專利名稱：一種黃曲霉毒素b1的免疫學檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及動物性食品安全和畜牧業生產中毒素殘留檢測的試劑盒，特別是一種用于檢測動物性食品和飼料生產中黃曲霉毒素BI的免疫學檢測試劑盒。
背景技術：
黃曲霉毒素是一類真菌(如黃曲霉 和寄生曲霉)的有毒代謝產物，它們具有很強的致癌性，主要存在于谷物、堅果、棉籽以及一些和人類血液、動物飼料相關的產品中。黃曲霉毒素(AFT)目前已發現20余種，其中黃曲霉毒素BI (AFBl)的毒性、致癌性、污染頻率均居于首位。黃曲霉毒素Ml是黃曲霉毒素BI的羥基化代謝產物，也是一種強致癌物質。當哺乳動物攝入黃曲霉毒素BI污染的飼料后，在體內經羥基化會將黃曲霉毒素Ml分泌于乳汁當中，奶牛經攝入黃曲霉毒素BI污染的飼料后產出的牛奶中便含有黃曲霉毒素Ml。由于黃曲霉毒素Ml相當穩定，巴氏滅菌法也無法將其消除，所以檢測黃曲霉毒素Ml不僅要檢測動物飼料原料，而且要檢測最終產品。為此世界各國都規定了牛乳及其制品中黃曲霉毒素Ml的最大允許含量并將其作為強制性標準，如中國政府規定牛乳及其制品(消毒牛奶、新鮮生牛乳、全脂牛奶粉、奶油等)中黃曲霉毒素Ml的最聞允許含量為O. 5ng/ml。現有技術中常用的黃曲霉毒素殘留檢測主要有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和免疫學分析法等。采用理化分析方法雖然是一種較理想的藥物殘留分析方法，但黃曲霉毒素BI分子中沒有紫外發光團和熒光團，在化學分析中需要將它轉變為具有紫外發光團或熒光團的衍生物才能進行分析，這給檢測工作帶來了極大困難，而且具有樣品前處理步驟繁瑣，耗時費力，儀器價格昂貴，需要專業人員操作等缺點。免疫學分析法具有特異性強、樣品前處理簡單、成本低、能進行批量檢測等優點。ELISA檢測是常用的免疫學分析方法，但國內用于藥物殘留檢測的研究較少，用于檢測黃曲霉毒素BI的ELISA試劑盒更是一項空白。
發明內容本實用新型的目的是提供了一種小巧輕便的黃曲霉毒素BI的免疫學檢測試劑盒，使用該試劑盒操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩定性好，可進行一次連續多個樣品中黃曲霉毒素BI的檢測。本實用新型的技術方案是一種黃曲霉毒素BI的免疫學檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于盒體內包含有酶標板、蓋板膜、14瓶試劑和具有下凹瓶位的模具，所述的酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應微孔條組成，酶標板采用96孔試劑板作為固相載體，微孔條上預包被黃曲霉毒素BI偶聯抗原后固定于酶標板的外框支撐架上，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔；所述的蓋板膜大小與酶標板一致；所述的模具上的下凹瓶位分別為標準液瓶位、高濃度標準液瓶位、酶標二抗工作液瓶位、黃曲霉毒素BI抗體瓶位、顯色液A液瓶位、顯色液B液瓶位、終止液瓶位、濃縮洗滌液瓶位、濃縮樣品稀釋液瓶位。所述的盒體是硬紙盒；所述的酶標板由聚苯乙烯制成，放于真空鋁鉬袋內；所述的蓋板膜是透明塑料硬膜，放于鋁鉬袋內；所述的14瓶試劑分別為6瓶標準液、I瓶高濃度標準液、I瓶酶標二抗工作液、I瓶黃曲霉毒素BI抗體、I瓶顯色液A液、I瓶顯色液B液、I瓶終止液、I瓶濃縮洗滌液、I瓶濃縮樣品稀釋液，標準液均用白色瓶帽的乳白色塑料瓶盛裝，酶標二抗工作液用紅色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，黃曲霉毒素BI抗體用黃色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，顯色劑A液用黑色瓶帽的黑色塑料瓶盛裝，顯色劑B液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，終止液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，濃縮洗滌液和樣品稀釋液用白色瓶帽的半透明塑料瓶盛裝；所述的模具由塑料泡沫制成，具有14個下凹瓶位，14個試劑瓶依次放入對應下凹瓶位內。所述的6瓶標準液,均為lml/瓶,濃度分別為0ng/ml,0. 02ng/ml,0. 06ng/ml,O. lng/ml,0. 3ng/ml,0. 