專利名稱：一種尿液中肌酐的液相色譜串聯質譜測定方法
技術領域：
本發明屬于尿液樣本的理化檢驗技術領域，具體涉及一種尿液中肌酐的液相色譜串聯質譜測定方法。
背景技術：
連續完全采集志愿者實驗期間的24小時尿液能夠提供更準確毒物接觸劑量水平。尿液樣本的完整性是實驗組織者首先需要關心的問題，一般采用肌酐的24小時清除率來確定樣本的完整性，或者用肌酐比率來校正尿液濃度。近年來，肌酐作為校正因子廣泛應用于煙氣相關生物標志物的濃度校正，包括可替寧、NNAL和巰基尿酸等。
尿液中肌酐的檢測方法主要有Jaffe法、酶解分光光度法、HPLC法、毛細管電泳法、毛細管區帶電泳法、GC-MS法和LC-MS/MS法。LC - MS/MS由于其高靈敏度與選擇性，被廣泛應用于尿液和血液等生物基質中肌酐的檢測。Hoskova發展了一種快速分析肌酐的電噴霧-串聯質譜法，尿液樣本通過固相萃取后直接進入串聯質譜檢測。此方法雖然省去了尿液樣本的分離時間，但是尿液基質只通過固相萃取后就直接進入質譜分析可能會污染儀器，串聯質譜的選擇分離遠不如液相色譜柱。Park報道了一種LC-MS-MS直接分析尿肌酐的方法，尿液只需甲醇稀釋與過濾后就可以進樣檢測。但是，肌酐在反相C18柱上的保留時間是O. 59 min，難以與尿液中水溶性的干擾物分開。本發明旨在建立一種簡單、快速、選擇性好的LC-MS-MS方法測定尿液中的肌酐。
發明內容
本發明的目的旨在克服現有技術缺陷，提供一種采用LC-MS/MS測定卷煙尿液中肌酐含量的方法，該方法能快速、準確檢測尿液中肌酐的含量，測定結果準確、測定干擾少。
本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種尿液中肌酐的液相色譜串聯質譜測定方法，包括以下工藝步驟a、收集志愿者尿液；b、樣品前處理室溫下解凍尿液樣品，混合均勻后，取ImL的尿液并加入10 μ L的甲酸酸化到ρΗ=2. 5左右，在10000轉/min的條件下離心10 min，離心的混合物過O. 22 μ m 聚醚砜水相濾膜，取5 μ L濾液于10 mL棕色容量瓶，加入100 μ L濃度為I μ g/mL的肌酐-d3，用純水定容至刻度；C、標準工作液的配制用純水配制不同濃度的肌酐標準工作溶液 d、液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度的肌酐標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統，肌酐的線性回歸方程為y=0. 0106x+0. 00615，其中Y代表分析物與內標峰面積的比值，X表示尿液中目標分析物的濃度。相關系數大于O. 999，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
步驟b中的稀釋過程依次加入的肌酐-d3和離心過濾后的尿液的體積分別為100 μ L 和 5 μ L。
在步驟d中，所述的色譜分析條件為色譜柱采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mmX2.1 mm, 3. 5 Mm)，初始流動相體系選取50%溶劑A (O. 1%乙酸水溶液)和50%溶劑B (O. 1%乙酸甲醇溶液)，分析時間為12 min，進樣量為5 μ L。
采用色譜柱分析時，選取的洗脫條件50%的O. 1%乙酸水溶液和50%的O. 1%乙酸甲醇溶液等度洗脫，流動相流速為200 μ L/min。
串聯質譜檢測器的條件電噴霧離子源，多反應監測正離子掃描方式；電噴霧電壓為5000V，霧化氣為40 psi,氣簾氣的量為30 psi,輔助加熱氣的流速為40 psi,離子源溫度為480 °C，射入電壓10 V,碰撞能29 eV ；去簇電壓73 V，駐留時間100 ms。
本發明具體的工藝過程進一步詳述如下I尿液收集收集志愿者尿液。
2樣品前處理b、樣品前處理室溫下解凍尿液樣品，混合均勻后，取I mL的尿液并加入10 μ L的甲酸酸化到ρΗ=2. 5左右，在10000轉/min的條件下離心10 min。離心的混合物過O. 22 μπι 聚醚砜水相濾膜。取5 μ L濾液于10 mL棕色容量瓶，加入100 μ L肌酐_d3( I μ g/mL), 用純水定容至刻度，取5 μ L濾液引入LC-MS/MS分離分析。
3 LC-MS/MS 測定(I)LC-MS/MS 條件 色譜條件Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 色譜柱(150 mmX2.1 mm, 3· 5 Mm);流動相A 0. 1%乙酸水溶液(體積分數)，流動相B :0. 1%乙酸甲醇溶液(體積分數)；柱溫40 °C;進樣量5 μ 。選取50% A和50%Β在流速O. 2 ml/min時等梯度洗脫尿液樣品，分析時間為12 min。
