專利名稱：臭茉莉hplc標準指紋圖譜及其建立方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物分析技術領域，更為具體地，涉及臭茉莉HPLC指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜。
背景技術：
臭茉莉(別名:臭矢茉莉，臭茉莉，大髻婆，單茉莉，過墻風)，為馬鞭草科植物臭茉莉的干燥莖或根，為常用中草藥，現收載于《廣東省中藥材標準》，具有祛風除濕，利水消腫的功效，常用于治療風濕骨痛，腳氣水腫，支氣管炎、高血壓癥及濕疹疥瘡，皮膚瘙癢等皮膚疾病。廣東省各地有產，以陽山，寶安，三水等地產出較多。其根莖均可入藥微苦，平。歸肝、脾、腎經，有祛風除濕，利水消腫的功效。用于風濕骨痛，腳氣水腫；可治療支氣管炎、高血壓病。外用治濕疹疥瘡，皮膚瘙癢。臭茉莉原定名為Clerodendron fragrans auct.non.Vent., Clerodendronphilippinum Schauer var.simplex Moldenke,變種臭茉莉Clerodendron lindleyi Decne.ex Planch.和原變種重瓣臭茉莉 C.phi lippinum Schauer Var.philippinum。現有標準對臭茉莉質量控制只有性狀鑒別及顯微鑒別，國內外關于臭茉莉的研究報道極少見，尚沒有對臭茉莉的指紋圖譜的質量控制方法的相關報道。本發明是在對臭茉莉根和莖進行了系統的化學成分研究上，采用HPLC方法，建立能較全面反映臭茉莉藥材質量的指紋圖譜，對控制臭茉莉原料和產品的質量有重要意義。
發明內容
現有標準對臭茉莉質量控制只有性狀鑒別及顯微鑒別，質量控制方法水平不高，本發明所要解決的是對現有的臭茉莉的質量控制方法水平不高，提供了一種臭茉莉的標準指紋圖譜，利用該標準圖譜更好的控制臭茉莉的質量，保證藥品使用的安全有效，同時本發明還提供了一種臭茉莉標準指紋圖譜的建立方法和應用。本發明通過以下技術方案予以實現上述目的:
一種臭茉莉HPLC標準指紋圖譜，其特征在于，包括13個共有特征峰，保留時間分別為:0.183,0.204,0.243,0.493,0.514,0.669,0.718,0.892,1.151,1.179,1.245,1.482、
18.541min。—種臭茉莉HPLC標準指紋圖譜，其特征在于，包括21個共有特征峰:以9號峰為對照峰(9號峰為毛蕊花糖苷峰，保留時間為18.54Imin )，其他的20個共有峰的相對保留時間為:0.183,0.204,0.243,0.493,0.514,0.669,0.718,0.892,1.151,1.179,1.245,1.482、1.493,1.517,1.605,1.635,1.743,1.795,2.044,2.203。一種臭茉莉HPLC標準指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟:
51.供試品溶液的制備:稱取樣品，加入提取溶劑，浸潤1(Γ60分鐘，超聲提取3(Γ60分鐘，過濾蒸干后溶解即得供試品溶液；
52.指紋圖譜的制作:將SI所得溶液過色譜分離柱，加入乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，流速0.8 1.2mL/min,乙腈在洗脫過程中體積分數變化規律:(Tl2min, 14 17%; 12 18miη, 17 20%18 20min, 20 20%2(T35min，20 40%; 35 40min, 40 78%; 40 50min，78 88% ;檢測波長327nm，柱溫25 35°C ;在此條件下分析供試品溶液，得到臭茉莉的指紋圖譜；
S3.標準指紋圖譜的確定:對11批臭茉莉建立HPLC指紋圖譜，通過分析比較，確定共有特征峰，這些共有特征峰作為臭茉莉的標準指紋圖譜。優選地，SI中所述提取溶劑為石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、50%甲醇、70%甲醇或70%乙醇；更為優選地，SI中所述提取溶劑為甲醇。優選地，SI中所述樣品與提取溶劑的重量與體積比為1:25 50。優選地，SI中所述浸潤的時間為30分鐘，超聲提取的時間為45分鐘。優選地，S2中所述色譜分離柱為安捷倫Z0RBAX-C18 (250 mmX4.6 mm，5ym)、賽默飛 Hypersil 0DS2 (4.6mmX 250mm, 5 μ m)或菲羅門 Phenomenex Synergi 4uFusion-RP 80A (250 mmX4.6 mm)。優選地，S2中所述色譜分離柱為安捷倫Z0RBAX-C18 (250 mmX4.6 mm, 5 μ m)。優選地，S2中所述流速為1.0mL/min。優選地，S2中所述柱溫為35 °C。一種如上所述臭茉莉HPLC標準指紋圖譜在臭茉莉質量控制中的應用。利用臭茉莉HPLC標準指紋圖譜控制臭茉莉質量的具體步驟如下:
