專利名稱：一種人抗凝血酶-Ⅲ濃縮物中肝素含量的測定方法
一種人抗凝血酶-1II濃縮物中肝素含量的測定方法技術領域
本發明屬于生物學檢測技術領域，具體涉及一種人抗凝血酶-1II濃縮物中肝素含 量的測定方法。
背景技術：
人抗凝血酶-1II (anti thrombin-1II, AT-1II)濃縮物是從人血衆中分離純化得到的 血漿蛋白制品，主要用于治療各種原因引起的抗凝血酶-1II缺乏癥及手術造成的血栓等。 目前，抗凝血酶-1II的純化制備工藝以利用肝素親和層析為主要步驟，在純化的過程中，會 發生層析填料中的肝素脫落，因此，要對抗凝血酶-1II濃縮物中的肝素含量進行檢測。歐洲 藥典第 7 版(European Pharmacopoeia 7. O, EP7. O)和美國藥典第 32 版(United States Pharmacopeia 32, USP32)對抗凝血酶-1II濃縮物的要求為每國際單位(IU)抗凝血酶-1II 中肝素含量不超過0. 1IU。
目前肝素的含量測定多采用凝固法和發色底物法，其檢測基本原理均基于肝素與 抗凝血酶-1II結合能夠滅活凝血因子或抑制凝血反應。歐洲藥典第7版中列出的抗凝血 酶-1II中肝素測定方法有兩種，一種為發色底物法，利用肝素-抗凝血酶復合物能夠抑制活 化的凝血因子X水解發色底物的顯色反應的基本原理，以已知含量肝素標準品作為參照， 檢測標準品及待測樣品反應結果的吸光值(0D. 405)，通過繪制標準曲線計算待測樣品中肝 素的含量；另一種為凝固法，該方法是通過觀察在一定條件下樣品對血漿與高嶺土、腦磷脂 混合物復鈣化后的抗凝作用(凝固時間)，來判斷待測樣品的肝素含量。美國藥典第32版對 肝素含量的測定采用發色底物法，其原理與歐洲藥典相同，但該法是以已知含量肝素和抗 凝血酶-1II標準品的溶液作為標準溶液，待測樣品肝素含量是通過與標準溶液反應結果比 對得到。
凝固法操作復雜、耗時，發色底物法具有靈敏度高，操作簡單、省時，檢測所需試劑 用量小等優點。在發色底物法中，繪制標準曲線計算結果的方式較采用的單一對比計算具 有更高的穩定性和準確性。由于待測樣品的特殊性，與肝素標準品相比，其含大量抗凝血 酶-1II，在測定反應中會促進對凝血因子的滅活反應，進而影響測定結果的準確性。
中國藥典(2010版)第三部中采用的肝素含量測定法為凝固法，以血漿與高嶺土、 腦磷脂混合物復鈣化后的凝固反應為檢測體系，利用硫酸魚精蛋白能夠中和肝素從而影響 檢測體系凝固時間為原理進行測定，但該方法并不適用于抗凝血酶-1II濃縮物。截至目前， 還沒有相關專門針對抗凝血酶-1II濃縮物中肝素含量檢測方法的研究報道。發明內容
發明目的本發明目的在于針對以上所述測定技術中存在的樣品抗凝血酶-1II的 干擾大、測定準確性不高等技術問題，提出一種新的抗凝血酶-1II濃縮物中肝素含量的測 定方法。首先根據肝素具有比抗凝血酶-1II熱耐受性高的特點，設計采用高溫加熱處理的 方法使待測樣品中抗凝血酶-1II失活，進而消除其對測定結果的影響；其次，采用微量發色底物法，通過繪制標準曲線，對待測樣品肝素含量進行計算。
本發明所采用的技術方案為一種人抗凝血酶-1II濃縮物中肝素含量的測定方法，包括待測樣品的處理、標準曲線的制作與樣品的測定三個部分。其操作步驟為1、待測樣品的處理用O. 02mol/L Tris緩沖液(pH8. 4)將已知效價的抗凝血酶-1II濃縮物樣品稀釋至抗凝血酶-1II濃度為lIU/ml，6(T8(rC高溫水浴處理2(T50min。
