專利名稱：一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感器制備方法
技術領域：
本發明提供一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感器制備方法，屬于生物傳感器技術領域。
背景技術：
在農業生產中，農藥在控制農作物病蟲害，保障農產品穩產、高產方面起到至關重要的作用，但是，農藥的不合理使用，不僅造成了水環境、土壤、大氣的污染，也導致了農產品中農藥殘留超標，引起人體中毒以及貿易壁壘。當前，我國生產和使用的殺蟲劑絕大多數品種為有機磷和氨基甲酸酯類農藥，其中毒死蜱的生產使用逐漸增加，毒死蜱在人體中主要分布于肝臟、腎臟、脾臟等血流量較高的器官。它可以抑制膽堿酯酶活性，對人體有致畸作用，甚而對人體的中樞神經產生影響。因此，建立一種快速、靈敏、安全可靠的毒死蜱農藥 殘留的檢測方法迫在眉睫。傳統的農藥殘留檢測主要有光譜法(紅外光譜法、熒光光譜法、紫外-可見光、化學發光法等)、色譜法(氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、高效液相色譜(HPLC))、氣-質聯用(GC-MS)，液-質聯用(^-1^)、酶聯免疫化1^34)等。雖然這些方法的選擇性好、靈敏度高和準確度高，同時檢測多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設備，樣品的前處理過程繁瑣、費時，并且對分析人員的技術水平要求很高，不適于現場快速檢測。因此，人們迫切需要快速、可靠、經濟和適合于現場應用的快速檢測方法。于是，廉價、快速、可信、敏感的生物傳感器應運而生。與傳統的分析方法相比，生物傳感器具有如下特點(1)較高的選擇性，因此不需要對被測組分進行分離，即不用對樣品進行預處理。(2)結構簡單，體積小，使用方便，特別是便攜式的生物傳感器，非常有利于食品質量的市場快速評價。(3)可實現連續在線檢測，使食品加工過程的質量控制變得簡便。(4)響應速度快，樣品用量少，與其他大型分析儀器相比，生物傳感器制作成本低，且可反復使用。因此本文嘗試制備一種毒死蜱殘留的免疫傳感器。發明的目的在于提供一種能克服上述方法的缺陷、且操作簡單、靈敏度高，選擇性好的毒死蜱農藥殘留檢測的免疫傳感器制備方法。其技術方案為一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于制備出一種新型的納米復合物多壁碳-硫堇-殼聚糖，從而增大電極表面的電流信號，加大檢測范圍，降低免疫傳感器的檢測限。所述的一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于多壁碳納米管具有的良好的化學穩定性，導電性和極高的機械強度；殼聚糖具有良好的生物相容性與成膜性，可以增大多壁碳納米管在溶液里的溶解性，解決了多壁碳納米管難溶解的問題；硫堇作為一種電子傳遞的媒介，可以很大程度上提高電子的傳輸，進一步增強了多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物的導電性。所述的一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于實驗條件的優化，主要包括免疫傳感器的修飾及表征過程，有關實驗參數的優化(納米復合物中硫堇的濃度、測試底液的pH、孵育時間等);所制備出電流型免疫傳感器的工作曲線；免疫傳感器性能檢測包括重現性、穩定性、特異性、再生性以及免疫傳感器對蔬菜樣品加標回收率的測定。所制備的免疫傳感器的工作曲線為y = 9.5771 IgC (ng/mL) + 16. 220，(R2=O. 9964)，其檢測限為O. 046ng/mL ;免疫傳感器性能檢測包括特異性、穩定性、重現性、再生性以及免疫傳感器對多種果蔬樣品回收率的測定。其制備原理為本發明利用功能化的多壁碳納米管，具有羧基(-C00H)，可以提供大的外部表面面積，且可以促進電子轉移；殼聚糖富含氨基(-NH2),是多壁碳納米管很好的分散劑，具有較高的成膜性及生物相容性；硫堇作為電子傳遞的媒介，具有大量的氨基(-NH2),將三種物質按一定比例混合，從而制備出多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物；而作為交聯劑的戊二醛可以與氨基(-NH2)結合，因此可以將多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物中殼聚糖、硫堇與毒死蜱抗體連接；用牛血清蛋白(BSA)封閉抗體上的非特異性結合位點后即可制備得到一種新型的、便捷的免疫傳感器。