專利名稱：一種龍血素a酶聯免疫檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及免疫檢測領域，特別是涉及一種檢測龍血素A的試劑盒。
背景技術：
龍血素A(4’ -羥基_2，4，- 二甲氧基二氫查耳酮)是傳統藥物龍血竭的有效成分之一。龍血竭被譽為“活血圣藥”，它是由百合科植物劍葉龍血樹(Dranaenacochinachinensis (Lour.) S.C.Chen)的含脂木材經提取得到的樹脂,在臨床上主要有活血散瘀，定痛止血，斂瘡生肌等功效。有研究認為龍血素A有血小板聚集抑制作用、抗真菌等活性。目前市場上龍血竭的質量參差不齊，有的混入其他樹脂，傳統的鑒定方法主要靠有經驗人員的主觀判斷，現代藥品標準中的檢測方法采用薄層色譜法、分光光度法等，處理繁瑣。所以急需一種能有效便捷地檢測龍血竭質量的方法。用龍血竭的主要有效成分龍血素A可作為龍血竭的質量判斷標準。目前對龍血素A的檢測主要采用高效液相色譜法。酶聯免疫檢測法具有高通量、快速、靈敏的特點，且廣泛用于醫學檢驗，技術成熟，在中藥材的品質鑒定方面也有大量的應用。龍血素A的酶聯免疫檢測方法還未見報道，研制龍血素A的酶聯免疫檢測試劑盒有重要意義。現代化的檢測診斷手段越來越多地應用于科研和臨床，現今藥物濃度檢測產品多是針對西藥，我國傳統藥物現代化研究中迫切需要現代化的靈敏便捷的檢測手段和產品。
實用新型內容本實用新型提供一種龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒，試劑盒外殼內含有盒內支架和固定有龍血素A的酶標板，固定有龍血素A的酶標板放置在盒內支架上。龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒的盒內支架中有插槽，插槽中放置的試劑瓶分別為樣品稀釋液瓶、龍血素A多克隆抗體溶液瓶、酶標記抗體溶液瓶、底物液瓶、終止液瓶、濃縮洗滌液瓶、龍血素A標準品瓶。這樣設計便于試劑存放、運輸及在檢測中使用。龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒中的酶標板反應孔內包被固定有龍血素A與載體蛋白分子偶聯物。載體蛋白為雞卵清白蛋白、牛血清白蛋白或血藍蛋白。龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒可用于檢測樣品中龍血素A的濃度。本試劑盒采用間接競爭酶聯免疫法檢測樣品中龍血素A的濃度。檢測時，向試劑盒中的酶標板孔中加入樣品溶液和龍血素A多克隆抗體溶液，反應后洗滌，加入酶標記抗體溶液，反應后再次洗滌，加入底物液顯色，用終止液終止反應后用酶標儀測定吸光度。待測樣品中的龍血素A濃度與吸光度值呈負相關，用用四參數Logistic方程擬合標準曲線，樣品吸光度與標準曲線比較得出龍血素A的濃度。龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒檢測的樣品是含有龍血素A的溶液或是血液樣品。本試劑盒用于檢測龍血竭樣品，通過比較待測龍血竭與合格龍血竭中龍血素A的含量來判斷龍血竭質量。
[0011]圖1.本實用新型龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒內部俯視示意圖其中1-試劑盒外殼，2-盒內支架，3-固定有龍血素A的酶標板，4 10為支架上的插槽，插槽中各試劑瓶分別盛裝液體為:樣品稀釋液、龍血素A多克隆抗體溶液、酶標記抗體溶液、底物液、終止液、濃縮洗滌液、龍血素A標準品。
具體實施方式
如圖1所示，本實用新型提供一種龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒，包含外殼1、插有試劑瓶的支架2、固定有龍血素A的酶標板3。使用支架放置各試劑瓶，便于試劑盒的存放、運輸和使用。其中試劑瓶盛裝的液體分別為:樣品稀釋液、龍血素A多克隆抗體溶液、酶標記抗體溶液、底物液、終止液、濃縮洗滌液、龍血素A標準品。這些試劑在檢測中使用。龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒中的酶標板反應孔內包被有龍血素A與載體蛋白分子偶聯物。實施例1.試劑盒各組分的制備和試劑盒成品的組裝1.1樣品稀釋液含0.15M NaCl 和 0.005% 吐溫-20°C 的 0.1M 的磷酸鹽緩沖液，PH7.4。1.2龍血素A包被原制備取龍血素A9.4mg，溶于Iml 二甲亞砜，并加入適量的Κ0Η，再加入30mg溴乙酸，在室溫反應4h，用G5砂芯漏斗抽濾，棄濾液，用乙醇洗下沉淀物，真空干燥得到半抗原。取
