形成共價鍵(例如，靶向部分和效應物)。合適的連接物為本領域技術人員熟知且包括，但不限于:直鏈或支鏈碳連接物、雜環碳連接物或肽連接物。
[0149]可以將雙官能團連接物用來形成期望的偶聯物，其中的雙官能團連接物的一個官能團可與一個分子上的基團反應(例如，抗MAA抗體)，且另一基團在另一分子上反應(例如，可檢測標記)。作為選擇，可以進行衍生來提供官能團。因此，例如，在肽上生成游離的巰基基團的程序也是已知的(見，例如，第4659839號美國專利)。
[0150]在某些實施方案中，連接劑為或包含官能團。官能團包括包含反應基以及多功能交聯物的單官能團連接物，其中的功能交聯物包含兩個或更多個能與兩個或更多個不同的功能目標(例如，標記、蛋白質、大分子、半導體納米晶體或基質)形成結合的反應基。在一些實施方案中，多功能交聯物為包含兩個或更多個不同的反應基的異源雙功能交聯物。
[0151]合適的反應基包括，但不限于:硫醇(-SH)、羧化物(COOH)、羧基(-C00H)、羰基、胺(NH2)、羥基(-0H)、醛(-CH0)、乙醇(ROH)、酮(R2CO)、活性氫、酯、巰基(SH)、磷酸鹽(-PO3)或光敏部分。胺反應基包括，但不限于:例如，異硫氰酸酯、異氰酸酯、酰基疊氮、NHS酯、磺酰氯、醛和乙二醛、環氧化合物和環氧乙烷、碳酸鹽、芳化劑、亞胺酸酯、碳化二亞胺以及酐。硫醇反應基包括，但不限于:例如，鹵代乙酰和鹵代烷衍生物、馬來酰亞胺、氮雜環丙烷、丙烯酰衍生物、芳化劑以及硫醇-二硫化物轉換試劑。羧化物反應基包括，但不限于:例如，重氮烷和重氮基乙酰化合物，如羰基二咪唑和碳化二亞胺。羥基反應基包括，但不限于:例如，環氧化合物和環氧乙烷、羰基二咪唑、氧化性高碘酸鹽、N，N’ - 二琥珀酰亞基碳酸鹽或N-羥基琥珀酸銨氯甲酸酯、酶氧化物、鹵代烷基以及異氰酸酯。醛和酮反應基包括，但不限于:例如，席夫堿形成或氨基化減少的肼衍生物。活性氫反應基包括，但不限于:例如，曼尼希縮合和碘化反應的重氮衍生物。光敏基團包括，但不限于:例如，疊氮化物和鹵代的芳基疊氮化物、苯甲酮、重氮化合物和雙吖丙啶衍生物。
[0152]在形成嵌合部分中有用的其他合適的反應基和反應類型包括生物共軛化學領域熟知的反應基和反應類型。當前有利的對反應螯合物有效的反應類型為在相對溫和的條件下進行的反應。這些反應包括，但不限于:親核取代(例如，帶有鹵化酰基、活化酯的胺類和醇類的反應)、親電取代(例如，烯胺反應)以及加入碳-碳和碳-雜原子重鍵(例如，邁克爾反應、狄爾斯-阿爾德反應)。這些和其他的有用的反應被討論于，例如，March (1985)Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John ffiley&Sons, New York、Hermanson(1996)Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego 和 Feeney et al.(1982)Modification of Proteins: Advances in Chemistry Series,Vol.198, AmericanChemical Society, Washington, D.C0
[0153]將不同的分子連接到肽或蛋白質上的許多程序和連接分子為已知的(見，例如，第188256號歐洲專利申請；第4671958號、第4659839號、第4414148號、第4699784號、第 4680338 號、第 4569789 號和第 4589071 號美國專利；以及 Borlinghaus et al.(1987)Cancer Res.47:4071-4075)。
[0154]可以將本文中描述的許多成像試劑提供為螯合物，尤其是當利用了預靶向策略時。螯合分子通常被結合到與連接在本發明的前列腺癌特異性抗體上的表位標簽特異性結合的分子(例如，生物素、親和素、鏈霉親和素等)上。
[0155]螯合基團為本領域技術人員熟知。在某些實施方案中，螯合基團來源于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、環己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-0，O’-二(2-氨乙基)-N，N, N’，N’-四乙酸(EGTA) ,N, N-二(羥芐基)_ 乙二胺-N，N’-二乙酸(HBED)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)U, 4，7，10-四氮雜環十二烷-N, N’ -，N"，N〃’ -四乙酸(DOTA)、羥乙基二胺三乙酸(HEDTA)U, 4，8，11-四-氮雜環十四烷-N，N，，N〃，N〃’ -四乙酸(TETA)、取代的DTPA、取代的EDTA等。
[0156]某些優選的螯合劑的實例包括未被取代的或取代的2-亞胺基硫雜烷和2-亞氨基硫雜環己烷，具體來說，為2-亞氨基-4-巰基甲基硫雜烷。
[0157]由于一種螯合劑——I, 4，7，10-四氮雜環十二烷-N，N’ -，N〃，N〃’ -四乙酸(DOTA)可螯合多種諸如放射性核素和放射性標記的在診斷上和治療上具有重要性的金屬的能力，其尤其讓人感興趣。
[0158]已經描述過諸如抗體的DOTA和蛋白質的偶聯物。例如，第5428156號美國專利教導了可將DOTA偶聯到抗體和抗體片段上的方法。為了產生這些偶聯物，將DOTA的一個羧酸基團轉化為了活化酯，其可以與抗體或抗體片段上的胺基或巰基反應。Lewis etal.(1994)Bioconjugate Chem.5:565-576描述了類似的方法，其中將DOTA的一個羧基轉化為了活化酯，并用抗體混合活化的D0TA，通過抗體的賴氨酸殘基的ε -氨基將抗體連接到DOTA上，從而將DOTA的一個羧基轉化為氨基化合物部分。
[0159]作為選擇，可以直接地或通過連接物將螯合劑結合到表位標簽上或結合到結合表位標簽的部分上。已經描述過DOTA和生物素的偶聯物(見，例如，Su(1995) J.Nucl.Med.，36 (5Suppl): 154P，其公開了通過可利用的諸如DOTA-LC-生物素或DOTA-芐基-4-(6-氨基-己酰胺)_生物素)的氨基側鏈生物素衍生物將DOTA連接到生物素上。PCT公開W095/15335公開了產生可以被偶聯到生物素上的硝基-芐基-DOTA化合物的方法。該方法包括:通過短暫透射羥基的環化反應；氨基的甲苯磺酰化；短暫保護羥基的去保護；去保護羥基的甲苯磺酰化；以及分子內甲苯磺酸鹽環化。Wu et al.(1992) Nucl.Med.Biol.，19⑵:239-244公開了用111In和9°Y合成放射性標記蛋白質的大環螯合劑。Wu etal.制造了帶有標記的DOTA-生物素偶聯物來研究帶有親和素的偶聯物一研究的一種模式蛋白質的穩定性和生物分布。該偶聯物使用含有游離氨基的生物素酰肼制得，用來與原位產生的活化DOTA衍生物反應。
[0160]應當注意大環螯合劑1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N，N’_，N〃，N〃’-四乙酸(DOTA)可以以非凡的穩定性結合9°Y和mIn。可以進行選定緩沖液中用來評估預期的放射性藥物標記下的放射性標記反應時間的動力學研究，來確定最優放射性標記條件，以提供符合放射藥物的FDA需求的高產物產量。應當注意，Kukis et al.(1998) J.Nucl.Med.，39(12):2105-2110詳細描述過制造釔-90-D0TA螯合物的方案。