為達到以上目的，采取以下技術方案實現一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感 器制備方法，其特征在于(I)基于新型納米材料多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物，增大電流相應；(2)通過戍二醒將多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物中硫堇、殼聚糖與抗體中所含的氨基(-NH2)很好地結合，從而實現抗體的固定。本發明制備了新型納米材料多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物，利用多壁碳納米管具有的良好的化學穩定性，導電性和極高的機械強度，廣泛用于電極的表面修飾，然而其溶解性很差，進而需要尋找一種良好的分散劑。殼聚糖具有良好的生物相容性與成膜性，可以增大多壁碳在溶液里的溶解性，從而解決多壁碳的難溶解的問題。另外，硫堇作為一種電子傳遞的媒介，可以很大程度上提高電子的傳輸，進而加強了多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物的導電性。而戊二醛，作為交聯劑，可以很好地結合多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物中硫堇、殼聚糖與抗體中所含的氨基(-NH2),進而制備成一種新型的免疫傳感器，該免疫傳感器檢測時間較短，靈敏度高，選擇性穩定性好，再生能力強，回收率符合要求以及可以用于實際樣品的檢測。所述一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感器制備方法的制備工藝如下(I)制備多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物；(2)將6 μ L多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物修飾到清洗好的裸玻碳電極修飾上，烘干；(3)修飾3μ L 2. 5%戊二醛，烘干；(4)修飾6μ L 200ng/mL毒死蜱抗體，4°C孵育12h ；(5)將上述制備好的電極最后浸入2. 5%的BSA溶液中室溫下靜置I h，以封閉電極上非特異性結合位點，室溫下晾干，免疫傳感器制作完成，保存在
4°C條件下備用。
具體實施例方式實施例(1)多壁碳-硫堇-殼聚糖(MWCNTs-TH1-CS)納米復合物的制備將
O.5g殼聚糖溶于IOOmL 1.0%的醋酸溶液中，室溫下攪拌3h，配成O. 5% CS溶液，室溫下磁力攪拌lh，使殼聚糖完全溶解；稱取5. Omg多壁碳納米管，加入5. OmL上述得到的殼聚糖溶液中，在室溫下超聲分散，直至得到穩定的黑色分散液(多壁碳-殼聚糖納米復合材料)；再將5. Omg硫堇加入多壁碳-殼聚糖納米復合材料中，再在室溫下超聲分散12h至硫堇完全溶解，最終得到了多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物。(2)免疫傳感器的制備取6 μ L上述制備好的多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物滴涂在清洗好的玻碳電極(GCE)表面，晾干，然后用ρΗ=7. 5的硫酸鹽緩沖液(PBS)沖洗表面，晾干，該修飾電極記作MWCNTs-TH1-CS/GCE ;取 3 μ L 2. 5% 戊二醛(GA)溶液滴涂在 MWCNTs-TH1-CS/GCE 表面，孵育30min，然后用pH=7. 5的PBS緩沖液沖洗表面，晾干，記作GA/MWCNTs-THI_CS/GCE ;取6 μ L 200ng/mL 毒死蜱抗體(ant1-chlorpyrifos)溶液滴涂在 GA/MWCNTs-TH1-CS/GCE 上，4°C孵育12h，然后用ρΗ=7· 5的PBS緩沖液沖洗表面，晾干，記作ant1-chlorpyrifos/GA/MWCNTs-TH1-CS/GCE ;將上述組裝好的電極浸入2. 5%的BSA溶液中室溫下lh，以封閉抗體上的非特異性結合位點，室溫下晾干，免疫傳感器制作完成，保存在4°C條件下備用。(3)對所制備的免疫傳感器的復合物中硫堇的濃度、測試底液PH值、和孵育時間三方面實驗條件進行優化硫堇的最佳濃度為1. Omg/mL, pH值的范圍為7. 5，孵育時間的范圍為25min。IGI配置O. 1-1. OX 105ng/mL的毒死蜱標準溶液，將上述制備好的免疫傳感器分別浸入不同濃度的毒死蜱標準溶液，在常溫下孵育25min，檢測免疫前后電流變化得到其工作曲線；
