用來進行流動式細胞量測術的方法、系統及儀器的制造方法

用來進行流動式細胞量測術的方法、系統及儀器的制造方法
【專利摘要】本發明提供一種用于偵測一樣品中的一分析物的儀器，其包括一照射源，用于產生電磁能以照射一詢問區域處的該樣品；一凹形收集器組件，其具有一光軸及一焦點，該詢問區域與該凹形收集器組件的該焦點重合；一封閉流槽，其具有一設定于一樣品入口與一樣品出口之間的流徑，該流徑穿過該詢問區域及一安置于該詢問區域下游的分選區域。該流徑中穿過該詢問區域的部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準。該儀器進一步包括包含或懷疑包含該分析物且流入該流徑的該樣品，其中該分析物回應于照射而產生可偵測信號。該儀器也包括一用于偵測該可偵測信號的偵測器。
【專利說明】用來進行流動式細胞量測術的方法、系統及儀器
[0001]相關申請案的交叉參照
[0002]本申請案根據35U.S.C.§ 119(e)主張美國臨時專利申請案第61 / 443，174號(2011年2月15日申請)、第61 / 443，178號(2011年2月15日申請)及第61 / 482, 504號(2011年5月4日申請)的權益，該等案的各別揭示內容以全文引用的方式并入本文中。
【背景技術】
[0003]揭示領域
[0004]本發明大體是關于用于偵測分析物的方法、儀器及系統，且詳言之用于偵測流過封閉流槽的樣品中的分析物且在偵測后視情況使用控制能源影響該封閉流槽中的該分析物的至少一部分的方法、儀器及系統。
[0005]相關技術簡述
[0006]流動式細胞量測分選術允許選擇、富集、分配或分裂所關注細胞、病毒、物體或粒子(下文稱為細胞)的群體。選擇準則包括自細胞外部借助于或不借助于化學試劑或與細胞締合或可使得與細胞締合的復合物或物體可偵測到的個別細胞的可量測性質。舉例而言，細胞性質可通過偵測及/或定量細胞與 一或多種標記(諸如發熒光或已經修飾而使得發熒光的分子、復合物或物體)的締合來量測或估計。根據細胞的定性或定量性質，包括細胞中、細胞上或與細胞締合的蛋白質、脂質、磷蛋白、醣蛋白、磷脂、醣脂、核酸(包括核酸的數量、序列或組織化)、碳水化合物、鹽/離子及任何其它分子的組成，該等熒光分子、復合物及/或物體可與細胞有差別地締合。此外，根據細胞的物理或生理特征，其實例包括(但不限于)膜通透性、膜組成、膜流動性、化學或膜電位、存活力、化學梯度、活動力、氧化電位或氧化態的降低及其它參數或性質，該等熒光分子、復合物及/或物體可與細胞有差別地
鋪A
?φ π O
[0007]細胞(無論經標記或未經標記、經修飾或未經修飾)的可為細胞選擇提供根據的其它可量測性質可包括(但不限于):
[0008]-與細胞相互作用的光的性質，諸如熒光、吸收、反射、散射、偏振或其它性質；
[0009]-細胞的電學性質或細胞對其環境的影響，包括電導、電感、電阻、膜電位或電壓或其它性質；
[0010]-細胞的磁或電磁性質，包括細胞的磁性、順磁性、磁共振及/或與電磁能的相互作用；
[0011]-細胞的外觀、影像或形態性質；及
[0012]-關于以任何方式直接或間接量測的任何物質或參數的細胞組成。
[0013]此外，直接或間接、單一或組合量測該等數量及質量可反映所關注的簡單或復雜細胞性質。
[0014]該性質的一個實例為二倍體、單倍體或配子基因組中所包括的性染色體，其可為X染色體、Y染色體、Z染色體、W染色體或缺乏性染色體(稱為『O』)或其組合,此視細胞類型及生物體而定。此外，已知與其它染色體或DNA序列的存在有關的其它性別判定系統。在許多情況下，細胞的性染色體含量的測定可使用利用一或多種方法直接或間接量測或測定來推斷。該等方法包括經相對或絕對測定的細胞的DNA含量的量測；某些DNA序列的存在或不存在，或某些DNA序列的存在或不存在的標記物；細胞或細胞的一部分或細胞器的大小；特性化細胞的性染色體含量的蛋白質或其它標記物的存在、定位或不存在，或該等標記物的表現組合或模式；或反映細胞的性染色體組成的任何其它量測。可進行許多其它該等量測，或測定性質，以鑒別特定實例、情形、系統、疾病、條件、過程或情況中所關注的細胞。
[0015]該等細胞量測術量測允許對細胞、細胞群體、器官、組織或生物體進行定量及/或定性測定。該等測定可用于許多方面，包括(但不限于)診斷、生物醫學研究、工程改造、流行病學、藥物、農業、畜牧業、家畜管理、動物學、生物制藥業及其它領域。除能夠進行該等量測外，當前方法及儀器允許基于通過如上文所述的細胞量測術量測的特征或參數分離細胞。細胞可通過濃縮、收集、分離或分配所關注細胞或通過移除制劑中不合需要或不關注的細胞來進行陽性或陰性選擇。該選擇可基于可如上文所述測定的任何參數、特征或參數或特征的組合來控制。
[0016]通過包括上述方法或與上述方法有關的方法鑒別的細胞可分離、分配、濃縮、耗竭或收集至任意數目的任何群組中。一種常見分離方法(圖1A中所描繪)使用靜電力將含有具有所需或非所需性質的細胞的帶電或帶靜電的物流或液滴轉向。如圖1A中所說明，視特定應用情況收集或丟棄轉向的細胞。如圖1B中所說明，其它分離方法包括使用包括閥門的射流裝置，或改變氣體或液體流的流動性質或方向的其它方法，將流體流中的細胞轉向至替代路徑、信道、試管或組件以隨后進行收集或處置。如圖1B中所說明，其它方法包括使用使流分裂(諸如與可控制的第二物流相交)的方法，將含有所關注細胞或粒子的物流的一部分轉向以將流體流中的細胞轉向至替代路徑、信道、試管或組件以隨后進行收集或處置。流體流分離至替代分流路徑中可以各種方式達成。舉例而言，美國專利第6，400, 453號描述使用液體或壓縮氣體的流體轉換來將流體轉向。國際專利公開案第W02010 / 149739號描述使用雷射加熱流體流從而引起流分裂及流徑轉向來將流轉向至不同路徑中的另一方法。
[0017]現有多種用來進行細胞的流動式細胞量測分選的方法及系統。其中有設計成進行哺乳動物精細胞的流動式細胞量測分選及詳言之將精細胞分選為帶有X染色體的精細胞群體及/或帶有Y染色體的精細胞群體的方法及系統，其目的在于增加卵與經分選精子的受精將繁衍具有所需性別的后代的可能性。舉例而言，奶農可能需要分選公牛的精子以使得可通過人工授精、試管內受精或其它方法，使用增加帶有X染色體的精細胞的出現率的精細胞制劑制造牛胚胎，以繁衍額外雌性牛后代。
[0018]流動式細胞量測分選方法呈現許多挑戰，尤其關于分選哺乳動物精細胞以供以后用于繁衍后代。重要的是，用于標記及/或區分細胞的方法及/或用于分選細胞的方法不得對細胞的存活力產生不利影響。通常，所涉及的方法及/或系統的一或多個目的(例如較快分選、提高準確性等)與方法及/或系統的其它目的相沖突。必須平衡及考慮各種因素，包括細胞所經受的溫度、溫度變化、壓力及/或壓力變化，細胞所暴露的射流環境，細胞所暴露的化學環境及物質，施加于細胞的力，及細胞的壽命。舉例而言，熒光分子(例如熒光染料)進入細胞以結合于細胞核中的DNA的速率(也即可將細胞染色的速率)可隨溫度增加而增加。因此，系統的輸送量(至少染色過程的輸送量)可隨細胞環境的溫度增加而增力口。然而，溫度增加可能證明對細胞的存活力及/或細胞保持有活力的時間長度不利。相比之下，在低溫下維持細胞以促使維持良好存活力可能會延長細胞染色所需的時間(及因此延長包含量測及分選的整個操作所需的時間)，以致該過程所用的時間長于實務時間或致使細胞在完成該過程所需的時間后不存活。
[0019]另一與分選細胞相關的挑戰是關于細胞的物理及光學性質。詳言之，扁平或另外不對稱細胞(諸如一些哺乳動物紅血球或精細胞)可展現能量(例如光)的各向異性發射。細胞內部的復雜幾何形狀及/或細胞邊界的復雜幾何形狀起透射、折射及/或反射光的作用，此作用方式高度依賴于細胞相對于任何照射源及/或用于區分細胞的偵測器的位向。舉例而言，將哺乳動物精細胞流動式細胞量測術分選為含有X或Y染色體的細胞的出現率增加的群體通常涉及用結合于細胞中的DNA且在結合時發出明亮熒光的分子將細胞染色。大多數哺乳動物物種的X及Y染色體之間的DNA含量變化(Y染色體所含的DNA —般少于X染色體)導致來自含有X染色體的細胞的熒光相對更強。然而，帶有X及Y染色體的細胞的DNA含量差異典型地僅約百分之幾，且細胞幾何形狀及/或位向影響所偵測的熒光的百分比通常可超過X與Y染色體之間的DNA含量差異百分比。另外，該分析要求細胞逐一穿過偵測區域，以使得偵測器不會將來自兩個細胞的熒光解釋為來自單個細胞的熒光。
[0020]流動式細胞量測術分選系統通常使用芯鞘(core-1n-sheath)射流機構來使細胞穿過偵測區域。如圖1C中所描繪，將細胞752的水性懸浮液的相對緩慢移動流750注入鞘流體的相對較快移動流754中。此配置將細胞752集中為物流756，稱為芯流。在適當選擇壓力、邊界的形狀、尺寸、位向及材料及射流系統的組分，及隨后芯懸浮液及鞘流體的速度及組織化的情況下，通過鞘流所施加的流體動力使芯流變窄，且使芯流中的細胞縱向分布以使得其幾乎逐個帶入流中。迫使芯流拉長及變窄的額外益處為使細胞752定向以使得細胞752的縱軸758 —般平行于單行流756的流動方向。然而，細胞關于縱軸758的位向在系統中保持不同程度的隨機性，其中芯流及鞘流設計成一般關于流軸呈圓柱形對稱。因此，當各細胞752穿過偵測區域時，入射于細胞上的光、自細胞發射的光(例如熒光或散射光或透射光)及自細胞反射離開的光仍依賴于細胞752的位向。此對于許多類型的哺乳動物精細胞尤其成立。
[0021]流動式細胞量測術系統中關于照射及偵測細胞的精細胞位向問題存在多種解決方法。舉例而言，圖1D說明一種解決方法，該解決方法使用試管762上的切割、斜截尖端760將樣品流764注入鞘流766中。扁平、斜截尖端760有助于使細胞關于其縱軸758在鞘流766中定向(圖1C中所說明)，以使得細胞的扁平面傾向于以一致方向排列。另一解決方法(其可與斜截尖端解決方法組合)使用彼此正交的兩個偵測器768及770 (O度偵測器768及90度偵測器770)，其組合使用以估計各細胞穿過偵測區域772時的位向并量測經發現已適當定向以便可精確定量熒光信號的彼等細胞的熒光。使用流體動力學使細胞關于縱軸定向的解決方法一般得到對于樣品流中約60%至約80%的細胞達成熒光量測的所需對準的群體，其降低儀器的輸送量且導致丟棄不適當定向的細胞。
[0022]與細胞幾何形狀及位向相關的問題的又一解決方法利用沿與載運細胞的芯鞘流相同的軸進行光學偵測。在一種該解決方法中，使用落射照射(ep1-1llumination)光學組件照射細胞且偵測細胞所發出的光。如圖1E中所描繪，由鞘流776載運的樣品流774直接移向顯微鏡物鏡778，從而消除對細胞(例如精細胞780)關于細胞780的縱軸782定向的依賴性。然而，細胞780向著物鏡778的軌跡要求細胞780在穿過偵測區域784 (也即物鏡778的焦點784)后立即改變軌跡。該系統通過使用橫向流體流786來實現此軌跡變化。個別細胞位置的不確定性可在分析后因橫向流體流786及鞘流776及樣品流774的會聚788而引入。該位置不確定性可使得系統不能有效進行細胞分選，因為會聚流中細胞780的位置可在細胞穿過偵測區域784后立即或不久變得無法預測。
[0023]圖1F中說明的另一解決方法利用一或多個拋物形或橢球形反射器802均勻地照射細胞及/或收集細胞徑向發出的光。該系統利用噴嘴804發射含有個別細胞792的液體流/射流806。物流806移動穿過偵測區域794并穿過反射器802中的孔796。在穿過偵測區域后的某一時刻，物流806分裂為可帶電的液滴790。隨后，各液滴790可通過例如使用帶電致偏板798使帶電液滴790偏轉以使液滴偏轉至一或多個容器800中來進行分選。問題在于，此「空氣中射流(jet-1n-air)」組態使得當物流806離開噴嘴804時物流806 (及物流806中所含的細胞792)經受壓降。突然的壓力變化(及噴嘴內自身的壓力增加)會不利地影響細胞792的存活力，隨后會使細胞792沖入容器800中。因此，物流806離開噴嘴804的壓力及速度必須保持低于會損壞細胞792的任何臨限值，其降低系統的輸送量。另夕卜，液滴790移動穿過氛圍可能需要環境約束，包括室內空氣的潔凈度(例如「潔凈室」)及溫度控制。
[0024]因此，即使使用相對先進的流動式細胞量測術，此項技術中仍需要提供更高效、更靈敏且更精確的細胞鑒別及/或分離方法及裝置。

【發明內容】

[0025]根據本發明的一具體實例，用于偵測射流樣品中的分析物的儀器包括用于產生電磁能以照射詢問區域處的樣品的照射源；包含頂點、光軸及焦點的凹形收集器組件，該詢問區域與該凹形收集器組件的該焦點重合；及封閉流槽。該封閉流槽包括樣品入口、樣品出口、設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過詢問區域及安置于詢問區域下游的分選區域。流徑中穿過詢問區域的部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準，且流徑中穿過詢問區域及分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉。包含或懷疑包含該分析物的該樣品以芯鞘流或層流形式流入流徑，至少穿過詢問區域。樣品具有自詢問區域向該收集器組件的該頂點移動的流動方向，或自收集器的頂點向詢問區域移動的流動方向且流徑的一部分穿過收集器組件的內部體積。分析物響應于照射而產生可偵測信號。該儀器也包括用于偵測該可偵測信號的偵測器。
[0026]根據本發明的另一具體實例，用于偵測射流樣品中的分析物的儀器包括用于照射詢問區域處的樣品的照射源；第一及第二凹形光學組件，其各包含光軸及焦點；安置于該第一凹形光學組件的內部體積中的圓錐形光學組件，其中該照射源聚焦于圓錐形光學組件上。該儀器也包括包含頂點、光軸及焦點的凹形收集器組件，其中該詢問區域與該凹形收集器組件的焦點重合；及封閉流槽。該封閉流槽包括樣品入口、樣品出口、設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過詢問區域及安置于詢問區域下游的分選區域。流徑中穿過詢問區域的部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準。流徑中穿過詢問區域及分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉。包含或懷疑包含該分析物的該樣品以芯鞘流或層流形式流入流徑，至少穿過詢問區域。該第二凹形光學組件將電磁能聚焦于詢問區域處的樣品上。分析物響應于照射而產生可偵測信號。儀器也包括用于偵測該可偵測信號的偵測器，該可偵測信號由凹形收集器組件收集且反射至該偵測器。
[0027]根據本發明的另一具體實例，用于偵測射流樣品中的分析物的儀器包括用于照射詢問區域處的樣品的照射源；第一及第二拋物形光學組件，其各包含光軸及焦點；安置于該第一拋物形光學組件的內部體積中的圓錐形光學組件，其中該照射源聚焦于該圓錐形光學組件上；及包含頂點、光軸及焦點的橢球形收集器組件。該第一拋物形光學組件及該第二拋物形光學組件、該圓錐形光學組件及該橢球形收集器組件同軸對準，且該詢問區域與該橢球形收集器組件的該焦點重合。該儀器進一步包括封閉流槽，其包括樣品入口、樣品出口、設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過詢問區域及安置于詢問區域下游的分選區域。流徑中穿過詢問區域的部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準，且流徑中穿過詢問區域及分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉。該流槽包括包圍詢問區域的球形組件，該球形組件的折射率在比詢問區域處的流槽壁的折射率大或小0.1范圍內。包含或懷疑包含該分析物的該樣品以芯鞘流或層流形式流入流徑，至少穿過詢問區域。該第二拋物形光學組件將電磁能聚焦于詢問區域處的樣品上。分析物響應于照射而產生可偵測信號。儀器包括用于偵測該可偵測信號的偵測器，該可偵測信號由橢球形收集器組件收集且反射至該偵測器。
[0028]根據本發明的一具體實例，使用儀器偵測射流樣品中的分析物的方法包括控制封閉流槽中的樣品流以具有⑴自收集器組件的頂點向詢問區域或⑵自詢問區域向收集器組件的頂點的流動方向，該儀器包含照射源，具有頂點、光軸及焦點的凹形收集器組件，及與該凹形收集器組件的該焦點重合的詢問區域。該流槽包括樣品入口、樣品出口、設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過詢問區域及安置于詢問區域下游的分選區域。流徑中穿過詢問區域的部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準，且流徑中穿過詢問區域及分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉。當該流動方向為自詢問區域流向收集器組件的頂點時，流徑的一部分穿過收集器組件。該方法進一步包括照射詢問區域處的該樣品，其中該分析物回應于照射而產生可偵測信號。方法也包括用凹形收集器組件收集可偵測信號，其中收集器組件將該可偵測信號反射至偵測器；及用該偵測器偵測可偵測信號。
[0029]根據本發明的另一具體實例，在儀器中偵測分析物的方法包括控制封閉流槽中的包含或懷疑包含分析物的樣品流，該儀器包含照射源，圓錐形光學組件，第一及第二凹形光學組件，具有頂點、光軸及焦點的凹形收集器組件，及與該凹形收集器組件的該焦點重合的詢問區域。該封閉流槽包括樣品入口、樣品出口、設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過詢問區域及安置于詢問區域下游的分選區域。流徑中穿過詢問區域的部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準，且流徑中穿過詢問區域及分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉。該方法進一步包括使用光學配置照射詢問區域處的該分析物。分析物響應于照射而產生可偵測信號。該光學配置包括該第一凹形光學組件及該第二凹形光學組件，其各具有光軸及焦點；及安置于第一凹形光學組件的內部體積中的該圓錐形光學組件。圓錐形光學組件將來自照射源的電磁能反射至第一凹形光學組件。第一凹形光學組件將該電磁能反射至第二凹形光學組件，且第二凹形光學組件將電磁能聚焦于詢問區域上。方法也包括用凹形收集器組件收集可偵測信號，其中凹形收集器組件將該可偵測信號反射至偵測器；及用該偵測器偵測可偵測信號。