Sll.待測樣品溶液的制備:稱取樣品，加入提取溶劑，浸潤(Γ60分鐘，超聲提取3(Γ60分鐘，過濾蒸干后溶解即得供試品溶液；
S12.指紋圖譜的制作:將SI所得溶液過色譜分離柱，加入乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，流速0.8^1.2mL/min,乙腈在洗脫過程中體積分數變化規律:(Tl2min， Γ 7%; 12 18min, 17 20%18 20min, 2(T20%2(T35min，20 40%; 35 40min, 40 78%; 4(T50min, 78 88% ;檢測波長327nm，柱溫25 35°C ;在此條件下分析待測樣品溶液，得到待測臭茉莉的指紋圖譜；
S2.將待測樣品的HPLC圖譜如上所述標準圖譜對比，確定待測樣品質量。本發明的有益效果是:
(O目前執行的標準中尚無建立臭茉莉指紋圖譜的檢測方法標準，標準對臭茉莉質量控制只有性狀鑒別及顯微鑒別，質量控制方法水平不高，發明是在對臭茉莉根和莖進行了系統的化學成分研究上，采用HPLC方法，建立能較全面反映臭茉莉藥材質量的標準指紋圖譜。為藥品生產及檢測中提供了臭茉莉質量控制的高標準，可以更好的控制臭茉莉的質量，使質量可控，保證藥品使用的安全有效。(2)本發明提供了一種建立臭茉莉標準指紋圖譜的建立方法，提供了臭茉莉高水平的檢測的操作標準和規范，方法簡單，易操作，重復性好，可以全面監控臭茉莉的產品，以確保產品質量的穩定性。(3)本發明提供的臭茉莉的標準指紋圖譜和檢測方法，為行業內臭茉莉的質量控制提供了標準和操作規范，方法簡單，易操作，重復性好，可以在原料采購、產品生產工藝流程中的各個步驟的質量進行監控，廣泛推廣應用。
(4)利用本發明的測定方法，可得到臭茉莉樣品的指紋圖譜色譜圖。再借助計算機相似度輔助評價軟件，將樣品圖與共有模式圖譜比較，通過相似度計算，即可評價原料品種、產地、真偽優劣，以及判斷產品質量的穩定性。
圖1.超聲提取和熱回流提取比較。圖2.浸潤時間的比較。圖3.不同提取溶劑比較。圖4.不同料液比提取比較。圖5.不同洗脫系統的比較。圖6.不同洗脫系統的比較。圖7.不同流速的比較。圖8.不同柱溫的比較。圖9.不同色譜柱的比較。 圖10.臭末利指紋圖譜；1.臭末利20100617 ；2.臭末利20100930 ；3.臭末利
20101101；4.臭茉莉 20101102 ;5.臭茉莉 20110301 ;6.臭茉莉 220110302 ;7.臭茉莉20110303 ；8.臭茉莉 20110304 ;9.臭茉莉 20110501 ;10.臭茉莉 20120723 ;11.臭茉莉20120830。圖11.對照品色譜圖；S.為毛蕊花糖苷對照品。圖12.臭茉莉的標準指紋圖譜。圖13.專屬性考察。圖14.精密度考察。圖15.重復性考察。圖16.穩定性考察。圖17.臭茉莉指紋圖譜共有模式圖譜；9號峰為毛蕊花糖苷；17號峰為3"，4〃 -0-acetyImartynoside ；18 號峰為 friedelin 。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步詳細說明本發明。實施例1 S1.儀器與試劑
電熱重蒸餾水器(上海三申醫療器械有限公司)、電熱恒溫水浴鍋DK-S24 (上海森信實驗儀器有限公司)、FEJ-200電子稱(d=0.lg)、萬分之一電子天平AB204-S (METTLERTOLEOD)、十萬分之一電子天平AUW220D (島津公司)安捷倫1200RLC快速液相色譜儀(配有G1315C型號DAD檢測器、G4218A的ELSD蒸發光檢測器、G1312B 二元泵、G1329B自動進樣器、G1322A 脫氣機G1316B 柱溫箱，Agilent Chemstation 色譜工作站、Agilent ZORBAX-C185 μ m(250 mmX4.6 mm)、Agilent ZORBAX-C181.8 μ m(50 mmX4.6 mm)、菲羅門PhenomenexSynergi 4u Fusion-RP 80A (250 mmX 4.6 mm)色譜柱、KQ-400K0E 型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。對照品:(1)樺木酸(betulinic acid) ； (2)單乙酰馬蒂羅苷(monoacety Imartinoside) ； (3) 4 " -O-乙酸馬蒂羅苷(4 " -O-acetylmartynoside)；(4)貞桐苷 A (clerodendronoside A) ； (5) 3 " , 4 " -O-乙酸馬蒂羅苷(3〃 ,4" -O-acetylmartynoside) ； (6)阿克替苷(acteoside) ； (7)木栓酮(friedelin) ； (8)粘霉烯醇(glutinol) ; (9)蒲公英職醇(taraxerol) ; (10)鉤大青酮(uncinatone) ； (11)mandarone E ; (12) (24S)-乙基膽留-5,22,25-三稀-3 β -醇[(24S) -24-ethylcholesta-5, 22, 25-trien-3 β -οI ] ； (13) hedyotol C 4" -0-β -D-glucopyranoside。