專利名稱：一種基于一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種應用于蛋白質分離領域的具有親和性分離功能的透射電鏡支持膜
背景技術：
人類基因組測序的完成并不足以使人們解釋及推測細胞的各種生命現象，細胞的活性及功能是蛋白質之間的相互作用完成的。蛋白質之間通過相互作用形成蛋白質復合物，從而決定生物體的復雜功能。從分子水平揭示蛋白質復合物的三維結構是蛋白質相互作用研究中的核心方向，這對于理解生物調控機制等生命活動規律至關重要，為探討重大疾病的機制、疾病治療、疾病預防和新藥開發提供了重要的理論基礎。[I]然而，當今蛋白質復合物結構的研究在很大程度上取決于其技術方法水平的高低。人體內的蛋白質有10萬種以上，而蛋白質之間通過相互作用而形成的復合物則有上千萬種之多。目前，世界上對于蛋白質復合物的結構研究工作剛剛起步，絕大多數蛋白質復合物的結構并沒有獲得解析。其主要原因為大多數蛋白質復合物不穩定，在分離過程中容易分解。當前的主要的蛋白質純化方法為色譜法和親和性分離，其中色譜法使用柱層析進行分離，耗時長[3];而使用親和性分離法，如鏈酶親和素-生物素，NTA-6His相互作用，需要較為強烈的洗脫條件，大多數蛋白質之間的相互作用為瞬時作用，其作用力較為薄弱因而蛋白質復合物不穩定，隨時間和環境的變化而發生解離，導致獲得高純度的目標蛋白質復合物成為一個難題，這已經成為阻礙該領域發展的一個瓶頸。如何克服該瓶頸，開發出快速純化蛋白質的方法以用于結構表征，是目前該領域方法學研究中的一個新問題。透射電鏡單粒子分析是解決蛋白質復合物三維結構的一種有效手段，該方法是將蛋白質在各個角度的二維圖像通過三維重建的方法還原為三維結構。這種方法過程簡單，不需要像X射線衍射分析法(XRD)那樣需要結晶過程；該方法也不像NMR—樣，需要大量的蛋白質樣品(毫克級)。因此該方法是一種可以解決蛋白質復合物三維結構的有效方法。2010年，劉遵峰等提出使用鏈酶未和素修飾石墨稀，可用作生物素標記的蛋白質的快速分離，不需要經過淋洗等步驟，便可將其應用于透射電鏡單粒子分析。[4]然而，該方法存在很大的缺陷，就是石墨烯具有很強的吸附能力，用作蛋白質分離時，石墨烯表面對雜質蛋白的非專一性吸附能力很強，因此純化的純度不能夠保證。對石墨烯表面使用聚乙二醇等高分子進行處理，用以減少非專一性吸附，又會增加石墨烯的尺寸，影響電子透射率，從而影響蛋白質結構分析的精度。這成為該方法進一步應用的瓶頸。目前，急需一種既能達到快速蛋白質分離、可應用于結構分析、并能解決雜質非專一性吸附的方案。參考文獻1.Phizicky, E.M.;Fields，S.Protein-Protein Interactions-Methods forDetection and Analysis.Microbiological Reviews 1995，59 (I)，94-123.[0009]2.Mastrobattista, E.；van der Aa，M.A.E.M.；Hennink, W.E.；Crommelin,D.J.A.Artificial viruses:a nanotechnological approach to gene delivery.NatureReviews Drug Discovery 2006,5 (2),115-121.[0010]3.Graslund, S.；Nordlund, P.；Weigelt, J.Bray, J.；Hallberg, B.M.;Gileadi，0.；Knapp, S.;Oppermann，IL ；Arrowsmith, C.；Hui, R.；Ming, J.;Dhe_Paganon，S.;Park，H.W.；Savchenko, A.；Yee, A.；Edwards, A.；Vincentelli, R.；Cambillau, C.；Kim, R.;Kim，S.H.;Rao，Z.;Shi，Y.；Terwilliger, T.C.;Kim，C.Y.;Hung，L.W.；Waldo, G S.;Peleg，Y.;Albeck，S.；Unger, T.;Dym，0.；Prilusky, J.;Sussman，J.L ;Stevens，R.C.;Lesley，S.A.；Wilson, 1.A.；Joachimiak, A.;Collart，F.;Dementieva，1.;Donnelly，M.1.；Eschenfeldt，W.H.;Kim，Y.;Stols，L.；Wu, R.;Zhou，M.;Burley，S.K.;Emtage，J.S.；Sauder, J.M.；Thompson, D.;Bain，K.;Luz，J.;Gheyi，T.