專利名稱：一種檢測水產品中呋喃它酮代謝物的膠體金試劑板的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及ー種檢測水產品中呋喃它酮代謝物的膠體金試劑板，具體涉及ー種檢測呋它酮代謝物的免疫膠體金快速檢測試劑板。
背景技術：
呋喃它酮是ー種硝基呋喃類藥物，具有非常好的抗菌作用，在臨床上主要用于雞白痢、雞大腸桿菌病、雞球蟲病等各種腸道感染性疾病的治療及用作豬、禽類和水產促生長 的添加剤。但有關研究證明，呋喃它酮及其代謝物具有相當大的毒性和副作用，能誘導有機體基因突變及致畸胎，且能誘發癌癥。歐盟早在1990年就頒布2377/90/EEC條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝物列為A類禁用藥，規定其在動物源性食品中的最高殘留量為l.Oyg/kg。1995年起歐盟、日本、美國等開始禁止這類抗菌劑在食用的畜禽及水產動物中使用，并嚴格執行對輸入的食用魚、蝦及禽類進行殘留檢測。中國農業部2002年2月發布‘食品動物禁用的獸藥及其他化合物清単》中，明文禁止在所有食品動物的所有用途中使用硝基呋喃類藥物。但是，由于其價格便宜，藥效好，在很多國家還在繼續違規使用。為了保障人民健康及擴大與世界各國動物源性食品貿易往來，必須對動物源性食品中呋喃它酮進行檢測.由于呋喃它酮在體內很快就能被代謝，而在組織中結合的代謝產物(AMOZ)則能存留較長的一段時間，所以藥殘監測部門經常以檢測其代謝產物一 AMOZ為手段達到檢測呋喃它酮殘留的目的。目前，呋喃它酮代謝物(AMOZ)檢測方法主要有微生物法、色譜法、免疫分析法等。微生物法是測定抗生素殘留的經典方法，具有前處理簡單、經濟、批量大等優點，但精確度、準確度和特異性不高。色譜法應用較普遍，精確度和靈敏度高，但因其流程繁瑣、設備昂貴、檢測速度慢等原因，很難實現現場檢測和普及推廣。酶聯免疫檢測法的基礎是抗原抗體反應，該法精確、靈敏，檢測時間大大縮短，但是ELISA法中酶的活性易受反應條件影響，由此易造成測定結果重復性較差。此外ELISA試劑壽命短，因此需要低溫保藏。基于抗原抗體特異性反應建立起來的免疫學測定方法靈敏度較高，特異性強，試樣預處理簡単，分析時間短，使用方便。因此，在現場監控和基層的大規模篩選檢測中，免疫學檢測方法更實際。膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術的基礎上建立的一種簡易快速的免疫學檢測技術，除了具備酶聯免疫法的諸多優點外，還克服了酶聯免疫法的ー些不足。該方法將反應所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，反應通常只需數分鐘，測試結果以肉眼可見的顯色條帶來判斷。具有簡便快速、操作簡單、特異性強、不需要額外設備等優點。
實用新型內容本實用新型針對檢測需求，研制開發ー種檢測限符合要求，重現性好，檢測時間短，適合現場快速檢測，技術產品或儀器設備成本較低，運行費用低的快速檢測試劑。本實用新型試劑板應用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標抗體反應顯色，特異性檢測水產樣品中的呋喃它酮代謝物殘留水平。檢測樣品包括魚、蝦等水產品。如果樣品溶液中含有呋喃它酮代謝物殘留，呋喃它酮代謝物先和膠體金顆粒上的抗體反應，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的呋喃它酮代謝物藥物占據而無法與檢測線上呋喃它酮代謝物特異性抗原結合；當樣品中的呋喃它酮代謝物含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性。反之，當樣品中呋喃它酮代謝物含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有1_2_的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進行。膠體金結合墊上包被有抗呋喃它酮代謝物單克隆抗體與膠體金的結合物；硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有呋喃它酮代謝物-載體蛋白偶聯物和羊抗鼠 IgG，分別作為檢測線和控制線。偶聯呋喃它酮代謝物的載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血監蛋白等。本實用新型試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標示各功能區(加樣孔、檢測區、控制區)的作用。背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液pH值的作用。膠體金結合墊，由聚酯膜制成，其上有抗呋喃它酮代謝物單克隆抗體與膠體金顆粒的結合物，為樣品溶液中有效成分和金標抗體反應提供場所。硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊，由濾紙制成，將反應過程中多余的溶液吸收。本實用新型試劑板具有如下有益效果(I)特異性好。本實用新型試劑板對呋喃它酮代謝物的交叉反應率為100%，對如呋喃唑酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物等抗生素的交叉反應率均低于I %。