專利名稱：一種檢測人蛋白c活性的方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質檢測領域，涉及一種的檢測人蛋白C活性的發色底物法。
背景技術：
人蛋白C (protein C，簡稱PC)是一種分子量約為62kD的糖蛋白，在血漿中含量約為2-6 mg/L。健康人的血漿蛋白C活性為100%(即I IU/ml)。臨床多以占正常血漿蛋白C濃度的百分數來衡量PC的水平，健康成人的下限為65% — 75% (即O. 65—0. 75 IU/ml)，上限為124% —165%(即1. 24—1. 65 IU/ml)。該蛋白在人體中主要有抗凝血和抗炎癥等作用，當人體中有生理活性的蛋白C顯著降低時，會引發靜脈血栓、彌散性血管內凝血等疾病，嚴重危及患者生命。檢測人蛋白C活性的方法有凝固法和發色底物法。考慮到檢測費用、時間等，在日常檢測中一般采用發色底物法。
傳統的檢測蛋白C的發色底物法包括以下幾個步驟37°C激活5-10分鐘一37°C顯色5-10分鐘一終止一讀數。目前該方法存在以下不足開始要加入激活劑進行孵育激活，然后再加入作用底物進行顯色，最后加入終止液終止反應，在整個實驗過程中要進行三次的間斷性添加試劑，操作繁瑣，費時費力，而且在多樣品檢測時容易造成操作失誤。基于上述因素，本發明通過優化反應體系和實驗條件，建立了新的檢測人蛋白C的發色底物法，該方法具有良好的重復性，顯著降低了操作的復雜程度，減少造成人為失誤的概率，并能準確檢測人蛋白C的活性，有效確保了檢測結果的真實性和準確性。
發明內容
本發明提供了一種減少操作步驟、確保檢測準確性的發色底物法用于檢測人蛋白C的活性。該方法能顯著減少操作步驟，減少檢測所需時間，降低造成的人為失誤，并能有效地檢測出人蛋白C的活性。本發明所述的用于檢測人蛋白C的發色底物的方法，包括
(I)激活和顯色
將用樣品稀釋液稀釋后的樣品10-50 μ L加入96孔板中，然后依次加入約3倍體積的人蛋白C的特異性的激活劑(商業化產品，一種提取自蝮蛇蛇毒中的蛋白質)和活化的人血漿蛋白C的特異性的顯色底物(商業化產品，一種連接對硝基苯胺顯色基團的三肽化合物)，然后在37 °C水浴孵育8-20分鐘。⑵終止
加入約3倍待測樣品體積的酸性終止液，終止反應。(3)讀數
在405nm波長讀取吸光值。本發明在“激活和顯色”過程中，所用的樣品稀釋液為pH 7. 2-8. 4的20_50mM的Tris緩沖液或!fepes緩沖液，從而使稀釋后的樣品pH在7-8之間，與生理情況下血漿的pH相近，進而保證檢測的準確性。加入的人蛋白C激活劑的濃度為O. 05-0. 4 IU/ml，顯色底物的濃度為O. 05-2 mg/ml，保證人蛋白C能完全反應。在“終止”過程中加入的酸性終止液中為體積百分濃度為20-50%的醋酸。
Tris :是Tris (Hydroxymethyl) aminomethane的常用縮寫；中文品名三輕甲基氨
基甲燒。Hepes :4_(2-Hydroxyethyl)-l-piperazineethanesulfonic acid 的常用縮寫；中文品名4_羥乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸。IU :是International unit的常用縮寫,是用生物活性來表示某些蛋白質、抗生素、激素、維生素及抗毒素量的藥學單位。IU/ml :是單位體積(ml)中所含的生物活性量。本發明的有益效果是，將傳統的檢測人蛋白C的發色底物法過程中的兩個單獨的“激活”和“顯色”過程合并為一個“激活和顯色”步驟，大大簡化了操作步驟，使操作時間降為傳統的1/2-2/3，減少造成人為失誤的可能性，檢測準確性與靈敏度與傳統方法相似。
圖1傳統方法和新方法的標準曲線
