專利名稱：檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條及方法。
背景技術：
大觀霉素又稱壯觀霉素、奇放線菌素、壯觀菌素等，為大觀鏈霉菌所產生的一種氨基環醇類抗生素，對革蘭氏陰性菌(如布魯氏菌、克雷伯菌屬、變形桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等)有較強作用，對革蘭氏陽性菌(鏈球菌、葡萄球菌等)作用較弱，對支原體亦有一定作用，是一新型特效專治淋病的抗生素，對淋病奈瑟菌有較強的抗菌作用。能促進動物生長，是良好的動物飼料添加劑，作為獸藥廣泛應用于畜牧業中。一些不法商販受經濟利益的驅使濫用抗生素，使大量抗生素殘留在畜產品中，如果長期食用含有抗生素殘留的動物源性食品，也就相當于長期低劑量吸收抗生素，使人體內菌株產生抗生素抗性，給患病時使用抗生素治療帶來不良影響，會破壞機體內環境平衡，造成菌群失調，抗生素過敏體質的人會出現過敏反應，引起免疫性溶血，同時造成食品和環境中藥物殘留污染的一系列問題。鏈霉素是氨基糖苷類抗生素，在奶牛及奶羊養殖中應用普遍，但由于使用管理不規范，常造成鮮奶及奶粉中鏈霉素殘留。由于鏈霉素、對人體具有較大的毒副作用，嚴重時可造成過敏性休克和耳聾，特別是對小孩的危害較大，可透過胎盤進入羊水和胎兒循環，危害胎兒健康。各國對乳制品中的鏈霉素、雙氫鏈霉素均制定了嚴格的殘留限量，如日本規定奶中鏈霉素與雙氫鏈霉素的總限量為0.2 mg/kg，美國規定乳及牛奶中雙氫鏈霉素的限量為0.125 mg/kg,中國規定奶中鏈霉素與雙氫鏈霉素的限量均為0.2 mg/kg,所以對奶粉中的鏈霉素、雙氫鏈霉素殘留量進行檢測對于控制奶粉質量，維護人類的飲食健康有重要意義。慶大霉素是由小單胞菌產生的一種氨基糖苷類抗生素，對多種革蘭陽性和陰性菌都具有顯著的抗菌效果，作為飼料添加劑和治療疾病的抗生素廣泛應用于畜牧業。然而，慶大霉素對人類具有明顯的毒害作用，對腦神經、聽覺以及腎臟的損害嚴重。許多國家和國際組織均明確規定了食品中該藥物殘留的最大殘留限量。歐盟規定，牛奶中的最大殘留量為100 μ g/kg,肌肉、脂肪中的最大殘留量為50 μ g/kg。新霉素屬氨基糖苷類抗生素，抗菌譜廣，在獸醫臨床上應用廣泛，是重要的抗感染藥物，還被普遍用于治療乳腺炎、角膜炎、結膜炎、耳炎、皮炎、外傷感染、足腐爛等疾病。我國和其它一些國家還將新霉素作為飼料抗生素添加劑使用，用于預防畜禽感染引起的早期損失和腸炎，提高飼料利用率，促進生長。雖然新霉素在獸醫和畜牧上使用取得了巨大的成功，但其對人和動物存在潛在的耳毒性和腎毒性，為此，我國和歐盟等國家均制定了動物源性食品中新霉素最高殘留限量。目前免疫分析領域缺乏能夠同時檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素這四種藥物的技術及其應用。因此，在實踐中有必要建立一種敏感度高、操作簡單、成本低、檢測藥物種類多、適合大規模推廣的檢測方法。
實用新型內容本實用新型的目的是提供一種同時檢測檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條。本實用新型所提供的試紙條包括微孔條、微孔試劑、微孔塞和試紙，試紙包括底板、樣品吸收墊、反應膜、吸水墊、保護膜，其依次連接；所述微孔試劑的凍干有大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物；反應膜上具有包被有大觀霉素-載體蛋白偶聯物、鏈霉素-載體蛋白偶聯物、慶大霉素-載體蛋白偶聯物以及新霉素-載體蛋白偶聯物的四條檢測線和包被羊抗鼠抗抗體的一條質控線。四條檢測線和一條質控線互相平行，大觀霉素檢測線靠近樣品吸收墊一端，質控線靠近吸水墊一端。鏈霉素檢測線、慶大霉素檢測線、新霉素檢測線在大觀霉素檢測線和質控線之間。其中大觀霉素檢測線用檢測線(Tl)表示，鏈霉素檢測線用檢測線(T2)表示，慶大霉素檢測線用檢測線(T3)表示，新霉素檢測線用檢測線(T4)表示，質控線用質控線(C)表示。質控線(C)距離反應膜的末端與吸水墊相連的一端為5-8mm，檢測線(T4)距離質控線(C) 4_6mm，檢測線(T3)距離檢測線(T4) 4_6mm，檢測線(T2)距離檢測線(T3) 4-6mm，檢測線(Tl)距離檢測線(T2) 4_6mm。保護膜粘貼樣品吸收墊上的檢測端，上面有MAX標記線。