[0161]制造適合結合到不同的靶向部分(例如，抗MAA加合物抗體)上的螯合物的方法為本領域技術人員熟知(見，例如，第6190923號、第6187285號、第6183721號、第6177562號、第 6159445 號、第 6153775 號、第 6149890 號、第 6143276 號、第 6143274 號、第 6139819號、第 6132764 號、第 6123923 號、第 6123921 號、第 6120768 號、第 6120751 號、第 6117412號、第 6106866 號、第 6096290 號、第 6093382 號、第 6090800 號、第 6090408 號、第 6088613號、第 6077499 號、第 6075010 號、第 6071494 號、第 6071490 號、第 6060040 號、第 6056939號、第 6051207 號、第 6048979 號、第 6045821 號、第 6045775 號、第 6030840 號、第 6028066號、第 6022966 號、第 6022523 號、第 6022522 號、第 6017522 號、第 6015897 號、第 6010682號、第6010681號、第6004533號、第6001329號美國專利等)。
[0162]檢測此類標簽的方法為本領域技術人員熟知。因此，例如，可以使用感光片、閃爍探測器等檢測放射性標記。使用PET成像系統檢測/成像PET標記。類似地，使用MRI系統檢測/成像MRI標記。
[0163]杭體產牛
[0164]在某些實施方案中，MAA加合物的體內檢測的標記試劑包括抗MAA抗體。這樣的組合物中有用的抗體包括多克隆和單克隆抗體、抗體片段、單鏈抗體等。通過將(例如，皮下或肌肉內注射)免疫原(例如，MAA加合物)注射到合適的非人的哺乳動物(例如，小鼠或兔)體內引發多克隆抗體。一般來說，免疫原應當誘導對目標抗原具有相對高的親和力的高滴度的抗體的產生。`
[0165]如有需要，可以通過本領域熟知的偶聯技術將抗原偶聯到載體蛋白上。通常使用的載體包括鑰孔戚血藍素(KLH)、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破傷風類毒素。隨后將偶聯物用來免疫動物。
[0166]隨后從從動物采集的血液樣品獲得抗體。用來制造多克隆抗體的技術在文獻中得到廣泛的描述(見，例如，Methods of Enzymology, “Production of Antisera WithSmall Doses of Immunogen:Multiple Intradermal Injections, ^Langone, et al.eds.(Acad.Press, 1981))。可以將動物制造的多克隆抗體進一步純化,例如,通過結合到并從目標抗原結合到的基質上洗脫。本領域技術人員可了解免疫學領域內常見的用于純化和/或濃縮多克隆以及單克隆抗體的不同技術，見，例如，Coligan, et al.(1991)Unit9, CurrentProtocols in Immunology, Wiley Interscience。
[0167]對于很多應用，單克隆抗體(mAb)是優選的。用于制造雜交瘤分泌性mAb的一般方法是熟知的(Kohler 和 Milstein (1975)Nature, 256:495)。簡單地說，如 Kohler 和Milstein所描述，該技術需要:從患有黑色素瘤、畸胎癌或者子宮癌、神經膠質癌或肺癌的5個不同的癌癥患者的局部引流淋巴結分離淋巴細胞(其中樣品從手術樣本獲得)、合并細胞和用SHFP-1融合細胞。篩選了雜交瘤用于制造與癌細胞系結合的抗體。可以使用常規篩選技術(如酶聯免疫吸附測定或“ELISA”)完成在mAb間確認特異性，以確定目標mAb的
基元反應模式。
[0168]如本文中所使用，術語“抗體”包括抗原結合性抗體片段，例如，單鏈抗體(scFv或其他)，其可以使用噬菌體展示技術進行制造/挑選。在感染細菌的病毒(細菌噬菌體或噬菌體)表面表達抗體片段的能力使得分離單個結合性抗體片段成為可能，例如，從大于1010個非結合性克隆文庫中。為了在噬菌體表面上表達抗體片段(噬菌體展示)，將抗體片段基因插入到編碼噬菌體表面蛋白(例如，PlII)的基因內，并將抗體片段-PlII融合蛋白質展不在卩遼菌體表面上(McCafferty et al.(1990) Nature, 348:552-554 ；Hoogenboom etal.(1991)Nucleic Acids Res.19:4133-4137)。
[0169]因為噬菌體表面上的抗體片段是有功能的，可以通過抗原親和層析將噬菌體約束性抗原結合性抗體片段從未約束的噬菌體中分離出來(McCafferty et al.(1990)Nature, 348:552-554)。取決于抗體片段的親和力，單輪親和挑選獲得了 20倍-1000000倍的富集因子。然而，通過用洗脫的噬菌體感染細菌，更多的噬菌體可以得到生長并經歷另一輪的挑選。以這種方式，一輪中的1000倍的富集可以變為挑選的兩輪中的1000000倍(McCafferty et al.(1990)Nature, 348:552-554)。因此，即使當富集較低時(Marks etal.(1991) J.Mol.Biol.222:581-597)，多輪的親和挑選可以引起稀有噬菌體的分離。因為抗原上噬菌體抗體文庫的挑選引起富集，在少至3至4輪的挑選后大多數的克隆即結合上抗原。因此，僅需分析相對小數量的克隆(幾百個)的抗原結合。[0170]可以通過在噬菌體上展示非常大的和多變的V-基因全庫制造人抗體，而不需要前免疫(Marks et al.(1991) J.Mol.Biol.222:581-597)。在一個實驗方案中，通過PCR從未免疫的供體中分離出了存在人外周血淋巴細胞中的天然VH和VL全庫。可以使用PCR任意地將V-基因全庫疊接在一起，來建立scFv基因全庫，其可以被克隆到噬菌體載體內來建立3千萬個噬菌體抗體的文庫(Id.)。從單個“初級”噬菌體抗體文庫中，對多于17個不同的抗原分離了結合性抗體片段，其中的抗原包括半抗原、多糖和蛋白質(Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597 ；Marks et al.(1993).Bio/Technology.10:779-783 !Griffithset al.(1993)EMBO J.12:725-734 ；Clackson et al.(1991)Nature.352:624-628)。
[0171]此外，應當注意特異性結合MAA加合物的抗體的產生被描述于第5939535號美國專利。如其中所描述，通過在lmg/ml的濃度和37°C下,用ImM乙醒加ImM MDA處理兔血衆蛋白(由硫酸銨沉淀制備，如 Klassen (1994) Alcohol Clin Exp Res.18:164-171 所描述)3天制得了 MAA-加合物免疫原。對0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4和4°C )過夜透析后，用等體積的弗氏完全佐劑混合溶液并乳化。在沿著它們背上的4個位點處對新西蘭白兔進行皮下注射(400yg的修飾蛋白)。兩周或四周后，除了使用弗氏完全佐劑外，通過相同的程序增強兔子。最終注射后兩周，得到了血清并測試了抗體活性。