2.48mg半抗原溶于0.08ml的N, N- 二甲基甲酰胺(DMF),然后將1.08mg的N, N- 二環己基碳二亞胺(DCC)和0.6mg的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)分別溶于0.03ml的DMF中，并在攪拌條件下依次逐滴滴加到半抗原溶液中，于室溫下密閉攪拌4h，4°C冰箱過夜。次日4000r/min離心IOmin取上清——活性酯液待用。稱取雞卵清白蛋白OVAlOmg，溶于2mL0.05MPH8.0PBS,取活性酯液，冰浴下逐滴滴加到BSA溶液中，室溫反應2h，于4°C冰箱緩慢攪拌反應過夜。TLC跟蹤觀察反應。將反應液裝入透析袋，于4°C下，pH7.4，0.0lM的PBS中透析3天，紫外掃描透析外液中無半抗原紫外吸收為止或紫外下觀察顯色。取出透析袋內溶液，分裝，_20°C保存，得龍血素A-OVA偶聯物，即龍血素A包被原。1.3龍血素A包被酶標板制備用0.05M碳酸鹽緩沖液(PH9.6)將龍血素A包被原稀釋到4 μ g/ml，加入酶標板孔中，100 μ L/孔，2-8°C冷藏過夜，倒掉包被液，用洗滌液清洗3次。每孔加入封閉液(含1%脫脂奶粉的PBS溶液)120 μ L，37°C孵育2小時，倒掉封閉液，拍干，于30°C干燥3_4小時，
鋁箔袋真空包裝。1.4龍血素A多克隆抗體溶液制備使用1.2中方法把OVA替換為BSA合成龍血素A-BSA偶聯物作為免疫原，取6_7周齡的Balb/C小白鼠進行免疫。基礎免疫使用等量弗氏完全佐劑與龍血素A-BSA偶聯物乳化，每只背部皮下注射龍血素A-BSA偶聯物0.025mg,加強免疫采用弗氏不完全佐劑乳化免疫原，每隔2周進行加強免疫，三免后第10天小鼠眼眶采血，分離出抗血清，其中含有龍血素A多克隆抗體，用樣品稀釋液稀釋1000倍使用。1.5酶標記抗體溶液使用天津三箭生物技術有限公司生產的HRP標記羊抗小鼠IgG，用含0.1 % OVA的
0.1M的磷酸鹽緩沖液(PH = 7.4)稀釋4000倍。[0025]1.6終止液為2mol/L的硫酸溶液。1.7濃縮洗滌液含0.5%吐溫-20的0.2M的磷酸鹽緩沖液，PH = 7.4。1.8龍血素A標準品用樣品稀釋液稀釋的龍血素A溶液。1.9底物液購自鄭州博威嘉生物科技有限公司。1.10試劑盒組裝取固定有龍血素A的酶標板、樣品稀釋液、龍血素A多克隆抗體溶液、酶標記抗體溶液、底物液、終止液、濃縮洗滌液、龍血素A標準品各一個插在盒內支架插槽中，包上外殼，即組成一個龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒。實施例2檢測藥品中龍血素A含量用樣品稀釋液稀釋樣品，向試劑盒中的酶標板孔中加入樣品溶液50 μ L/孔和龍血素A多克隆抗體溶液50 μ L/孔，37°C反應30min后洗滌，加入酶標記抗體溶液100 μ L/孔，反應后再次洗滌，加入底物液100 μ L/孔避光顯色lOmin，加終止液100 μ L/孔終止反應后用酶標儀測定吸光度(雙波長測定用0D450nm減去0D630nm作為吸光度)。每次反應用樣品稀釋液將標準品稀釋成10 μ g/ml、I μ g/ml、0.1 μ g/ml、0.01 μ g/ml、0 μ g/ml的系列標準品加入酶標板與樣品同時反應。待測樣品中的龍血素A濃度與吸光度值呈負相關，用標準品吸光度和標準品濃度用四參數Logistic方程擬合標準曲線，代入待測樣品吸光度值即可求出龍血素A的濃度。實施例3鑒定龍血竭質量用樣品稀釋液將待測龍血竭和合格龍血竭按相同稀釋度稀釋后作為樣品檢測其龍血素A含量，如待測龍血竭含量中龍血素A含量低于合格龍血竭中龍血素A含量的50 %，可判斷該待測龍血竭質量不佳。
權利要求1.龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒，其特征是:試劑盒外殼內含有盒內支架和固定有龍血素A的酶標板,固定有龍血素A的酶標板放置在盒內支架上。
2.根據權利要求1所述的龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒，其特征是:所述盒內支架中有插槽，插槽中放置的試劑瓶分別為樣品稀釋液瓶、龍血素A多克隆抗體溶液瓶、酶標記抗體溶液瓶、底物液瓶、終止液瓶、濃縮洗滌液瓶、龍血素A標準品瓶。
專利摘要本實用新型提供一種龍血素A酶聯免疫檢測試劑盒，涉及免疫檢測領域。其包含外殼、固定有龍血素A的酶標板、盒內支架。酶標板反應孔內固定有龍血素A與載體蛋白分子偶聯物。采用間接競爭酶聯免疫法檢測樣品中龍血素A的濃度。待測樣品中的龍血素A濃度與檢測吸光度值呈負相關，用標準品濃度及其吸光度擬合標準曲線，樣品吸光度與標準曲線比較得出樣品中龍血素A的濃度。
文檔編號G01N33/543GK203069589SQ20122049582
公開日2013年7月17日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者劉向明, 沈洲, 陳素, 雷麗云, 李羽欣, 龍蓉, 米雪 申請人:中南民族大學