專利名稱：磺胺類藥物elisa檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測磺胺類藥物殘留量的試劑盒，特別是檢測動物組織(肌肉/魚/蝦)、雞蛋、飼料、尿液中磺胺類藥物殘留量的酶聯免疫檢測(ELISA)試劑盒，ELISA(Enzyme Linked Immunosorbnent Assay)是酶聯免疫吸附劑測定的簡稱,它是繼免疫突光和放射免疫技術之后發展起來的一種酶免技術。
背景技術：
磺胺類藥物(Sulfonamides, SAs)是一類具有對氨基苯磺酰胺結構、用于預防和治療細菌感染性疾病的化學治療藥物。因具有廣譜、穩定、經濟、易用以及聯合抗菌增效劑效果可提高數十倍的特點，常以亞治療濃度的藥物做為飼料添加劑來預防疾病的發生，提高飼料的轉化率和促進動物生長，其中常用的SAs就有十幾種。但該類藥物存在嚴重副作用，人體中長期存在會導致許多細菌對磺胺類藥物產生耐藥性，且有潛在的致癌性，因此已引 起了國內外的高度重視。我國以及美國、歐盟等國家規定了動物性食品中總磺胺以及單個磺胺的最高殘留限量(MRLs)為O. lmg/kg，其中磺胺二甲基嘧啶(SM2)的MRLs為O. 025 μ g/ml ο目前，磺胺類藥物殘留的檢測方法主要有微生物學法、理化分析方法和免疫法等。微生物學法簡便、費用低，但操作費時且敏感性、特異性都較差，在定性定量上都存在困難，不能滿足現代殘留檢測的需要，甚至有些檢測結果還達不到最高殘留限量的要求；理化法常作為確證方法用于測定動物組織中的藥物殘留，如氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、氣-質聯用(GC-MS)、液-質聯用(HPLC-MS)等，這些方法靈敏、準確，特異性強、分離度好，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器、樣品的前處理復雜、繁瑣費時、檢測的成本較高，不能現場操作，而且需專業人員操作，所以限制了其應用；與之相比，酶聯免疫方法具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合于批量樣品的篩選檢測等優點，而且所需設備少，操作簡單易學，成本低廉，能夠更好地滿足我國畜禽養殖戶、屠宰場、食品企業、政府職能監管部門等開展檢測工作。
實用新型內容本實用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的磺胺類藥物殘留量檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩定性好，需要的技術含量不高，可進行一次連續多個樣品中磺胺類藥物殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。本實用新型可以檢測15種磺胺類藥物。本實用新型的技術方案是一種磺胺類藥物ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質檢報告，其特征在于酶標板時采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被磺胺類藥物偶聯抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別為7瓶標準品溶液、酶標二抗、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液，下凹瓶位共15個。酶標板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜為蓋板膜，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致，將14瓶試劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶盛裝并固定在下凹瓶位中，與酶標板、蓋板膜、自封袋、說明書、質控報告一同封裝在硬紙盒內，以便于攜帶和運輸。14瓶試劑分別為7瓶Iml標準品溶液、12ml酶標二抗、7ml抗體工作液、7ml顯色液A液、7ml顯色液B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、50ml濃縮復溶液。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定(包括標準分析孔)，既可進行一次連續多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結果的準確性。檢測時，樣本中的磺胺類藥物將和酶標板微孔條上預包被的磺胺類藥物偶聯抗原競爭抗磺胺類藥物抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中磺胺類藥物的殘留量成負相關，與標準曲線比較再乘以其 對應的稀釋倍數，即可得出樣品中磺胺甲基異噁唑的殘留量，再利用交叉反應率計算樣本中含有的其他磺胺類藥物的殘留量，其操作簡便易行。經實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度動物組織(雞肉/豬肉/魚/蝦)樣本的最低檢測限為I. 0μ g/kg ;雞蛋樣本的最低檢測限為4μ g/kg ;飼料樣本的最低檢測限為40 μ g/kg ;尿液樣本的最低檢測限為4 μ g/kg。動物組織(雞肉/豬肉/魚/蝦)樣本的回收率為95%±15% ;雞蛋樣本的回收率為80%±10% ;飼料樣本的回收率為85%±15% ;尿液樣本的回收率為90%±10%。同磺胺甲基異噁唑的交叉反應率為100%、同磺胺嘧啶的交叉反應率為150%、同磺胺二甲基嘧啶的交叉反應率為340%、同磺胺間二甲氧嘧啶的交叉反應率為140%、同磺胺多辛的交叉反應率為131%、同磺胺甲噻二唑的交叉反應率為78%、同磺胺喹噁啉的交叉反應率為320%、同磺胺甲基嘧啶的交叉反應率為326%、同磺胺甲氧噠嗪的交叉反應率為213%、同磺胺氯噠嗪的交叉反應率為306%、同磺胺間甲氧嘧啶的交叉反應率為338%、同磺胺苯酰的交叉反應率為129%、同磺胺對甲氧嘧啶的交叉反應率為523%、同磺胺(二甲基)異噁唑的交叉反應率為518%、同酞酰磺噻唑的交叉反應率為208%。相對于其他磺胺類藥物檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標儀、均質器、氮氣吹干裝置、渦旋儀、離心機、振蕩器和微量加樣器等，同類實驗室一般均有配備，所需成本較低。本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準確地用于動物組織、雞蛋、飼料、尿液中磺胺類藥物殘留量的檢測。