2、標準曲線的制作與樣品的測定(1)用Tris緩沖液pH8.4將已知效價的肝素標準品稀釋至(TO. lIU/ml的已知濃度，作為標準溶液；(2)取四種或四種以上不同濃度肝素標準溶液及處理后的待測樣品溶液一定體積于微孔板不同孔中；(3)每孔加入等體積O.5^2. 0IU/ml抗凝血酶-1II標準溶液，混合均勻，37°C孵育2分鐘；(4)每孔加入等體積活化的牛凝血因子X溶液即牛FX a溶液，混合均勻，37°C孵育2 分鐘；(5)每孔加入等體積發色底物N-α-芐氧羰基-D-精氨酰-L-甘氨酰-L-精氨酸-P-硝基苯胺的鹽酸鹽溶液即S-2765溶液，混合均勻，37°C孵育2分鐘；(6)每孔加入適量乙酸，混合均勻終止反應；(7)將微孔板直接在酶標儀上于波長405nm處讀取吸光值；(8)根據肝素標準溶液濃度與測得的相應吸光值繪制標準曲線；(9)以待測溶液反應產物吸光值根據標準曲線計算每國際單位人抗凝血酶-1II溶液中肝素的含量。
Tris :是Tris (Hydroxymethyl) aminomethane的常用縮寫；中文品名三輕甲基氨基甲燒。
IU :是International unit的常用縮寫,是用生物活性來表示某些蛋白質、抗生素、激素、維生素及抗毒素量的藥學單位。
IU/ml :是單位體積(ml)中所含的生物活性量。
本發明有益效果是1、利用微量發色底物法進行測定，具有靈敏度高，操作簡單、省時， 檢測所需試劑用量小等優點；2、采用繪制標準曲線計算結果的方式較單一對比計算，穩定性、準確性更高；3、本發明以6(T80°C高溫處理待檢樣品抗凝血酶-1II濃縮物2(T50min，能夠滅活待檢樣品中對結果造成很大影響的抗凝血酶-1II成分，但不會對肝素的活性產生影響，提高了測定結果的準確性。
`具體實施方式
以下結合實施例對本發明所述的測定法做進一步的描述。
實施例1 :測定抗凝血酶-1II溶液中肝素的含量(采用不同溫度加熱處理)1、待測樣品的處理(1)待測樣品準備取人抗凝血酶-1II和肝素標準品，配制3種含不同濃度肝素的人抗凝血酶-1II溶液，其中人抗凝血酶-1II的濃度均為liu/ml，肝素含量分別為O. 02,0. 04和O.05IU/ml ；(2)將配制的3種待測樣品分別分為四組對照組、60°C熱處理組、70°C熱處理組和 80°C熱處理組。對照組溶液不經任何處理，三個熱處理組溶液分別于60°C、70°C和80°C三種不同溫度條件下孵育30min。
2、標準曲線的制作與樣品的測定(1)用Tris緩沖液(ρΗ8·4)將已知效價的肝素標準品稀釋為0.0125,0.025,0. 05、O.1 IU/ml的作為標準溶液；(2)取標準溶液及待測樣品溶液40μ I于微孔板不同孔中；(3)每孔加入等體積O.5IU/ml抗凝血酶-1II標準溶液，混合均勻，37°C孵育2分鐘；(4)每孔加入等體積牛FX a溶液，混合均勻，37°C孵育2分鐘；(5)每孔加入等體積發色底物S-2765溶液，混合均勻，37°C孵育2分鐘；(6)每孔加入40μ I乙酸，混合均勻終止反應；(7)將微孔板直接在多功能酶標儀上于波長405nm處讀取吸光值；(8)根據肝素標準溶液濃度與測得的相應吸光值繪制標準曲線；(9)以待測溶液反應產物吸光值根據標準曲線計算每國際單位人抗凝血酶-1II溶液中肝素的含量；(10)重復以上方法，對制備的待測樣品進行3次重復試驗，結果求均值。