在裝有凍干有大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔條上具有微孔塞。為了便于運輸和使用，試紙條還有固定用具及其固定于其中用于盛裝試紙和凍干有大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔條的試劑桶，所述試劑桶上具有密封蓋。本實用新型試紙條中試紙底板可為PVC底板或其他硬質不吸水的材料；樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；吸水墊為吸水紙；反應膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；保護膜為PE材質保護膜；試紙條盒體為硬紙盒；試劑桶為塑料試劑桶；固定用具為硬質支撐材料。本實用新型試紙條具有如下有益效果:1.靈敏度高:傳統的試紙卡均具有固定試紙條的卡殼固定裝置,卡殼固定裝置緊緊地將試紙固定其中，在對樣品檢測時，由于卡殼與試紙結合的比較緊密，致使檢測樣品溶液不能夠充分滲透到樣品吸收墊一段，并在試紙上進行層析的速度十分緩慢，導致檢測樣品中的藥物不能夠與檢測線上包被的包被原充分接觸，致使試紙卡的靈敏度下降。本實用新型試紙條比傳統試紙卡的檢測靈敏度高，由于本實用新型試紙條的試紙為裸條狀，無需殼體緊固裝置，檢測樣品可以直接接觸試紙的樣品吸收墊一端，并且樣品在試紙上的層析速度比較快，使樣品中的待檢藥物能夠充分的與檢測線上包被的包被原結合，從而提高了試紙條的檢測靈敏度。大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素檢測試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金對單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。其中的大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標記物凍干在微孔試劑條中，在檢測過程中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應，從而減少誤差，增加整個體系的反應靈敏度。因此，本實用新型試紙條具有較高的特異性和靈敏度。本試紙條對大觀霉素檢測靈敏度為:20 μ g/L ;對鏈霉素檢測靈敏度為:80 μ g/L ;對慶大霉素檢測靈敏度為:20μ g/L ;對新霉素檢測靈敏度為:500 μ g/L。2.操作簡便快速:對于以往的試紙卡檢測原料奶必須要將原料奶加入稀釋液進行稀釋才能夠點樣檢測，原因是由于固定試紙的塑料殼體緊緊地把試紙固定在殼體內，而原料奶比較粘稠，所以直接將原料奶在試紙卡的加樣孔進行點樣檢測的話，由于殼體與試紙條結合緊密以及奶液粘稠所致，原料奶樣品無法完全滲透到樣品吸收墊和結合物釋放墊中，并且在試紙上的層析速度比較緩慢，以至于無法檢測，故要將原料奶加入稀釋液進行稀釋后方可檢測。使用本實用新型試紙條檢測時無需任何其它試劑，檢測原料奶時，也不需要對原料奶進行稀釋，原因由于本實用新型試紙條中的試紙為裸條狀，即無需用殼體對其進行固定，只要將待檢樣品溶液直接滴加于凍干有大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標記物的微孔中，混勻后，孵育5min，再將試紙標有MAX線標記端向下，插入孵育后的微孔試劑中，試紙可以與樣品溶液充分接觸，5min后觀察結果。對于牛奶樣品的檢測，本實用新型試紙條比傳統試紙卡檢測時間短，由于本實用新型試紙條無需對樣品進行稀釋，可直接對樣品進行檢測。3.顯示檢測結果形象、直觀準確。檢測結果的判定是以試紙條的四條檢測線和一條質控線是否顯色作為陰性和陽性判斷標準。如果反應膜上的大觀霉素檢測線顯示一條紅色條帶，鏈霉素檢測線顯示一條紅色條帶，慶大霉素檢測線顯示一條紅色條帶，新霉素檢測線也顯示一條紅色條帶，同時質控線也顯示一條紅色條帶，表示樣品中大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素均分別低于試紙條對大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的最低檢測限；如果反應膜上鏈霉素、慶大霉素、新霉素的檢測線顯示紅色條帶，同時質控線也顯示一條紅色條帶，而大觀霉素檢測線不顯色，表示檢測樣品中只有大觀霉素含量