[0030]根據本發明的另一具體實例，在儀器中偵測分析物的方法包括控制封閉流槽中的包含或懷疑包含分析物的樣品流，該儀器包含照射源，圓錐形光學組件，第一及第二拋物形光學組件，具有頂點、光軸及焦點的橢球形收集器組件，及設定于該橢球形收集器組件的該焦點處的詢問區域。該封閉流槽包括樣品入口、樣品出口、設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過收集器組件、詢問區域及安置于詢問區域下游的分選區域。流徑中穿過詢問區域的部分與該橢圓形收集器組件的該光軸同軸對準，且流徑中穿過詢問區域及分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉。流槽也包括包圍詢問區域的球形組件，該球形組件的折射率在比流槽壁的折射率大或小0.1范圍內。該方法進一步包括使用光學配置照射詢問區域處的該分析物，其中分析物回應于照射而產生可偵測信號。該光學配置包括該第一拋物形光學組件及該第二拋物形光學組件，其各包含光軸及焦點；及安置于第一拋物形光學組件的內部體積中的該圓錐形光學組件。圓錐形光學組件將來自照射源的電磁能反射至第一拋物形光學組件，第一拋物形光學組件將該電磁能反射至第二拋物形光學組件，且第二拋物形光學組件將電磁能聚焦于詢問區域上。方法也包括用橢球形收集器組件收集可偵測信號，其中橢球形收集器組件將該可偵測信號反射至偵測器；及用該偵測器偵測可偵測信號。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1A-1F為使用流動式細胞量測術分選樣品的先前技術方法的示意圖；
[0032]圖2為說明根據本發明的具體實例偵測分析物的方法的流程圖；
[0033]圖3為根據本發明的具體實例偵測分析物的方法及儀器的示意圖；
[0034]圖4A及4B為根據本發明的具體實例的樣品流動方向的具體實例的示意圖；
[0035]圖5A為根據本發明的具體實例的流體動力學聚焦組件的示意圖；
[0036]圖5B為經由線A-A'得到的圖5A的流體動力學聚焦組件的橫截面的示意圖；
[0037]圖6為根據本發明的另一具體實例的先前技術流體動力學聚焦組件的示意圖；
[0038]圖7A為根據本發明的一具體實例形成芯鞘流的方法的示意圖；
[0039]圖7B為圖7A的方法在加速區域前形成流的示意圖。
[0040]圖7C為自圖7A的方法在加速區域后獲得芯銷流的不意圖；
[0041]圖8為聲學聚焦樣品流以增強分析物的中心對準的習知方法的示意圖；
[0042]圖9為使用以與流軸正交的角度照射的單一照射源對詢問區域處的樣品進行照射的不意圖；
[0043]圖10為使用在與流軸正交的平面內以各種角度照射的多個照射源對詢問區域處的樣品進行照射的示意圖；
[0044]圖11為使用流槽作為波導將照射導引至詢問區域上來對詢問區域處的樣品進行照射的不意圖；
[0045]圖12為使用略微離軸照射對詢問區域處的樣品進行照射的示意圖；
[0046]圖13為本發明的一具體實例的示意圖，其中收集器組件的功能也在于將電磁能聚焦于詢問區域上；[0047]圖14為根據本發明的一具體實例使用圓錐形光學組件及凹形光學組件對詢問區域處的樣品進行照射的示意圖；
[0048]圖15為根據本發明的一具體實例使用兩個凹形光學組件及圓錐形光學組件對詢問區域處的樣品進行照射的示意圖；
[0049]圖16為根據本發明的一具體實例使用物鏡作為收集器組件收集來自詢問區域處的分析物的可偵測信號的示意圖；
[0050]圖17為根據本發明的一具體實例使用物鏡作為收集器組件收集來自詢問區域處的分析物的可偵測信號的示意圖，該物鏡經改良以允許至少一部分樣品流穿過物鏡；
[0051]圖18為根據本發明的一具體實例收集來自詢問區域處的分析物的可偵測信號的拋物形收集器組件的示意圖；
[0052]圖19為根據本發明的一具體實例收集來自詢問區域處的分析物的可偵測信號的橢圓形收集器組件的示意圖；
[0053]圖20A為根據本發明的一具體實例收集經由流槽上的球形模制物所發射的可偵測信號的示意圖；
[0054]圖20B為圖20A的放大示意圖，其說明經由球形模制物發射的可偵測信號；
[0055]圖21A-21C為根據本發明的具體實例在偵測后收集流槽出口處的樣品的示意圖；
[0056]圖22為根據本發明的一具體實例的儀器及方法的控制系統的示意圖；
[0057]圖23為根據本發明的一具體實例偵測及分選分析物的例示性方法的示意圖；
[0058]圖24為根據本發明的一具體實例偵測分析物的例示性系統的示意圖；
[0059]圖25為根據本發明的另一具體實例偵測分析物的例示性系統的示意圖；及
[0060]圖26為根據本發明的另一具體實例偵測分析物的例示性系統的示意圖。
【具體實施方式】
[0061]所述方法及儀器允許通過偵測許多特征(例如所需性質)的存在或不存在或可在與流動式細胞量測技術兼容的量測中測定、估計或反映的參數來鑒別所關注分析物。雖然本文大致關于分析物且有時尤其關于細胞進行描述，但應了解，本文所述的方法及儀器一般適用于分析物且在特定實例中關于細胞或更具體關于精子描述流動式細胞量測儀的情況。在任何情況下，在描述中提及「細胞」或「細胞群體」應理解為并非限制，而是僅適用于所述原理的特定情況。
[0062]在各種態樣中，用于定義所關注分析物或分析物群體的細胞量測術量測包括本文所論述的量測及另外此項技術中已知的量測，以及可引入或使得適用于流動式細胞量測分析的新穎量測方法、機制及/或儀器。經由實施本發明所述的方法及儀器進行細胞量測分析的分析物可經標記或未經標記，或另外使用此項技術中已知的技術及試劑修飾或未經修飾。
[0063]如本文中所使用，術語「標記(label)」是指可通過光測定、影像分析、光譜、光化學、生物化學、免疫化學或化學方法偵測的組成物。舉例而言，適用標記包括熒光染料、電子致密試劑、酶、生物素-抗生蛋白鏈菌素、長葉毛地黃配質(dioxigenin)、半抗原、可使用抗血清或單株抗體的蛋白質或核酸特異性染料。因此，在本發明所述的方法及儀器中，關于以任何方式直接或間接量測的任何物質或參數的分析物的組成、性質及/或特征為用于鑒別分析物及分析物群體以進行選擇或排除的根據。
[0064]分析物的可偵測組成、性質及/或特征的實例包括(但不限于)⑴量測與分析物相互作用或由分析物發射的光的性質，諸如吸光度、光散射、發光、熒光、磷光、光偏振或去偏振或其它性質；(2)電學性質，包括(但不限于)分析物或周圍介質的電感、電容、電位、電流或電阻；(3)電磁性質，包括磁性、順磁性、磁共振及/或分析物與電磁力及/或電磁波的相互作用或電磁力及/或電磁波的發射 '及(4)對分析物的影像或類似影像性質進行收集及/或分析而得到的成像、影像性質、形態性質或相關性質。在某些態樣中，量測為分析物的固有數量或質量，或在替代性態樣中，量測為間接反映、表示或估計分析物的數量或質量的值。在其它態樣中，量測為分析物的固有數量或質量與分析物的數量或質量的間接反映、表示或估計。舉例而言(但不限于)，偵測或量測分析物產生的熒光可表示分析物的固有熒光或結合于分析物或以其它方式與分析物締合的熒光染料或熒光粒子的存在及/或數量，其可直接及/或間接指示分析物的一些性質。
[0065]在所述方法及儀器的一些態樣中，分析物為細胞(例如哺乳動物精子)且分選細胞量測儀使用可在實體或空間上分離細胞及細胞群體的技術。在所述方法及儀器的其它態樣中，分選細胞量測儀利用實體上及/或功能上修飾群體中的所選細胞以允許其功能及/或實體分離及/或區分、視情況供后續使用的技術。在所述方法及儀器的一些態樣中，分選細胞量測儀不依靠通過位置、定位、容器或時間立即分離細胞，而改為提供就某種所需性質而言不活化、喪失能力、破裂、斷裂、破碎或以其它方式改變(也即「修飾」)的細胞，從而視情況允許分離或區分制備物中的子群。修飾的性質全部或部分視所鑒別細胞的所欲應用或用途而定及從而視所鑒別細胞的與應用相關的特征而定。舉例而言且僅出于解釋或闡明的目的，在制備正常體細胞的情形下，若細胞繁殖的能力受到不利影響或若細胞被殺死，則惡性或另外永生或快速生長細胞可視為功能上不活化。在另一實施例中，再次僅出于解釋或闡明的目的，當應用需要自群體移除細胞子群(例如產生不合需要的蛋白質或其它物質的子群)時，分選細胞量測儀可通過消除此等細胞中該物質的產生，通過殺死該等細胞，及/或通過修飾該等細胞以允許其自群體實體移除來達成此結果。
[0066]在一些具體實例中，本發明所述的方法及儀器利用分選能源修飾細胞或誘導或起始可修飾細胞的過程，諸如化學活化。在各種態樣中由分選能源誘導的修飾包括對分析物的直接作用。舉例而言，當分析物為細胞時，對該等細胞的直接作用包括(但不限于)(I)修飾細胞組分或化學物質，包括蛋白質、DNA及與細胞代謝有關的物質；(2)在細胞內或細胞附近發生的破裂、加熱、空蝕或爆裂；細胞的通透或穿孔；及(3)細胞(包括細胞、病毒、物體或粒子)的破壞、碎裂或形態變化。
[0067]在其它具體實例中，修飾也可或者包括分選能源的間接作用，其由分選能源或由其它因素介導，包括例如(I)細胞或一或多種細胞組分的化學活化及/或失活、化學交聯或化學衍生；(2)在細胞內或細胞附近一或多種化學藥劑的活化及/或失活，此可引起該等藥劑或其衍生物結合或締合于細胞或其組分；或(3)誘導細胞功能改變。在某些具體實例中，照射時與細胞反應的化學藥劑通常可存在于細胞中或應用中，或可將化學藥劑添加至樣品流體中作為方法的一部分。
[0068]在一些具體實例中，所述方法及儀器結合使用光可活化化合物，用適當強度及能量的光照射時，其經誘導而與細胞或細胞組分結合或以其它方式締合。在一些具體實例中，光可活化化合物可誘導一或多種細胞組分發生足以影響所關注細胞的細胞過程或代謝的交聯或變性。或者，光可活化化合物可誘導一或多種細胞組分發生足以殺死所關注細胞的交聯或變性。在另一替代方案中，光可活化化合物可與所選細胞結合或以其它方式締合且以使得所關注細胞在后續過程中易鑒別及/或富集及/或耗竭的方式改變所關注細胞的一或多種性質。
[0069]在某些態樣中，在隨后步驟中，通過利用該物質的性質或相互作用的方法移除、濃縮或純化已通過化學衍生(諸如通過添加化學物質)改變的所關注細胞。舉例而言，且僅出于解釋及闡明的目的，在一個態樣中，所關注細胞通過添加隨后由抗體結合的物質來衍生，該抗體允許通過各種方法捕捉或滯留所關注的衍生細胞。涵蓋許多該等物質，且在一個態樣中，該等物質包括一類含有2，4-二硝基苯基(DNP)或與其有關的化合物，在一個態樣中該化合物由識別DNP的抗體識別并特異性結合。因此，在一個態樣中，使用DNP或相關化合物的光可活化衍生物來衍生此類型的應用中所關注的細胞。
[0070]或者，所關注的衍生細胞可使用引起所關注的衍生細胞優先結合于某些受質的策略捕捉或移除。舉例而言且僅出于解釋及闡明的目的，在一個態樣中，使用含有生物素或與生物素有關的化合物衍生的所關注細胞捕捉或滯留于結合生物素或已修飾而結合生物素的受質、表面、物質、介質、化合物或粒子上，例如通過存在抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、生物素結合抗體或其它生物素結合分子。在與此態樣有關的另一替代方案中，使用生物素或相關化合物的光可活化衍生物來衍生該應用中所關注的細胞。或者，在其它態樣中，所關注細胞通過添加或締合化學物質或化合物，隨后經受選擇及修飾來改變。因此，在該情況下，本文所述的方法及儀器的具體實例利用改變所選細胞上的所添加物質以允許區分該等細胞與群體中的其它細胞。舉例而言，且僅出于解釋及闡明的目的，在一個態樣中，群體中的所有細胞均通過在分析之前添加光不穩定化合物來衍生，且在一個態樣中，使用儀器的能源修飾系以特定細胞為目標以修飾彼等細胞上的光不穩定化合物。
[0071]參看圖2，在本發明的一具體實例中，用于偵測及視情況高速分選分析物的方法100—般可依序包括例如經由樣品入口將含有或懷疑含有分析物的樣品引入流槽的射流流徑中(步驟110)，使該樣品穿過流體動力學聚焦區域(步驟112)，照射詢問區域處的樣品，該分析物響應于照射而產生可偵測信號(步驟114)，收集可偵測信號并偵測分析物或分析物的所需特點(步驟116)，視情況使用導引至位于該詢問區域下游的分選區域中的分析物的分選能量分選該分析物或所關注分析物，該分選能量可有效改變、損壞或破壞分析物(步驟118)，視情況實體分選樣品出口或位于分選區域下游的其它區域處的樣品(步驟119)，及使樣品經由該流槽的樣品出口離開(步驟120)。
[0072]雖然上文各別地及下文詳細地描述該等方法的各種步驟，但應了解，方法的步驟可同時或實質上同時進行。舉例而言，將樣品引入射流流徑中與流體動力學聚焦可同時進行，例如在流槽由毛細管形成的具體實例中。毛細管可實現樣品的近似立即聚焦。在另一具體實例中，流體動力學聚焦組件可設置于樣品入口處，以使得該樣品入口為流體動力學聚焦區域及/或包括流體動力學聚焦儀器且樣品在進入流槽的射流流徑中時變得聚焦。或者，流體動力學聚焦組件或區域可設置于樣品入口下游且樣品可在入口引入后聚焦。
[0073]可同時或實質上同時進行的步驟的另一實例包括視情況實體分選位于分選區域下游的樣品及使樣品離開樣品出口。如下文詳細描述，實體分選可在樣品離開樣品外線的同時進行。在其它具體實例中，也可提供位于樣品外線上游但位于分選區域下游的實體分選區域以使得實體分選在樣品離開之前進行。
[0074]舉例而言，照射樣品、收集可偵測信號及偵測分析物也均可實質上同時進行。應了解，實質上同時意謂照射、收集及偵測步驟是以樣品可照射、產生可偵測信號及可收集可偵測信號并傳輸至偵測器的速度進行。舉例而言，該作用可以大約電磁能的速度進行，且因此可視為實質上同時。
[0075]與習知流動式細胞量測術系統相比，根據本發明的具體實例偵測分析物的方法及儀器具有改良的準確性及輸送量。該等方法及儀器具有多種應用，包括例如基于其所含的DNA量、其所含的特定蛋白質或其它生物分子標記物及/或其所含的特定基因標記物(天然存在或不存在)區分細胞。方法及儀器也應用于區分分析物(例如細胞)，其通過使用熒光抗體或基因探針或染料，從而在有或無標記物的細胞之間產生可偵測差異，或使得能夠量測標記物的表現或數量的差異。本發明方法及儀器特定用于鑒別精細胞的性別。
[0076]儀器的具體實例有利地提供流動式細胞量測術系統，其中光學配置(也即收集器組件及視情況存在的光學組件)不會形成障壁或另外需要樣品流在詢問區域與分選區域之間關于光學配置轉向或重導引，同時允許樣品以任何所需方向流動。
[0077]下文參考圖3描述通用方法及儀器僅用于說明性目的且不以任何方式限制照射方法、光學配置、分選方法或本發明的方法及儀器的任何其它組件，如下文詳細描述。參看圖3，根據本發明的具體實例的儀器一般包括封閉流槽132，其具有樣品入口 134、樣品出口136及在樣品入口 134與樣品出口 136之間延伸的流徑138。流槽132可視情況包括鞘流體入口及鞘流體供應容器(圖中未示)用于將鞘流體引入流槽區域中以稍后形成芯鞘流。該儀器也包括照射詢問區域148的照射源(圖中未示)及收集分析物142回應于照射而產生的可偵測信號的凹形收集器組件146。照射時，分析物可反射、發射、傳輸或以其它方式產生可偵測信號。凹形收集器組件146具有相關頂點159、光軸161及焦點163。如本文中所使用，「頂點(vertex)」應理解為包括收集器組件146中對應于頂點的彼等區域或與收集器組件146有關的彼等區域，不論收集器組件146是否包括實際頂點，經截頂，或包括開口或間隙(否則實際頂點會位于此處)。如本文中所使用，「光軸(optical axis)」是指收集器組件的穿過焦點的軸且凹形收集器組件關于該軸呈旋轉對稱。如本文中所使用，「焦點(focal point) J以其在此項技術中的一般含義使用，且為了更清楚，是指由收集器組件接收的電磁能聚焦所在的虛擬點。當樣品穿過詢問區域時，其流軸145與收集器組件146的光軸161重合。該儀器也包括偵測所收集的可偵測信號的偵測器150。
[0078]包含或懷疑包含分析物142的樣品經由樣品入口 134供應至封閉射流流槽132。參看圖4A，在一些具體實例中，樣品在流徑138中自詢問區域148流向收集器組件146的頂點159。參看圖4B，在其它具體實例中，樣品在流徑138中自收集器組件146的頂點159流向詢問區域148。在兩種流動具體實例中，流徑138的一部分穿過收集器組件146的內部體積167。圖3也說明樣品自收集器組件146的頂點159流向詢問區域148的一具體實例。
[0079]在各種具體實例中，流槽132的一部分穿過收集器組件146或收集器組件146的壁中的區域或空間。舉例而言，如圖3、4A及4B中所示，收集器組件146經截頂且流槽132的一部分穿過對應于收集器組件146的頂點159的區域中的開口。預期流槽132可穿過凹形收集器組件的一部分或開口，包括頂點、頂點中的鉆孔及/或一或多個側壁中的開口或孔。
[0080]詢問區域148與收集器組件146的焦點145重合。在一些具體實例中，詢問區域148可為與收集器組件146的焦點163重合的單個點。在其它具體實例中，舉例而言，如圖4A中所示，詢問區域148可具有位于收集器組件146的焦點FP上游及/或下游O μ m至約150 μ m范圍內的最大外邊界。其它適合的邊界(位于收集器組件146的焦點163的上游、下游或上游與下游)包括例如Oym至約100 μ m、約I μ m至約80 μ m、約5 μ m至約70 μ m、約10 μ m至約60 μ m、約15 μ m至約50 μ m、約20 μ m至約40 μ m、約15 μ m至約30 μ m、約