8ng/ml ;高濃度標準品溶液I瓶，lml/瓶；酶標二抗工作液I瓶，6ml/瓶；黃曲霉毒素BI抗體工作液I瓶，6ml/瓶；顯色液A液I瓶，7ml/瓶；顯色液B液I瓶，7ml/瓶；終止液I瓶，7ml/瓶；濃縮洗滌液(IOX) I瓶，40 ml/瓶；濃縮樣品稀釋液(2X) I 瓶，40 ml/瓶。本實用新型用不同大小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與酶標板、蓋板膜、自封袋、說明書和質控報告一同封裝在硬紙盒內，以便于攜帶和運輸。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96份測定(包括標準分析孔)，即可進行一次連續多個樣品 的檢測，也可將酶標板微孔條拆開進行多次使用。此時，將剩下的微孔條放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結果的準確性和穩定性。檢測時，樣本中的殘留物黃曲霉毒素BI將和微孔條上預包被的黃曲霉毒素BI偶聯抗原竟爭抗黃曲霉毒素BI抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素BI的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物黃曲霉毒素BI的含量，其操作簡便易行。經實驗表明本試劑盒具有很聞的靈敏度最低檢測限為O. 02ng/ml,回收率花生、玉米等谷物類為90± 15%、飼料樣品為85± 15%、食用油為90± 15%、鮮奶類及其制品為92±15%，且試劑盒的變異系數均小于10%。相對于其他檢測黃曲霉毒素BI殘留的方法，本試劑盒所需要的儀器較少，只需要酶標儀、勻質器、振蕩機和微量加樣器，同類實驗室一般均有配備，操作簡單易行，所需成本較低。本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準確地用于動物源性食品中黃曲霉毒素BI殘留的定量、定性檢測。
圖I是本實用新型中酶標板的主視圖；圖2是圖I中沿A-A的縱向剖視圖；圖3是本實用新型蓋板膜的主視圖；圖4是本實用新型中試劑瓶的主視圖；圖5是本實用新型中具有下凹瓶位模具的結構示意圖；圖6是本實用新型中放入下凹瓶位模具盒體的結構示意圖。圖面說明1、支撐架；2、微孔條；3、黃曲霉毒素BI偶聯抗原；4、蓋板膜；5、白色瓶帽；6、半透明塑料試劑瓶；7、黃色瓶帽或紅色瓶帽；8、黑色瓶帽；9、黑色塑料試劑瓶；10、綠色瓶帽；11、白色塑料試劑瓶；12、白色瓶帽；13、6ml黃曲霉毒素BI抗體工作液瓶位；14、6ml酶標二抗工作液瓶位；15、7ml底物顯色劑A液瓶位；16、Iml高濃度黃曲霉毒素BI標準品溶液瓶位；17、7ml底物顯色劑B液和7ml終止液瓶位；18、lml/瓶各種濃度的標準液瓶位；19、40ml濃縮洗滌液瓶位；20、40ml濃縮樣品稀釋液瓶位；21、具有下凹瓶位的模具；
22、盒體。
具體實施方式
結合附圖詳細描述實施例。酶標反應微孔條(2)預包被黃曲霉毒素BI偶聯抗原
(3)后固定于酶標板的外框支撐架(I)上，且酶標反應微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標板置水浴或恒溫箱內反應時封蓋酶標反應微孔條(2 );白色瓶帽(5 )的半透明塑料試劑瓶(6)用于封裝40ml濃縮洗滌液或40ml濃縮樣品稀釋液；黃色瓶帽(7)的白色塑料試劑瓶用于封裝6ml黃曲霉毒素BI抗體工作液，紅色瓶帽(7)的白色塑料試劑瓶用于封裝6ml酶標二抗工作液；黑色瓶帽(8)的黑色塑料試劑瓶(9)用于封裝7ml底物顯色劑A液，綠色瓶帽(10)的白色塑料試劑瓶(11)用于封裝7ml底物顯色劑B液或7ml終止液；白色瓶帽(12)的半透明塑料試劑瓶用于封裝lml/瓶的標準品溶液；實用新型盒體(22)內置新型·具有下凹瓶位的模具(21)，上有14個瓶位，放置位置依次為6ml黃曲霉毒素BI抗體工作液瓶位(13)，6ml酶標二抗工作液瓶位(14)，7ml底物顯色劑A液瓶位(15)，Iml高濃度黃曲霉毒素BI標準品溶液瓶位(16)，7ml底物顯色劑B液和7ml終止液瓶位(17)，6種lml/瓶各種濃度的標準液瓶位(18)，40ml濃縮洗滌液瓶位(19)，40ml濃縮樣品稀釋液瓶位(20)。動物飼料樣品中黃曲霉毒素BI含量的測定I)樣本前處理取3g粉碎飼料樣品，加入9ml樣品提取液；劇烈振蕩IOmin ；4000r/min離心5min,或用定量分析濾紙過濾；上清液或濾液用去離子水按1:9比例稀釋(I份濾液+9份去離子水)；取稀釋后液體待測。稀釋倍數30倍。