[0172]接著親和純化了產生的抗血清。通過將其加入到溶于0.1磷酸鹽緩沖液的乙醛(ImM)和MDA(ImM) (pH7.4)中，并在37°C恒定震蕩下培養3天，對賴氨酸衍生的瓊脂糖4B珠(Sigma Chemical C0.，St.Louis, M0.)進行了修飾。用4體積的緩沖液清洗珠子并將其導入 0.7cmX 15cm 的低壓 Econo-Column (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)中。將來自免疫的動物的IOml的兔血清載到柱子上。用5體積的緩沖液及隨后的IM NaCl清洗柱子，然后用0.5M乙酸(pH2.5)洗脫到Tris緩沖液(pH8.2)中，來中和酸性。通過蛋白質G-瓊脂糖B (Pharmacia, Piscataway, N.J.)柱層析進一步純化洗脫的材料,產生大于95%的純化的IgG部分。
[0173]如本領域技術人員可以容易地理解的那樣，還可以通過多種商業服務(例如，Berkeley Antibody Laboratories, Bethyl Laboratories, Anawa, Eurogenetec 等)的任何一種制備抗體。
[0174]以炎性過程為特征的其他病癥的診斷/預后
[0175]還發現丙二醛-乙醛加合物(MAA)可用作許多疾病的炎癥的生物標志物。這源于在形成該加合物中涉及到的組分的基本性質。不受具體理論的束縛，據信組織損傷后，細胞膜被不同的吞噬細胞(巨噬細胞和中心粒細胞)識別。在該過程中，吞噬細胞釋放可改變細胞膜脂質的超氧化物來制造丙二醛(MDA)。當制造了足夠水平的MDA時，隨后MAA加合物將會產生。就其本身而言，組織內MAA的存在為發生在炎癥反應期間的組織/細胞損傷的量的反應，且其檢測為該炎癥的良好標志物。
[0176]已經表明MAA加合物具有許多前炎癥性和免疫刺激性特性，這些特性可以導致抗體發展為MAA加合物和其結合在上面的大分子(見我們的第二份專利、其他的論文)。因此,抗MAA抗體的存在可反映炎癥反應期間組織內形成的MAA的量。此外，MAA的單克隆和多克隆抗體的產生使得評估不同疾病中的炎癥反應成為可能。
[0177]因此，在某些實施方案中，預期可以將MAA加合物和/或MAA加合物的抗體用作以炎癥反應為特征的多種病理中的炎癥的標志物。
[0178]以炎癥反應為特征的病癥的實例包括，但不限于:風濕性關節炎、動脈粥樣硬化(如上面所指出)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺氣腫、哮喘、感染(例如，細菌性感染、病毒性感染、寄生性感染)、膿毒癥/膿毒癥綜合癥、炎癥性腸病、狼瘡、多發性硬化、結締組織病、肝炎、濕疹等。
[0179]因此，在某些實施方案中，提供了評估個體的炎癥性病變的風險、狀態、階段、進展或嚴重性的方法。該方法通常包括:測定來自個體的生物樣品中的MAA加合物和/或抗MAA加合物的水平，其中MAA加合物和/或抗MAA抗體的提高的水平(相比正常健康的個體，和/或相比與以前相同的個體)指示炎癥性病變的增加的風險、狀態、階段、進展和/或嚴重性。在某些實施方案中，樣品包括選自以下的樣品:尿液樣品、血清樣品、血漿樣品、血液、血液部分、口腔液體/痰、支氣管灌洗、滑液樣品、糞便樣品、組織活檢和腦脊液樣品。
[0180]應當理解可以在差別診斷的情形下容易地測定為炎癥性狀態所特有的特定病變，例如，通過考慮其他的風險因子、病史、生活方式和其他的測試結果。
[0181]可以根據本領域技術人員熟知的標準方法進行MAA加合物和/或抗MAA加合物抗體的分析。
[0182]試劑盒
[0183]診斷/預后分析試劑盒
[0184]在某些實施方案中，用于檢測和/或定量生物樣品中的抗MAA加合物抗體的試劑盒是預期的。在一個實施方案中，該試劑盒包含含有MAA蛋白質加合物的容器，其中可以將MAA蛋白質加合物提供為凍干粉、溶于溶液中或連接到固相支持體上(例如，微量滴定板、微珠等)。該試劑盒可以任選地還包含一種或多種試劑，用于檢測MAA-加合物/抗MAA加合物復合物。此類試劑可以包含抗MAA抗體(例如，抗MAA抗體IgG，和/或IgM，和/或IgM)。該試劑盒可以還包含報道分子，如，例如，酶(諸如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)、基質、輔因子、抑制劑、染料、放射性核素、發光基團、熒光基團、生物素或者諸如膠體金或硒的膠粒。優選將此類報道分子直接連接到檢測試劑抗體上。
[0185]在某些實施方案中，試劑盒另外包含參考樣品。此類參考樣品可以，例如，包括一種或多種抗MAA加合物抗體的標準溶液。
[0186]在另一實施方案中，試劑盒任選包含樣品制備方式，如，樣品收集裝置、樣品貯存容器、緩沖液、酶底物等。
[0187]此外，試劑盒任選包含可提供指導(例如，方案)的標記材料和/或指導材料，用于實踐本文中描述的診斷/預后方法。優選的指導材料描述了抗MAA加合物抗體(例如，IgG,和/或IgM，和/或IGA)的檢測，來診斷斑塊的存在和/或來評估斑塊形成的預后(例如，形成穩定或不穩定斑塊)。
[0188]成像試劑盒
[0189]在某些實施方案中，提供了用于檢測和/或定量體內MAA加合物的試劑盒(例如，用于體內成像斑塊)。在某些實施方案中，這些試劑盒包含含有抗MAA加合物抗體的容器。在某些實施方案中，該試劑盒可以還包含可檢測標記(例如，不透射線的標記、MRI標記、PET標記、NMR標記、ESR標記等)。該試劑盒可以任選地還包含一種或多種試劑和/或裝置，用于體內給予和/或檢測抗MAA抗體。
[0190]此外，該試劑盒任選包含可提供使用MAA加合物成像試劑來和/或定位，和/或成像斑塊的說明(例如，方案)的標記材料和/或指導材料。
[0191]雖然不同試劑盒中的指導材料通常包括書寫的或打印的材料，它們并不限于此。任何能儲存此類說明并將它們傳達給終端用戶的媒介都是本發明預期的。此類媒介包括，但不限于:電子儲存媒介(例如，磁盤、磁帶、暗盒、芯片)、光學媒介(例如，CD ROM)等。此類媒介可以包括可提供此類指導材料的互聯網網站的網址。
實施例
[0192]提供以下實施例來例證、但不限制要求保護的發明。
[0193]實施例1
[0194]用醛類修飾的Ox-LDL和蛋白質通過兩者共有的丙二醛/乙醛(MAA)加合物誘導前炎癥、免疫和動脈粥樣硬化效應
[0195]早已知道Ox-LDL和隨后由位于主動脈的血管壁上的巨噬細胞攝取可增加動脈粥樣硬化病變和斑塊形成的風險。丙二醛/乙醛修飾的蛋白質(MAA)存在且似乎與人動脈粥樣硬化的發展和進展相關。該研究的目的是確定MAA修飾的蛋白質和Ox-LDL間是否存在關聯，這可以解釋它們在發展動脈粥樣硬化中的潛在作用。
_6] 方法
[0197] 將小鼠主動脈內皮細胞系CRL-2167用來確定MAA修飾的蛋白質或Οχ-LDL是否可能誘導細胞因子表達和/或分泌。簡單地說，將這些細胞暴露到不同濃度的LDL、Ox-LDL,人血清白蛋白(HSA)或HSA-MAA下，并分析其細胞因子表達(mRNA)和分泌(蛋白質)。為了評定這些反應是否是因為修飾的配體的相似性，用LDL、Ox-LDL、LDL-MAA、HAS或HSA-MAA免疫Balb/c大鼠，并測試了血清以驗證MAA和LDL的抗體的存在。使用先前報導為對該表位具有特異性的抗體分析了這些配體，以驗證MAA。從JCR大鼠提取了主動脈組織并通過免疫印跡探測MAA修飾的蛋白質。
[0198]結果和結論
[0199]mRNA表達和蛋白質分泌研究證明了用HSA-MAA、Οχ-LDL和LDL-MAA孵育后MCP-1、IL-6, TNF-α和平滑肌肌動蛋白的增加。來自用不同的配體免疫過的小鼠的血清表明MAA的抗體僅在用Οχ-LDL、LDL-MAA和HSA-MAA免疫過的小鼠體內產生。抗MAA抗體表明僅這3個免疫性配體含有該加合物。用LDL-MAA免疫還導致潛在致病的抗LDL抗體的產生。最后，如通過免疫印跡ting、使用抗MAA抗體所評估，來自JCR大鼠的主動脈含有MAA修飾的蛋白質。總之，MAA修飾的蛋白質和Οχ-LDL引起抗體反應和前炎癥效應，它們可以通過兩者共有的MAA部分加重動脈粥樣硬化疾病。