100μ m至約150 μ m、約50 μ m至約150 μ m及約30至約100 μ m。適合的邊界距離也可包手舌 ?列如會勺 O μ m、I μ m、2 μ m、3 μ m、4 μ m、5 μ m、6 μ m、7 μ m、8 μ m、9 μ m、10 μ m、15 μ m、20 μ m、25μηι>30μηι>35μηι>40μηι>45μηι>50μηι>55μηι>60μηι>65μηι>70μηι>75μηι>80μηι>85ym、90ym、95ym、100ym、105ym、110ym、115ym、120ym、125ym、130ym、135ym、140 μ m、145 μ m 及 150 μ m。
[0081]流徑138中穿過詢問區域148的部分與收集器組件146的光軸161同軸對準。
[0082]如本發明中所使用，「同軸(coaxially)」是指組件關于其各別軸在約0°至約15°的容限內對準。舉例而言，適合的容限包括約0°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、
8。、9。 、10。 、11。 、12。 、13。 、14。及 15° 。
[0083]通過照射源(圖3中未示)或經由使用光學配置(其例示性具體實例在下文詳細描述)將照射源發射的電磁能聚焦于詢問區域148上來照射詢問區域148的樣品。分析物142響應于照射而產生可偵測信號。收集器組件146收集該可偵測信號且將可偵測信號反射或傳輸至偵測分析物142的偵測器150。儀器及方法可視情況包括用于分選位于詢問區域148下游的分選區域152的分析物142的分選能源。
[0084]流槽132為封閉流槽，其具有樣品入口 134、樣品出口 136及設定于樣品入口 134與樣品出口 136之間的流徑138。流槽可具有任何適合的橫截面形狀，包括(但不限于)圓形、橢圓形、矩形、正方形或任何其它多邊形。在各種具體實例中，流槽為具有圓形橫截面形狀的圓筒形。在本文所述的任一具體實例中，流槽132可視情況包括包圍詢問區域148的球形模制物154 (如圖3中所示)。球形模制物154可由折射率在詢問區域處的流槽132的壁的折射率的適合容限內的材料形成。如下文詳細論述，球形模制物可減輕或消除由流槽壁-空氣界面所導致的可偵測信號的折射失真。該容限可例如在O至0.1的范圍內。
[0085]如本文中所使用，「封閉流槽(closed flow cell)」是指流槽132,其中流徑138中穿過詢問區域148及穿過分選區域152的至少一部分為封閉流徑。如本文中所使用，「封閉流徑(closed flow path)」是指具有以流槽壁為邊界且無分裂或分叉的整體流徑的流徑。如本文中所使用，「分裂(division)」及「分叉(bifurcation)」是指流徑變成兩個或兩個以上各別路徑的任何分離。因此，本發明的封閉流槽132包括位于詢問區域148與分選區域152之間并穿過詢問區域148及分選區域152的流徑138，其具有完整邊界且未分裂。因此，在本發明的流槽132中，分選區域152處的分選是通過聚焦于分選區域152上的分選能量而不通過將樣品實體分選至分裂的流徑中來實現。封閉流槽有利地消除由習知未封閉流槽中樣品液滴與空氣之間的界面引起的對電磁能的不當折射作用。如下文詳細論述，然而，本發明的具體實例可進一步包括位于分選區域152下游(例如在樣品出口 136處)的實體分選區域，其用于在施加分選能量后實體分選樣品，及/或用于將流動流體分裂為各別組分，例如(但不限于)用于自含有分析物的樣品分離一些鞘流體。
[0086]本發明的方法的階段及執行該方法的儀器將在下文詳細描述。下文個別所述的流體動力學聚焦組件、照射方法、光學配置及分選方法可在根據本發明的具體實例的方法及儀器中任意組合使用。
[0087]流體流及流體動力學聚焦
[0088]將鞘流體及分析物流體注入射流流徑138中。舉例而言，流體動力學聚焦組件可在流槽中形成分析物于鞘流體或層流中的芯鞘流。芯鞘流或層流可在穿過詢問區域148之前為實質上穩定的。芯鞘流的流速可為約Im / s至約60m / S。芯鞘流中的分析物142可隔開以使得每秒約10，000至約300，000個細胞穿過詢問點148。分析物142之間的間距可通過例如調整芯流及鞘流的相對速度及/或流速來調整，而其又可通過流動控制系統來完成，該系統調節各別信號傳至連接于鞘流體及樣品流體的各別供應器的泵。
[0089]一些射流系統(諸如(但不限于)芯鞘流)具有使非對稱細胞、粒子或分析物定向以使得細胞、粒子或分析物的長軸與流體流的方向同軸對準的性質。熟習此項技術者充分了解某些精子(包括許多類型的哺乳動物精子)的情況確實如此，且已證明精細胞可在芯鞘流中對準以使得細胞的長軸與該流實質上同軸。因此，在一些具體實例中，芯鞘流或其它流動方法可提供其中所載運的粒子(例如哺乳動物精細胞)的縱向對準。
[0090]粒子在流中的縱向對準具有實際益處，例如(但不限于)用于分析精子的脫氧核糖核酸(DNA)含量。精子帶有DNA，且可在流動式細胞量測儀中，使用可用于處理細胞的熒光染料(諸如4'，6_二甲脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽或雙苯甲亞胺(Hoechst33312))得到與個別細胞中的DNA量有關的熒光量測來直接或間接量測精細胞中的DNA相對量。因為在包括(但不限于)許多哺乳動物的一些物種中，精細胞可含有X或Y染色體，其預示精細胞與卵母細胞結合的后代的雌性或雄性(分別)性別，且因為X及Y染色體可具有不同大小，并進一步因為精細胞中的其它染色體及DNA的總量可相對不變，所以經適當熒光染色的精細胞的熒光可用于判定其是否含有X或Y染色體。然而，精細胞可關于主縱軸呈非圓柱形對稱。例如(但不限于)人類及牛精細胞確實如此。該等細胞具有扁平細胞主體，也稱為頭部，且熟習此項技術者充分了解該等不對稱主體各向異性地發射熒光，以使得一個方向上的突光可顯著不同于關于精細胞長軸的另一個方向上的突光。因此之故，在未首先測定相對于偵測器的旋轉角度的情況下難以精確量測精細胞在關于精細胞長軸的各方向上發出的熒光。定向及/或判定精細胞在流中的位向的方法已為熟習此項技術者所知，且區別帶有X及Y染色體的精細胞已達成必要的精確度，例如Johnson的美國專利第5，135，759號，其揭示內容以全文引用的方式并入本文中。然而，在長軸方向上精細胞的熒光相對不變，此與細胞關于長軸的旋轉有關。Meistrich及G6hde等人(1978:Resolution of X and Yspermatids by pulse cytophotometry.Nature274(5673):821-823)及其它文獻已證明當使精細胞在流體流(例如芯鞘流)中縱向定向時，且當使熒光偵測光學組件與該流同軸定向時，實際上可達成帶有X及Y染色體的精細胞的區別。
[0091]已有利地確定，在流體動力學聚焦期間施加于細胞上的應力可根據最大局部能量耗散速率來量測且與基于剪切應力的預測相比，該量測可更好地預測因流體動力學聚焦而引起的樣品中細胞死亡率。能量耗散速率(energy dissipation rate,EDR)可使用下式計算:[0092]ε = μ^7υ+ νυτ\.νυ
[0093]其中ε為EDR，μ為黏度，(Vt/+ 為應力張量，vt；為速度梯度張量，且ViZr為Vt；的轉置。EDR說明作用于懸浮液中的細胞的剪切力與拉伸力。
[0094]在一些具體實例中，流體動力學聚焦組件可并入流槽132的一部分中以形成芯鞘流。流體動力學聚焦組件可有利地提供以下一或多個優點:在芯鞘流中形成分析物粒子的層流，消除或最小化芯流注入鞘流的注入點155處的回流，使得芯流相對于鞘流的稀釋因子小于20: 1，維持穩定的芯流大于0.200mm及多至數公分，最小化分析物粒子所經歷的剪切應力，最小化分析物粒子所經歷的最大局部能量耗散，及/或以每秒大于10，000個粒子及每秒至多300，000個粒子的速率形成分析物的單行流。流體動力學聚焦的其它已知優點也涵蓋于本文中。
[0095]流體動力學聚焦組件可置于流徑138中的任何適合位置，只要在樣品穿過詢問區域148前形成穩定的層流或芯鞘流即可。
[0096]圖5A說明可用于本發明的方法及儀器中的流體動力學聚焦組件157的一具體實例。圖5B為經由圖5A上所示的線A-A'所得的圖5A的流體動力學聚焦組件157的橫截面影像。參看圖5A及5B，例 示性流體動力學聚焦組件157具有外流徑156及安置于外流徑156內部的內流徑158。內流徑158及外流徑156可各具有各別流軸160、162，且流軸160、162可同軸對準。外流徑可設定例如鞘流體164的流徑，且內流徑可設定例如含有或懷疑含有分析物142的樣品141的流徑。
[0097]外流徑156可具有最大半徑166，例如其范圍為約0.4mm至約20mm、約0.6mm至約15mm、約0.8mm至約10mm、約Imm至約8mm、約IOmm至約20mm、約Imm至約20mm、約2mm至約18_、約4_至約16_、約6_至約14_、約8_至約12_、約0.4mm至約1_、約0.6mm至約0.7mm、約0.5mm至約0.7mm、約0.5mm至約1mm、及約0.4mm至約0.8mm。其它適合的最大半徑 166 包括例如約 0.4mm、0.45mm、0.5mm、0.55.0.6mm、0.65mm、0.7mm、0.75mm、0.8mm、
0.85mm、0.9mm、0.95mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm及 20mm。在一些具體實例中，最大半徑 166 為約 0.628mm。
[0098]內流徑158可具有最大半徑168，例如其范圍為約20 μ m至約IOOOumJS 30 μ m至約40 μ m、約35 μ m至約40 μ m、約35 μ m至約45 μ m、約30 μ m至約45 μ m、約20 μ m至約80 μ m、約 20 μ m 至約 100 μ m、約 20 μ m 至約 500 μ μ m、約 10 μ m 至約 500 μ m、約 10 μ m 至約40 μ m、約10 μ m至約80 μ m、約10 μ m至約100 μ m。其它適合的半徑168包括例如約20 μ m、30 μ m、40 μ m、50 μ m、60 μ m、70 μ m、80 μ m、90 μ m、100 μ m、200 μ m、300 μ m、400 μ m、500 μ m、600 μ m、700 μ m、800 μ m、900 μ m及1000 μ m。在一些具體實例中，內流徑的最大半徑168為約 38 μ m。
[0099]流體動力學聚焦組件157可包括包圍內流徑158的壁170。壁170可具有外直徑172，例如其范圍為約50 μ m至約300 μ m、約100 μ m至約200 μ m、約150 μ m至約200 μ m、約50 μ m至約250 μ m及約100 μ m至約300 μ m。其它適合的直徑172包括例如約50 μ m、60 μ m、70um、80um、90um、100um、125um、150um、175u m、200 μ m、225 μ m、250 um、275um 及300 um0在一些具體實例中，外直徑172為約191μπι。
[0100]包圍內流徑158的壁170的外表面174可在向著內流徑158及外流徑156的會聚點178安置的末端176處呈錐形。舉例而言，自錐體182的開頭部分181至流徑156、158的會聚點178的距離180可在約200 μ m至約1000 μ m、約500 μ m及約600 μ m、約550 μ m至約 560 μ m、約 550 μ m 至約 600 μ m、約 400 μ m 至約 700 μ m、約 400 μ m 至約 1mm、約 200 μ m至700 μ m或約300 μ m至約600 μ m的范圍內。其它適合的距離180包括例如約200 μ m、250 μ m、300 μ m、350 μ m、400 μ m、450 μ m、500 μ m、550 μ m、600 μ m、650 μ m、700 μ m、750 μ m、800μπι、850μπι、900μπι、950μπι 及 1000 μ m。在一些具體實例中，距離 180 為約 555 μ m。
[0101]同軸流軸160、162與包圍內流徑158的壁170的錐形外表面182之間的角度184可介于約0.1°與約15°之間；或者介于約0.1°與約10°之間；或者介于約5°與約10°之間；或者介于約5°與約10°之間；或者介于約8°與約12°之間；或者介于約5°與約15°之間；或者介于約9°與約11°之間；或者介于約9.5°與約10.5°之間。其它適合的角度 184 包括例如約 0.1° ,0,2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、1.5。、2°、2.5°、3°、3.5°、4°、4.5。、5°、5.5°、6°、6.5。、7°、7.5°、8°、8.5。、9°、9.5°、10。、10.5°、11。,11.5°、12。、12.5°、13。,13.5°、14。、14.5° 及 15°。在一些具體實例中，角度184為約10°。
[0102]外流徑156的外表面186自第一點188至第二點190可呈錐形。第二點190可為對應于形成穩定芯鞘流192的點，而在一些具體實例中，第一點188可與包圍內流徑158的壁170的外表面174的錐體182的開頭部分共平面，位于與內流徑158及外流徑156均正交的平面上。沿流徑138的軸160、162自第一點188至第二點190的距離可在約Imm至約 1.1_、約 0.8mm 至約 1.1_、約 0.8mm 至約 1.2_、約 0.5mm 至約 1.2_、約 0.56mm 至約
1.1mm、約0.56mm至約1.2mm的范圍內。其它適合的距離194包括例如約0.5,0.52,0.54、0.56、0.58、0.6、0.62、0.64、0.66、0.68、0.7、0.72、0.74、0.76、0.78、0.8、0.82、0.84、0.88、0.9、0.92、0.94、0.96、0.98、1、1.02、1.04、1.06、1.08、1.1、1.12、1.14、1.16、1.18 及 1.2。在一些具體實例中，距離194為約1.062mm。
[0103]同軸流軸160、162與外流徑156的錐形外表面186之間的角度196可在約15°至約45°、約15°至約35°、約25°至約45°、約25°至約35°、約27°至約33°或約29°至約31°的范圍內。其它適合的角度196包括例如約15°、16°、17°、18°、19°、20°、
21。、22。、23。、24。、25。、26。、27。、28。、29。、30。、31。、32。、33。、34。、35。、36°、37°、38°、39°、40°、41°、42°、43°、44 及 45°。在一些具體實例中，角度 196 為約 30。。
[0104]流過外流徑156的鞘流體164的流動速率可介于每秒約20mm3與每秒約600mm3之間；或者每秒約20mm3至每秒約400mm3 ;或者介于每秒約20mm3與每秒約200mm3之間；或者介于每秒約20mm3與每秒約IOOmm3之間；或者介于每秒約20mm3與每秒約85mm3之間；或者介于每秒約25mm3與每秒約85mm3之間；或者介于每秒約35mm3與每秒約85mm3之間；或者介于每秒約40mm3與每秒約85mm3之間；或者介于每秒約50mm3與每秒約85mm3之間；或者介于每秒約75mm3與每秒約85mm3之間；或者介于每秒約80mm3與每秒約81mm3之間；或者每秒約500mm3至每秒約600mm3 ;或者每秒約IOOmm3至每秒約600mm3 ;或者每秒約200mm3至每秒約400mm3 ;或者每秒約300mm3至每秒約500mm3 ;或者每秒約400mm3至每秒約500mm3 ；或者每秒約300mm3至每秒約400mm3 ;且尤其為每秒80.3mm3。舉例而言,適合的速率包括每秒約 2Omm3、2 5mm3、3Omm3、3 5mm3、40mm3、45mm3、5Omm3、5 5mm3、6Omm3、6 5mm3、7Omm3、7 5mm3、8Omm3、8 5mm3、9 0mm3、9 5mm3、100mm3、120mm3、140mm3、160mm3、180mm3、200mm3、220mm3、240mm3、260mm3、280mm3、300mm3、3 20mm3、340mm3、360mm3、380mm3、400mm3、420mm3、440mm3、460mm3、480mm3、500mm3、520mm3、540mm3、560mm3、580mm3 及 600mm3。
[0105]芯流體(也即樣品141)流過內流徑158的速率可為每秒約0.1mm3至每秒約30mm3 ；每秒約IOmm3至每秒約30mm3 ;每秒約15mm3至每秒約20mm3 ;每秒約Imm3至每秒約30mm3 ;每秒約2mm3至每秒約20mm3 ;每秒約4mm3至每秒約18mm3 ;每秒約6mm3至每秒約16mm3 ;每秒約8mm3至每秒約IOmm3 ;每秒約20mm3至每秒約30mm3 ;每秒約0.1mm3與每秒約IOmm3 ;或者介于每秒約2mm3與每秒約IOmm3之間；或者介于每秒約3mm3與每秒約IOmm3之間；或者介于每秒約3mm3與每秒約8mm3之間；或者介于每秒約3mm3與每秒約6mm3之間；或者介于每秒約3.5mm3與每秒約4.5mm3之間；且尤其為每秒約4mm3或每秒約3.93mm3。其它適合的速率包括例如每秒約 0.lmm3>0.2mm3>0.3mm3>0.4mm3>0.5mm3>0.6mm3>0.7mm3>0.8mm3>0.9mm3、1mm3、2mm3、3mm3、4mm3、5mm3、6mm3、7mm3、8mm3、9mm3、10mm3、11mm3、12mm3、13mm3、14mm3、15mm3、16mm3、17mm3、18mm3、19mm3、20mm3、21mm3、22mm3、23mm3、24mm3、25mm3、26mm3、27mm3、28mm3、29mm3及 30mm3。