2)使用試劑盒的操作步驟①將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(20 25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻取出需要數量的微孔條，將不用的微孔條放進原鋁箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2 8°C 洗滌工作液在使用前也需回溫；④編號將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置； 加標準品/樣本加標準品/樣本50 μ I到對應的微孔中，隨即加入酶標二抗工作液50 μ I /孔，再加入黃曲霉毒素BI抗體工作液50μ1 /孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環境中反應30min;⑥洗板小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液300μ I/孔，充分洗滌5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破) ’⑦顯色加入底物顯色劑A液50 μ I/孔，再加底物顯色劑B液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光環境反應15 20min ’⑧測定加入終止液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據)，測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。3)結果判定有兩種方法，粗略判定可用第I種方法，而定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含黃曲霉毒素BI成負相關。①用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍。假設樣本I的吸光度值為O. 659，樣本2的吸光度值為I. 525，標準液吸光度值分別是0ng/ml為2. 101 ；O. 02ng/ml 為 I. 738 ；0. 06ng/ml 為 I. 313 ；0. lng/ml 為 O. 831 ；0. 3ng/ml 為 O. 262。則樣本I的濃度范圍是O. lng/ml O. 3ng/ml ;樣本2的濃度范圍是O. 02ng/ml O. 06ng/ml,再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中黃曲霉毒素BI的濃度范圍。②準確定量計算分兩個步驟第一步，百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(O標準)的吸光度值，再乘以100%，S卩百分吸光度(％)= B/B0 X 100%式中，B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值Atl-OngAil標準溶液的平均吸光度值。第二步，標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以黃曲霉毒素BI標準品濃度(ng/ml)的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲霉毒素BI實際含量。4)注意事項①室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20 25°C )會導致所有標準的OD值偏低；②在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作；③每加一種試劑前需將其搖勻；④反應終止液為濃度2 mol/1硫酸,避免接觸皮膚；⑤不使用過有效日期的試劑盒；不使用過有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑；⑥保存試劑盒于2 8°C，不可冷凍，將不用的酶標板微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑(底物液)對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；⑦試劑變質的跡象底物液有任何顏色表明變質，應當棄之。O標準的吸光度(450/630nm)值小于O. 5 (A450nm<0. 5)時，表示試劑可能變質；⑧在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時間為15 20min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到30min (或更長)。反之，則減短反應時間；⑨濃縮洗滌液如有結晶屬正常現象，請加熱溶解后使用；⑩該試劑盒最佳反應溫度為37°C，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