在圖1中，橫坐標(X axis)是檢測到的吸光值的對數值,縱坐標(Y axis)是蛋白C的活性的對數值。兩條曲線分別是以人蛋白C活性為150%、100%、50%、25%和12. 5%五個梯度，用傳統方法和該發明的新方法做的標準曲線。傳統方法(籲)標準曲線的方程式為Log(y)=0. 0407+1. 05*Log(x)，相關系數R2=O. 997 ;新方法(▲)標準曲線的方程式為Log (y)= -O. 143+1. 06禮og(x)，相關系數 R2=O. 997。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步說明本發明，但并不是將本發明的保護范圍限定為所列舉的實施例。實施例1 :
Cl)激活和顯色
用pH 7. 2的20mM Tris緩沖液將標準血漿稀釋成3/8、1/4、1/8、1/16和1/32五個濃度梯度；待測樣品稀釋為1/4，取25 μ L分別加入96孔板中，然后依次加入75 μ L O. 32 IU/ml的激活劑protac (法國Hyphen BioMed公司)和1. 6 mg/ml的作用底物S2366 (p-谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-P-硝基苯胺鹽酸鹽，法國Hyphen BioMed公司)，振蕩混勻后在37°C水浴孵育14分鐘。(2)終止
加入75 μ L體積百分比為50%的醋酸終止液，靜置I分鐘。(3)讀數
使用美國Molecular Devices公司的SpectraMax M2e酶標儀在405nm波長處讀取吸光值。所得實驗數據用SoftMax軟件中的Log-Log數據處理模式處理后，以人蛋白C的吸光值的對數值為橫軸、人蛋白C活性的對數值為縱軸分別制作出傳統方法和本發明新方法的標準曲線(如圖1所示)，計算出待測樣品中人蛋白C的活性，結果如下表所示
權利要求
1.一種檢測人蛋白C活性的方法，其特征是用于檢測人蛋白C的發色底物的方法，包括①激活和顯色將用樣品稀釋液稀釋后的樣品10-50 μ L加入96孔板中，然后依次加入約3倍體積的人蛋白C的特異性的激活劑——一種提取自蝮蛇蛇毒中的蛋白質和活化的人蛋白C的特異性的顯色底物——一種連接對硝基苯胺顯色基團的三肽化合物，然后在 37°C水浴孵育8-20分鐘；②終止加入約3倍待測樣品體積的酸性終止液，終止反應；在 “終止”過程中加入的酸性終止液的體積百分濃度為20-50%的醋酸；③讀數在405nm波長讀取吸光值。
2.根據權利要求1所述的一種檢測人蛋白C活性的方法，其特征是在“激活和顯色”過程中，所用的樣品稀釋液為pH 7. 2-8. 4的20-50mM的Tris緩沖液或Ifepes緩沖液，從而使稀釋后的樣品PH在7-8之間，與生理情況下血漿的pH相近，進而保證檢測的準確性；加入的人蛋白C激活劑的濃度為O. 05-0. 4IU/ml，顯色底物的濃度為O. 05_2mg/ml，保證人蛋白 C能完全反應。
全文摘要
本發明公開了一種檢測人蛋白C活性的方法，用于檢測人蛋白Ｃ活性的發色底物的方法，包括激活和顯色:同時進行，所用的樣品稀釋液為pH7.2-8.4的20-50mM的Tris緩沖液或Hepes緩沖液，從而使稀釋后的樣品pH在7-8之間，與生理情況下血漿的pH相近，進而保證檢測的準確性；加入的人蛋白Ｃ激活劑的濃度為0.05-0.4IU/ml，顯色底物的濃度為0.05-2mg/ml，保證人蛋白Ｃ能完全反應；本發明的有益效果是，將傳統的檢測人血漿PC的發色底物法過程中的兩個單獨的“激活”和“顯色”過程合并為一個“激活和顯色”步驟，大大簡化了操作步驟，使操作時間降為傳統的1/2～2/3,減少造成人為失誤的可能性，檢測準確性與靈敏度達到傳統檢測方法要求。
文檔編號G01N21/31GK103018188SQ20121058458
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者王宗奎, 杜晞, 李長清, 王玉梅, 袁靖, 陳云華, 劉欣晏, 楊剛 申請人:中國醫學科學院輸血研究所, 貴州泰邦生物制品有限公司