[0106]在各種具體實例中，流體動力學聚焦組件157可產生鞘直徑在以下范圍內的穩定芯鞘流192:介于約10 μ m與約50 μ m之間；或者介于約10 μ m與約40 μ m之間；或者介于約10 μ m與約30 μ m之間；或者介于約10 μ m與約20 μ m之間；或者介于約20 μ m與約30 μ m之間；或者介于約20 μ m與約40 μ m之間；或者介于20 μ m與約50 μ m之間；或者介于約30 μ m與約40 μ m之間；或者介于約30 μ m與約50 μ m之間；或者介于約25 μ m與約35 μ m之間；且尤其為約30μπι。在各種具體實例中，流體動力學聚焦組件157可產生芯直徑在以下范圍內的穩定芯鞘流192:介于約I μ m與約10 μ m之間；或者介于約2 μ m與約9 μ m之間；或者介于約3μηι與約10 μ m之間；或者介于約5μηι與約10 μ m之間；或者介于約5μηι與約7 μ m之間；或者介于約5 μ m與約15 μ m之間；且尤其為約6 μ m。
[0107]在其它具體實例中，芯鞘流可例如如美國專利第5，007，732號中所述來形成，該專利以引用的方式并入本文中。參看圖6，芯鞘流可例如使用具有安置于鞘流體流200中心的樣品試管的流體動力學聚焦組件198來形成，含有或懷疑含有分析物142的樣品經該樣品試管流動。流體動力學聚焦組件198包括具有一個具有光滑表面的側壁202A及另一個具有粗糙表面的側壁202B的毛細管流動通道202。層流在毛細通道中形成且借助于配置樣品及鞘流體流而形成芯鞘流。在一些具體實例中，圖6中所示的流體動力學聚焦組件198可經改良用于僅注射樣品流體而不注射鞘流體200以在毛細管區域中誘導層流而不一定形成芯鞘流。
[0108]參看圖7A，芯鞘流可例如通過在與收集器組件(圖中未示)的光軸正交的平面內引入鞘流體200及含有分析物142的樣品141并將流導引穿過加速區域204用于產生芯鞘型流來形成。樣品141經由安置于鞘流體流徑中的孔或腔室引入鞘流200的中心。兩個流皆進入加速區域204且形成穩定芯鞘流。如圖7B中所示，鞘流200可在加速區域204上方具有旋轉流動，其可有助于樣品141的芯形成。參看圖7C，該流在加速區域204后穩定以形成穩定芯鞘流。
[0109]在其它具體實例中，層流可通過形成毛細管的流槽的至少一部分且使樣品流穿過該毛細管，導致分析物的排序來達成。[0110]如美國專利第7，340, 957號及美國專利公開案第2010 / 0009333號及第2009 /0162887號中所述，該等專利的揭示內容各以全文引用的方式并入本文中，流槽及/或任一上述流體動力學聚焦組件可用于聲學聚焦裝置以進一步提純樣品流。舉例而言，如圖8中所說明，樣品的分析物142可使用聲學聚焦在樣品流中更加中心對準。樣品流過流槽，經過轉換器206，其發射在樣品流體中誘導駐波的機械波長。分析物被吸引至樣品流的中心，因為此中心為駐波中最穩定的區域。聲學聚焦可用于任何上述流體動力學聚焦方法以進一步增強樣品流動以用于照射及偵測。
[0111]照射
[0112]樣品可用足以在照射時激發或以其它方式引發來自分析物的可偵測信號的任何來源的電磁能及任何類型的電磁能進行照射。舉例而言，來自照射源(或通過光學配置自其聚焦)的電磁能可入射于分析物上，且可使得光反射離開或透射穿過分析物中的一或多個要素或反射于分析物表面上。或者或另外，電磁能可入射于分析物上或分析物中的要素上且可由分析物中的一或多個要素吸附或吸附于分析物表面上并可使得一或多個要素發射可偵測信號，諸如光或其它電磁能。在一些具體實例中，要素內部或表面上可為添加至分析物(例如細胞)中的標記物(天然存在或不存在)。舉例而言，該標記物可響應于照射而發射熒光信號。在一具體實例中，標記物為熒光染料，諸如4'，6-二甲脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽或雙苯甲亞胺(Hoechst33312)。
[0113]如本文中所使用，「照射(illumination)」是指照射、激發或其它高能刺激分析物或要素或標記物以產生可偵測反應。舉例而言，電磁能可為可見光譜中的光、紅外光譜中的光及/或紫外光譜中的光。其它類型及波長的適合電磁能也可用于本發明的任一所述具體實例中。
[0114]照射源可為任何適合來源的電磁能。舉例而言，照射源可為雷射或非相干光源，諸如汞弧燈、鎢絲燈、金屬鹵化物燈、氙氣燈或發光二極管。在一些具體實例中，電磁能可例如通過使用四分之一波片來加以圓偏振。圓偏振可有利地降低可偵測信號的偏振依賴性。在一些具體實例中，偵測器或與偵測器組件對準的一或多個平面鏡(如下文詳細描述)可包括可減輕所偵測或量測的信號對照射源偏振的依賴性的偏振組件。
[0115]在一些具體實例中，照射源151直接照射詢問區域148處的樣品。舉例而言，一或多個照射源可以相對于流軸的任何所需角度照射詢問區域處的樣品。舉例而言，照射源可在與流軸正交的平面內照射詢問區域處的樣品。其它照射角度也可為適合的。舉例而言，在各種具體實例中，照射源可與流軸同軸照射詢問區域處的樣品。
[0116]可自一或多個方向以點狀、角狀、立體角狀或任意區域形狀照射詢問區域。諸如平面鏡的平坦光學組件可并入下文詳細描述的任一照射方法及組態以將電磁能的路徑轉向至儀器的所需區域(例如另一光學組件或詢問區域)，以達成儀器的光學配置的通用性。舉例而言，該等平坦光學組件可用于使收集器組件、偵測器、光學組件(若存在)及分選能量(若存在)以除同軸外的方式對準。在一些具體實例中，電磁能的該重導引可使收集器組件、偵測器、光學組件(若存在)及分選能量(若存在)中的一或多者達成更緊湊配置。
[0117]在一些具體實例中，以旋轉對稱照射詢問區域。如本文中所使用，「旋轉對稱(rotational symmetry) J是指關于任何指定軸呈旋轉對稱來照射詢問區域。在其它具體實例中，呈軸對稱來照射詢問區域。如本文中所使用，「軸對稱(axisymmetrically)」是指關于收集器組件是光軸呈旋轉對稱來照射詢問區域。盡管由于例如儀器的組件引起電磁能路徑中斷或受阻，但照射仍被視為旋轉對稱或軸對稱，只要照射呈旋轉對稱或軸對稱而未中斷或受阻即可。舉例而言，自任何所選方向入射于詢問區域上的相干光源可經選擇以使入射角相對于彼此或相對于收集組件的軸為約54.7°，其中54.7°為此項技術中已知在一些情況下有利于降低與偏振有關的量測難度的角度(Asbury等人Cytometry40:88—
101(2000))。該照射呈旋轉對稱。
[0118]在其它具體實例中，自單一方向或自不由旋轉對稱定義的許多方向照射詢問區域。僅舉例而言(但不限于)，該非對稱照射方案可包括使用自垂直于詢問區域處的流軸的平面會聚于詢問點的若干雷射束，以使得照射源的入射角無規律地間隔且與旋轉對稱無關。
[0119]在各種具體實例中，可使用一或多個照射源以關于詢問區域處的流軸分布的各種角度直接照射詢問區域的樣品。在該等具體實例中，來自照射源的光可以所需照射角度直接聚焦于詢問區域上或可使用一或多個平坦光學組件以所關注角度將電磁能導引至詢問區域。
[0120]圖9說明以與詢問區域148處的流軸正交的角度照射詢問區域148處的分析物142的一具體實例，該角度也與收集器組件的光軸正交(與詢問區域148附近的流軸同軸對準)。在圖9中所描繪的具體實例中，照射源151直接照射詢問區域148。圖9說明位于詢問區域處的流槽132，其中收集器組件的光軸延伸至頁面中及自頁面延伸出。也預期一或多個光學組件可插入照射源151與詢問區域148之間以按與詢問區域148附近的流軸正交的角度導引照射。舉例而言，當電磁能自時，呈45°角的平面鏡可與照射源151發射電磁能的路徑呈90°導引電磁能。可使用其它角度及多個鏡轉向來自照射源151的電磁能以使照射源151達成更方便及/或緊湊的置放。
[0121]圖10說明使用多個照射源151a、151b、151c (通過電磁能149的射束)在與收集器組件的光軸(及因此詢問區域148附近的流軸)正交的平面上照射詢問區域148處的分析物142的實例。圖10說明詢問區域處的流槽132，其中收集器組件的光軸延伸至頁面中及自頁面延伸出。一或多個照射源可自一或多個方向、以大于0°至小于360°的弧形角度在與詢問區域處的流軸實質上正交的平面上照射樣品。舉例而言，軸對稱照射詢問區域148處的樣品可使用多個照射源以關于詢問區域處的流軸分布的角度達成。舉例而言(但不限于)，三個照射源可與詢問區域148處的流軸呈90° (與其正交)配置，彼此呈100°、140°及120°配置。如本文中所使用，因為關于收集器組件的光軸存在旋轉對稱照射，所以該照射被視為軸對稱。在一些具體實例中，可使用四個照射源自偏移90°的方向直接照射詢問區域。可使用任何適合數目個照射源。
[0122]在其它具體實例中，一或多個照射源可自一或多個方向、以大于O°至小于360°的弧形角度照射相對于詢問區域148處的流軸呈任何角度的平面上的樣品。舉例而言，可以傾斜于流軸(與收集器組件的光軸同軸對準)的角度照射詢問區域148。
[0123]舉例而言，可使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上照射源。使用多個照射源的具體實例可展現高信號強度及中等特異性，同時最低限度地影響收集器組件對發射、傳輸或反射的電磁能的收集。一或多個孔、間隙或開口可設置于收集器組件中以允許多個照射源以多個方向進行照射。[0124]參看圖11，在一些具體實例中，流槽132可用作波導以便沿流槽132的至少一部分(例如穿過詢問區域148的部分)進行照射。照射源151 (圖11中未示)聚焦于流槽132的開口或半透明部分上，或來自照射源151的電磁能使用一或多個可聚焦的光學組件導引至其上。舉例而言，可使用弧光燈作為照射源151。流槽132將電磁能149經由流槽132中繼至詢問區域148，從而照射詢問區域148中的分析物142。毛細管型流槽尤其適用于該等具體實例。經由毛細管照射有利地不易失準，相對易于對準，且提供詢問區域148處的分析物的均勻照射，因為波導中的強度變化極小。
[0125]圖12說明電磁能149相對于詢問區域148附近的樣品流軸略微離軸地照射樣品的一具體實例，該流軸與收集器組件146的光軸同軸對準。
[0126]在其它具體實例中，可使用一或多個照射光學組件及/或收集器組件146將來自照射源151的電磁能導引并聚焦于詢問區域148上。參看圖13，在一些具體實例中，凹形收集器組件146可充當用于照射的光學組件與收集組件。在該等具體實例中，收集器組件146接收來自照射源151或來自另一光學組件的電磁能149且將電磁能149聚焦于詢問區域148上。在各種具體實例中，凹形收集器組件146可為使來自照射源151的電磁能聚焦的唯一光學組件。在其它具體實例中，收集器組件146可為光學配置的一部分且可充當用于將電磁能149聚焦于詢問區域148上的最后光學組件。
[0127]參看圖14，在各種具體實例中，照射源151可聚焦于圓錐形光學組件208上，該圓錐形光學組件將光傳輸至凹形光學組件210或傳輸至充當光學組件的凹形收集器組件146。凹形光學組件210使環形、錐形或其它任意形狀的電磁能關于詢問區域148聚焦。在一些情況下，電磁能關于詢問區域148呈旋轉對稱聚焦。在其它實例中，電磁能關于詢問區域148呈軸對稱聚焦。需要或適宜時，此光學配置可進一步包括平坦光學組件(圖中未示)用于進一步自凹形光學組件210聚焦電磁能。
[0128]在一些具體實例中，凹形光學組件210可為具有一般凹形形狀的環形光學組件。任何其它適合形狀(諸如拋物線體、圓錐形組件、雙曲線體、橢球體及類球體)可用作此光學配置或以下任一光學配置中的凹形光學組件。其它形狀也可用作凹形光學組件，包括(但不限于)三維二次方程式的一般數學形式的一些表面或與其有關的一些表面，例如f (X, Y，z) =ax2+by2+cz2+2fyz+2gxz+2hxy+2px+2qy+2rz+d=0o 除非另外規定，否則術語「凹形光學組件(concave optical element)」、「第一凹形光學組件(first concave opticalelement)」及「第二凹形光學組件(second concave optical element)」在本發明中應理解為一般指凹形光學組件的所有可能具體實例。本文中應了解，盡管光學組件壁中存在中斷或間隙，但凹形光學組件可例如視為大致橢球形或其它形狀。舉例而言，在一些具體實例中，凹形光學組件可在頂點處及/或在光學組件側壁處包括開口。舉例而言，若提供缺失的壁，則基于環形的大致形狀，環形光學組件一般可視為橢球體、拋物線體、雙曲線體或類球體。在一些具體實例中，凹形光學組件為用于將電磁輻射反射至所需位置的鏡面。
[0129]在使用圓錐形光學組件208的上述或以下任一具體實例中，圓錐形光學組件208可具有任何適合的基礎形狀且可為直圓錐或斜圓錐。圓錐形光學組件208相對于凹形光學組件210的配置視凹形光學組件210的形狀及圓錐形光學組件208的形狀(直或斜)而定。配置圓錐形光學組件208及凹形光學組件210而使得光以平面、環形或任何任意形狀傳輸可如此項技術中所知通過相對于凹形光學組件210的內部體積中的一點置放圓錐形光學組件208來達成。圓錐形光學組件208可沿凹形光學組件210的光軸對準。舉例而言，在一些具體實例中，圓錐形光學組件208與凹形光學組件210的焦點重合。在其它具體實例中，圓錐形光學組件208可相對于凹形光學組件210的焦點向著或遠離凹形光學組件210的頂點位移。在一些具體實例中，可使用平面鏡將來自圓錐形光學組件208的照射轉向凹形光學組件210以使得圓錐形光學組件208不必與凹形光學組件210同軸對準。照射源可與圓錐形光學組件208同軸對準。在凹形光學組件210、圓錐形光學組件208及照射源151同軸對準的具體實例中，凹形光學組件210可在頂點處包括間隙或開口以允許來自照射源151的電磁能通暢地傳至圓錐形光學組件208。或者，照射源151可相對于圓錐形光學組件208的光軸失準且可使用一或多個平坦光學組件使電磁能偏轉至圓錐形光學組件208。在該等具體實例中，凹形光學組件210也可在頂點處包括間隙或開口以允許電磁能通暢地傳遞。
[0130]圖15說明使用多個凹形光學組件照射樣品的一具體實例。如圖15中所說明，光學配置可如上文參照圖14所述，但可進一步包括第二凹形光學組件212。由第一凹形光學組件210傳輸或反射的電磁能149導引至第二凹形光學組件212而非直接聚焦于詢問區域148上。舉例而言，圓錐形光學組件208可相對于第一凹形光學組件210配置，以使得凹形光學組件210將環形電磁能149傳輸或反射至第二光學組件212。接著第二凹形光學組件212將環形電磁能149呈圓錐形式聚焦于詢問區域148上。第二凹形光學組件212使電磁能149關于詢問區域聚焦。在一些情況下，電磁能旋轉對稱聚焦，在其它實例中，電磁能關于收集器組件的光軸旋轉對稱(也即軸對稱，其中相關軸為收集器組件的光軸)。在一些具體實例中，如圖15中所說明，第一光學組件210及第二光學組件212及圓錐形組件208彼此同軸對準且與凹形收集器組件146同軸對準。在其它具體實例中，光學組件中的一或多者可與光學組件中的另一或多者失準及/或可使用收集器組件146及平坦光學組件將電磁能149導引至所需區域或光學組件。
[0131]在一些具體實例中，第一凹形光學組件210及第二凹形光學組件212為拋物線體且收集器組件146為橢球體。在該等具體實例中，第一拋物形光學組件210接收來自圓錐形光學組件208的電磁能149且將電磁能149以環形反射或傳輸至第二拋物形光學組件212。第二拋物形光學組件212將所接收的電磁能149聚焦于詢問區域148上。
[0132]第一凹形光學組件210及第二凹形光學組件212可具有任何適合的形狀。舉例而言，第一凹形光學組件210及第二凹形光學組件212中的一者或兩者可為橢球體、拋物線體、雙曲線體或類球體，只要該等組件經配置以使得第二凹形光學組件212接收來自第一凹形光學組件210的電磁能149且將電磁能149聚焦于詢問區域148或收集器組件146上即可。如上文所述，在一些具體實例中，收集器組件146也可用作光學組件以將電磁能149聚焦于詢問區域148上。在使用第一凹形光學組件210及第二凹形光學組件212的具體實例中，也預期電磁能149自第二凹形光學組件212傳輸或反射于凹形收集器組件146上，其接著將電磁能149聚焦于詢問區域148上。若照射詢問區域148中的分析物，則凹形收集器組件146也將用以接收并收集可偵測信號。
[0133]在圖15中所描繪的具體實例中，流槽132進入第一凹形光學組件210與凹形收集器組件146之間的光學配置，接著穿過收集器組件146的頂點處的開口。然而，也涵蓋其它流槽配置。舉例而言，流槽132可經由收集器組件146的側壁或側壁區域中的間隙(圖中未示)進入收集器組件146的內部體積，接著轉而穿過詢問區域148以使得流槽132中穿過詢問區域148的部分與收集器組件146的光軸同軸對準。可使用流槽132相對于收集器組件146及光學組件的任何其它配置，只要詢問區域148附近的流軸與收集器組件146的光軸同軸對準且在詢問區域148上游形成穩定的層流或芯鞘型流即可。
[0134]在各種具體實例中，可使用物鏡作為將來自照射源151的電磁照射聚焦于詢問區域148上的光學組件。該物鏡可與詢問區域148附近的流槽132的流徑138同軸對準。在一些具體實例中，樣品可經導引以自物鏡流走。圖16說明使用物鏡217作為收集器組件且樣品自物鏡217流走的一例示性具體實例。在圖16中所示的具體實例中，自平面樣品源達成流體動力學聚焦。然而，可如上文所述使用其它流體動力學聚焦方法及儀器。在圖16中所描繪的實施例中，鞘流體200及樣品流體141流過加速區域204以在詢問區域148上游產生穩定芯鞘流。現參看圖17，物鏡317可經改良以允許流體動力學聚焦儀器及/或樣品流穿過物鏡317。在圖17中所描繪的具體實例中，用于引入樣品141的流徑穿過經改良的物鏡317。