(4)選5根制備好的免疫傳感器測量毒死蜱農藥殘留，檢測其重現性；將制備好的免疫傳感器保存24天之后，再去檢測毒死蜱農藥殘留量，從而檢測其穩定性；將免疫傳感器在克百威、辛硫磷、西維因、3-羥基克百威等干擾物存在的情況下對200ng/mL的毒死蜱進行測試，以檢測其選擇性；將免疫后的傳感器用甘氨酸-HCl緩沖液(pH=2. 8)解離毒死蜱農藥5min后再次免疫，檢測其再生能力；(5)將多種果蔬樣品清洗干凈，進行實際樣品加標回收率的測試。此種阻抗型免疫傳感器檢測農藥毒死蜱殘留的檢測方法操作工藝簡單，檢測時間較短，靈敏度高，選擇性好，穩定性高，再生能力好和回收率符合要求，符合我國農藥殘留快速檢測技術發展和國際化要求。
權利要求
1.一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于制備了多壁碳-硫堇-殼聚糖(MWCNTS-TH1-CS)納米復合材料，該傳感器的組裝過程為將多壁碳_硫堇_殼聚糖納米復合物滴涂到玻碳電極表面，然后用戊二醛交聯，再在抗體溶液中孵育12小時，用BSA封閉，進而制備出一種檢測毒死蜱農藥的免疫傳感器。
2.如權利要求1所述的一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于多壁碳納米管具有良好的化學穩定性、導電性和極高的機械強度；殼聚糖具有良好的生物相容性與成膜性，可以增大多壁碳納米管在溶液里的溶解性，解決了多壁碳納米管難溶解的問題 ，硫堇作為一種電子傳遞的媒介，通過鍵與多壁碳納米管形成很強的作用力，很大程度上提高了復合物中電子的傳輸，進一步增強了多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物的導電性；而戊二醛又可以很好地交聯復合物里硫堇、殼聚糖與抗體中的氨基(-NH2)，因此，制備的免疫傳感器靈敏度高，穩定性好。
3.如權利要求1所述的一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于免疫傳感器的修飾及表征過程，有關實驗參數的優化，所制備的免疫傳感器的工作曲線為毒死蜱濃度O. l-105ng/mL時，檢測毒死蜱農藥的線性范圍為y = 9. 5771 IgC (ng/mL)+ 16. 220，檢測限為O. 046ng/mL，免疫傳感器性能檢測包括重現性、穩定性、特異性、再生性以及免疫傳感器對蔬菜樣品加標回收率的測定。
全文摘要
本發明涉及一種檢測毒死蜱農藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于制備了一種新型納米材料多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物多壁碳納米管具有的良好的化學穩定性，導電性和極高的機械強度，然而其溶解性很差，需要尋找一種良好的分散劑；而殼聚糖具有良好的生物相容性與成膜性，可以增大多壁碳納米管在溶液里的溶解性；另外，硫堇作為一種電子傳遞的媒介，提高了電子的傳輸，進一步增強了多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物的導電性；而作為交聯劑的戊二醛可以很好地結合硫堇、殼聚糖與抗體中所含的氨基(-NH2)，進而制備成一種新型的免疫傳感器。該免疫傳感器檢測時間較短，靈敏度高，選擇性穩定性好，再生能力強，回收率符合要求。
文檔編號G01N33/544GK103018438SQ20121058902
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者孫霞, 曹瑤瑤, 王相友, 劉君峰, 鞏智利 申請人:山東理工大學