[0200]實施例2
[0201]用于評估患有動脈粥樣硬化疾病和劑型心肌梗死的患者中易損斑塊的新的生物標志物
[0202]被氧化的蛋白質涉及動脈粥樣硬化的發展和進展。制造了丙二醛(MDA)-乙醛(AA)加合物(MAA)，且其為用氧化性產物MDA孵育蛋白質后形成的優勢表位。該研究的目的是作為心臟動脈疾病的標志物評估抗MAA加合物抗體。
[0203]分析了來自正常對照、患有急性心肌梗死(MI)、早期冠狀動脈疾病(CAD)和晚期狀態冠狀動脈疾病的患者的血清樣品的MAA蛋白質加合物的抗體(生物標志物)。
[0204]為了測定血清樣品中的MAA蛋白質加合物，用人白蛋白或人白蛋白MAA包覆ELISA盤。將來自個體的血清稀釋并加入到合適的孔中。使用過氧化物酶標記的抗人IgG第二抗體檢測抗體結合(如圖3中所闡述)。測定了光密度并從人IgG標準曲線外推出了抗MAA加合物抗體的濃度。將抗MAA加合物抗體濃度測定為抗體MAA-白蛋白減去單一的白蛋白的抗體濃度的濃度。
[0205]如圖4中所闡述，相比正常對照、患有早期階段CAD的個體和患有晚期階段CAD的個體，患有急性MI的個體具有顯著偏高的抗MAA加合物抗體水平。
[0206]存在關于以上分析的特異性的問題，因此進行了研究來表明檢測到得抗體即為加合物MAA的抗體。使用牛血清白蛋白(BSA)和用MAA修飾的BSA(BSA-MAA)抑制了血清抗體濃度。將抗體維持在恒定的稀釋水平并將不同濃度的BSA或BSA-MAA用作抑制劑。將抗體和抑制劑一起孵育，隨后將他們加入到分析孔中并按如上所述使其發展。產生的數據，呈現為百分比抑制，展示在圖5中。如其中所示，MAA特異性抗體包含約70%的信號。
[0207]在這些關于MAA的抗體的研究過程中獲得了有趣的觀察結果。在心肌梗死(MI)時和穩定后24小時收集血清。如圖6中所顯示，MI后24小時抗體濃度顯著減少。不受具體理論所束縛，據信這是由于組織被破壞時產生且在MI期間被釋放的修飾蛋白質對抗體的結合和扣留。
[0208]還檢測了來自冠狀動脈旁路移植術(CABG)患者的主動脈鉆取活組織檢查中MAA的存在。用MAA的抗體著色來自冠狀動脈旁路移植術(CABG)患者的鉆取活組織檢查。結果顯示在圖7中。用小鼠(中圖)或兔血清(右圖)阻塞組織，隨后與用紅外線顆粒(680nm)直接標記的小鼠或兔抗MAA孵育。通過共聚焦顯微鏡(63倍)評估片子。組織的自發熒光由左圖中的組織表示。如圖7中所闡述，MAA存在于這些患者的主動脈中。[0209]圖8提供了易損斑塊的圖解，顯示了脂質核心、炎癥位點、薄纖維帽和MAA修飾的蛋白質(MAA加合物)的位置。
[0210]在另一研究中，測定了 JCR大鼠體內MAA修飾的大鼠白蛋白的血清抗體濃度。用高膽固醇飲食喂養JCR大鼠6-8個月。分析了血清，以驗證大鼠的用MAA修飾的血清白蛋白(RSA-MAA)、正常大鼠血清白蛋白(RSA)或主動脈和用MAA修飾的主動脈的抗體的存在。數據顯示在圖9中。對未修飾蛋白質減去MAA修飾的蛋白質的活性間的差異表示為ng/ml的從標準曲線推測來的大鼠IgG。
[0211]還進行了來自JCR大鼠的主動脈組織的MAA修飾的蛋白質(MAA蛋白質加合物)的免疫沉淀反應。喂養JCR大鼠高膽固醇飲食6-8個月。收集了來自JCR大鼠或斯普拉-道來氏大鼠的主動脈組織，并使用單克隆抗MAA抗體免疫沉淀。通過SDS-PAGE溶解蛋白質并用兔抗MAA抗體通過免疫印跡探測。結果顯示在圖10中。數據表示88帶的著色性88-kDa的強度，表示為3個動物實驗的均值土SEM。JCR大鼠顯示顯著偏高的MAA加合物水平。
[0212]該模型似乎在模仿人體系統，關于:1)發展動脈粥樣硬化斑塊；2)發展對MAA修飾的蛋白質抗體滴度；和3)可以在發展出動脈粥樣硬化的JCR大鼠的主動脈中檢測到MAA修飾的蛋白質的形成。
[0213]不受具體理論所束縛，據信在動脈粥樣硬化的進展中和在特定的冠狀動脈疾病中，建立了炎癥位點，其中被氧化的蛋白質和LDL結合、內在化并起始前炎癥反應。一些oxLDL和MAA修飾的蛋白質被從該位點釋放，并遷移到免疫系統來以負荷依賴性方法啟動免疫反應。起始了與動脈粥樣硬化斑塊的發展以及其進展相關的抗體。MAA的抗體越多，斑塊不穩定的幾率越大。隨著oxLDL和加合的蛋白質積聚，更多的炎癥細胞積聚、滲入，且斑塊生長，造成心絞痛。最后，炎癥變得具有壓倒性，由于細胞因子和免疫反應，造成纖維斑塊帽變薄，且由于漏膜和對泄露的修飾的大分子的響應，抗體濃度增加。最終，斑塊破裂造成釋放大量的oxLDL和與循環性抗體結合的MAA修飾的蛋白質，引起減少的抗體濃度。
[0214]實施例3
[0215]患有動脈粥樣硬化疾病和急性心肌梗死的患者體內增加的MAA-蛋白質加合物和抗MAA抗體:用于評估易損斑塊的新的生物標志物
[0216]被氧化的蛋白質涉及動脈粥樣硬化的發展和進展。丙二醛/乙醛(MAA)修飾的LDL被高度氧化且優勢表位在用丙二醛修飾蛋白質后形成。MAA修飾的蛋白質還與內皮細胞和巨噬細胞上的清道夫受體結合，并促進前炎癥細胞因子的釋放。已經在動脈粥樣硬化的JCR大鼠模型中檢測到了 MAA修飾的蛋白質。
[0217]目標:
[0218]該研究的目的是評估來自患有動脈粥樣硬化的患者的組織以驗證MAA加合的蛋白質的存在,并測定這些患者體內循環性抗MAA抗體的水平。
[0219]方法:
[0220]收集了來自正常對照(N=82)、穩定型心絞痛(N=42)、急性心肌梗死(AMI) (N=39)和冠狀動脈旁路移植術(CABG) (N=72)的血清樣品，并測試了循環性MAA修飾的蛋白質和抗MAA抗體的存在。使用單克隆小鼠抗MAA抗體，使來自CABG患者的主動脈鉆取活組織檢查經歷了免疫組織化學著色，并通過共聚焦顯微鏡檢測。
[0221]結果:[0222]相比正常健康的對照，來自患有穩定型心絞痛、急性MI和CABG的患者的血清中的MAA修飾的蛋白質的循環性抗體被顯著性增加(P〈0.001)。相比來自穩定型心絞痛(P<0.04)或CABG(P〈0.004)患者的血清樣品，來自患有急性MI的患者的血清樣品具有顯著增加的循環性抗MAA抗體水平。主動脈鉆取活組織檢查的共聚焦顯微鏡檢查顯示增加的MAA加合物水平。
[0223]益論:
[0224]AMI患者體內抗MAA抗體顯著偏低的水平被認為是急性期期間抗體產生的初始增力口，伴隨著隨后隨著在患者的支架或搭橋手術前的醫療穩定后修飾的蛋白質或LDL被清除又減少的結果。這些數據顯示了循環性抗MAA抗體水平的顯著增加和患有動脈粥樣硬化的患者的組織中MAA加合物的存在。抗MAA抗體和MAA修飾的蛋白質可以用作動脈粥樣硬化疾病另外的生物標志物和易損斑塊的估量。
[0225]實施例4
[0226]CAD中的MAA的抗體同種型
[0227]測定了來自正常對照、急性MI患者、穩定早期CAD患者和穩定晚期CAD患者的血清中的MAA加合物的不同抗體同種型(IgG、IgM和IgA)的血清濃度。如圖11中所顯示，相比正常對照或患有穩定早期CAD或穩定晚期階段CAD的患者，患有急性MI的患者具有顯著偏高的MAA加合物的IgG水平。
[0228]如圖12中所顯示，相比正常對照和患有穩定早期CAD或穩定晚期CAD的患者，患有急性MI的患者具有顯著偏高的MAA加合物的抗體的IgM水平。這些發現緊密地模仿了觀察到的MAA加合物的IgG抗體的發現。
[0229]圖13顯示相比正常對照或患有穩定早期CAD和穩定晚期CAD的患者，來自患有穩定晚期CAD的患者的血清具有顯著偏高的MAA加合物的IgA抗體水平。患有穩定早期CAD和急性MI的患者也具有顯著高于正常對照的MAA加合物的IgA抗體水平。