[0135]來自照射源(圖中未示)的電磁能由物鏡217或317或由另一光學組件聚焦于詢問區域148上。物鏡217或317也充當收集器組件，其具有與詢問區域148重合的焦點且與一或多個其它光學組件合作以將自詢問區域148中的分析物發射的能量導引至偵測器。該配置有利地允許使用物鏡217或317而無需將流轉向繞過物鏡。與流必須在物鏡217或317周圍轉向的習知系統相比，此可有利地將分選區域152置于詢問區域148下游較遠處。
[0136]應了解任一上述光學配置中所說明的具體實例可包括其它組件。在許多具體實例中，偵測器、分選能源及使電磁能轉向的平面鏡可能未展示，但應理解為包括于適合配置中。其它組件也可包括:光學組件，諸如可有效調節及/或削弱光學或其它電磁信號、基于所偵測的電磁(例如光學)信號進行量測、特性化信號及/或信號強度的組件；及射流組件，諸如可有效引起鞘流體或分析物流動、量測流速或流量或調節流速或流量的組件。
[0137]收集及偵測
[0138]收集器組件146收集由分析物142及/或自分析物142、自分析物142中或表面上的要素或自分析物142中或表面上的標記物發射或傳輸的能量(可偵測信號)。為收集自詢問區域148處的分析物142接收的可偵測信號及/或將其聚焦于偵測器150上，收集器組件146可使用任何數目個凹形反射表面幾何形狀，包括拋物線體幾何形狀、橢球形幾何形狀及/或其它形狀，包括(但不限于)三維二次方程式的一般數學形式的一些表面或與其有關的一些表面，例如 f(x，Y，z) =ax2+by2+cz2+2fyz+2gxz+2hxy+2px+2qy+2rz+d=0? 除非另外規定，否則術語「收集器組件(collector element)」在本發明中應理解為一般是指收集器組件146的所有可能具體實例。當涵蓋特定形狀的收集器組件146 (例如橢球形、拋物線體等)時，「收集器組件」一詞前將冠以適當描述詞，諸如「拋物線體」或「橢球形」。本文中應了解，盡管收集器組件146的壁中存在中斷或間隙，但凹形收集器組件146可視為例如大致橢球形或其它形狀。舉例而言，在一些具體實例中，收集器組件146可包括位于頂點處及/或收集器組件146的側壁中的開口。舉例而言，若提供缺失的部分，則基于環形的大致形狀，環形收集器組件一般可視為橢球體、拋物線體、雙曲線體或類球體。
[0139]返回參看圖3，僅舉例而言，收集器組件146 —般呈具有內部體積167的凹形。收集器組件146也具有光軸161及焦點163。收集器組件146進一步包括頂點159。在一些具體實例中，收集器組件146可具有環形或另外不完整外壁(例如一般形成的拋物線體、橢球體或球體)。如本文中所使用，「頂點」應理解為包括收集器組件146中對應于頂點的彼等區域，而不考慮收集器組件146是否包括壁或頂點處的開口。舉例而言，如圖3中所示，具有截頂形狀的收集器組件146被視為具有頂點159，若未截頂，則實際頂點位于此處。
[0140]收集器組件146的光軸161與流徑138中穿過詢問區域148的部分同軸對準。另夕卜，收集器組件146的焦點FA與詢問區域148重合。
[0141]在一些具體實例中，收集器組件146與一或多個凹形光學組件(諸如凹形光學組件210、212)同軸對準。在其它具體實例中，光學組態的凹形光學組件210、212中的一或多者可關于收集器組件146的光軸161離軸對準且可使用一或多個鏡面將反射或傳輸的電磁能149導引至所關注區域，例如聚焦于詢問區域148上。
[0142]在一些具體實例中，收集器組件146可與偵測器150同軸對準。在其它具體實例中，可使用光學組件將自收集器組件146收集的可偵測信號導引至偵測器150。舉例而言，一或多個平面鏡可將所收集的可偵測信號反射、重導引及/或聚焦至偵測器150或其上。
[0143]現參看圖18，使用例如拋物線體收集器組件346可有利地以極高數值孔徑軸對稱地收集來自分析物142的可偵測信號。另外，拋物線體收集器組件346展現高選擇性，對所檢查的分析物敏感且對其他分析物及拋物線體收集器組件346的焦點外的其它來源的噪聲不敏感。
[0144]仍參看圖18，在一些具體實例中，拋物線體收集器組件346的體積可具有內部拋物形反射表面348，其對應于截頂圓形拋物線體的表面及尤其對應于經垂直于拋物線體的軸354的第一平面350及/或第二平面352截頂的圓形拋物線體的表面。在一些具體實例中，來自照射源151的電磁能可進入拋物線體收集器組件346的體積，在沖擊詢問點148處(也即拋物線體收集器組件346的焦點358處)的分析物前穿過第一平面350，但在沖擊詢問點148處的分析物前不入射于拋物線體收集器組件346的反射表面348上。在其它及/或另外具體實例中，由拋物線體收集器組件346收集的可偵測信號153通過穿過第一平面350而離開拋物線體收集器組件346。在圖18中所描繪的具體實例中，可偵測信號153穿過近軸透鏡251及針孔216，隨后到達偵測器150。近軸透鏡251及針孔216視情況存在且當在偵測之前使用任何類型的收集器組件進一步聚焦可偵測信號153時可包括兩者。當使用拋物形收集器組件346時，因為所收集的可偵測信號一般以平行射束形式自拋物形收集器組件反射，所以可能尤其需要一或多個該等聚焦組件。
[0145]圖18中所描繪的具體實例說明填有介質以減少對可偵測信號153的繞射作用的拋物線體收集器組件346。該介質由框147表示。下文詳細論述用介質填充收集器組件146。已觀察到，經填充的拋物形收集器組件346在焦點358處具有約68%的收集效率，而在焦點358上游100 μ m處展現僅約0.4%的收集效率。因此，拋物形收集器組件346顯示高特異性以及高收集效率。穿過詢問區域148的流軸相對于收集器組件346的光軸的失準也會降低收集器組件346的收集效率。該配置雖然不理想但可適合于各種具體實例。已觀察到，穿過詢問區域148的流軸相對于光軸50 μ m的失準導致拋物形收集器組件346的收集效率為34%且導致詢問區域/點148上游的收集效率增加。
[0146]參看圖19，在一些具體實例中，使用橢球形收集器組件446收集來自詢問點148的光。橢球形收集器組件446可具有任何外表面形狀，且由單一內部同軸橢球形反射器表面設定，該表面對應于可通過橢圓關于其長軸旋轉所形成的截頂橢球體的表面。橢球體可在第一點處由平面450截頂，該平面由橢球體的短軸設定或者由與長軸正交且安置于橢球體的中心點與由橢球形收集器組件446設定的體積中的第一焦點之間的平面設定。在又一替代方案中，橢球體可在該第一點處由穿過橢球體的長軸且與由橢球體的短軸設定的平面形成銳角的平面截頂。在一些具體實例中，橢球體可另外在位于第一焦點454與設定橢球形收集器組件446的橢球體邊界之間的第二點452處截頂。
[0147]類似于拋物線體收集器組件346，橢球形收集器組件446以極高數值孔徑軸對稱地收集來自分析物142的可偵測信號153且展現高選擇性。另外，如上文所述的橢球形收集器組件446有利地向第二焦點456反射起源于第一焦點454的電磁能,該第二焦點可對應于針孔216位置，針孔216過濾不需要的電磁能(例如反射的照射電磁能)以免其到達偵測器150，第一焦點454與針孔254之間無需另一透鏡或鏡面。在一些具體實例中，流槽132可穿過橢球形收集器組件446的表面，且詳言之可沿其長軸在第一焦點454與設定橢球形收集器組件446的橢球體邊界之間穿過橢球形收集器組件446，流槽132可為含有芯鞘流(諸如通過流體動力學聚焦組件(諸如上述組件)所形成的芯鞘流)的試管。
[0148]如同圖18中所描繪的具體實例，橢圓形收集器組件446說明為填充有介質(由框147表示)以減輕流槽壁/空氣界面的折射作用。已觀察到，經填充的橢圓形收集器組件446在第一焦點454 (與詢問區域148重合)處具有約68%的收集效率，而在焦點454上游100 μ m處展現僅約0.003%的收集效率。因此，橢圓形收集器組件346顯示高特異性以及高收集效率。
[0149]為減少或消除由流槽壁產生的對可偵測信號的干擾作用，收集器組件146(例如分別為拋物線體收集器組件346及橢球形收集器組件446)的內部體積可填充有折射率在詢問區域148處的流槽132的壁的折射率的適合容限內的介質，以便最小化或消除沿能量路徑的折射率變化所引起的可偵測信號153的能量繞射。該容限可例如在O至0.1的范圍內。適合的介質包括例如此項技術中熟知為「折射率匹配流體」或「折射率匹配油」的材料。經填充的收集器組件146可與上述流體動力學聚焦方法及儀器及光學配置中的任一者組合使用。此外，收集器組件146可填充有與流槽折射率匹配的固體聚合物，以便最小化或消除沿能量路徑的折射率變化所引起的可偵測信號的能量繞射。此外，流槽可部分在固體材料中制造，例如穿過固體材料的信道，且收集器組件可與固體材料的表面部分整體構建，例如構建于固體材料外表面上的凹形(相對于詢問區域)光學組件。
[0150]在其它具體實例中，流槽132在詢問區域148處包括整體形成的球形模制物154。球形模制物154也減少或消除光經由流槽132壁傳輸所產生的對可偵測信號的干擾。自分析物發射、經由分析物傳輸或由分析物反射的可偵測信號153 —般以與球形模制物154的表面正交的角度沖擊球形模制物154，由此減輕或消除光穿過材料-空氣(球形模制物表面-空氣)界面時的折射作用。
[0151]球形模制物154可由與流槽132相同的材料形成，或在一替代性具體實例中，可由折射率在詢問區域148處的流槽132的壁的折射率的適合容限內的材料形成，以便減少或消除沿能量路徑的折射率變化所引起的可偵測信號153的能量繞射。該容限可例如在O至0.1的范圍內。球形模制物的曲率可在約0%至約5%、約I %至約5%、約2%至約4%及約1%至約3%的容限內。其它適合的容限包括例如約1%、2%、3%、4%及5%。另外，球形模制物關于收集器組件146的焦點的對中可在約Omm至約5mm、約Imm至約4mm、約2mm至約3mm及約Imm至約3mm的容限內。其它適合的容限包括例如約0mm、1mm、2mm、3mm、4mm及5mm ο
[0152]球形模制物154在收集器組件146的焦點處有利地產生約75%的收集效率且在焦點上游或下游50 μ m的距離處產生相當于約0.00002%的收集效率的高選擇性。在該等具體實例中，詢問區域148宜極小且傾向于單個收集。
[0153]圖20A說明球形模制物154及經球形模制物154向收集器組件146發射可偵測信號153及可偵測信號153傳輸至偵測器150或置于偵測器150之前的平坦光學組件或針孔216。圖20B為經由球形模制物154發射可偵測信號153的特寫示意圖，其顯示可偵測信號153不受模制物壁干擾。
[0154]在其它具體實例中，流槽壁-空氣界面的折射作用可通過使詢問區域148處的流槽壁薄化來減輕。舉例而言，詢問區域148處的流槽壁厚度可為約20 μ m至約2000 μ m、約40 μ m 至約 1500 μ m、約 60 μ m 至約 1000 μ m、約 80 μ m 至約 800 μ m、約 100 μ m 至約 600 μ m、約 200 μ m 至約 400 μ m、約 1000 μ m 至約 2000 μ m、約 20 μ m 至約 50 μ m、約 20 μ m 至約 80 μ m、約20 μ m至約200 μ m、約400 μ m至約1000 μ m或約1500 μ m至約2000 μ m。舉例而言，適合的壁厚度可包括約 20 μ m、30 μ m、40 μ m、50 μ m、60 μ m、70 μ m、80 μ m、90 μ m、100 μ m、150200μηι>250μηι>300μηι>350μ m、400 μ m>450 μ m>500 μ m>550 μ m>600 μ m>650 μ m>700 μ m>750 μ m、800 ym、850ym、900 ym、950ym、1000ym、1100ym、1200 ym、1300 ym、1400 μ m、1500 μ m、1600 μ m、1700 μ m、1800 μ m、1900 μ m 及 2000 μ m。在詢問區域 148 處具有薄流槽壁而無其它減輕組件(諸如經填充的收集器或球形模制物154)的具體實例的收集效率可在收集器組件146的焦點處顯示至多約50%的收集效率及在收集器組件146的焦點上游約100 μ m處顯示約3%的收集效率。
[0155]參看圖26，收集器組件可為例如物鏡517，其中該物鏡的焦點與詢問區域148重合。可偵測信號由物鏡收集且以環形傳輸至另一透鏡517或將可偵測信號153聚焦于偵測器150上的其它聚焦組件。如上文關于圖16及17所述,在一些具體實例中，物鏡也可用于照射樣品。在其它具體實例中，物鏡可用于收集且照射可使用任一上述方法達成，包括例如自與詢問區域148正交的照射源進行照射，如圖26中所說明。
[0156]在各種具體實例中，儀器可進一步包括針孔216或平坦光學組件(例如二向色鏡)，其與偵測器150對準以在偵測器150偵測之前聚焦所收集的可偵測信號153。
[0157]分選
[0158]在所述方法及儀器的一些態樣中，分選細胞量測儀利用實體上及/或功能上修飾群體中的所選細胞以允許其區分的技術。也即，替代依靠通過位置、定位、容器或時間立即分離細胞，所述具體實例改為提供關于某種所需性質不活化、喪失能力、破裂、斷裂、破碎或以其它方式改變(也即「修飾」)的細胞，該性質視情況允許分離或區分制備物中的子群。修飾的性質全部或部分視所鑒別細胞的所欲應用或用途而定及從而視所鑒別細胞與應用相關的特征而定。舉例而言且僅出于解釋或闡明的目的，在制備正常體細胞的情形下，若細胞繁殖能力受到不利影響或若細胞被殺死，則惡性或以其它方式永生或快速生長的細胞可視為功能上不活化。在另一實施例中，再次僅出于解釋或闡明的目的，當應用需要自群體移除細胞子群(例如產生不合需要的蛋白質或其它物質的子群)時，分選細胞量測儀可通過消除此等細胞中該物質的產生，通過殺死該等細胞，及/或通過修飾該等細胞以允許其自群體實體移除來達成此結果。
[0159]在一些具體實例中，本發明所述的方法及儀器利用能源修飾細胞或誘導或起始可修飾細胞的過程，諸如化學活化。在各種態樣中，由能源誘導的修飾包括對細胞的直接作用，包括(但不限于)修飾細胞組分或化學物質，包括蛋白質、DNA及與細胞代謝有關的物質；在細胞內或細胞附近發生的破裂、加熱、空蝕或爆裂；細胞通透或穿孔；及細胞(包括細胞、病毒、物體或粒子)的破壞、碎裂或形態變化。在其它具體實例中，修飾也包括或者包括能源的間接作用，其由能源或由其它因素介導，包括細胞或一或多種細胞組分的化學活化及/或失活、化學交聯或化學衍生；在細胞內或細胞附近一或多種化學藥劑的活化及/或失活，此可引起該等藥劑或其衍生物結合或締合于細胞或其組分；或誘導細胞功能改變。在某些具體實例中，照射時與細胞反應的化學藥劑通常存在于細胞中或應用中，或添加其作為方法的一部分。
[0160]在一些具體實例中，所述方法及儀器結合使用光可活化化合物，在用適當強度及能量的光照射時，其經誘導而與細胞或細胞組分結合或締合。在某些態樣中，該等化合物誘導一或多種細胞組分發生足以影響所關注細胞的細胞過程或代謝的交聯或變性。或者，在某些態樣中，該等化合物誘導一或多種細胞組分發生足以殺死所關注細胞的交聯或變性。在另一替代方案中，所述方法及儀器中所使用的光可活化化合物結合于所選細胞且以使得所關注細胞在后續過程中易鑒別及/或富集及/或耗竭的方式改變所關注細胞的一或多種性質。在某些態樣中，在隨后步驟中，通過利用該物質的性質或相互作用的方法移除、濃縮或純化已通過化學衍生(諸如通過添加化學物質)改變的所關注細胞。舉例而言，且僅出于解釋及闡明的目的，在一個態樣中，所關注的細胞通過添加隨后由抗體結合的物質來衍生，該抗體允許通過各種方法捕捉或滯留所關注的衍生細胞。涵蓋許多該等物質，且在一個態樣中，該等物質包括一類含有2，4-二硝基苯基(DNP)或與其有關的化合物，在一個態樣中該化合物由識別DNP的抗體識別并特異性結合。因此，在一個態樣中，使用DNP或相關化合物的光可活化衍生物來衍生此類型的應用中所關注的細胞。或者，所關注的衍生細胞可使用引起所關注的衍生細胞優先結合于某些受質的策略捕捉或移除。舉例而言且僅出于解釋及闡明的目的，在一個態樣中，使用含有生物素或與生物素有關的化合物衍生的所關注細胞捕捉或滯留于結合生物素或已修飾以結合生物素的受質、表面、物質、介質、化合物或粒子上，例如通過存在抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、生物素結合抗體或其它生物素結合分子。在與此態樣有關的另一替代方案中，使用生物素或相關化合物的光可活化衍生物來衍生該應用中所關注的細胞。或者，在其它態樣中，所關注細胞通過添加或締合化學物質或化合物，隨后經受選擇及修飾來改變。因此，在該情況下，本文所述的方法及儀器的一具體實例利用改變所選細胞上的所添加物質以允許區分該等細胞與群體中的其它細胞。舉例而言，且僅出于解釋及闡明的目的，在一個態樣中，群體中的所有細胞均通過在分析之前添加光不穩定化合物來衍生，且在一個態樣中，使用儀器的能源修飾是以特定細胞為目標以修飾彼等細胞上的光不穩定化合物。
[0161]照射后，分析物(若存在)自詢問區域148流動至分選區域152。由于芯鞘流或層流可預測且穩定，因此對于各分析物而言，可獲知分析物離開詢問區域148且流向分選區域152后一定距離處的位置。在一些具體實例中，分選能源350(圖22中描繪)可經控制以照射分選區域處的樣品中的分析物或分析物的一部分以使分析物失能、修飾或破壞該分析物。
[0162]在其它具體實例中，樣品可包括第一及第二分析物，其可使用本文所述的方法及儀器有差別地偵測。第一及第二分析物的分選可例如通過在偵測后照射第一或第二分析物來達成。舉例而言，偵測器150可經組態以偵測及判定可偵測信號153是否來自第一或第二分析物。在偵測特定分析物(例如第二分析物)以用于分選時，分選能源350可經控制以照射第二分析物以使第二分析物失能、修飾或破壞該分析物。
