專利名稱：鄰苯二甲酸二丁酯elisa檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯的試劑盒，特別是檢測鄰苯二甲酸二丁酯的酶聯免疫(ELISA)檢測試劑盒。
背景技術：
鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)屬于鄰苯二甲酸酯類，是目前國內外工業生產中使用最多的塑化劑(又稱增塑劑)，廣泛存在于食品包裝、化妝品、醫療器材以及環境水體中。這類塑化劑并非食品或食品添加物，但會通過環境遷移、食品包裝遷移及非法添加等進入食品，對人體健康產生毒害作用，如造成內分泌失調，影響正常生育能力，在體內長期蓄積會導致畸形、癌變和突變，對心血管、消化和泌尿系統也有很大傷害。因此，我國衛生部衛辦監督函〔2011〕551號文件中規定:嚴禁在食品、食品添加劑中人為添加鄰苯二甲酸酯類物質，食品、食品添加劑中的鄰苯二甲酸二( a -乙基已酯)(DEHP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)和鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)最大殘留量分別為1.5mg/kg、9.0mg/kg和0.3mg/kg。目前文獻報道有關鄰苯二甲酸酯類物質的檢測方法有氣相色譜法、超高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜法、氣相色譜-離子阱質譜法等。但研究大多集中于環境樣品和塑料包裝材料，對于食品中的污染情況檢測研究較少。我國食品中鄰苯二甲酸酯檢測使用“GB/T 21911-2008《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》”，包裝中鄰苯二甲酸酯檢測使用“GB/T 21928-2008《食品塑料包裝材料中鄰苯二甲酸酯的測定》”，兩種檢測方法均運用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)的方法進行測定。該方法靈敏、準確，特異性強、分離度好，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器、樣品的前處理復雜、繁瑣費時、檢測的成本較高，不能現場操作，而且需專業人員操作，所以限制了其應用。與之相比，酶聯免疫方法具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合于批量樣品的篩選檢測等優點，而且所需設備少，操作簡單易學，成本低廉，能夠更好地滿足我國食品企業、政府職能監管部門等開展檢測工作。
實用新型內容本實用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的鄰苯二甲酸二丁酯殘留檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩定性好，需要的技術含量不高，可進行一次連續多個樣品中鄰苯二甲酸二丁酯殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。本實用新型的技術方案是:一種鄰苯二甲酸二丁酯ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的聚苯乙烯酶標板、一張蓋板膜、13瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋，其特征在于:酶標板是采用96孔的聚苯乙烯試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被鄰苯二甲酸二丁酯偶聯抗原制成的檢測板，13瓶試劑分別為6瓶標準品溶液、酶標二抗、抗體工作液、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、樣本稀釋液，下凹瓶位共15個。[0006]酶標板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝的酶標反應微孔條有8個反應孔，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜為蓋板膜，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致，將13瓶試劑用不同大小、不同顏色的試劑瓶盛裝并固定在下凹瓶位中，與酶標板、蓋板膜、自封袋一同封裝在硬紙盒內，以便于攜帶和運輸。13瓶試劑分別為6瓶Iml梯度濃度的標準品溶液、12ml酶標二抗、7ml抗體工作液、7ml底物液A液、7ml底物液B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、50ml樣本稀釋液。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定(包括標準分析孔)，既可進行一次連續多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結果的準確性。檢測時，樣本中的殘留物(鄰苯二甲酸二丁酯)將和酶標板微孔條上預包被的鄰苯二甲酸二丁酯偶聯抗原競爭抗鄰苯二甲酸二丁酯的抗體，加入酶標二抗后，用底物液顯色，樣本吸光度值與所含殘留物(鄰苯二甲酸二丁酯)的含量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中鄰苯二甲酸二丁酯的殘留量，其操作簡便易行。經實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度:白酒樣本的最低檢測限為0.lmg/L,回收率為90%±20% ;同鄰苯二甲酸二丁酯的交叉反應率為100%、同鄰苯二甲酸二異丁酯的交叉反應率為35%、同鄰苯二甲酸二辛酯的交叉反應率< 1%、同鄰苯二甲酸二異壬酯的交叉反應率< 1%、同鄰苯二甲酸二異辛酯的交叉反應率< 1%、同鄰苯二甲酸二甲酯的交叉反應率< 1%。相對于其他鄰苯二甲酸二丁酯檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標儀、振蕩器和微量加樣器等，同類實驗室一般均有配備，所需成本較低。本實用新型的有益效果是:能快速、簡便、靈敏、準確地用于鄰苯二甲酸二丁酯殘留量的檢測。
圖1為本實用新型酶標板的側面縱剖面圖(長為8.55cm)；圖2為本實用新型酶標板的側面橫剖面圖(長為12.8cm)；圖3為本實用新型酶標板的俯視圖；圖4為本實用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側視圖。參見附圖:酶標反應微孔條(2)預包被鄰苯二甲酸二丁酯偶聯抗原(3)固定于酶標板的外框支撐架(I)上，酶標反應微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標板置水浴或恒溫箱內反應時封蓋酶標反應微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍色帽的半透明PE塑料試劑瓶(5)用于封裝50ml樣本稀釋液；白色帽的白色PE塑料試劑瓶(6)用于封裝7ml底物液A液，紅色帽的黑色PE塑料試劑瓶(6)用于封裝7ml底物液B液，黃色帽的白色PE塑料試劑瓶(6)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝12ml酶標二抗，綠色帽的白色PE塑料試劑瓶(7 )用于封裝7ml抗體工作液，黑色帽的棕色玻璃瓶(8 )用于封裝Iml/瓶的標準品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個下凹瓶位,放置位置依次為:40ml濃縮洗滌液瓶位(18)，50ml樣本稀釋液瓶位(11)，7ml底物液A液瓶位(14)，Iml底物液B液瓶位(13)，7ml終止液瓶位(12)，7ml抗體工作液瓶位(16)，12ml酶標二抗瓶位(15)，6個Iml/瓶各種濃度的標準品溶液瓶位(17)，盒體(9)是硬紙盒。
