專利名稱：檢測呋喃唑酮代謝物的試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及ー種檢測呋喃唑酮代謝物的試劑盒，特別是檢測動物組織中呋喃唑酮代謝物的試劑盒。
背景技術：
呋喃唑酮(Furazolidone)屬硝基呋喃類藥物，為廣譜抗生素，對革蘭氏陽性及陰性菌均有一定抗菌作用，被廣泛應用于家禽、家畜、水產品的痢疾、腸炎、球蟲病以及火雞黑頭病的預防和治療。但研究證明硝基呋喃類藥物及其代謝物具有相當大的毒性，有致畸胎副作用，且能誘發癌癥。我國農業部文件農牧發[2002] I號規定食品性動物中呋喃唑酮的檢出限為不得檢出。 由于硝基呋喃類藥物在體內很快就能被代謝，而在組織中結合的代謝產物則能存留較長的一段時間，所以在分析此類藥物的殘留時經常要分析其代謝后的產物，管理部門就以檢測代謝產物為手段達到檢測硝基呋喃類殘留的目的。目前用來檢測呋喃唑酮代謝物的最常用方法是高效液相色譜法(HPLC)、液質聯用法(LC-MS、LC-MS/MS)等，這些方法雖然具有靈敏度高、結果準確、重復性好、假陽性少等優點，但仍存在一定缺點，如樣品前處理過程復雜，儀器化程度高且價格昂貴，分析速度慢，已逐漸不能滿足發達國家及食品加工企業對檢測方法檢測限的要求；而常用的免疫分析法主要為酶聯免疫檢測法和放射免疫分析法，需要的檢測費用還是較高，不適合企業低成本的檢測需要。因此，在實踐中有必要建立ー種敏感度高、操作簡單、成本低、檢測藥物種類多、適合大規模推廣的檢測方法。
實用新型內容本實用新型的目的是提供一種靈敏度高、成本低、操作簡單、檢測時間短的檢測呋喃唑酮代謝物的試劑盒。本實用新型的試劑盒包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶包括微孔試劑條和8個試紙條，微孔試劑條有8個反應孔，反應孔上具有微孔塞，其中凍干有呋喃唑酮代謝物單克隆抗體-肢體金標記物。試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜組成，所述反應膜上具有包被有呋喃唑酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線印跡“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線印跡“ I ”。檢測線和質控線平行，檢測線位于距離樣品吸收墊ー側5-8mm處，質控線位于距離檢測線4-7mm處，試紙條上貼有保護膜，保護膜覆蓋在樣品吸收墊上，為檢測端，上面印有MAX標記線。本實用新型試劑盒中的試紙條底板可為PVC底板或其他硬質不吸水的材料；樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；吸水墊為吸水紙；反應膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；保護膜為PE材質保護膜；試劑盒盒體為硬紙盒；試劑桶為塑料試劑桶；固定用具為硬質支撐材料。本實用新型試劑盒具有如下有益效果[0008]I、靈敏度高。呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒以膠體金標記高親和カ的單克隆抗體為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華カ相結合，膠體金對單克隆抗體特異性和親和カ影響很小，且具有較高的標記率。其中的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物凍干在微孔試劑條中，在檢測過程中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應，從而減少誤差，増加整個體系的反應靈敏度。因此，本實用新型試劑盒具有較高的特異性和靈敏度。本試劑盒對呋喃唑酮代謝物的檢測靈敏度為I μ g/L。2、操作簡便快速。使用試劑盒檢測時無需任何其它試劑，只要將待檢樣品溶液滴加于微孔試劑中，混勻后，將試紙標有MAX標記線的一端向下插入微孔中，室溫(20-25°C )孵育5min后觀察結果。3、顯示檢測結果形象、直觀、準確。檢測試紙條以顯示紅色線“I”及“ Il ”印跡作為陽性和陰性標記，即在硝酸纖維素膜上顯示一條紅線“ I ”印跡表示被檢測樣本液中呋喃唑酮代謝物的含量高于或等于試劑盒對呋喃唑酮代謝物的最低檢測限，兩條紅線“ Il ”印跡 表示被檢測樣本中呋喃唑酮代謝物的含量低于試劑盒對呋喃唑酮代謝物的最低檢測限，結果判定形象、直觀、準確、簡單明了，不容易出現結果誤判。4、成本低，投資少。使用本實用新型試劑盒，不需另配儀器設備及其它試劑，使現場檢測一歩到位，成本低廉，投資少，見效快。5、易于大范圍推廣應用。試劑盒操作簡單，能較好滿足不同層次人員的需要，如專業化驗、海關檢疫、衛生防疫、質量監測、食品企業等，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
圖I為本實用新型試紙條結構示意圖；圖2為本實用新型試紙條俯視圖；圖3為本實用新型微孔試劑圖；圖4為本實用新型試紙條檢測結果判定圖；圖5為本實用新型試劑桶結構示意圖；圖6為本實用新型固定用具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定用具的側視圖。
具體實施方式
一、呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒的組裝制備⑴試紙條樣品吸收墊I、反應膜2、吸水墊3和保護膜7依次按順序黏貼在所述底板6上，樣品吸收墊的末端與反應膜的始端相連，反應膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，試紙粘貼有保護膜，保護膜7覆蓋在樣品吸收墊上，為檢測端，上面印有MAX標記線，檢測線4包被有呋喃唑酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物，質控線5包被有羊抗鼠抗抗體。底板為PVC底板，樣品吸收墊為吸濾紙，反應膜為硝酸纖維素膜，吸水墊為吸水紙，保護膜為PE材質保護膜。(2)微孔試劑條微孔試劑條8具有微孔塞9，板孔中凍干有呋喃唑酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物。(3)將(I)試紙條和(2)微孔試劑條裝入具有密封蓋的塑料試劑桶10，將塑料試劑桶放置于試劑盒盒體12內的固定用具11中。ニ、試劑盒的使用(I)樣品前處理取(5. 