等于或高于試紙條對大觀霉素的低檢測限；如果反應膜上大觀霉素、慶大霉素、新霉素的檢測線顯示紅色條帶，同時質控線也顯示一條紅色條帶，而鏈霉素檢測線不顯色，表示檢測樣品中只有鏈霉素含量等于或高于試紙條對鏈霉素的低檢測限；如果反應膜上大觀霉素、鏈霉素、新霉素的檢測線顯示紅色條帶，同時質控線也顯示一條紅色條帶，而慶大霉素檢測線不顯色，表示檢測樣品中只有慶大霉素含量等于或高于試紙條對慶大霉素的低檢測限；如果反應膜上大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素的檢測線顯示紅色條帶，同時質控線也顯示一條紅色條帶，而新霉素檢測線不顯色，表示檢測樣品中只有新霉素含量等于或高于試紙條對新霉素的低檢測限；如果反應膜上只有質控線顯示紅色條帶，而大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素檢測線均不顯示紅色條帶，表示檢測樣品中的大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的含量同時等于或高于試紙條對大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的最低檢測限；如果反應膜上的質控線沒有顯示紅色條帶，無論大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和(或)新霉素檢測線是否顯示紅色條帶，試紙條檢測結果均視為無效。結果判定形象、直觀、準確、簡單明了，不容易出現結果誤判。4.成本低，投資少:使用本實用新型試紙條，不需另配儀器設備及其他試劑，也不需要固定試紙條的卡殼固定裝置，成本低廉，投資少，見效快，使現場檢測一步到位。[0016]5.易于大范圍推廣應用:試紙條操作簡單，能較好滿足不同層次人員的需要，如
專業化驗、衛生防疫、質量監測、乳業企業等，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效.、/■
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圖1為本實用新型試紙結構剖面圖；圖2為本實用新型試紙俯視圖；圖3為本實用新型凍干有金標抗體的微孔條；圖4為本實用新型微孔塞俯視圖5為本實用新型微孔塞側視圖；圖6為本實用新型試紙條檢測結果判定圖；圖7為本實用新型試劑桶結構示意圖；圖8為本實用新型固定用具的俯視圖；圖9為本實用新型盒體與固定用具的側視圖。
具體實施方式
一、大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素檢測試紙條的組裝制備I)試紙樣品吸收墊1、反應膜2、吸水墊3和保護膜7依次按順序黏貼在所述底板6上，樣品吸收墊的末端與反應膜始端相連，反應膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，保護膜7覆蓋在樣品吸收墊的檢測端，在檢測端保護膜上印有MAX標記線。反應膜上的四條檢測線和一條質控線互相平行，并且與試紙的長相垂直。檢測線4-1即為檢測線(Tl)，靠近樣品吸收墊一端，質控線5即為質控線(C)，靠近吸水墊一端，檢測線4-2即為檢測線(T2)，檢測線4-3即為檢測線(T3)，檢測線4-4即為檢測線(T4)，在檢測線(T)和質控線(C)之間。質控線(C)距離反應膜的末端與吸水墊相連的一端為5-8mm，檢測線(T4)距離質控線(C) 4_6mm，檢測線(T3)距離檢測線(T4)4-6mm,檢測線(T2 )距離檢測線(T3 ) 4_6mm，檢測線(TI)距離檢測線(T2 ) 4_6mm。檢測線(Tl)包被有大觀霉素-載體蛋白偶聯物，檢測線(T2)包被有鏈霉素-載體蛋白偶聯物，檢測線(T3)包被有慶大霉素-載體蛋白偶聯物，檢測線(T4)包被有新霉素-載體蛋白偶聯物，質控線(C )包被有羊抗鼠抗抗體。底板為PVC底板，樣品吸收墊為吸濾紙，反應膜為硝酸纖維素膜，吸水墊為吸水紙，保護膜為PE材質保護膜。2)凍干有金標抗體的微孔條所述微孔條8的底部凍干有大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標記物，即金標抗體9。微孔條8具有微孔塞10。3)將I)試紙條和2)微孔條裝入具有密封塞的試劑桶11中，將試劑桶放置于試紙條盒體13內的固定用具12中。