圖I為本實用新型酶標板的側面縱剖面圖(長為8. 55cm)；圖2為本實用新型酶標板的側面橫剖面圖(長為12. 8cm)；圖3為本實用新型酶標板的俯視圖；圖4為本實用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側視圖。[0017]參見附圖酶標反應微孔條(2)預包被磺胺類藥物偶聯抗原(3)固定于酶標板的外框支撐架(I)上，酶標反應微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標板置水浴或恒溫箱內反應時封蓋酶標反應微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍色帽的半透明PE塑料試劑瓶(5)用于封裝50ml濃縮復溶液；白色帽(6)的白色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液A液，紅色帽(6)的黑色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液B液，黃色帽(6)的白色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色PE塑料試劑瓶(8)用于封裝12ml酶標二抗，綠色帽的白色PE塑料試劑瓶(8)用于封裝7ml抗體工作液，黑色帽的棕色玻璃試劑瓶(9)用于封裝Iml/瓶的標準品溶液及Iml高濃度標準品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個下凹瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(18)，50ml濃縮復溶液瓶位(11)，7ml顯色液A液瓶位(14)，7ml顯色液B液瓶位(13)，7ml終止液瓶位(12)，7ml抗體工作液瓶位
(16), 12ml酶標二抗瓶位(15)，7個Iml/瓶各種濃度的標準品溶液瓶位(17)，盒體為(19)是硬紙盒。
具體實施方式
一、樣本的前處理I、配液配液I :0. lmol/L NaOH 溶液稱取O. 4g氫氧化鈉，加IOOml去離子水溶解混勻。配液2 乙腈-O. lmol/L NaOH 溶液量取90ml乙腈，加入IOml O. lmol/L NaOH溶液混勻。配液3 0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液稱取51. 6g十二水合磷酸氫二鈉、8. 7g 二水合磷酸二氫鈉加IL去離子水溶解混勻。配液4:復溶工作液用去離子水將2X濃縮復溶液按1:1體積比進行稀釋(I份2X濃縮復溶液+1份去離子水)用于樣本的復溶，復溶工作液在4°C環境下可保存一個月。配液5 :洗滌工作液用去離子水將20 X濃縮洗滌液按1:19體積比進行稀釋(I份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4°C環境可保存一個月。2、樣本處理步驟 (I)動物組織(雞肉、豬肉、魚、奸)樣本稱取2. 0g±0. 05g均質物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈-O. lmol/LNaOH溶液，立即用振蕩器振蕩5min，4000rpm室溫(20 25°C /68 77° F)離心5min ;取2ml上清液至IOml干凈玻璃試管中，于5(T60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動30s溶解干燥殘留物，加入O. 5ml復溶液工作液，用渦旋儀渦動30s后轉入2ml離心管中，4000rpm室溫(20 25°C /68 77° F)離心5min ;除去上層正己烷相，取下層水相50 μ I用于分析。(2)雞蛋樣本[0034]用均質器均質雞蛋樣本，使蛋清和蛋黃充分混合；稱取2. 0g±0. 05g均質物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩IOmin,4000rpm室溫(20^250C /68 77° F)離心5min ;取Iml上清液至IOml干凈玻璃試管中，于5(T60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動30s溶解干燥殘留物，再加入Iml復溶工作液，用渦旋儀渦動lmin，4000rpm室溫(20 25°C /68 77° F)離心5min ;除去上層正己烷相，取下層水相50 μ I用于分析。(3)飼料樣本稱取2. 0g±0. 05g均質物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈,用振蕩器振蕩5min，4000rpm室溫(20 25°C /68 77。F)離心5min ;移取Iml上層有機相至IOml干凈玻璃試管中，于5(T60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動30s，再加Iml O. 2mol/L磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動30s后轉入2ml離心管中，4000rpm室溫(20^250C /68 77。F)離心5min ;除去上層有機相，取下層100 μ I加入到900 μ I O. 2mol/L磷酸鹽緩沖溶液，混勻；取50 μ I用于分析。(4)尿液樣本將尿液于4000rpm室溫(2(T25°C/68 77° F)離心5min，直至尿液樣本清亮；移取200 μ I清亮尿液加600 μ I復溶工作液混合；取50 μ I用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟I、將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(20_25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于疒8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。5、加標準品/樣本和抗體工作液加標準品/樣本50 μ I到對應的微孔中，然后加入抗體工作液50 μ I/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應30min。6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液250 μ I/孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。7、加酶標二抗加入酶標二抗100 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應30min，取出重復洗板步驟6。8、顯色加入底物液A液50μ I/孔，再加底物液B液50μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應15min。9、測定加入終止液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據)，測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。