具體實施方式
一、樣本的前處理1、配液配液1:洗滌工作液用去離子水將20 X濃縮洗滌液按1:19體積比進行稀釋(I份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4°C環境可保存一個月。2、白酒樣本處理步驟移取IOOii I白酒樣品于2ml聚苯乙烯離心管中，再加入400 ii I樣本稀釋液,充分振蕩混勻；取5(^1用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(2(T25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放回自封袋，封口，保存于21 °C。3、濃縮洗滌液和樣本稀釋液在使用前也需回溫。
4、編號:將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。5、加標準品/樣本和抗體工作液:加標準品/樣本50 U I到對應的微孔中，然后加入抗體工作液50 ii I/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應30min。6、洗板:小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液250 Ul/孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。7、加酶標二抗:加入酶標二抗IOOiU/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應30min，取出重復洗板步驟6。8、顯色:加入底物液A液50 iil/孔，再加底物液B液50 iil/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應15min。9、測定:加入終止液50 U I/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據)，測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。三、結果判定結果判定有兩種方法，粗略判定可用第I種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含鄰苯二甲酸二丁酯的含量成負相關。1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(mg/L)。假設樣本I的吸光度值為0.820，樣本2的吸光度值為1.320，標準液吸光度值分別是:0mg/L為1.984 ；
0.02mg/L 為 1.632 ；0.06mg/L 為 1.232 ；0.18mg/L 為 0.752 ；0.54mg/L 為 0.361 ；1.62mg/L為0.156。貝U樣本I的濃度范圍是0.06、.18mg/L再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中鄰苯二甲酸二丁酯殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0.02、.06mg/L再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中鄰苯二甲酸二丁酯殘留的濃度范圍。2、定量分析(I)百分吸光率的計算:標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100%，即:
權利要求1.一種鄰苯二甲酸二丁酯ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、13瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋，其特征在于:酶標板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被鄰苯二甲酸二丁酯偶聯抗原制成的檢測板，13瓶試劑分別為6瓶標準品溶液、酶標二抗、抗體工作液、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、樣本稀釋液，下凹瓶位共15個。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標板，放于真空鋁箔袋內；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶標二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，樣本稀釋液用藍色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:酶標板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔；蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；標準品溶液6瓶，Iml/瓶；酶標二抗I瓶，12ml ;抗體工作液I瓶，7ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;終止液I瓶，7ml ;濃縮洗滌液I瓶，40ml ;樣本稀釋液I瓶，50ml。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯ELISA檢測試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標板、酶標二抗、抗體工作液、6個濃度的標準品溶液、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、樣本稀釋液。采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中殘留的鄰苯二甲酸二丁酯將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗鄰苯二甲酸二丁酯抗體，加入酶標二抗后，用底物液顯色，利用樣本吸光度值計算出樣品中鄰苯二甲酸二丁酯的殘留量。與儀器分析技術相比具有操作簡便、費用低廉、靈敏度高等特點，可在鄰苯二甲酸二丁酯的殘留量檢測中發揮重要作用。
文檔編號G01N33/543GK202956383SQ20122069410
公開日2013年5月29日 申請日期2012年12月14日 優先權日2012年12月14日
發明者何方洋, 萬宇平, 馮才偉, 馮靜, 陶光燦, 聶雯瑩, 吳小勝, 彭鴿 申請人:北京勤邦生物技術有限公司