二、試紙條的使用[0034]取待檢牛奶樣品溶液滴加200 μ I到微孔試劑中，混勻后，孵育5min，將試紙標有MAX線標記端向下，插入鮮育后的微孔試劑后計時，5min后觀察結果。三、檢測結果分析陰性(_):C線顯色，四條T線均顯色，無論顏色深淺，均表示牛奶樣本中大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素濃度均低于檢測限，如圖6.a所示。陽性(+ ):C線顯色，T1線不顯色，表示牛奶樣本中大觀霉素濃度等于或高于檢測限；(:線顯色，T2線不顯色，表示牛奶樣本中鏈霉素濃度等于或高于檢測限；C線顯色，T3線不顯色，表示牛奶樣本中慶大霉素濃度等于或高于檢測限； C線顯色，T4線不顯色，表示牛奶樣本中新霉素濃度等于或高于檢測限，如圖6.a-6.f所示。無效:未出現C線，表明不正確的操作過程或試紙條已失效，如圖6.g-6.k所示。四、檢測試紙條中用到的材料制備方法如下:1、抗原的制備 I)、大觀霉素-載體蛋白偶聯物的合成與鑒定a.大觀霉素半抗原合成:取大觀霉素0.66 g、羧甲基輕胺0.27 g和卩比唳I ml于20 ml DMSO中的混合液，在室溫下攪拌反應20小時，蒸除溶劑，柱層析純化后在乙醇-水體系中重結晶得到大觀霉素與羧甲基羥胺的縮合物，分子結構如下:
權利要求1.一種檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的試紙條，其特征在于包括試紙、微孔條、微孔試劑和微孔塞，所述試紙包括反應膜、樣品吸收墊、吸水墊、保護膜、底板，所述反應膜上有四條檢測線和包被羊抗鼠抗抗體的一條質控線，四條檢測線分別包被有大觀霉素-載體蛋白偶聯物、鏈霉素-載體蛋白偶聯物、慶大霉素-載體蛋白偶聯物和新霉素-載體蛋白偶聯物，所述微孔試劑為凍干的大觀霉素-膠體金標記物、鏈霉素-膠體金標記物、慶大霉素-膠體金標記物和新霉素-膠體金標記物。
2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于所述反應膜上的四條檢測線和一條質控線互相平行，并且與試紙條的長相垂直。
3.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于所述的大觀霉素檢測線靠近樣品吸收墊一端，質控線靠近吸水墊一端，鏈霉素檢測線、慶大霉素檢測線和新霉素檢測線在大觀霉素檢測線和質控線之間。
4.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于所述試紙由樣品吸收墊、反應膜、吸水墊、保護膜依次黏貼在底板上組成。
5.根據權利要求1或4所述的試紙條，其特征在于:所述保護膜粘貼樣品吸收墊上的檢測端，上面有MAX標記線。
6.根據權利要求1所述試紙條，其特征在于所述微孔條上具有微孔塞。
7.根據權利要求1所述試紙條，其特征在于所述試紙條還包括用于盛裝試紙和凍干有大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔條的試劑桶和固定試劑桶的固定用具。
8.根據權利要求7所述的試紙條，其特征在于所述試劑桶上具有密封蓋。
9.根據權利要求7所述的試紙條，其特征在于所述試紙條盒體為硬紙盒，試劑桶為塑料試劑桶，固定用具為硬質支撐材料。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條。試紙條包括微孔條、微孔試劑、試紙條和微孔塞，所述試紙由樣品吸收墊、反應膜、吸水墊、保護膜、底板依次連接組成，所述反應膜上包括四條檢測線和一條質控線，四條檢測線分別包被有大觀霉素-載體蛋白偶聯物、鏈霉素-載體蛋白偶聯物、慶大霉素-載體蛋白偶聯物和新霉素-載體蛋白偶聯物，質控線包被有羊抗鼠抗抗體。用本實用新型試紙條檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的方法，簡便、快速、直觀、準確、便于攜帶、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。
文檔編號G01N33/577GK203069593SQ20122051020
公開日2013年7月17日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者萬宇平, 羅曉琴, 劉葉, 聶雯瑩, 楊秀賢, 郝士元, 陳娟, 韓京朋 申請人:北京勤邦生物技術有限公司