權利要求1.一種黃曲霉毒素BI的免疫學檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于盒體內包含有酶標板、蓋板膜、14瓶試劑和具有下凹瓶位的模具，所述的酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應微孔條組成，酶標板采用96孔試劑板作為固相載體，微孔條上預包被黃曲霉毒素BI偶聯抗原后固定于酶標板的外框支撐架上，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔；所述的蓋板膜大小與酶標板一致；所述的模具上的下凹瓶位分別為標準液瓶位、高濃度標準液瓶位、酶標二抗工作液瓶位、黃曲霉毒素BI抗體瓶位、顯色液A液瓶位、顯色液B液瓶位、終止液瓶位、濃縮洗滌液瓶位、濃縮樣品稀釋液瓶位。
2.根據權利要求I所述的黃曲霉毒素BI的免疫學檢測試劑盒，其特征在于所述的盒體是硬紙盒；所述的酶標板由聚苯乙烯制成，放于真空鋁鉬袋內；所述的蓋板膜是透明塑料硬膜，放于鋁鉬袋內；所述的14瓶試劑分別為6瓶標準液、I瓶高濃度標準液、I瓶酶標二抗工作液、I瓶黃曲霉毒素BI抗體、I瓶顯色液A液、I瓶顯色液B液、I瓶終止液、I瓶濃縮洗滌液、I瓶濃縮樣品稀釋液，標準液均用白色瓶帽的乳白色塑料瓶盛裝，酶標二抗工作液用紅色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，黃曲霉毒素BI抗體用黃色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，顯色劑A液用黑色瓶帽的黑色塑料瓶盛裝，顯色劑B液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，終止液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，濃縮洗滌液和樣品稀釋液用白色瓶帽的半透明塑料瓶盛裝；所述的模具由塑料泡沫制成，具有14個下凹瓶位，14個試劑瓶依次放入對應下凹瓶位內。
3.根據權利要求2所述的黃曲霉毒素BI的免疫學檢測試劑盒，其特征在于所述的6瓶標準液，均為 lml/ 瓶，濃度分別為 Ong/ml, O. 02ng/ml, O. 06ng/ml, O. lng/ml, O. 3ng/ml,.0.8ng/ml ;高濃度標準品溶液I瓶，lml/瓶；酶標二抗工作液I瓶，6ml/瓶；黃曲霉毒素BI抗體工作液I瓶，6ml/瓶；顯色液A液I瓶，7ml/瓶；顯色液B液I瓶，7ml/瓶；終止液I瓶，.7ml/瓶；濃縮洗滌液(IOX) I瓶，40 ml/瓶；濃縮樣品稀釋液(2X ) I瓶，40 ml/瓶。
專利摘要本實用新型涉及一種黃曲霉毒素B1的免疫學檢測試劑盒。本實用新型的技術方案要點為一種黃曲霉毒素B1的免疫學檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于盒體內包含有酶標板、蓋板膜、14瓶試劑和具有下凹瓶位的模具，所述的酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應微孔條組成，酶標板采用96孔試劑板作為固相載體，微孔條上預包被黃曲霉毒素B1偶聯抗原后固定于酶標板的外框支撐架上，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔；所述的模具上具有14個下凹瓶位，14瓶試劑依次放入對應下凹瓶位內。本實用新型能實現快速、簡便、靈敏、準確地對食品中黃曲霉毒素B1殘留的定量、定性檢測。
文檔編號G01N33/558GK202614766SQ20122025248
公開日2012年12月19日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者姜金慶, 張海棠, 楊雪峰, 范國英, 梁新紅, 張 浩, 莫海珍, 楊志, 李桂平, 李晨照 申請人:河南知微生物工程有限公司