[0230]不受具體理論所束縛，據信在動脈粥樣硬化進展期間，且尤其是在冠狀動脈疾病期間，建立了炎癥位點，其中被氧化的蛋白質和LDL結合、內在化和啟動前炎癥反應。一些oxLDL和MAA修飾的蛋白質被從該位點釋放，并遷移到免疫系統來以負荷依賴性方法啟動免疫反應，引起IgM抗體的產生。隨著oxLDL和加合的蛋白質積聚，更多的炎癥細胞滲入，且斑塊生長，造成心絞痛。最后，炎癥變得具有壓倒性，IgM抗體被類別轉換為更具致病性的IgG抗體，其幫助纖維斑塊帽變薄(由于細胞因子和免疫反應)，且由于漏膜和對增加的泄露的修飾的大分子水平的響應，抗體濃度增加。最終斑塊破裂造成大量的oxLDL和MAA修飾的蛋白質的釋放和急性心肌梗死。作為選擇，在患有穩定CAD的患者體內，oxLDL和加合的蛋白質在帽的外膜邊(不在脈管系統的內腔內)上積累，且炎癥反應得到減少。釋放的細胞因子造成IgA反應，其為更少致病性的，且纖維斑塊帽被保持完整，導致穩定性CAD。
[0231]實施例5
[0232]區別正常冠狀動脈、穩定的動脈粥樣化病灶和不穩定的動脈粥樣化病灶:患有動脈粥樣硬化疾病和急性心肌梗死的患者中MAA-蛋白質加合物和抗MAA抗體同種型
[0233]被氧化的蛋白質涉及動脈粥樣硬化的發展和進展。制造了丙二醛(MDA)-乙醛(AA)加合物(MAA)，且其為用氧化性產物MDA孵育蛋白質后形成的優勢表位。此外，已經在JCR動脈粥樣硬化大鼠主動脈組織和動脈粥樣硬化的人體模型中檢測到了這些MAA修飾的蛋白質。MAA修飾的蛋白質涉及動脈粥樣硬化疾病的進展。
[0234]且起:
[0235]本研究的目的是評估MAA加合的蛋白質和循環性IgM、IgG和IgA抗MAA抗體同種型與具有正常冠狀動脈的患者和患有穩定和不穩定動脈粥樣硬化病變的患者的關聯。
[0236]方法:
[0237]在6個月期間，收集了來自正常對照(n=82)、穩定型心絞痛(n=42)、急性心肌梗死(AMI) (n=41)和冠狀動脈旁路移植術(CABG) (n=72)患者的血清樣品，并測試了抗MAA抗體同種型的存在。所有的樣品都在肝素化、干預和/或旁路血液泵起始前收集。使用單克隆小鼠抗MAA抗體使來自CABG患者的大動脈鉆取活組織檢查經歷免疫組織化學(IHC)著色，并通過共聚焦顯微鏡檢測。
[0238]益果:
[0239]相比患有冠狀動脈疾病(p〈0.001)的患者，正常對照患者具有顯著偏低的循環性抗 MAA IgG(97ng/ml, SE=6.9)和 IgA(82ng/ml)。相比穩定型心絞痛(186ng/ml, SE=20.7)(ρ〈0.04)或CABG患者(163ng/ml, SE=14.6) (ρ〈0.004)，AMI患者具有顯著增加的循環性抗 MAA IgG 抗體(242ng/ml, SE=30.5)水平。相比穩定型心絞痛(367ng/ml, SE=64.4)(ρ〈0.001)或AMI患者(361ng/ml, SE=65.0) (ρ〈0.001)，來自患有CABG的患者的血清樣品具有顯著增加的循環性抗MAA IgA抗體(2495ng/ml，SE=334)水平。抗MAA IgM抗體以與IgG結果類似的形式在組間顯著不同。主動脈鉆取活組織檢查的共聚焦顯微鏡檢查證實主動脈中層間隙中MAA加合物增加的水平。
[0240]益論:
[0241]這些數據表明MAA修飾的蛋白質存在于動脈粥樣硬化組織，且患有冠狀動脈疾病的患者中循環性抗MAA抗體(IgM、IgG和IgA)水平存在顯著增加。相比正常冠狀動脈和穩定型CAD患者，展現AMI的患者中抗MAA IgM和IgG表型顯著增加，然而，相比所有其他的組，進行過CABG的患者體內抗MAA IgA表型顯著增加。免疫球蛋白表型(IgM、IgG和/或IgA)被假定為僅次于患病組織中MAA修飾的蛋白質的抗原致敏作用的差異(Thl對Th2)。
[0242]應思:
[0243]抗MAA IgM、IgG和IgA抗體同種型以及MAA修飾的蛋白質可以用作亞臨床的動脈粥樣硬化疾病(IgM、IgG和IgA)的生物標志物，以及用作區分具有穩定型(IgA)和不穩定型(IgG)動脈粥樣硬化斑塊的CAD患者。
[0244]應當理解本文中描述的實例和實施方案僅用于示例性目的，且基于其的不同的修飾或改變被教導給本領域技術人員且被包括在本申請的精神和范圍以及附加的權利要求的范圍內。本文中引用的所有的出版物、專利和專利申請通過引用整體并入本文，用于所有目的。
【權利要求】
1.鑒定哺乳動物具有提高的不利心血管事件風險和/或確定所述哺乳動物的預后的方法，所述方法包括: 確定與來自所述哺乳動物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，所述抗體的提高的水平指示所述哺乳動物患有一種或多種動脈粥樣硬化病變。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結合的IgG抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
3.如權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結合的IgM抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結合的IgA抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，所述IgG抗體和/或所述IgM抗體的提高的水平指示所述哺乳動物具有一個或多個動脈粥樣硬化斑塊和存在患心臟動脈疾病風險。
6.如權利要求5所述的方法，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，所述IgA抗體提高的水平指示所述哺乳動物患有穩定型心絞痛。
7.如權利要求5所述的方法，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，所述IgA抗體的水平指示所述哺乳動物患有不穩定型心絞痛且存在明顯的心肌梗死風險。
8.如權利要求5-6中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物被作為具有提高的不利心血管事件風險的個體和/或被作為患`有穩定型心絞痛的個體接受治療。
9.如權利要求7所述的方法，其中所述哺乳動物被作為患有不穩定型心絞痛且存在明顯的心肌梗死風險的個體接受治療。
10.如權利要求8-9中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物被開出了補充測試的處方和/或進行了所述補充測試。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述補充測試不為測量與MAA加合物結合的抗體。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述補充測試包括選自以下的一種或多種測試:心臟組織損傷或高心臟病發作風險的血液檢查、心電圖、壓力測試、冠脈MRI和冠狀動脈造影。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述血液檢查包括選自以下的一種或多種測試:肌鈣蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)、LDL、AST、ALT和肌紅蛋白。
14.如權利要求12所述的方法，其中所述壓力測試包括選自以下的一種或多種測試:運動耐量測試、核壓力測試、心臟MRI壓力和壓力超聲波心動圖。