；Zhang, F.;Atwell，S.;Almo，S.C.；Bonanno, J.B.；Fiser, A.；Swaminathan, S.；Studier, F.W.；Chance, M.R.；Sali, A.；Acton, T.B.；Xiao, R.;Zhao，L ；Ma, L.C.；Hunt, J.F.;Tong，L ；Cunningham, K.；Inouye,M.；Anderson, S.；Janjua, H.；Shastry, R.;Ho，C.K.；Wang, D.Y.；Wang, H.；Jiang, M.；Montelione，G.T.;Stuart，D.1.；Owens, R.J.;Daenke，S.;Schutz，A.;Heinemann，U.；Yokoyama,S.；Bussow,K.；Gunsalus,K.C.Protein production and purification.NatureMethods2008，5(2)，135-146.[0011]4.Liu, Z.F.；Jiang, LH.;Galli，F.1gor Nederlof, ReneC.L.0lsthoom, Gerda
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: 圖1.基于一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜示意圖。1.透射電鏡支持月吳;2.一維碳納米材料；3.親和性功能基團圖2.基于一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜的透射電鏡圖。標尺長度:2.5微米
具體實施方式
:實施例一:將IOmg單臂碳納米管(SWNT)于硝酸中(2.8M)中120°C加熱攪拌2h，過濾，洗滌烘干，獲得SWNT-C00H。取2.5mg SffNT-COOH分散于Iml DMF中，加入Img氨基封端的生物素(Biotin-PEG8-NH2)，2mg(3H-l，2，3-三唑并[4，5_b]吡啶 _3_ 氧基)三-1-吡咯烷基鱗六氟磷酸鹽(PyAOP)，2mg N, N-二異丙基乙胺(DIEA)，室溫攪拌lh，過濾、洗滌，得到SWNT-biotin,將其分散于IOml H2O中。將5ml SWNT-biotin與5mg鏈酶親和素混合，過濾，得到鏈酶親和素修飾的單臂碳納米管(SWNT-strep)，將其溶解于2ml含0.5%的4臂聚乙二醇2000的磷酸緩沖液(PBS，pH 7.5)中。取10 μ I SWNT-strep滴加在鏤空透射電鏡支持膜上，獲得可用于親和性分離的透射電鏡支持膜。使用Iml含有0.1% triton的tris-HCl緩沖液將培養于IOcm培養皿中的表達有生物素標記的綠色熒光蛋白的H293T細胞裂解。使用上述功能化的透射電鏡支持膜在裂解液中撈取，之后使用細胞裂解液沖洗。使用熒光顯微鏡觀測到俘獲在透射電鏡膜上的綠色熒光蛋白，說明蛋白質俘獲能力很好。實施例二:將IOmg單臂碳納米管(SWNT)于硝酸中(2.8M)中120°C加熱攪拌2h，過濾，洗滌烘干，獲得 SffNT-COOH0 取 2.5mg SffNT-COOH 分散于 5ml H20 中，2mg 碳二亞胺(EDC)，2mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫攪拌lh，過濾、洗滌，得到SWNT-NHS，將其分散于5ml H2O中。加入N，N，- 二(羧甲基)-L-賴氨酸混合，過濾，得到NTA修飾的單臂碳納米管(SWNT-NTA)，將其溶解于2ml含0.5%的4臂聚乙二醇2000的PBS緩沖液中。取10 μ I SffNT-NTA滴加在鏤空透射電鏡支持膜上，滴加1%的NiCl2，獲得可用于親和性分離的透射電鏡支持膜。使用Iml含有0.1 % triton的tris-HCl緩沖液將培養于IOcm培養皿中的表達有6His標記的綠色熒光蛋白的H293T細胞裂解。使用上述功能化的透射電鏡支持膜在裂解液中撈取，之后使用上述緩沖液沖洗。使用熒光顯微鏡觀測到俘獲在透射電鏡膜上的綠色熒光蛋白，說明蛋白質俘獲能力很好。實施例三:將IOmg單臂碳納米管(SWNT)于硝酸中(2.8M)中120°C加熱攪拌2h，過濾，洗滌烘干，獲得 SWNT-C00H。取 2.5mg SWNT-C00H 分散于 5ml H20 中，2mg EDC, 2mg NHS，室溫攪拌lh，過濾、洗滌，得到SWNT-NHS，將其分散于5ml H2O中。加入N，N，- 二(羧甲基)-L-賴氨酸混合，過濾，得到NTA修飾的單臂碳納米管(SWNT-NTA)，將其溶解于2ml含0.5%的單臂聚乙二醇2000的PBS緩沖液中。取10 μ ISffNT-NTA滴加在鏤空透射電鏡支持膜上，滴加1%的NiCl2，獲得可用于親和性分離的透射電鏡支持膜。