0±0· 05) g均質樣本至50ml聚苯こ烯離心管中，加入5ml 10%三氯こ酸，再加入100 μ I衍生化試劑(向裝有151mg 2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至10ml)，充分振蕩3min，在60°C放置I. 5h ;取出依次加入Iml O. 5mol/L磷酸氫ニ鉀溶液、I. 5ml 2mol/L氫氧化鈉溶液和IOmlこ酸こ酷，振蕩10s，脂肪含量高的樣本輕微振蕩8 10下；3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ;取8mlこ酸こ酯相至IOml干燥的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干，加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動30s，再加入O. 6mlO. 2mol/L磷酸鹽緩沖液，渦動IOs充分混勻；3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min，除去上層有機相，取下層100 μ I用于分析。(2)用試劑盒檢測用微量移液器吸取100 μ I待檢樣品溶液到微孔試劑中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻，將試紙標有MAX標記線的一端向下插入微孔中，室溫(20 25°C )孵育5min后觀察結果。三、檢測結果分析呋喃唑酮代謝物在樣本中的含量高于或等于試劑盒對其的最低檢測限吋，呋喃唑酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物與呋喃唑酮代謝物結合，金標抗體上的抗原結合位點被封閉，從而在檢測區內因為競爭反應，不會與呋喃唑酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物結合而不出現紅色條帯。陰性樣本在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應，將會在檢測線和質控線上出現紅色條帶。如圖4所示。陽性當質控線(C)顯示一條紅色條帶，而檢測線(T)不顯色，試紙條以顯示紅色線“I”，判為陽性，如圖4. a圖所示。陰性當質控線(C)顯示一條紅色條帯，檢測線(T)同時也顯示出一條紅色條帯，試紙條以顯示紅色線“ Il ”，判為陰性，如圖4.b所示。無效當質控線(C)不顯示出紅色條帯，則無論檢測線(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙條均判為無效，如圖4. C、4. d所示。四、檢測試劑盒中用到的材料制備方法I、呋喃唑酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物的合成與鑒定呋喃唑酮代謝物是小分子物質，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發機體產生免疫應答，必須與大分子載體蛋白偶聯后才具有免疫原性。(I)呋喃唑酮代謝物半抗原的制備取呋喃唑酮代謝物(AOZ) I. 02g和20ml N，N_ ニ甲基甲酰胺(DMF)混合，得到A液；取對苯ニ甲醛2. 68 5. 36g和50 100ml DMF混合，得到B液；室溫下將A液緩慢滴加入B液中，滴加完畢后室溫至60°C反應2 4h，除去溶劑，柱層析純化，得到淡黃色物質，即為呋喃唑酮代謝物半抗原。(2)免疫原的制備——呋喃唑酮代謝物半抗原與牛血清白蛋白偶聯物合成取呋喃唑酮代謝物半抗原8. 5mg用Iml DMF溶解，得到溶液I ;取牛血清白蛋白(BSA) 40mg用9ml水溶解，得到溶液II ;將溶液I滴加入溶液II中，室溫反應24h，得到溶液III ;取 NaBH420mg 用 O. 2ml O. lmol/L NaOH溶解后加入溶液III中，4°C反應 2h ;用 O. 01mol/LPBS4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；分裝，于_20°C保存備用。(3)包被原的制備——呋喃唑酮代謝物半抗原與卵清蛋白偶聯物合成取呋喃唑酮代謝物半抗原IOmg用Iml DMF溶解，得到溶液I ;取卵清蛋白(OVA) 36mg用8ml水溶解，得到溶液II ;將溶液I滴加入溶液II中，室溫反應24h，得到溶液III ;取 NaBH418mg 用 O. 2ml O. lmol/L NaOH 溶解后加入溶液III中，4°C反應 2h ;用 O. Olmol/L PBS 4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；分裝，于-20°C保存備用。(4)呋喃唑酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物的鑒定將載體蛋白、呋喃唑酮代謝物半抗原、呋喃唑酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物用ρΗ7· 4的PBS配成O. 5mg/ml的溶液，以O. 01mol/L pH7. 4PBS調零，用紫外分光光度計在波長200 800nm范圍內掃描，得到載體蛋白、呋喃唑酮代謝物半抗原、呋喃唑酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物的吸收曲線。三者出現不同的吸收曲線，表明呋喃唑酮代謝物半抗原與載體蛋白偶聯成功。2、呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的制備(I)動物免疫將步驟I得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內，免疫劑量為150 μ g/只，使其產生
抗血清。(2)細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按8 I (數量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選得到穩定分泌呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的呋喃唑酮代謝物單克隆雜交瘤細胞株。(3)細胞凍存和復蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成IX IO6個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。(4)單克隆抗體的制備與純化增量培養法將雜交瘤細胞置于細胞培養基中，在37°C條件下進行培養，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。所述細胞培養基為向RPMI1640培養基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養基中的終濃度為20% (質量百分含量)，碳酸氫鈉在細胞培養基中的終濃度為0.2% (質量百分含量)；所述細胞培養基的pH為7.4。