[0163]在一些具體實例中，分選能源350可經對準以與流徑138正交照射分選區域152處的樣品。在其它具體實例中，分選能源350可經對準以以相對于分選能量呈斜角照射樣
品O
[0164]在一些具體實例中，分選能源350為發射電磁能的雷射,例如紫外光、可見光及紅外光。
[0165]舉例而言，分選能源350可為UV雷射。小于約350nm的UV波長可由核酸、蛋白質及/或用于吸收光的染料吸收且可將能量轉移至分析物(例如細胞)的區域，從而修飾、損壞或殺死細胞。
[0166]分選能源350可為例如可見/紅外雷射。約775nm及約775nm以上的可見/紅外波長可由細胞組分及/或用于吸收光的染料及/或水吸收且可將能量轉移至分析物(例如細胞)的區域，從而修飾、損壞或殺死細胞。
[0167]分選能源350可為例如可見雷射。350nm及至約775nm的可見波長可由細胞色素及/或用于吸收光的染料及/或水吸收且可將能量轉移至分析物(例如細胞)的區域，從而修飾、損壞或殺死細胞。
[0168]在分析物為細胞且分選將依據細胞死亡達成的具體實例中，分選能量可經選擇以將細胞的內部溫度加熱至約70°C。該加熱可例如以約50W的瞬時功率達成。能夠殺死細胞的能源包括例如雷射二極管數組、低非空因子脈沖及適當波長或功率的經調節連續或準連續能源。
[0169]任一此等或其它已知分選能源350可用于殺死、修飾或損壞分選區域152處的分析物。分選能源350可以各種方式損壞細胞，包括例如膜或其它細胞器或組分的破裂、細胞中的生物分子的變性及生物分子的交聯或位移。膜或其它細胞器或組分的破裂可通過細胞內的水的空蝕及對鄰近細胞組分的破壞或通過細胞中的水或生物分子的能量誘導解離來達成。生物分子的變性及生物分子的交聯或位移導致生物分子及/或細胞的功能的相關變化或損失。
[0170]在偵測分析物或不合需要的分析物時，分選能源350可預定以分析物為目標或其輸出經調節或重導引而以分析物為目標。使用分選能源350進行分選可通過修飾分析物、使分析物失能或破壞分析物來達成。分選能源350可以各種方式損壞、修飾樣品中的分析物或使該分析物失能，包括例如促使分析物區域中(分選區域處)的樣品流體空蝕，促使分析物區域中(分選區域處)的樣品流體受熱，促使分析物中的分子分解及/或交聯，及直接或通過誘導樣品流體中的化學試劑結合于分析物而對分析物進行化學修飾。
[0171]在一些具體實例中，分選能源350可為熱源，諸如加熱組件、微波或放電。樣品在分選區域152中通過加熱分選區域152處的分析物周圍的流體以損壞、修飾或破壞分析物來分選。
[0172]在一些具體實例中，分選可使用電穿孔或經由向分選區域處的樣品施加力來達成。該力可為例如超音波。
[0173]偵測及分選后的樣品收集
[0174]樣品已穿過詢問區域148進行照射及偵測及穿過分選區域152視情況分選之后，樣品流動至流槽132的出口 136且可在流槽出口處收集于敞開或封閉容器中。圖21A說明收集于敞開容器218中的實例。
[0175]在一些具體實例中，流槽132的出口 136端可具有擴大直徑以允許在減壓及/或低速下收集樣品141。圖21B說明經由流槽132的區域220收集的實例，其具有擴大直徑，從而產生減壓及/或低速區域。樣品141可收集于出口 136處的敞開或封閉容器(敞開容器218例示于圖21B中)中。其它方法也可用于減緩輸出流的速度以最小化對分析物的破壞。
[0176]在其它具體實例中，位于分選區域152下游的出口 136處的實體分選可通過流徑138在出口端分裂為兩個或兩個以上流徑來達成。舉例而言，圖21C說明流徑138在位于分選區域152下游的流槽132的出口 136端處分裂為三個流徑138a、138b、138c的一具體實例。流體流的芯中的分析物142可導引至中央流徑138b，而鞘流體可轉向至外流徑138a及138c。各別容器140a、140b、140c可用于自流徑138a、138b、138c進行收集。該等容器可敞開或封閉。流槽132可視情況包括確保粒子相對于分裂流徑的位置的組件(圖中未示)。視情況存在的組件可包括例如用于偵測進入中央流徑138b的分析物粒子的光學儀器。在一些具體實例中，可使用實體分離的出口或區域處的可變流速將分析物及/或所關注分析物及/或經修飾分析物轉向至該等流徑之一，例如如美國專利第7，355，696號中所述，其揭示內容以全文引用的方式并入本文中。
[0177]流槽132在本文中將理解為封閉流徑，只要流徑138在穿過詢問區域148及穿過分選區域152的區域中為單一、整體且有界的流徑即可。流徑138在分選區域152下游分裂不會影響封閉時流槽132的特性化。
[0178]控制系統
[0179]參看圖22,流動式細胞量測術系統也可包括計算機控制系統400。該計算機控制系統可包括一或多個計算機裝置402，諸如工作站、膝上型計算機、平板計算機、迷你筆記型計算機、個人數字助理及其類似物。如一般已知，各計算機裝置402可包括或可接取一或多個微處理器裝置404、一或多個易失性內存裝置(例如RAM)406及一或多個非易失性內存裝置(例如硬盤驅動機、光學內存裝置等)408。微處理器裝置404可在運作時間操作期間將指令及數據儲存于易失性內存裝置406上，且類似地可將指令及數據儲存于非易失性內存裝置408上。舉例而言，如一般已知，一或多個例程或程序的指令可儲存于非易失性內存裝置408中以由微處理器裝置404擷取。微處理器裝置404在執行例程時可自非易失性內存裝置408擷取該例程且將例程的復本儲存于易失性內存裝置406中。在執行例程期間，微處理器裝置404可另外將數據分別儲存于易失性內存裝置406及非易失性內存裝置408的一或兩者中。另外，微處理器裝置404可自如下文所述的位于計算機402外部的一或多個裝置接收、處理數據及/或將數據儲存于內存裝置406、408中。一或多個輸入/輸出(I /O)裝置410可有助于微處理器404與外部裝置之間的通信及另外有助于微處理器404與內存裝置406、408之間的通信。此外，I / O裝置410可與顯示裝置412通信,顯示裝置412可位于計算機裝置402內部或外部，且可用于顯示使用者接口以允許操作者控制細胞量測術系統。一或多個輸入裝置414(例如鼠標、觸控屏幕、鍵盤等)可允許使用者將數據或命令輸入細胞量測術系統。
[0180]I / O裝置410可有助于微處理器404與細胞量測術硬件之間的通信，該硬件諸如分選能源、偵測器150、照射源151及射流系統。具體而言，關于射流系統，I / O裝置410可有助于微處理器404與流動控制子系統416之間的通信，該流動控制子系統可有效控制鞘流體及樣品流體分別自鞘流體及樣品流體的供應器的流動及向收集容器的流動。舉例而言，流動控制子系統416可控制與鞘流體供應器310流體連通的泵310A，可控制與樣品流體供應器312流體連通的泵312A，及/或可控制與收集容器314流體連通的泵314A。此外，流動控制子系統416可包括可有效感測鞘流體、樣品流體、進入收集容器140的流體及/或形成于流動式細胞量測術系統中的芯鞘流的體積或流速的傳感器或與其通信。最后，I / O裝置410可有助于微處理器404與光學子系統的一或多個組件420之間的通信。組件420可包括一或多個可移動光學組件(例如鏡面或透鏡)及/或一或多個電色裝置，其可用于選擇性導引、重導引及/或阻斷來自分選能源及/或照射能源418的能量。另外，組件420可包括一或多個可有效校準或有助于校準以下的可移動光學組件:(I)光學組件的位置；(2)照射能量、分選能量及/或偵測能量的方向 '及/或(3)照射能量、分選能量及/或偵測能量的強度。
[0181]如應了解，計算機402可儲存及執行用于實施一或多個例程的各種計算機可讀指令，該等例程可包括控制例程、分析例程、分選例程等，及尤其為控制鞘流體及樣品流體的相對流動，接收并分析偵測器150輸出的數據，控制照射源，控制分選能源，控制光學組件的組態，分析流體流的一或多種性質等的例程。雖然例程被描述為儲存于內存裝置上且由微處理器裝置執行，但例程也可為硬件模塊。硬件模塊為能夠進行某些操作的有形單元且可以一定方式組態或配置。在實施例具體實例中，一或多個計算機系統(例如獨立、客戶端或服務器計算機系統)或計算機系統的一或多個硬件模塊(例如處理器或一組處理器)可通過軟件(例如應用程序或應用程序部分)組態為有效進行如上文所述的某些操作的硬件模塊。
[0182]在各種具體實例中，硬件模塊可以機械方式或以電子方式實施。舉例而言，硬件模塊可包含經永久組態以進行某些操作的專用電路或邏輯(例如作為專用處理器，諸如現場可程序化門陣列(field—programmable gate array, FPGA)或特殊應用集成電路(application-specific integrated circuit, ASIC))。硬件模塊也可包含通過軟件臨時組態以進行某些操作的可程序化邏輯或電路(例如涵蓋于通用處理器或其它可程序化處理器中)。應了解，在專用的永久組態電路中或在臨時組態電路(例如通過軟件組態)中以機械方式實施硬件模塊的決定可由成本及時間考慮驅動。
[0183]分選精子的例示性方法
[0184]圖23說明本文所述的方法的例示性具體實例，詳言之，自細胞樣品選擇所需細胞子群體(例如自含有帶有X與Y染色體的細胞混合物的樣品選擇帶有X或Y染色體的細胞)的方法430。在一些具體實例中，方法430或其一部分以構成一或多個相關儀器的控制例程的一組機器可讀指令儲存于內存406、408之一中。處理器404可自內存406、408讀取指令且執行該等指令以執行方法430。在另一具體實例中，方法430包括若干個例程。該等例程可個別地控制一或多個儀器，可分析由該一或多個儀器收集的數據，及/或可基于所分析的數據進行一或多個判定等。如一般已知，技術人員或儀器可標記用于分析的試樣(例如精細胞的集合)(步驟432)。標記細胞可在分選流動式細胞量測儀中，或在分選流動式細胞量測儀外的各別過程或程序中完成。此外，施用于細胞的特定標記可視細胞量測應用而定。在一些具體實例中，標記過程的參數可由處理器404測定及/或標記過程或其一部分可由處理器404控制。舉例而言，細胞可經標記以使得細胞及/或標記組分響應于照射而產生可偵測信號。
[0185]在任何情況下，在標記細胞后，根據本說明書的儀器，詳言之，分選流動式細胞量測儀，可在流徑138中產生鞘流體流(步驟434)。經由各別輸入，分選流動式細胞量測儀可將試樣(也即適合液體中的經標記細胞)注入流徑138中(步驟436)，較佳在鞘流體流的中心或中心附近。也較佳地，該試樣相對于鞘流體流緩慢地進入鞘流體流，以使得試樣中的細胞(例如精細胞)與平行于鞘流體流的長軸對準，并使得細胞以一般單行模式流動。流動控制子系統416可根據由處理器404執行的例程控制鞘流體及樣品流體自鞘流體及樣品流體的供應器的流動，以最佳化鞘流體及樣品流體的相對流動。流動控制子系統416可包括各種傳感器及/或偵測器，其向處理器404上所執行的例程提供輸入，以有助于相對流動的最佳化。
[0186]當細胞移動穿過流徑138時，照射能源151 (諸如UV雷射)照射詢問區域148中的試樣(步驟438)。照射能源可連續地照射詢問區域148，或處理器404上所執行的例程可控制照射能源151選擇性地照射詢問區域148 (例如僅當試樣存在于詢問區域148中時)。細胞及/或細胞的組分或標記或與細胞相關的組分或標記響應于照射而產生可偵測信號。
[0187]凹形收集器組件146有效聚焦自各細胞發射、傳輸或反射的能量(例如標記響應于照射而發射的熒光)(步驟440)。也即，在流徑138中組合的鞘流及試樣一般沿凹形收集器組件146的光軸移動，該光軸一般與流同軸且試樣中的各細胞按計劃穿過凹形收集器組件146的焦點(與詢問區域148重合)。偵測器150接收自凹形收集器組件146聚焦的能量(步驟442)，且向處理器404發送表示所偵測能量的信號。在一些具體實例中，偵測器150可以每秒超過40，000個細胞個別地偵測聚焦能量，可以每秒超過75，000個細胞個別地偵測聚焦能量，可以每秒超過100，000個細胞個別地偵測聚焦能量，可以每秒超過200，000個細胞個別地偵測聚焦能量，或可以每秒超過300，000個細胞個別地偵測聚焦能量。
[0188]處理器404接收表示所偵測能量的信號且分析數據(步驟444)以判定(步驟446)資料是否表示細胞屬于所需子群體或細胞不屬于所需子群體。在一些具體實例中，處理器404也可判定數據是否表示不確定的細胞，既不判定其屬于所需子群體，也不判定其不屬于所需子群體。在后者情況下，處理器404可處理細胞，恰如偵測器150判定細胞不屬于所需子群體一般。若處理器404判定細胞不屬于所需子群體或為不確定的，則處理器404可向分選能源350 (諸如紅外雷射)發送信號，一旦細胞已自詢問區域148傳至分選區域152，即在適合的時間照射細胞(例如改變細胞、破壞細胞、使得細胞不存活等)(步驟448);分選能源聚焦于分選區域152上。或者，若處理器404判定細胞屬于所需子群體，則處理器404可向分選能源350發送信號(或避免發送信號)，以使得當細胞穿過分選區域152時，分選能源350不照射細胞(步驟450)。分選能源可經組態以使得在預期所需或非所需細胞存在于分選區域152中的期間，其將能量傳遞至試樣或不將能量傳遞至試樣。換言之，分選能源350可根據預設將能量傳遞或不將能量傳遞至試樣，且可由處理器404傳遞信號以在如處理器404測定的適當時間改變其傳遞或不傳遞能量的狀態。當然，應了解，替代控制發送至分選能源350的信號或除此以外，調節及/或減弱由分選能源350提供的分選能量可通過控制光學組件420來實現，該光學組件可包括衰減器、可移動光學組件及其類似物。
[0189]儀器可在過程末端收集細胞進行使用及/或進一步加工(例如分離細胞)。在可包括圖15中所描繪的具體實例的一些具體實例中，處理器404向分選能源350及/或向光學組件420發送信號以留下判定為屬于所需子群體的未改變(也即不照射)細胞，且經加工細胞的所得集合包含大于或等于60%的所需細胞子群體中的細胞與未改變總細胞的比率。此外，在可包括圖15中所描繪的具體實例的一些具體實例中，處理器404向分選能源350及/或向光學組件420發送信號以留下判定為屬于所需子群體的未改變(也即不照射)細胞，且經加工細胞的所得集合包含大于或等于50%的所需子群體中的經改變細胞與所需子群體的總細胞的比率。
[0190]當然，上述方法不經反映本發明所述方法的一或多個具體實例，而且可涵蓋如本說明書關于各種具體實例所述的一或多個其它步驟或例程。此外，一些具體實例可省去參考方法430所述的一或多個步驟或例程。舉例而言(但不限于)，在一些具體實例中，細胞或細胞組分可固有地發射可偵測信號，例如因磷光或化學發光，從而消除用標記標記試樣來產生可偵測反應的需要。此外，在一些具體實例(如上文所述)中，方法可顛倒步驟448及450，允許判定為不屬于所需子群體的細胞穿過而不用可控制能源照射，而使得可控制能源照射判定為屬于所需子群體的細胞。
[0191]第一例示性系統具體實例
[0192]圖24描繪執行流動式細胞量測術的系統470的第一例示性具體實例。如上文所述，計算機402控制系統470。計算機402接收來自流動控制的系統416的感測信號及其它信息，且將控制信號發送回至流動控制子系統416。流動控制子系統416根據自計算機402接收的信號操作，以控制泵310A自鞘流體供應器310抽汲鞘流體并控制泵312A自樣品流體供應器312抽汲樣品流體。從而沿流徑138產生流。流徑138包括有效產生芯鞘流的流體動力學聚焦組件157。由計算機402的處理器404執行的例程促使計算機402向流動控制子系統416提供信號，以使得流動控制子系統416維持及/或調整鞘流體及樣品流體的流動以維持穩定流動并最佳化芯鞘流中的分析物粒子的間距。
[0193]計算機402也與照射能源151通信耦接，提供一或多個控制信號用于選擇性接通照射能源151及/或確定照射能源151的功率設定。照射能量149自照射能源151投射穿過第一拋物形光學組件210中的開口。照射能量149入射于圓錐形光學組件208上，其將照射能量149重導向第一拋物形光學組件210的表面。第一拋物形光學組件210將照射能量149以環形反射至第二拋物形光學組件212。當環形照射能量149入射于第二拋物形光學組件212上時，照射能量149向第二拋物形光學組件212的焦點反射(具有一般圓錐形形狀)，該焦點與流徑138中的詢問區域148重合。整體形成于詢問區域148處的流槽中的球形模制物154確保照射能量149在其入射于分析物上時保持聚焦。
[0194]當照射能量149入射于分析物上時，其促使分析物發射呈熒光形式的可偵測信號153。整體形成于詢問區域148處的流槽中的球形模制物154最小化可偵測信號153在其離開流槽時的折射。可偵測信號153入射于橢球形收集器組件146上，其具有與流徑138中的詢問區域148重合的第一焦點。橢球形收集器組件146向橢球形收集器組件146的第二焦點反射可偵測信號153，該第二焦點對應于針孔216的位置。可偵測信號153穿過該針孔且入射于偵測器150上。
[0195]與計算機402通信耦接的偵測器150向計算機402發送對應于可偵測信號153的信號。計算機402執行有效接收來自偵測器150的信號并利用該偵測器判定發射可偵測信號153的分析物是否屬于所需子群體或不屬于所需子群體的例程。
[0196]計算機402另外與分選能源350通信耦接。計算機402向分選能源350發送信號以在發射可偵測信號153的分析物處于分選區域152中時選擇性接通分選能源350，該分選區域安置于由分選能源350發射的電磁輻射476的路徑中。當分析物不屬于所需子群體時，計算機402促使分選能源350發射電磁輻射476，且當分析物屬于所需子群體時，促使分選能源350不發射電磁輻射476。在計算機402上執行的例程可根據已知流動參數判定分析物何時將在分選區域152中，該等參數在任何情況下也經由流動控制子系統416受計算機402控制。射束擋板478防止電磁輻射476入射于系統470的其它部分上。
[0197]收集容器314在流徑138的末端收集含有經分選樣品的流體。