三、結果判定結果判定有兩種方法，粗略判定可用第I種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含磺胺類藥物的含量成負相關。I、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(μ g/L)。假設樣本I的吸光度值為O. 111，樣本2的吸光度值為O. 585，標準液吸光度值分別是0 μ g/L為I. 861 ;lyg/L 為 I. 525 ;3yg/L 為 I. 131 ;9yg/L 為 0. 566 ;27yg/L 為 0. 258 ;81yg/L 為0. 102。則樣本I的濃度范圍是27 81 μ g/L再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中磺胺甲基異噁唑殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是3、μ g/L再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中磺胺甲基異噁唑殘留的濃度范圍。再利用交叉反應率計算樣本中其他磺胺類藥物殘留的濃度范圍。2、定量分析(I)百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(O標準)的吸光度值，再乘以100%，即 ΓΤ分吸光率(％) =XlOO
B()B——標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0——O μ g/L標準溶液的平均吸光度值(2)標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以磺胺甲基異噁唑標準品濃度(μ g/L)的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中磺胺甲基異噁唑的實際濃度，再利用交叉反應率計算樣本中其他磺胺類藥物的殘留量。四、測定前的注意事項I、室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20-25°C )會導致所有標準的OD值偏低。2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性、重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。3、每加一種試劑前需要將其搖勻。4、反應終止液為2mol/L硫酸,避免接觸皮膚。5、不要使用過了有效期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試齊U，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。6、儲存條件保存試劑盒于2 8°C，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質的跡象發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。O標準的吸光度(450/630nm)值小于O. 5 (A450nm<0. 5)時，表示試劑可能變質。8、在加入底物液A液和底物液B后，一般顯色15min即可。若顏色較淺,可延長反應時間到2(T30 min (或更長)，反之，則減短反應時間。9、該試劑盒最佳反應溫度為25°C，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
權利要求1.一種磺胺類藥物ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的ー塊96孔酶標板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、ー個自封袋、ー份說明書和ー份質檢報告，其特征在于酶標板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被磺胺類藥物偶聯抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別為7瓶標準品溶液、酶標ニ抗、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液，下凹瓶位共15個。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯こ烯酶標板放于真空鋁箔袋內；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液用黒色帽的棕色玻璃試劑瓶，酶標ニ抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黒色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復溶液用藍色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于酶標板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔；蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；標準品溶液7瓶，Iml/瓶；酶標ニ抗I瓶，12ml ;抗體工作液I瓶，7ml ;顯色液A液I瓶，7ml ;顯色液B液I瓶，7ml ;終止液I瓶，7ml ;濃縮洗滌液I瓶，40ml ;濃縮復溶液I瓶，50ml。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測動物組織、雞蛋、飼料、尿液中磺胺類藥物ELISA檢測試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標板、酶標二抗、抗體工作液、磺胺甲基異噁唑7個濃度的標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、蓋板膜、自封袋、說明書和質檢報告。采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中殘留的磺胺類藥物將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗磺胺類藥物抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，利用樣本吸光度值及交叉反應率計算出樣品中磺胺類藥物的殘留量。與儀器分析技術相比具有操作簡便、費用低廉、靈敏度高等特點，可在磺胺類藥物的殘留量檢測中發揮重要作用。
文檔編號G01N33/543GK202649209SQ201220077239
公開日2013年1月2日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者何方洋, 聶雯瑩, 吳鵬, 余厚美, 何麗霞, 胡德專, 陳煒玲, 扶勝 申請人:北京勤邦生物技術有限公司