3、羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、呋喃唑酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物的制備[0061](I)膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸(購于sigma公司，產品目錄號T09041)稀釋成O. 01 % (質量百分含量)，取IOOml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續高溫、持續攪拌下加入2.5ml 1%檸檬酸三鈉(購于廣州化學試劑廠，產品目錄號BGl I-AR-01KG)，繼續勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復到原體積，4°C保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。(2)呋喃唑酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物的制備在磁力攪拌下,用O. 2mol/L碳酸鉀溶液調膠體金的pH至7. 2,按姆毫升膠體金溶液中加入50 100 μ g的標準向膠體金溶液中加入上述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體，繼續攪拌混勻10min，_A 10%牛血清白蛋白(BSA)使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置lOmin。12000r/min，4°C離心40min，棄上清液，沉淀用復溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用。復溶緩沖液含牛血清白蛋白O. I % O. 3 % (體積百分含量)、吐溫-80O. 05% O. 2% (質量百分含量)、PH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。5、將呋喃唑酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物凍干到微孔試劑上向微孔試劑微孔板中加入100 μ I呋喃唑酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物,放入冷凍干燥機中，在冷阱溫度_50°C條件下，預凍3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到凍干有呋喃唑酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑，密封保存。6、樣品吸收墊的準備將樣品吸收墊置于含O. 5%牛血清白蛋白(體積百分含量)、ρΗ7·2、0· lmol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡2h，37°C烘2h備用。7、反應膜的制備包被過程用磷酸緩沖液將呋喃唑酮代謝物半抗原-卵清蛋白偶聯物稀釋到10mg/ml，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線(T)，包被量為l.Oyg/cm2 ;用O. 01mol/L>pH7. 4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200 μ g/ml,用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質控線(C)，包被量為l.Oyg/cm2。將包被好的反應膜置于37°C條件下干燥2h，備用。
權利要求1.一種檢測呋喃唑酮代謝物的試劑盒，其特征在于試劑盒包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和8個試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜組成。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述反應膜上具有檢測線印跡“I ”和質控線印跡“I”。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述檢測線和質控線平行，均呈與試紙條的長相垂直的條帶狀。
4.如權利要求1、2或3所述的試劑盒，其特征在于所述檢測線位于距離樣品吸收墊一側5-8mm處，所述質控線位于距離檢測線4_7mm處。
5.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述試紙條上貼有保護膜，保護膜覆蓋在樣品吸收墊上，為檢測端，上面印有MAX標記線。
6.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述底板可為PVC底板或其他硬質不吸水的材料，樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙，吸水墊為吸水紙，反應膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，保護膜為PE材質保護膜。
7.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述微孔試劑條有8個反應孔，反應孔上具有微孔塞。
8.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒盒體為硬紙盒，試劑桶為塑料試劑桶，固定用具是硬質支撐材料。
專利摘要本實用新型提供了一種檢測呋喃唑酮代謝物的試劑盒，試劑盒包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜組成，呋喃唑酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物凍干在微孔試劑中。反應膜上具有包被有呋喃唑酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線印跡“|”和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線印跡“|”。本實用新型試劑盒具有便攜性好、靈敏度高、檢測時間短等特點，可以在呋喃唑酮代謝物殘留檢測中發揮重要作用。
文檔編號G01N33/558GK202649212SQ20122014068
公開日2013年1月2日 申請日期2012年4月5日 優先權日2012年4月5日
發明者何方洋, 羅曉琴, 趙正苗, 陳煒玲, 崔海峰, 汪善良, 扶勝, 楊秀賢 申請人:北京勤邦生物技術有限公司