對照品均是對臭茉莉根和莖進行了系統的化學成分研究上所得到的。乙腈(色譜純，安徽時聯特種溶劑股份有限公司)、甲醇(色譜純，安徽時聯特種溶劑股份有限公司)、磷酸(天津市福晨化學試劑廠)，冰醋酸(天津市福晨化學試劑廠)、乙醇(分析純，天津市大茂化學試劑有限公司)、石油醚(分析純，天津市大茂化學試劑有限公司)、甲醇(分析純，天津市大茂化學試劑有限公司)、重蒸水(自制)。S2.試驗藥材
11批臭茉莉藥材均由不同產地采集，樣品均按照《廣東省中藥材標準》進行檢測與鑒定，符合規定。樣品粉碎過50目篩，詳細信息見表1:
表1.11批臭茉莉樣品信息
權利要求
1.一種臭茉莉HPLC標準指紋圖譜，其特征在于，包括13個共有特征峰，保留時間分別為:0.183,0.204,0.243,0.493,0.514,0.669,0.718,0.892,1.151,1.179,1.245,1.482、18.541min。
2.一種臭茉莉HPLC標準指紋圖譜，其特征在于，包括21個共有特征峰，保留時間分別為:0.183,0.204,0.243,0.493,0.514,0.669,0.718,0.892,1.151,1.179,1.245,1.482、1.493,1.517,1.605,1.635,1.743,1.795,18.541、2.044,2.203 min。
3.一種臭茉莉HPLC標準指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.供試品溶液的制備:精密稱取樣品，加入提取溶劑，浸潤(Γ60分鐘，超聲提取3(Γ60分鐘，過濾蒸干后溶解即得供試品溶液； 52.指紋圖譜的制作:將SI所得溶液過色譜分離柱，加入乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，流速0.8" .2mL/min,乙腈在洗脫過程中體積分數變化規律:(Tl2min, 14 17%; 12 18miη, 17 20%18 20min, 20 20%2(T35min，20 40%; 35 40min, 40 78%; 40 50min，78 88% ;檢測波長327nm，柱溫25 35°C ;在此條件下分析供試品溶液，得到臭茉莉的指紋圖譜； 53.標準指紋圖譜的 確定:對11批臭茉莉建立HPLC指紋圖譜，通過分析比較，確定共有特征峰，這些共有特征峰作為臭茉莉的標準指紋圖譜。
4.根據權利要求3所述方法，其特征在于，SI中所述提取溶劑可以為石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、50%甲醇、70%甲醇或70%乙醇；S1中所述提取溶劑為甲醇。
5.根據權利要求3所述方法，其特征在于，SI中所述樣品與提取溶劑的重量與體積比為1:25 50。
6.根據權利要求3所述方法，其特征在于，再優選供試品的制作SI中所述浸潤的時間為30分鐘，超聲提取的時間為45分鐘。
7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，S2中所述色譜分離柱為安捷倫ZORBAX-C18、賽默飛 Hypersil 0DS2 或菲羅門 Phenomenex Synergi 4u Fusion-RP 80A。
8.根據權利要求3所述方法，其特征在于，S2中所述流速為1.0mL/min，S2中所述柱溫為 35。。。
9.一種如權利要求1至3任一項所述臭茉莉HPLC標準指紋圖譜在臭茉莉質量控制中的應用。
10.根據權利要求9所述應用，其特征在于，利用臭茉莉HPLC標準指紋圖譜控制臭茉莉質量的具體步驟如下:·51.按權利要求3中SI和S2所述方法分析待測樣品的HPLC圖譜；·52.將待測樣品的HPLC圖譜與權利要求1所述標準圖譜對比，確定待測樣品質量。
全文摘要
本發明提供了一種臭茉莉HPLC標準指紋圖譜及其建立方法與應用，所述方法包括供試品溶液的制備，對照品溶液的制備，色譜條件的選擇，并用高效液相色譜儀進行測定，得到臭茉莉藥材的指紋圖譜。通過對11批次臭茉莉藥材HPLC指紋圖譜的對比，確定其共有指紋特征，得到標準指紋圖譜。本發明具有方法簡便、重現性好、特征峰多、準確可靠等特點。所建立的標準指紋圖譜能有效地表征臭茉莉藥材的質量。
文檔編號G01N30/86GK103076408SQ20121058776
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者成金樂, 彭麗華, 王慧玲, 閔歡 申請人:中山市中智藥業集團有限公司