根據對本實施例所制備樣品的測定數據，經計算，測定結果見表I。
表I數據表明未經熱孵育處理的不同肝素濃度的待測樣品，肝素測定結果平均值分別為O. 0413,0. 0591和O. 0671IU/ml，測定值遠大于實際含量，而經60°C、70°C和80。。三種不同溫度條件下孵育30min后的樣品，不同肝素濃度的待測樣品測定結果的平均值都接近其肝素含量的實際值，且標準偏差較小。說明本發明提出的對樣品進行6(T80°C熱孵育處理后，通過后續檢測步驟，能夠更精確測定含有不同濃度肝素的人抗凝血酶-1II溶液中肝素的含量。
表1.測定抗凝血酶-1II溶液中肝素的含量(采用不同溫度加熱處理)
權利要求
1. 一種人抗凝血酶-1II濃縮物中肝素含量的測定方法，其特征是包括待測樣品的處理、標準曲線的制作與樣品的測定三個部分；其操作步驟為①、待測樣品的處理用O. 02mol/L Tris緩沖液(pH8. 4)將已知效價的抗凝血酶-1II濃縮物樣品稀釋至抗凝血酶-1II濃度為lIU/ml，6(T8(rC高溫水浴處理2(T50min;②、標準曲線的制作與樣品的測定a用Tris緩沖液pH8. 4將已知效價的肝素標準品稀釋至(TO. lIU/ml的已知濃度，作為標準溶液；b取四種或四種以上不同濃度肝素標準溶液及處理后的待測樣品溶液一定體積于微孔板不同孔中；c每孔加入等體積0.5 2.0IU/ml抗凝血酶-1II標準溶液，混合均勻，37°C孵育2分鐘； d每孔加入等體積活化的牛凝血因子X溶液即牛FXa溶液，混合均勻，37°C孵育2分鐘；e每孔加入等體積發色底物N- α -芐氧羰基-D-精氨酰-L-甘氨酰-L-精氨酸-P-硝基苯胺的鹽酸鹽溶液即S-2765溶液，混合均勻，37°C孵育2分鐘； f每孔加入適量乙酸，混合均勻終止反應； g將微孔板直接在酶標儀上于波長405 nm處讀取吸光值； h根據肝素標準溶液濃度與測得的相應吸光值繪制標準曲線； i以待測溶液反應產物吸光值根據標準曲線計算每國際單位人抗凝血酶-1II溶液中肝素的含量。
全文摘要
本發明公開了一種人抗凝血酶-Ⅲ濃縮物中肝素含量的測定方法，其特征是包括待測樣品的處理、標準曲線的制作與樣品的測定三個部分。待測樣品的處理方法為稀釋與加熱處理，標準曲線的制作與樣品的測定采用微量發色底物法。發明有益效果是利用微量發色底物法進行測定，具有靈敏度高，操作簡單、省時，檢測所需試劑用量小等優點；通過60~80℃加熱處理待檢樣品抗凝血酶-Ⅲ濃縮物20~50min，能夠滅活待檢樣品中對結果造成很大影響的抗凝血酶-Ⅲ成分，但不會對肝素的活性產生影響，提高了測定結果的準確性；采用繪制標準曲線計算結果，穩定性、準確性高。
文檔編號G01N21/31GK103063593SQ201210589290
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者葉生亮, 曹海軍, 胡吉軍, 李長清, 袁靖, 陳云華, 劉欣晏, 楊剛 申請人:中國醫學科學院輸血研究所, 貴州泰邦生物制品有限公司