[0198]如圖24描繪，流槽132保持封閉(也即芯鞘流不曝露于氛圍中)且至少自其穿過詢問區域148之前至其穿過分選區域152之后不間斷(也即芯鞘流不分叉)。另外，流徑138在穿過詢問區域148時，其流軸與橢球形收集器組件146的光軸同軸，與第二拋物形光學組件212的光軸同軸，且與第一拋物形光學組件210的光軸同軸。
[0199]第二例示性系統具體實例
[0200]圖25描繪執行流動式細胞量測術的系統480的第二例示性具體實例。如上文所述，計算機402控制系統480。計算機402接收來自流動控制子系統416的感測信號及其它信息，且將控制信號發送回至流動控制子系統416。流動控制子系統416根據自計算機402接收的信號操作，以控制泵310A自鞘流體供應器310抽汲鞘流體并控制泵312A自樣品流體供應器312抽汲樣品流體。從而沿流徑138產生流。流徑138包括有效產生芯鞘流的流體動力學聚焦組件157。由計算機402的處理器404執行的例程促使計算機402向流動控制子系統416提供信號，以使得流動控制子系統416維持及/或調整鞘流體及樣品流體的流動以維持穩定流動并最佳化芯鞘流中的分析物粒子的間距。
[0201]計算機402也與照射能源151A及151B通信耦接，向各照射能源提供一或多個控制信號用于選擇性接通照射能源151AU51B及/或確定照射能源151A、151B的功率設定。照射能量149自照射能源151AU51B的每一者投射穿過橢球形收集器組件146中的各別開口 482A、482B。照射能量149導向流徑138中的詢問區域148。整體形成于詢問區域148處的流槽中的球形模制物154確保照射能量149在其入射于分析物上時不折射。
[0202]當照射能量149入射于詢問區域148中的分析物上時，其促使分析物發射呈熒光形式的可偵測信號153。整體形成于詢問區域148處的流槽中的球形模制物154最小化可偵測信號153離開流槽時的折射。可偵測信號153入射于橢球形收集器組件146上，其具有與流徑138中的詢問區域148重合的第一焦點。橢球形收集器組件146向橢球形收集器組件146的第二焦點反射可偵測信號153，該第二焦點對應于針孔216的位置。可偵測信號153穿過針孔216，接著入射于偵測器150上。[0203]與計算機402通信耦接的偵測器150向計算機402發送對應于可偵測信號153的信號。計算機402執行有效接收來自偵測器150的信號并利用該偵測器判定發射可偵測信號153的分析物是否屬于所需子群體或不屬于所需子群體的例程。
[0204]計算機402另外與分選能源350通信耦接。計算機402向分選能源350發送信號以在發射可偵測信號153的分析物處于分選區域152中時選擇性接通分選能源350，該分選區域安置于由分選能源350發射的電磁輻射476的路徑中。當分析物不屬于所需子群體時，計算機402促使分選能源350發射電磁輻射476，且當分析物屬于所需子群體時，促使分選能源350不發射電磁輻射476。在計算機402上執行的例程可根據已知流動參數判定分析物何時將在分選區域152中，該等參數在任何情況下也經由流動控制子系統416受計算機402控制。射束擋板478防止電磁輻射476入射于系統470的其它部分上。
[0205]收集容器314在流徑138的末端收集含有經分選樣品的流體。
[0206]如圖25描繪，流槽132保持封閉(也即芯鞘流不曝露于氛圍中)且至少自其穿過詢問區域148之前至其穿過分選區域152之后不間斷(也即芯鞘流不分叉)。另外，流徑138的流軸在其穿過詢問區域148時與橢球形收集器組件146的光軸同軸。
[0207]第三例示性具體實例
[0208]圖26描繪執行流動式細胞量測術的系統580的第三例示性具體實例。如上文所述，計算機502控制系統580。計算機502接收來自流動控制子系統516的感測信號及其它信息，且將控制信號發送回至流動控制子系統516。流動控制子系統516根據自計算機502接收的信號操作，以控制泵310A自鞘流體供應器310抽汲鞘流體并控制泵312A自樣品流體供應器312抽汲樣品流體。如圖26中所示，流動式細胞量測儀的物鏡517可經改良以允許樣品流體141穿過透鏡517并以芯流體形式抽入鞘流體中。詳言之，樣品141經導引而經由安置于鞘流體流徑中的孔或腔室進入鞘流200的中心。兩個流皆進入加速區域204且形成穩定芯鞘流。由計算機502的處理器504執行的例程促使計算機502向流動控制子系統516提供信號，以使得流動控制子系統516維持及/或調整鞘流體及樣品流體的流動以維持穩定流動并最佳化芯鞘流中的分析物粒子的間距。
[0209]計算機502也與照射能源151通信耦接，提供一或多個控制信號用于選擇性接通照射能源151及/或確定照射能源151的功率設定。照射能量149導向流徑138中的詢問區域148。
[0210]當照射能量149入射于詢問區域148中的分析物上時，其促使分析物發射呈熒光形式的可偵測信號153。可偵測信號153入射于物鏡517上，其具有與流徑138中的詢問區域148重合的第一焦點。物鏡517向第二透鏡519反射可偵測信號153，該第二透鏡將可偵測信號153聚焦于位于第二透鏡519的焦點處的偵測器上。
[0211]與計算機502通信耦接的偵測器150向計算機502發送對應于可偵測信號153的信號。計算機502執行有效接收來自偵測器150的信號并利用該偵測器判定發射可偵測信號153的分析物是否屬于所需子群體或不屬于所需子群體的例程。
[0212]計算機502另外與分選能源350通信耦接。計算機402向分選能源350發送信號以在發射可偵測信號153的分析物處于分選區域152中時選擇性接通分選能源350，該分選區域安置于由分選能源350發射的電磁輻射576的路徑中。當分析物不屬于所需子群體時，計算機502促使分選能源350發射電磁輻射576，且當分析物屬于所需子群體時，促使分選能源350不發射電磁輻射576。在計算機502上執行的例程可根據已知流動參數判定分析物何時將處于分選區域152中，該等參數在任何情況下也經由流動控制子系統516受計算機502控制。射束擋板478防止電磁輻射576入射于系統570的其它部分上。
[0213]收集容器314在流徑138的末端收集含有經分選樣品的流體。
[0214]如圖26描繪，流槽132保持封閉(也即芯鞘流不曝露于氛圍中)且至少自其穿過詢問區域148之前至其穿過分選區域152之后不間斷(也即芯鞘流不分叉)。另外，流徑138的流軸在其穿過詢問區域148時與物鏡517的光軸同軸。
[0215]以下圖表鑒別本發明的方法及儀器的各種例示性組合。此等組合具例示性且不欲以任何方式限制本發明。在該圖表中所鑒別的各例示性具體實例中，樣品流過流槽中的詢問區域且該流槽在詢問區域與位于詢問區域下游的分選區域之間為封閉的，如上文第77段中所定義。如上文所定義，詢問區域與凹形收集器組件或物鏡收集器組件的焦點重合。也如上文所指示，收集器組件的光軸與詢問區域附近的樣品的流軸同軸對準。在任一例示性具體實例中，應了解，詢問區域可為具有規定范圍的區域或可為與凹形收集器組件的焦點重合的單點，如上文詳細描述。
[0216]在圖表中，A表示用于流體動力學聚焦的方法及儀器。應了解流體動力學聚焦組件(若使用)或流體動力學聚焦方法可位于流槽的任何區域中，只要流體動力學聚焦可使得樣品流在到達詢問區域之前達成穩定層流及/或芯鞘型流且維持穿過分選區域即可。Al表示使用圖5A及5B中所說明及第87-97段中所述的流體動力學聚焦組件達成的流體動力學聚焦。A2表示使用圖6中所說明及第98段中所述的流體動力學聚焦組件達成的流體動力學聚焦。A3表示使用圖7A中所說明及第99段中所述的流體動力學聚焦方法達成的流體動力學聚焦。A4表示如第100段中所述通過使樣品流體穿過毛細管所達成的流體動力學聚焦。A5表示如圖8中所說明及第101段中所述使用聲學聚焦使分析物在流槽中居中。除本文所述的任一流體動力學聚焦方法外，視情況也可使用聲學聚焦。
[0217]在圖表中，B表不用于照射樣品的方法及配置。應了解在任一例不性具體實例中，平面鏡可并入光學配置中以將電磁能導引至預定位置，以便必要時可利用光學組件的更方便及/或更緊湊配置(與光學組件的同軸對準相比)，如第106段中所述。B1-B4表示自一或多個照射源的直接照射。應了解，盡管使用平面鏡重導引來自照射源的電磁能可使照射源在本發明儀器中達成更方便及/或緊湊配置，但自照射源的直接照射被視為直接的。BI表示如第109段中所述自單一照射源的直接照射。Bla表示如圖9所示以與詢問區域附近的流軸正交的角度自單一照射源的直接照射。Blb表示以除與流軸正交外的角度自單一照射源的直接照射。
[0218]B2表示如第110-113段中所述自多個照射源的直接照射。B2a表示如圖10中所示自全部安置于與詢問區域附近的流軸正交的平面內的多個照射源的直接照射。B2b表示如第107及111段中所述自關于流軸旋轉對稱(也即軸對稱)的多個照射源的直接照射。B2c表示如第107段中所述自旋轉對稱(關于任何軸)的多個照射源的直接照射。B2d表示自安置于不同平面內及/或不旋轉對稱的多個照射源的直接照射。
[0219]B3表示如第114段中所述及圖11中所說明使用流槽作為波導自照射源的直接照射。
[0220]B4表示如第115段中所述及圖12中所說明自相對于詢問區域附近的流軸略微離軸的照射源的直接照射。
[0221]B5表示如第116段中所述及圖13中所示使用收集器組件將來自照射源的電磁能聚焦于詢問區域上的照射。如第127段中詳細描述，收集器組件可具有任何適合的形狀。
[0222]B6表示如第117-119段中所述使用單一凹形光學組件將來自照射源的電磁能聚焦于詢問區域上的照射。B6a表示如下照射配置:照射源直接照射凹形光學組件，該凹形光學組件接收來自照射源的電磁能且將電磁能聚焦于詢問區域上。B6b表示如第117段中所述及圖14中所說明的照射配置，其中照射源直接照射圓錐形光學組件，該圓錐形光學組件將電磁能導引至凹形光學組件，該凹形光學組件將照射聚焦于詢問區域上。選擇圖表中的B6(a或b)及B5表示如第116段中所述的照射，其中凹形光學組件將電磁能導引至凹形收集器組件，接著該凹形收集器組件將電磁能聚焦于詢問區域上。如第118段中所述，凹形光學組件可具有任何適合的形狀。
[0223]B7表示如所述使用兩個凹形光學組件照射詢問區域的照射。B7a表示如第120段中所述使用兩個凹形光學組件的照射，其中來自照射源的電磁能直接入射于第一凹形光學組件上，該第一凹形光學組件將電磁能以環形導引至第二凹形光學組件，該第二凹形光學組件又將電磁能聚焦于詢問區域上。B7b表示如第120-123段中所述及圖15中所說明使用兩個凹形光學組件的照射，其中圓錐形光學組件將來自照射源的電磁能導引至第一凹形光學組件，該第一凹形光學組件又將電磁能以環形導引于第二凹形光學組件上，接著該第二凹形光學組件將電磁能聚焦于詢問區域上。選擇圖表中的B7 (a或b)及B5表示如第116段中所述的照射，其中凹形光學組件將電磁電磁能導引至凹形收集器組件，接著該凹形收集器組件將電磁電磁能聚焦于詢問區域上。如第118段中所述，凹形光學組件可具有任何適合的形狀。第一及第二光學組件以及凹形光學組件(若使用)可以任何適合的方式對準。舉例而言，該等光學組件可彼此同軸對準。若光學組件不同軸對準，則也可使用平面鏡將電磁能導引至光學組件、收集器組件或詢問區域中的一或多者。
[0224]B8表示經由物鏡的照射，例如如第124段中所述及圖16及17中所說明。
[0225]C表示照射分析物時收集來自分析物的可偵測信號。Cl表示如第127—138段中所述及圖18及19中所說明的凹形收集器組件。如第127段中所述，凹形收集器組件可具有任何適合的形狀。C2表示如第144段中所述及圖26中所說明用作收集器的物鏡。在各具體實例中，收集器收集來自分析物的可偵測信號(照射分析物時)且將該信號傳輸至偵測器以進行偵測。本文所揭示的任一具體實例可進一步包括平面鏡、針孔或其它聚焦組件以在所收集的可偵測信號到達偵測器之前進一步聚焦。
[0226]D表示在分選區域處分選分析物的方法。如第146至160段中詳細描述，分選能量可修飾、損壞或以其它方式破壞分析物或分析物的子群體以實現分選。Dl表示如第146-157段中所述直接分選分析物，其中分選能量直接照射分析物，從而可修飾、損壞或破壞分析物。D2表示如第158-160段中所述間接分選分析物。D2a表示通過將分選能量導引至樣品流體處、從而引起分選區域處的分析物區域中的樣品流體空蝕的分選。D2b表示在分選區域處使用分選能源加熱分析物區域中的樣品流體的分選。D2c表示通過誘導分析物發生化學修飾(例如促使樣品流體中的化學試劑結合于分析物)的分選。D2a-D2c描述于第158-160段中。雖然圖表中所示的例示性具體實例各包括分選，但應了解使用分選能量的分選為所揭示方法中視情況選用的步驟。[0227]E表示如第138-143段中所述減少分析物所發射、傳輸或反射的可偵測信號因流槽壁與收集器組件之間空氣-樣品流體界面而出現的像差的方法。El表示如第138段中所述通過用折射率與詢問區域處的流槽壁的折射率實質上相同的流體、凝膠或固體填充收集器組件來減少像差。E2表示如第139-142段中所述及圖20A及20B中所說明通過在圍繞詢問區域的流槽上整體形成球形模制物來減少像差。E3表示如第143段所述通過使流槽壁在詢問區域處極薄來減少像差。E1-E3的任一者或組合可視情況用于本文所揭示的任一具體實例。
[0228]F表示詢問區域附近的樣品流動方向。Fl表示如第70段中所述及圖4A中所說明樣品自詢問區域向收集器組件的頂點流動。F2表示如第70段中所述及圖4B中所說明樣品自收集器組件的頂點向詢問區域流動。F3表示如圖7A中所說明樣品自物鏡型收集器組件流走。
[0229]G表示在偵測及視情況分選后的樣品收集。Gl表示在收集樣品時，芯流體自鞘流體穿過像穿過漏斗一樣，例如如第163段中所述及圖21C中所說明。G2表示收集整個芯鞘流。在Gl或G2中，樣品出口可包括增大的面積以在收集時降低樣品速度，例如如第162段中所述及圖21B中所說明。另外，在Gl或G2中可使用聲學聚焦保持分析物在樣品流中居中以用于收集。在Gl或G2中樣品收集也可在敞開或封閉各器中完成。
[0230]在以下圖表中所指定的任一具體實例中，流動式細胞量測術系統也可包括如170-173中一般所述的計算機控制系統。具體而言，計算機控制系統可與分選能源、偵測器、照射源及射流系統中的一者、任何組合或全部通信。就射流系統具體而言，如上文所述，計算機控制系統可控制流動控制子系統有效控制鞘流體及樣品流體分別自鞘流體及/或樣品流體的供應器的流動及向收集容器的流動。最后，計算機控制系統可控制光學子系統的各種組件，可包括一或多個可移動光學組件(例如鏡面或透鏡)及/或一或多個電色裝置，其可用于選擇性導引、重導引及/或阻斷來自分選能源及/或照射能源的能量，且可包括一或多個可有效校準或有助于校準以下的可移動光學組件:(I)光學組件的位置；(2)照射能量、分選能量及/或偵測能量的方向；及/或(3)照射能量、分選能量及/或偵測能量的強度。
[0231]此圖表包含鑒別以上所揭示的特征選集的例示性具體實例。該等選集格式為逗號分隔型值(comma-separated value)。
[0232]
【權利要求】
1.一種用于偵測射流樣品中的分析物的儀器，其包含: 照射源，用于產生電磁能以照射詢問區域中的該樣品； 凹形收集器組件，其包含頂點、光軸及焦點，該詢問區域與該凹形收集器組件的該焦點重合； 封閉流槽，其包含: 樣品入口， 樣品出口， 設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過該詢問區域及安置于該詢問區域下游的分選區域，其中該流徑中穿過該詢問區域的部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準，且其中該流徑中穿過該詢問區域及該分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉，且 該樣品包含或懷疑包含該分析物并流入該流徑，其中: 該樣品以芯鞘流或層流形式至少流過該詢問區域， 該樣品具有自該詢問區域向該收集器組件的該頂點移動的流動方向，或自該收集器的該頂點向該詢問區域移動的流動方向且該流徑的一部分穿過該收集器組件的內部體積，且該分析物響應于照射而產生可偵測信號；及偵測器，用于偵測該可偵測信號。
2.如權利要求1的儀器，其中該偵測器與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準。
3.如權利要求中前述任一項的儀器，其中該詢問區域為詢問點。
4.如權利要求中前述任一項的儀器，其中該照射源以與該詢問區域處的該流軸實質上正交的角度照射該樣品。
5.如權利要求1至3中任一項的儀器，其中該照射源在至少兩個方向上以與該詢問區域處的該流軸實質上正交的角度照射該樣品。
6.如權利要求1至3中任一項的儀器，其中該照射源與該流軸同軸聚焦以照射該流徑中穿過該詢問區域的該部分。
7.如權利要求1至3中任一項的儀器，其中該照射源自一或多個方向、以大于O度且小于或等于360度的弧形角度在與該詢問區域處的該流軸實質上正交的平面上照射該樣品。
8.如權利要求1至3中任一項的儀器，其中該照射源自一或多個方向、以大于O度且小于或等于360度的弧形角度在與該詢問區域處的該流軸傾斜一定角度的平面上照射該樣品O
9.如權利要求1至3中任一項的儀器，其中該照射源自一或多個方向、在包圍該詢問區域的虛擬球體表面上以點狀、弧狀、角狀、立體角狀或任意區域形狀照射該樣品。
10.如權利要求1至3中任一項的儀器，其中除照射光徑受阻引起的中斷外，該照射源以關于該詢問區域處的該流軸呈實質上旋轉對稱來照射該樣品。
11.如權利要求1至3中任一項的儀器，其進一步包含: 圓錐形光學組件，其中該圓錐形光學組件接收來自該照射源的該電磁能；及凹形光學組件，其包含與該詢問區域重合的焦點，其中該凹形光學組件反射來自該圓錐形組件的電磁能且將該電磁能聚焦于該詢問區域上以照射該樣品。