15.如權利要求8-14中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物被開出治療的處方和/或被治療。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述治療包括給予藥物。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述藥物包含選自以下的一種或多種藥物:他汀類、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、鈣通道阻滯劑以及雷諾嗪。
18.如權利要求15-17中任一項所述的方法，其中所述治療為選自以下的治療:血管成形術、經皮介入(PCI)，包括支架植入、和冠狀動脈搭橋術。
19.如權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述抗MAA加合物IgG抗體或抗MAA-1gM抗體水平和/或基于，至少部分基于所述水平的診斷被記錄在患者病歷中。
20.如權利要求1-19中任一項所述的方法，其中所述抗MAA加合物IgA抗體和/或基于，至少部分基于所述水平的診斷被記錄在患者病歷中。
21.如權利要求19-20中任一項所述的方法，其中所述患者病歷由實驗室、醫師診所、醫院、健康維護組織、保險公司或私人病歷網站維護。
22.如權利要求1-21中任一項所述的方法，其中至少部分基于抗MAA加合物IgG抗體水平，和/或IgM抗體水平，和/或IgA抗體水平的診斷，被記錄在選自以下的醫師警示物品上/內:卡、穿戴物或射頻識別(RFID)標記。
23.如權利要求19-20中任一項所述的方法，其中所述抗體水平和/或基于所述抗體水平的診斷被記錄在非暫時性的計算機可讀媒介上。
24.如權利要求1-23中任一項所述的方法，還包括告知所述個體抗MAA加合物抗體和/或至少部分基于抗MAA加合物抗體分析的診斷的結果。
25.如權利要求1-24中任一項所述的方法，其中所述與MAA加合物結合的抗體作為差別診斷的一部分被檢測。
26.如權利要求1-25中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物為非人的哺乳動物，且所述生物樣品來自所述非人的哺乳動物。`
27.如權利要求1-25中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物為人，且所述生物樣品來自所述人。
28.如權利要求1-27中任一項所述的方法，其中所述生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。
29.如權利要求1-28中任一項所述的方法，其中在分析中檢測抗MAA加合物抗體，在所述分析中，所述生物樣品被分開以從至少一種其他的樣品組分中分離包含所述抗體的部分。
30.如權利要求1-29中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物為已知患有或懷疑患有動脈粥樣硬化的哺乳動物。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述哺乳動物具有選自以下的一種或多種風險因子:心臟病家族風險、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖、糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結締組織病癥、慢性感染和炎癥性腸病。
32.如權利要求1-31中任一項所述的方法，其中在分析中檢測了與MAA加合物結合的IgG抗體和/或IgM抗體,和/或IgA抗體,在所述分析中，所述抗體和/或在所述抗體和MAA加合物之間形成的復合物變得標記有可檢測標記。
33.如權利要求1-32中任一項所述的方法，其中在分析中檢測了與MAA加合物結合的IgG抗體,和/或IgM抗體,和/或IgA抗體,在所述分析中，所述抗體通過與其他的分析組分形成復合物由未結合狀態變成了結合狀態。
34.如權利要求1-33中任一項所述的方法，其中在分析中檢測了與MAA加合物結合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗體變成固定在固相上。
35.如權利要求1-34中任一項所述的方法，其中使用選自以下的分析測量所述IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平:SDS/PAGE、等電點聚焦、2維凝膠電泳、血凝分析和免疫分析。
36.如權利要求35所述的方法，其中使用ELISA分析測量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平。
37.如權利要求35-36中任一項所述的方法，其中所述免疫分析包括: 提供被固定在固相支持體上的MAA加合物； 在這樣的條件下將所述MAA加合物與所述生物樣品接觸，其中所述樣品中的抗MAA加合物抗體與MAA加合物結合，形成加合物/抗體復合物；和 將所述復合物與特異性結合IgG抗體或IgA抗體或IgM抗體的檢測抗體接觸，或者將所述復合物與結合任一抗體的檢測試劑接觸；和 檢測和/或定量所述結合的檢測抗體或所述結合的檢測試劑。
38.如權利要求37所述的方法，其中: 所述檢測抗體被連接到可檢測標記上或被連接到可檢測標記上的另一抗體結合；和/或所述檢測試劑被連接到可檢測標記上和/或所述檢測試劑被連接到可檢測標記上的抗體結合；且 所述檢測和/或定量包括檢測和/或定量所述可檢測標記。
39.監測哺乳動物中動脈粥樣硬化進展的方法，所述方法包括:` 確定與來自所述哺乳動物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定；和 將所述抗體的水平與在先前的時間點測得的所述哺乳動物的水平比較，其中: 相比先前的測定，與所述生物樣品中的所述MA A加合物結合的抗體的總水平的增加，指示所述哺乳動物中動脈粥樣硬化病變已經惡化；且 相比先前的測定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結合的抗體的總水平的減少，指示所述哺乳動物中動脈粥樣硬化病變得到減輕或進展的風險得到減少。
40.如權利要求39所述的方法，其中在所述先前的時間點與所述確定或使其得到確定的時間之間的時期，所述哺乳動物的動脈粥樣硬化得到治療，且: 相比先前的測定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結合的抗體的總水平的增加，指示所述治療具有有限的功效或沒有功效且所述哺乳動物中病變已經惡化；和 相比先前的測定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結合的抗體的總水平的減少，指示所述治療至少具有一些功效且所述哺乳動物中動脈粥樣硬化病變得到減少，或進展的風險得到減少。
41.如權利要求39-40中任一項所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結合的IgG抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
42.如權利要求39-41中任一項所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結合的IgM抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