可見，本實用新型試劑板對呋喃它酮代謝物反應具有高度專ー性。(2)靈敏度高。本實用新型試劑板對水產品中呋喃它酮代謝物的檢出限為I. ομ g/kg，在水產品中對呋喃它酮代謝物的檢測達到了較優水平，適用于各類企業及檢測機構。(3)操作簡單快捷。本實用新型試劑板將反應所需的大部分原料整合到PVC背襯中，滴樣后，抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮短檢樣時間，且樣品無需特殊處理，滴樣后5-10分鐘即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和控制線的顔色深淺讀取結果。檢測實施過程不依賴任何實驗設備，普通人員均可操作，不需專業培訓。(4)成本低，易推廣。本實用新型試劑板生產エ藝簡單,流程成熟。生產成本低廉，投資少，收效快。
[0022]圖I為呋喃它酮代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板背襯結構示意圖，其中I為樣品墊，2為膠體金結合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為控制線，6為吸水墊，7為不干膠，8為PVC底板。圖2為呋喃它酮代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制區，T為檢測區。圖3為呋喃它酮代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板結果判定示意圖，其中C為控制區，T為檢測區。具體實施方法本實用新型試劑板的制備包括載體蛋白偶聯物的制備，抗呋喃它酮代謝物單克隆抗體的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標記抗呋喃它酮代謝物單克隆抗體的制備和呋喃 它酮代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝。I.半抗原與載體蛋白的偶聯呋喃它酮代謝物對醛基苯甲酸衍生物合成稱取3g對醛基苯甲酸于IOmL蒸餾水中，滴加ニ甲基甲酰胺(DMF)至對醛基苯甲酸完全溶解，攪拌中加入I. Og呋喃它酮代謝物，室溫反應2h，過濾水洗得白色固體即為呋喃它酮代謝物對醛基苯甲酸衍生物。呋喃它酮代謝物對醛基苯甲酸衍生物-牛血清蛋白(BSA)的合成稱取23. 4mg呋喃它酮代謝物對醛基苯甲酸衍生物溶于2mLDMF，攪拌加入27. 5mg的DCC，14. 4mg的NHS, 4 °C反應過夜,5000r/min離心IOmin,取上清液標記為A液。取170mg的BSA溶于IOmLO. lmol/L的PBS (pH 8. O)緩沖溶液，加入ImL的DMF溶解，標記為B液。將A液逐滴加入到B液中，同時攪拌。4°C下密封反應4h。5000r/min下離心IOmin,取上清液,4°C下PBS (pH 7. 4)透析3d，每天換液2次。反應產物_20°C冰箱保存備用。用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同樣方法制備呋喃它酮代謝物對醛基苯甲酸衍生物-卵清蛋白偶聯物。2.抗呋喃它酮代謝物單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的BSA偶聯物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強免疫I次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強化免疫I次，不用佐劑，劑量加倍。細胞融合按常規方法進行將Sp2/0多發性骨髄瘤細胞與免疫脾細胞按I : 10的比例混合，在50%聚こニ醇作用下融合，HAT培養基懸浮，分種于96孔培養板中，37°C, 5% CO2培養箱中培養。融合后，待細胞生長到培養孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初篩選擇10mg/L BSA包被酶聯板，被測孔加培養上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRPd iooo)，oro顯色。篩選出的陽性孔再用卵清蛋白偶聯物包被的酶聯板進行阻斷間接ELISA。將細胞培養上清與2X 10_3mol/L呋喃它酮代謝物溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶標板中。另外用PBS(O. 01mol/L、pH7. 4)替代呋喃它酮代謝物溶液作對照，其余步驟同上。若呋喃它酮代謝物阻斷后的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經2 3次檢測都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進行克隆化。體外培養將克隆化的細胞株擴大培養，細胞濃度達5 X 105/mL時停止換液，細胞全部死亡后收集培養液。體內誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細胞株107個細胞，7天后抽取腹水。