12.如權利要求1至3中任一項的儀器，其進一步包含:圓錐形光學組件，其中該圓錐形光學組件接收來自該照射源的該電磁能；及環形光學組件，其相對于該圓錐形光學組件配置以收集來自該圓錐形組件的電磁能且將該電磁能聚焦于該詢問區域上以照射該樣品。
13.如權利要求11或12的儀器，其進一步包含一或多個平面光學組件用于將該電磁能偏轉至該照射源與該詢問區域之間的任何處。
14.如權利要求11或12的儀器，其中該照射源與該圓錐形組件同軸對準。
15.如權利要求1至3中任一項的儀器，其進一步包含第一及第二凹形光學組件，其經配置以使得該第一凹形光學組件接收來自該照射源的該電磁能且將電磁能的環形射束反射至該第二凹形光學組件，且該第二凹形光學組件將該電磁能的環形射束聚焦于該詢問區域上以照射該樣品。
16.如權利要求15的儀器，其中該第一凹形光學組件及該第二凹形光學組件各包含光軸且該等光軸為同軸對準。
17.如權利要求16的儀器，其中該第一凹形光學組件及該第二凹形光學組件的該等光軸與該收集器組件的該光軸同軸對準，且該第二凹形光學組件使該電磁能的環形射束關于該詢問區域呈軸對稱聚焦于該詢問區域上。
18.如權利要求中前述任一項的儀器，其中該流徑的一部分穿過該收集器組件的壁。
19.一種用于偵測射流樣品中的分析物的儀器，其包含: 照射源，用于照射詢問區域處的樣品； 第一及第二凹形光學組件，其各包含光軸及焦點； 安置于該第一凹形光學組件的內部體積中的圓錐形光學組件，其中該照射源聚焦于該圓錐形光學組件上； 凹形收集器組件，其包含頂點、光軸及焦點，其中該詢問區域與該凹形收集器組件的焦點重合； 封閉流槽，其包含: 樣品入口， 樣品出口， 設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過該詢問區域及安置于該詢問區域下游的分選區域，其中該流徑中穿過該詢問區域的該部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準，且其中該流徑中穿過該詢問區域及該分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉；且 該樣品包含或懷疑包含該分析物并流入該流徑，其中: 該樣品以芯鞘流或層流形式至少流過該詢問區域， 該第二凹形光學組件使關于該收集器組件的該光軸同軸對準的該電磁能聚焦于該詢問區域處的該樣品上，且 該分析物響應于照射而產生可偵測信號；及 偵測器，用于偵測該可偵測信號，該可偵測信號由該凹形收集器組件收集且反射至該偵測器。
20.如權利要求19的儀器，其中該第一凹形光學組件呈橢球形、拋物形或球形。
21.如權利要求19或20的儀器，其中該第二凹形光學組件呈橢球形、拋物形或球形。
22.如權利要求中前述任一項的儀器，其中該收集器組件呈橢球形、拋物形或球形。
23.如權利要求中前述任一項的儀器，其中該流槽進一步包含包圍該詢問區域的球形組件，該球形組件的折射率在比該流槽壁的折射率大或小0.1范圍內。
24.一種用于偵測射流樣品中的分析物的儀器，其包含: 照射源，用于照射詢問區域處的樣品； 第一及第二拋物形光學組件，其各包含光軸及焦點； 圓錐形光學組件，其安置于該第一拋物形光學組件的內部體積中，其中該照射源聚焦于該圓錐形光學組件上； 橢球形收集器組件，其包含頂點、光軸及焦點，其中該第一拋物形光學組件及該第二拋物形光學組件、該圓錐形光學組件及該橢球形收集器組件同軸對準，且該詢問區域與該橢球形收集器組件的該焦點重合； 封閉流槽，其包含: 樣品入口， 樣品出口， 設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過該詢問區域及安置于該詢問區域下游的分選區域，其中該流徑中穿過該詢問區域的該部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準，且其中該流徑中穿過該詢問區域及該分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分 裂或分叉， 包圍該詢問區域的球形組件，該球形組件的折射率在比該詢問區域處的該流槽壁的折射率大或小0.1范圍內； 該樣品包含或懷疑包含該分析物并流入該流徑，其中: 該樣品以芯鞘流或層流形式至少流過該詢問區域， 該第二拋物形光學組件將該電磁能軸對稱地聚焦于該詢問區域處的該樣品上，且 該分析物響應于照射而產生可偵測信號；及 偵測器，用于偵測該可偵測信號，該可偵測信號由該橢球形收集器組件收集且反射至該偵測器。
25.如權利要求中前述任一項的儀器，其中該收集組件填充有介質，該介質的折射率在比該詢問區域處的該流槽壁的折射率大或小0.1范圍內。
26.如權利要求中前述任一項的儀器，其進一步包含將由該收集器組件反射的該可偵測信號聚焦至該偵測器的平面鏡。
27.如權利要求中前述任一項的儀器，其進一步包含與該偵測器對準的針孔裝置以將由該收集器組件反射的該可偵測信號聚焦至該偵測器。
28.如權利要求中前述任一項的儀器，其中該樣品具有自該收集器組件的該頂點向該詢問區域移動的流動方向。
29.如權利要求中前述任一項的儀器，其中該樣品具有自該詢問區域向該收集器組件的該頂點移動的流動方向。
30.如權利要求中前述任一項的儀器，其中該流槽為毛細管。
31.如權利要求中前述任一項的儀器，其進一步包含安置于該詢問區域上游的該流槽中的流體動力學聚焦組件。
32.如權利要求中前述任一項的儀器，其中該分析物包含第一及第二分析物，該儀器進一步包含在與該偵測器通信耦接的處理器上操作的邏輯例程，該邏輯例程可有效(I)利用該可偵測信號判定產生該可偵測信號的該分析物是否為第一分析物或第二分析物，且(2)根據該判定輸出信號。
33.如權利要求32的儀器，其進一步包含可控制分選能源，該分選能源與該邏輯例程通信耦接且可有效地根據來自該邏輯例程的該輸出信號在該分選區域處選擇性分選該第一分析物或該第二分析物。
34.如權利要求1至31中任一項的儀器，其中當偵測到該可偵測信號時，該偵測器可有效輸出信號，該儀器進一步包含可控制分選能源，該分選能源與該偵測器通信耦接且可有效地根據來自該偵測器的該輸出信號給予該分選區域處的該分析物能量。
35.一種使用儀器偵測射流樣品中的分析物的方法，該儀器包含照射源，具有頂點、光軸及焦點的凹形收集器組件，及與該凹形收集器組件的該焦點重合的詢問區域，該方法包含: 控制封閉流槽中的樣品流以具有(I)自該收集器組件的該頂點流向該詢問區域或(2)自該詢問區域流向該收集器組件的該頂點的流動方向，該流槽包含: 樣品入口， 樣品出口，及 設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過該詢問區域及安置于該詢問區域下游的分選區域，其中該流徑中穿過該詢問區域的該部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準，且其中該流徑中穿過該詢問區域及該分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉， 其中當該流動方向為自該詢問區域流向該收集器組件的該頂點時，該流徑的一部分穿過該收集器組件； 照射該詢問區域處的該樣品，其中該分析物回應于照射而產生可偵測信號； 用該凹形收集器組件收集該可偵測信號，其中該收集器組件將該可偵測信號反射至該偵測器；及 用該偵測器偵測該可偵測信號。
36.如權利要求35的方法，其中該封閉流槽進一步包含包圍該詢問區域的球形組件，該球形組件的折射率在比該流槽壁的折射率大或小0.1范圍內。
37.如權利要求35或36的方法，其中該偵測器與該收集器組件的該光軸同軸對準。
38.如權利要求35至37中任一項的方法，其中該照射區域為照射點。
39.如權利要求35至38中任一項的方法，其包含正交于該詢問區域處的該流軸照射該樣品。
40.如權利要求35至38中任一項的方法，其包含在至少兩個方向上正交于該詢問區域處的該流軸照射該樣品。
41.如權利要求35至38中任一項的方法，其中照射該樣品包含與該流軸同軸配置該照射源及照射該流徑中穿過該詢問區域的該部分。
42.如權利要求35至38中任一項的方法，其中照射該樣品包含: 使用圓錐形光學組件將來自該照射源的電磁能反射至凹形光學組件；及使用該凹形光學組件將該電磁能聚焦于該詢問區域上，該凹形光學組件包含與該詢問區域重合的焦點。
43.如權利要求35至38中任一項的方法，其中照射該樣品包含: 使用圓錐形光學組件將來自該照射源的電磁能反射至環形光學組件，其中該圓錐形光學組件相對于該環形光學組件配置以使得該電磁能由該環形光學組件接收，及使用該環形光學組件將該電磁能聚焦于該詢問區域上。
44.如權利要求42或43的方法，其進一步包含使用平面光學組件將來自該照射源的該電磁能反射至該圓錐形光學組件。
45.如權利要求42或43的方法，其中該照射源與該圓錐形光學組件同軸對準。
46.如權利要求35至38中任一項的方法，其中照射該樣品包含使用第一凹形光學組件將來自該照射源的電磁能以環形射束形式反射至第二凹形光學組件；及 使用該第二凹形光學組件將該電磁能的環形射束聚焦于該詢問區域上。
47.如權利要求46的方法，其中該第一凹形光學組件及該第二凹形光學組件各包含光軸且該等光軸同軸對準。
48.如權利要求47的方法，其中該第一凹形光學組件及該第二凹形光學組件的該等光軸與該收集器組件的該光軸同軸對準。
49.如權利要求35至48中任一項的方法，其中該樣品的該流動方向為自該收集器組件的該頂點流向該詢問區域，且該流徑的一部分穿過該收集器組件。
50.一種在儀器中偵測 分析物的方法，該儀器包含照射源，圓錐形光學組件，第一及第二凹形光學組件，具有頂點、光軸及焦點的凹形收集器組件，及與該凹形收集器組件的該焦點重合的詢問區域，該方法包含: 控制封閉流槽中的樣品流，該樣品流包含或懷疑包含分析物，該封閉流槽包含: 樣品入口， 樣品出口， 設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過該詢問區域及安置于該詢問區域下游的分選區域，其中該流徑中穿過該詢問區域的該部分與該凹形收集器組件的該光軸同軸對準，且其中該流徑中穿過該詢問區域及該分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉； 使用光學配置照射該詢問區域處的該分析物，其中該分析物回應于照射而產生可偵測信號且該光學配置包含: 該第一凹形光學組件及該第二凹形光學組件，其各具有光軸及焦點，及安置于該第一凹形光學組件的內部體積中的該圓錐形光學組件，其中該圓錐形光學組件將來自照射源的電磁能反射至該第一凹形光學組件，該第一凹形光學組件將該電磁能反射至該第二凹形光學組件，且該第二凹形光學組件將該電磁能聚焦于該詢問區域上； 用該凹形收集器組件收集該可偵測信號，其中該凹形收集器組件將該可偵測信號反射至偵測器 '及 用該偵測器偵測該可偵測信號。
51.如權利要求50的方法，其中該第一凹形光學組件呈橢球形、拋物形或球形。
52.如權利要求50或51的方法，其中該第二凹形光學組件呈橢球形、拋物形或球形。
53.如權利要求35至52中任一項的方法，其中該收集器組件呈橢球形、拋物形或球形。
54.一種在儀器中偵測分析物的方法，該儀器包含照射源，圓錐形光學組件，第一及第二拋物形光學組件，具有頂點、光軸及焦點的橢球形收集器組件，及設定于與該橢球形收集器組件的該焦點處的詢問區域，該方法包含: 控制封閉流槽中的樣品流，該樣品流包含或懷疑包含分析物，該封閉流槽包含: 樣品入口， 樣品出口， 設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑穿過該收集器組件、該詢問區域及安置于該詢問區域下游的分選區域，其中該流徑中穿過該詢問區域的該部分與該橢圓形收集器組件的該光軸同軸對準，且其中該流徑中穿過該詢問區域及該分選區域的至少一部分以流槽壁為邊界以形成連續封閉流徑，而無分裂或分叉，及 包圍該詢問區域的球形組件，該球形組件的折射率在比該流槽壁的折射率大或小0.1范圍內； 使用光學配置照射該詢問區域處的該分析物，其中該分析物回應于照射而產生可偵測信號且該光學配置包含: 該第一拋物形光學組件及該第二拋物形光學組件，其各包含光軸及焦點，及 安置于該第一拋物形光學組件的內部體積中的該圓錐形光學組件，其中該圓錐形光學組件將來自照射源的電磁能反射至該第一拋物形光學組件，該第一拋物形光學組件將該電磁能反射至該第二拋物形光學組件，且該第二拋物形光學組件將該電磁能聚焦于該詢問區域上； 用該橢球形收集器組件收集該可偵測信號，其中該橢球形收集器組件將該可偵測信號反射至偵測器 '及 用該偵測器偵測該可偵測信號。
55.如權利要求35至54中任一項的方法，其中該收集器組件填充有介質，該介質的折射率在比該詢問區域處的該流槽壁的折射率大或小0.1范圍內。
56.如權利要求35至55中任一項的方法，其進一步包含使用平面鏡反射來自該收集器組件的該可偵測信號。
57.如權利要求35至56中任一項的方法，其進一步包含使用與該偵測器對準的針孔裝置聚焦來自該收集器組件的該可偵測信號。
58.如權利要求35至57中任一項的方法，其包含控制該樣品流以具有自該收集器組件的該頂點向該詢問區域移動的流動方向。
59.如權利要求35至57中任一項的方法，其包含控制該樣品流以具有自該詢問區域向該收集器組件的該頂點移動的流動方向。
60.如權利要求35至59中任一項的方法，其中該流徑與該收集器組件的該光軸同軸對準。
61.如權利要求35至60中任一項的方法，其中該流槽為毛細管。
62.如權利要求35至61中任一項的方法，其進一步包含在至少穿過該詢問區域的該樣品流中形成芯鞘流。
63.如權利要求35至62中任一項的方法,其中該分析物包含第一及第二分析物,該方法進一步包含: 在偵測該可偵測信號后接收來自該偵測器的數據； 利用該所接收的數據判定該詢問區域中該分析物的存在；及 利用該所接收的數據判定該分析物是否為該第一分析物或該第二分析物。
64.如權利要求63的方法，其進一步包含控制分選能源以根據該分析物為該第一分析物或該第二分析物的該判定在該分選區域處選擇性分選該第一分析物或該第二分析物中的一者。
65.如權利要求64的方法,其中選擇性分選包含衍生、殺死、損壞、修飾、破裂或破碎該第一分析物或該第二分析物。
66.如權利要求35至62中任一項的方法，其進一步包含: 在偵測該可偵測信號后接收來自該偵測器的數據，及 控制分選能源以根據該所接收的數據向該分選區域處的該分析物破壞性地給予能量。
67.如權利要求66的方法，其中給予該分析物能量包含衍生、殺死、損壞、修飾、破裂或破碎該分析物。
68.一種用于偵測分析物的儀器，其包含: 照射源； 包含光軸及焦點的物鏡； 與該焦點重合的詢問區域； 流槽，其具有樣品入口、樣品出口及設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，其中該流徑的至少一部分穿過該詢問區域且具有與該光學組件的該光軸同軸對準的流軸；流入該流徑中的樣品，其包含或懷疑包含分析物，該樣品在流軸與該物鏡的該光軸同軸對準的該流徑的該部分中具有離開該物鏡的流動方向，其中該分析物響應于照射而產生可偵測信號； 偵測器，用于偵測該可偵測信號 '及 可控制能源，用于在該光學組件的該焦點下游分選該樣品。
69.一種在儀器中偵測分析物的方法，該儀器包含照射源及具有光軸及焦點的物鏡、設定于該物鏡的該焦點處的詢問區域及控制組件，該方法包含: 在離開該物鏡的流動方向上控制封閉流槽中的包含分析物的樣品流，該流槽包含: 樣品入口， 樣品出口， 設定于該樣品入口與該樣品出口之間的流徑，該流徑以流槽壁為邊界，其中該流徑的至少一部分穿過該物鏡及該詢問區域且具有與該物鏡的該光軸同軸對準的流軸； 照射該詢問區域處的該樣品，該分析物響應于照射而產生可偵測信號； 用該物鏡收集該可偵測信號且將該可偵測信號反射至偵測器；及 偵測該信號。
70.如權利要求69的方法，其中該分析物包含第一及第二分析物，該方法進一步包含: 在偵測該可偵測信號后接收來自該偵測器的數據； 利用該所接收的數據判定該詢問區域中該分析物的存在；及 利用該所接收的數據判定該分析物是否為該第一分析物或該第二分析物。
71.如權利要求70的方法，其進一步包含控制分選能源以根據該分析物為該第一分析物或該第二分析物的該判定選擇性分選該第一分析物或該第二分析物中的一者。
72.如權利要求71的方法，其中選擇性分選包含衍生、殺死、損壞、修飾、破裂或破碎該第一分析物或該第二分析物。
73.如權利要求中前述任一項的方法或儀器，其中該分析物為精細胞。
74.如權利要求中前述任一項的方法或儀器，其中該分析物包含第一及第二分析物，該第一分析物為包含X染色體的精細胞且該第二分析物為包含Y染色體的精細胞。
75.如權利要求73或74的方法，其進一步包含流體動力學聚焦該樣品以使得該等精細胞定向成同方向且在該樣品流體中對準，或 如權利要求73或74的儀器，其進一步包含流體動力學聚焦區域，用于使該精細胞定向成同方向且使該等精細胞在該樣品流體中對準。
76.原文權利要求76缺失。
77.如權利要求中前述任一項的方法，其進一步包含聲學聚焦該分析物以使該樣品中的該分析物居中，或 如權利要求中前述任一項的儀器，其進一步包含鄰近該流槽的轉換器，該轉換器可有效發射用于聲學聚焦該樣品中的該分析物的機械波。
78.如權利要求中前述任一項的方法或儀器，其中該樣品以每秒約0.1mm3至每秒約30mm3的速率流過該流槽。
79.如權利要求中前述任一項的方法或儀器，其中該樣品以芯鞘流形式流動且鞘流體以每秒約20mm3至每秒約600mm3的速率流動。
80.如權利要求中前述任一項的方法，其包含當該等分析物穿過該詢問區域時偵測每秒超過100，000個分析物的該可偵測信號。
【文檔編號】G01N15/14GK103477203SQ201280009586
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年2月15日 優先權日:2011年2月15日
【發明者】馬克·魯雪, 蘭道·馬克斯 申請人:麥克羅畢克斯生物系統公司