43.如權利要求39-42中任一項所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結合的IgA抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
44.如權利要求39-43中任一項所述的方法，其中:相比先前的測定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結合的抗體的總水平和/或從IgM到IgG和/或IgA抗體的類別轉換的增加，指示所述哺乳動物中動脈粥樣硬化病變已經惡化；且 相比先前的測定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結合的抗體的總水平和/或從IgM到IgG和/或IgA抗體的類別轉換的減少，指示所述哺乳動物中動脈粥樣硬化病變得到減少。
45.如權利要求39-44中任一項所述的方法，其中相比先前的測定，IgA抗體的增加指示所述哺乳動物中動脈粥樣硬化病變變得更穩定，和/或所述治療至少部分地增加所述哺乳動物中動脈粥樣硬化病變的穩定性。
46.如權利要求40-45中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物的所述治療包括選自以下的一種或多種形式:改變飲食、增加運動、減肥、開他汀類處方/給予他汀類、開受體阻滯劑處方/給予β -受體阻滯劑、開鈣通道阻滯劑處方/給予鈣通道阻滯劑、開血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑處方/給予血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑、心臟導管插入、壓力測試和血管支架。
47.如權利要求39-46中任一項所述的方法，其中如果測量提供所述治療具有有限功效或沒有功效和/或所述哺乳動物中病變已經惡化的指示，則給所述哺乳動物開出補充測試的處方和/或進行補充測試。
48.如權利要求47所述的方法，其中所述補充測試不為與MAA加合物結合的抗體的測量。
49.如權利要求47所述的方法，其中所述補充測試包括選自以下的一種或多種測試:心臟組織損傷或高心臟病發作風險的血液檢查、心電圖、壓力測試、冠脈MRI和冠狀動脈造`影。
50.如權利要求49所述的方法，其中所述血液檢查包括選自以下的一種或多種測試:肌鈣蛋白Ι、Τ-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)、LDL、AST、ALT和肌紅蛋白。
51.如權利要求49所述的方法，其中所述壓力測試包括選自以下的一種或多種測試:運動耐量測試、核壓力測試和壓力超聲波心動圖。
52.如權利要求39-51中任一項所述的方法，其中如果測量提供治療具有有限的功效或沒有功效和/或所述哺乳動物中病變已經惡化的指示，則給所述哺乳動物開出需新的治療、不同的治療或補充治療的處方，和/或使用新的治療、不同的治療或補充治療對其治療。
53.如權利要求52所述的方法，其中所述治療包括給予藥物。
54.如權利要求53所述的方法，其中所述藥物包括選自以下的一種或多種藥物:他汀類、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、血管緊張素受體受體阻滯劑(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、鈣通道阻滯劑以及雷諾嗪。
55.如權利要求52-54中任一項所述的方法，其中所述治療為選自以下的治療:血管成形術、經皮介入(PCI)，包括支架植入、和冠狀動脈搭橋手術。
56.如權利要求39-55中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物為非人的哺乳動物，且所述生物樣品來自所述非人的哺乳動物。
57.如權利要求39-55中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物為人，且所述生物樣品來自所述人。
58.如權利要求56-57中任一項所述的方法，其中所述生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、血漿、血清、組織液、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。
59.如權利要求62-58中任一項所述的方法，其中在分析中檢測抗MAA加合物抗體，在所述分析中，將所述生物樣品分開以從至少一種其他的樣品組分中分離包含所述抗體的部分。
60.如權利要求39-59中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物為已知患有或懷疑患有動脈粥樣硬化的哺乳動物。
61.如權利要求60所述的方法，其中所述哺乳動物具有選自以下的一種或多種風險因子:心臟病家族風險、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖、糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結締組織病癥、慢性感染和炎癥性腸病。
62.治療哺乳動物的方法，所述方法包括: 接受與來自所述哺乳動物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結合的抗體的存在和/或水平的測量，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，所述抗體的提高的水平指示所述哺乳動物患有一種或多種動脈粥樣硬化病變；和 當所述抗體顯示提高的水平時，提供與動脈粥樣硬化相關的對所述哺乳動物的補充測試或使其得到提供，和/或提供與動脈粥樣硬化相關的對所述哺乳動物的補充治療或使其得到提供。
63.如權利要求62所述的方法，其中所述方法包括接受與所述加合物結合的IgG抗體的存在和/或水平的測量。`
64.如權利要求62-63中任一項所述的方法，其中所述方法包括接受與所述加合物結合的IgM抗體的存在和/或水平的測量。
65.如權利要求62-64中任一項所述的方法，其中所述方法包括接受與所述加合物結合的IgA抗體的存在和/或水平的測量。
66.如權利要求62-65中任一項所述的方法，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，所述IgA抗體提高的水平指示所述哺乳動物患有穩定型心絞痛，且所述哺乳動物被進一步測試和/或被作為患有穩定型心絞痛或存在穩定型心絞痛的風險的個體接受治療。
67.如權利要求62-65中任一項所述的方法，其中相比正常健康的哺乳動物中發現的水平，所述IgA抗體的水平指示所述哺乳動物患有不穩定型心絞痛且存在明顯的心肌梗死風險，且所述哺乳動物被進一步測試和/或被作為患有不穩定型心絞痛和/或心肌梗死或存在不穩定型心絞痛和/或心肌梗死風險的個體接受治療。
68.如權利要求62-67中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物被開出補充測試的處方和/或進行了所述補充測試。
69.如權利要求68所述的方法，其中所述補充測試不為與MAA加合物結合的抗體的測量。
70.如權利要求68所述的方法，其中所述補充測試包括選自以下的一種或多種測試:心臟組織損傷或高心臟病發作風險的血液檢查、心電圖、壓力測試、冠脈MRI和冠狀動脈造影。