[0035]3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1%檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 1%氯金酸，繼續煮沸lOmin，冷卻后，4°C下保存備用。4.膠體金標記抗呋喃它酮代謝物單克隆抗體的制備取已制備好的IOOmL膠體金溶液，用O. lmol/L碳酸鉀溶液調pH到8.0。邊攪拌邊加入I. 5mg抗呋喃它酮代謝物單抗,攪拌20min,再逐滴加入2mL 25mol/L聚こニ醇20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20，OOOrpm 離心 15min，棄上清液，加入 IOmL pH 7. 4PBS 緩沖液(含O. 4mol/LPEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4)溶解，用O. 22 μ m無菌過濾器過濾后,4°C保存備用。5.呋喃它酮代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝參照圖1，用點膜機把適當濃度的載體蛋白偶聯物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，37°C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標記呋喃它酮代謝物單克隆抗體包被在膠體金結合墊上。檢測試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用切割機將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.呋喃它酮代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施操作方法6. I樣品制備取一定量的去脂肪組織樣本，用剪刀剪碎，稱取2g剪碎樣本于50mL離心管中，并加入4mL去離子水,O. 5mL lmol/L的鹽酸,O. ImL樣本衍生化試劑,充分混合3min ;60°C水浴條件下孵育lh，取出后加入5mL0. lmol/L的磷酸氫ニ鉀，O. 4mL lmol/L的氫氧化鈉，6mL提取劑，充分混合lmin,4000r/min,離心5min,移取上層溶液3mL于5mL離心管中，60°C下空氣吹干，向吹干的試管中加入ImL凈化劑，加蓋振蕩lmin，然后加入0. 3mL復溶液，充分混勻，4000r/min,離心Imin (或靜置至明顯分層)，吸取0. I μ L下層溶液,待檢。6. 2檢測步驟從包裝袋中取出試劑板，吸取待檢樣品溶液100 μ L滴加到加樣孔中，加樣后開始計時；結果應在3 5min讀取，其他時間判讀無效。觀察時，試劑板水平放置于觀察者正面。6. 3結果判讀讀取結果時，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側所示。陰性(-)T線顯色比C線深或一祥深，表示樣品中呋喃它酮代謝物殘留含量低于
I.O μ g/kg或不含呋喃它酮代謝物殘留。如圖3. a所示。陽性⑴T線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中呋喃它酮代謝物殘留含量高于I. O μ g/kg ;T線顯色比C線越淺，表示樣品中呋喃它酮代謝物殘留含量越高。如圖3. b所示。無效未出現C線，可能是操作不當或試劑板已失效。應再次閱讀說明書，并用新的試劑板重新測試。如圖3. c所示。
權利要求1.一種檢測水產品中呋喃它酮代謝物的膠體金試劑板，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，試劑板背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有l-2mm的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進行。
2.如權利要求I所說的試劑板，其特征在于試劑板的硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。
3.如權利要求I所說的試劑板，其特征在于膠體金顆粒的平均大小為30nm。
4.如權利要求I所說的試劑板，其特征在干，樣品墊由玻璃纖維制成，膠體金結合墊由聚酯膜制成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測水產品中呋喃它酮代謝物的膠體金試劑板，可用于檢測水產品中的呋喃它酮代謝物殘留。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，可將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。該試劑板可進行半定量直觀檢測，整個操作過程僅需2小時左右，且無需任何昂貴實驗設備輔助，利于大規模樣本篩選，適合檢驗檢疫機構、海洋與漁業局、水產質量檢測部門等對水產品中非法使用呋喃它酮藥物進行大規模快速檢測。
文檔編號G01N33/577GK202649214SQ20122030201
公開日2013年1月2日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者朱曉華, 耿雪冰, 張素青, 張宣偉 申請人:杭州南開日新生物技術有限公司