使用Iml含有0.1 % triton的tris-HCl緩沖液(細胞裂解液)將將培養于IOcm培養皿中的同時表達有6His標記的綠色熒光蛋白，和無標記的紅色熒光蛋白的H293T細胞裂解。使用上述功能化的透射電鏡支持膜在裂解液中撈取，之后使用上述細胞裂解液沖洗。使用熒光顯微鏡觀測到俘獲在透射電鏡膜上的綠色熒光蛋白，未觀測到紅色熒光蛋白，說明蛋白質純化效果很好。實施例四:將IOmg單臂碳納米管(SWNT)于硝酸中(2.8M)中120°C加熱攪拌2h，過濾，洗滌烘干，獲得 SffNT-COOH0 取 2.5mg SffNT-COOH 分散于 5ml H2O 中，加入 2mg EDC, 2mg NHS,室溫攪拌lh，過濾、洗滌，得到SWNT-NHS，將其分散于5ml H2O中。加入谷胱甘肽S-轉移酶，反應lh，過濾，得到谷胱甘肽S-轉移酶修飾的單臂碳納米管(SWNT-GST)，將其溶解于2ml含
0.5 %的4臂聚乙二醇2000的PBS緩沖液中。取10 μ I SffNT-GST滴加在鏤空透射電鏡支持膜上，獲得可用于親和性分離的透射電鏡支持膜。使用Iml 0.1 % triton的tris-HCl緩沖液(細胞裂解液)將將培養于IOcm培養皿中的同時表達有GST標記的綠色熒光蛋白，和無標記的紅色熒光蛋白的H293T細胞裂解。使用上述功能化的透射電鏡支持膜在裂解液中撈取，之后使用上述細胞裂解液沖洗。使用熒光顯微鏡觀測到俘獲在透射電鏡膜上的綠色熒光蛋白，未觀測到紅色熒光蛋白，說明蛋白質純化效果很好。
權利要求1.一種基于一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，它是一種功能化的透射電鏡支持膜，由3部分組成，包括鏤空透射電鏡支持膜，一維碳納米材料，和親和性分離基團，其特征是親和性分離基團連接到一維碳納米材料上，一維碳納米材料連接到透射電鏡支持膜上。
2.根據權利要求1所述的基于一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特征在于所述的一維碳納米 材料為碳納米管、碳納米線、碳納米帶。
3.根據權利要求1所述的基于一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特征在于所述的一維碳納米材料為單壁碳納米管。
4.根據權利要求1所述的基于一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特征在于所述的一維碳納米材料的長徑比為10-10000之間。
5.根據權利要求1所述的基于一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特征在于所述的親和性分離基團為可專一性識別特定分子或功能基團的分子或功能基團。
6.根據權利要求1所述的基于一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特征在于所述的一維碳納米材料使用表面活性劑處理。
7.根據權利要求1所述的基于一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特征在于所述的一維碳納米材料使用表面活性劑處理，所述的表面活性劑為單臂或多臂聚乙二醇。
專利摘要本實用新型屬于生物醫藥技術領域，基于一維碳納米材料設計的一種具有蛋白質分離功能的親和性分離透射電鏡支持膜。該親和性分離透射電鏡支持膜由3部分組成，包括鏤空透射電鏡支持膜，一維碳納米材料，和親和性分離基團，其中親和性分離基團連接到一維碳納米材料上，一維碳納米材料連接到透射電鏡支持膜上。本實用新型通過使用親和性識別分子修飾一維碳納米材料，并將其連接到鏤空的透射電鏡支持膜上，從而形成孔隙結構。雜質蛋白質可從一維碳納米材料的的縫隙中漏下去，而目標蛋白質將被俘獲于一維碳納米材料上，該過程可以迅速完成。從而可以解決雜質蛋白質復合物純化以及結構分析過程中的易分解、純度低等問題。本實用新型的用途是蛋白質分離，可用于蛋白質復合物的分離、純化、和三維結構分析。
文檔編號G01N23/04GK203083854SQ20122016069
公開日2013年7月24日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者劉遵峰, 劉倩, 王楠 申請人:劉遵峰, 劉倩, 王楠