71.如權利要求70所述的方法，其中所述血液檢查包括選自以下的一種或多種測試:肌鈣蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)、LDL、AST、ALT和肌紅蛋白。
72.如權利要求70所述的方法，其中所述壓力測試包括選自以下的一種或多種測試:運動耐量測試、核壓力測試和壓力超聲波心動圖。
73.如權利要求62-72中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物被開出治療的處方和/或被治療。
74.如權利要求73所述的方法，其中所述治療包括給予藥物。
75.如權利要求74所述的方法，其中所述藥物包括選自以下的一種或多種藥物:他汀類、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、血管緊張素受體受體阻滯劑(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、鈣通道阻滯劑以及雷諾嗪。
76.如權利要求73-75中任一項所述的方法，其中所述治療為選自以下的治療:血管成形術、經皮介入(PCI)，包括支架植入、和冠狀動脈搭橋手術。
77.如權利要求62-76中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物為非人的哺乳動物，且所述生物樣品來自所述非人的哺乳動物。
78.如權利要求62-76中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物為人，且所述生物樣品來自所述人。
79.如權利要求62-78中任一項所述的方法，其中所述生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、血漿、血清、組織液、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。`
80.如權利要求62-79中任一項所述的方法，其中在分析中檢測抗MAA加合物抗體，在所述分析中，將所述生物樣品分開以從至少一種其他的樣品組分中分離包含所述抗體的部分。
81.如權利要求62-80中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物為已知患有或懷疑患有動脈粥樣硬化的哺乳動物。
82.如權利要求81所述的方法，其中所述哺乳動物具有選自以下的一種或多種風險因子:心臟病家族風險、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結締組織病癥、慢性感染以及炎癥性腸病。
83.如權利要求62-82中任一項所述的方法，其中在分析中確定與MAA加合物結合的IgG抗體和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測量，在所述分析中，抗體和/或所述抗體和MAA加合物之間形成的復合物變得標記有可檢測標記。
84.如權利要求62-83中任一項所述的方法，其中在分析中確定與MAA加合物結合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測量，在所述分析中，所述抗體通過與其他的分析組分形成復合物由未結合狀態變成了結合狀態。
85.如權利要求62-84中任一項所述的方法，其中在分析中確定與MAA加合物結合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測量，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗體變成了被固定在固相上的抗體。
86.如權利要求62-85中任一項所述的方法，其中使用選自以下的分析測量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平:SDS/PAGE、等電點聚焦、2維凝膠電泳、血凝分析和免疫分析。
87.如權利要求86所述的方法，其中使用ELISA分析測量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平。
88.如權利要求86-87中任一項所述的方法，其中所述免疫分析包括: 提供被固定在固相支持體上的MAA加合物； 在這樣的條件下將所述MAA加合物與所述生物樣品接觸，其中所述樣品中的抗MAA加合物抗體與MAA加合物結合，形成加合物/抗體復合物；和 將所述復合物與特異性結合IgG抗體或IgA抗體，或IgM抗體的檢測抗體接觸，或者將所述復合物與結合任一抗體的檢測試劑接觸；和 檢測和/或定量所述結合的抗體或所述結合的檢測試劑。
89.如權利要求88所述的方法，其中 所述檢測抗體被連接到可檢測標記上或被連接到可檢測標記上的另一抗體結合；和/或所述檢測試劑被連接到可檢測標記上和/或所述檢測試劑被連接到可檢測標記上的抗體結合；和 所述檢測和/或定量包括檢測和/或定量所述可檢測標記。
90.用于評估哺乳動物中動脈粥樣硬化的存在和/或預后的試劑盒，所述試劑盒包含含有以下的包裝: MAA蛋白質加合物；和 與結合在所述MAA蛋白質加合物`上的IgG抗體特異性結合的第一試劑，和/或與結合在所述MAA蛋白質加合物的IgM抗體特異性結合的第二試劑。
91.如權利要求90所述的試劑盒，還包含與結合在所述MAA蛋白質加合物上的IgA抗體特異性結合的第三試劑。
92.如權利要求90-91中任一項所述的試劑盒，其中所述第一試劑包含與結合在所述MAA蛋白質加合物上的IgG抗體結合的抗體。
93.如權利要求90-92中任一項所述的試劑盒，其中所述第二試劑包含與結合在所述MAA蛋白質加合物上的IgM抗體結合的抗體。
94.如權利要求91-93中任一項所述的試劑盒，其中所述第三試劑包含與結合在所述MAA蛋白質加合物上的IgA抗體結合的抗體。
95.如權利要求90-94中任一項所述的試劑盒，其中所述MAA蛋白質加合物以被固定在固相支持體上的形式提供。
96.如權利要求95所述的試劑盒，其中所述固相支持體包括選自以下的材料:塑料、玻璃、石英、凝膠和金屬。
97.如權利要求95所述的試劑盒，其中所述固相支持體選自:顆粒、測試條、微量滴定板、ELISA盤和微流通道或室。
98.如權利要求90-97中任一項所述的試劑盒，還包含指導材料，所述指導材料教導使用MAA加合物抗體的測量以評估不利心臟事件風險，和/或確定哺乳動物的預后，和/或評估哺乳動物中動脈粥樣硬化的進展，和/或評估治療方案。
99.如權利要求90-98中任一項所述的試劑盒，用于評估不利心臟事件風險、和/或確定哺乳動物的預后，和/或用來評估哺乳動物中動脈粥樣硬化的進展，和/或用來評估治療方案。
100.治療哺乳動物的方法，所述方法包括: 給予所述哺乳動物包含抗體的組合物，所述抗體特異性結合連接到可檢測標記上的MAA加合物或能被可檢測標記選擇性結合； 檢測位于所述哺乳動物的脈管系統內的所述標記的位置，其中所述位置指示潛在的不穩定斑塊。
101.如權利要求100所述的方法，其中所述方法還包括治療所述潛在的不穩定斑塊。
102.如權利要求101所述的方法，其中所述治療包括對所述斑塊位于的區域進行血管成形術。
103.如權利要求101-102中任一項所述的方法，其中所述治療包括在所述斑塊位于的區域內插入支架。`
【文檔編號】G01N33/68GK103518135SQ201280022809
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年3月12日 優先權日:2011年3月11日
【發明者】杰弗里·M·蒂勒, 丹尼爾·R·安德森, 邁克爾·J·杜里埃 申請人:內布拉斯加大學董事委員會