質譜條件電噴霧離子源，多反應監測正離子掃描方式IS 5000V,Gasl :40 psi, CUR 30 psi, Gas2 :40 psi, TEM :480 °C, EP :10 V, CE :29 eV ；CXP :8 V, DP :73 V，駐留時間100 ms。選取m/z 114/44作為定量離子對，m/z 117/47為對應的氣代內標離子對。
(2)尿液中肌酐含量的測定吸取配制好的不同濃度的肌酐的混合標準工作溶液5 μ ，注入LC-MS/MS。肌酐的線性回歸方程為y=0. 0106x+0. 00615，其中Y代表分析物與內標峰面積的比值，X表示尿液中目標分析物的濃度。同樣的方法檢測實際樣本，求得實際樣本中肌酐的含量。
(3)本發明方法的線性范圍和檢出限用處理過的混合空白尿液配制系列標準曲線，肌酐的標準曲線的點為1，2，5，10，20， 50，100，200，500和2000 ng/mL，化合物的線性良好，相關系數為O. 9995。利用加標稀釋得到方法的定量限和檢出限，目標峰10倍信噪比對應的濃度為定量限，3倍信噪比對應的濃度為檢出限。方法的定量限和檢出限分別為O. 3 ng/mL和O. 99 ng/mL。
(4)本發明方法加標回收率和重復性選取肌酐含量為低、中、高的三個尿液樣本，檢測其中的肌酐含量。每個樣本測10個平行得到日內精密度；每個樣本連續測定8天，得到日間精密度。方法的日內和日間精密度 CCV%)范圍分別是1. 0% -1. 8% 和1. 5% - 2. 9% (表 I)。
表I方法的精密度
權利要求
1.一種尿液中肌酐的液相色譜串聯質譜測定方法，其特征在于包括以下工藝步驟 a、收集志愿者尿液； b、樣品前處理室溫下解凍尿液樣品，混合均勻后，取ImL的尿液并加入10 UL的甲酸酸化到pH=2. 5左右，在10000轉/min的條件下離心10 min，離心的混合物過0. 22 Um聚醚砜水相濾膜，取5 u L濾液于10 mL棕色容量瓶，加入100 u L濃度為I ii g/mL的肌酐-d3，用純水定容至刻度； C、標準工作液的配制用純水配制不同濃度的肌酐標準工作溶液 d、液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度的肌酐標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統，肌酐的線性回歸方程為y=0. 0106x+0. 00615，其中Y代表分析物與內標峰面積的比值，X表示尿液中目標分析物的濃度，相關系數大于0. 999，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
2.根據權利要求I所述的尿液中肌酐的液相色譜串聯質譜測定方法，其特征在于步驟b中的稀釋過程依次加入的肌酐-d3和離心過濾后的尿液的體積分別為100 y L和5U L0
3.根據權利要求I所述的尿液中肌酐的液相色譜串聯質譜測定方法，其特征在于在步驟d中,所述的色譜分析條件采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱色譜柱,初始流動相體系選取50%溶劑A (0.1%乙酸水溶液)和50%溶劑B (0.1%乙酸甲醇溶液)，分析時間為12 min,進樣量為5 y L。
4.根據權利要求3所述的尿液中肌酐的液相色譜串聯質譜測定方法，其特征在于采用色譜柱分析時，選取的洗脫條件50%0. 1%乙酸水溶液和50%的0. 1%乙酸甲醇溶液等度洗脫，流動相流速為200 u L/min。
5.根據權利要求I所述的尿液中肌酐的液相色譜串聯質譜測定方法，其特征在于串聯質譜檢測器的條件電噴霧離子源，多反應監測正離子掃描方式；電噴霧電壓為5000V，霧化氣為40 psi,氣簾氣的量為30 psi,輔助加熱氣的流速為40 psi,離子源溫度為480° C，射入電壓10 V，碰撞能29 eV ；去簇電壓73 V，駐留時間100 ms。
全文摘要
一種測定尿液中肌酐含量的方法，其特征在于包括樣品經稀釋后直接引入液相色譜-電噴霧電離-串聯質譜儀進行測定，可快速、準確檢測出尿液中肌酐的含量水平。本發明為全新的尿液中肌酐含量的測定方法，采用氘代標準品作為內標定量分析物，可以減少樣品前處理過程中引起的誤差；串聯質譜法更好的提高了方法的選擇性與準確性。通過色譜柱以及洗脫條件的選擇與優化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時間。
文檔編號G01N30/88GK102980968SQ20121058872
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年12月29日
發明者侯宏衛, 張小濤, 田永峰, 劉彤, 陳歡, 韓書磊, 胡清源 申請人:國家煙草質量監督檢驗中心